CN108872166B - 双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法，该方法包括以下步骤：(1)油菜种子的解剖及切片；(2)油菜种子切片的尼罗红染色及DiO染色；(3)油菜种子双荧光标记切片标本制作；(4)激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描；(5)油菜种子细胞双荧光标记信号的三维重构。本发明利用双荧光标记，并具体通过对染料的具体种类及具体染色过程、后续激光共聚焦深层扫描所采用的扫描条件等进行改进及进一步优选，与现有技术相比能够有效解决油菜种子细胞或该油菜种子细胞内油滴其三维可视化处理难等问题，并且能够实现油滴和细胞体积的精准测量。

Description

双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法
技术领域
本发明属于植物组织成像技术领域，更具体地，涉及一种双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法，该方法通过共聚焦显微镜断层扫描技术和三维重构技术联用，利用双荧光标记能够实现油菜种子内的油滴和细胞整体三维可视化处理和相应体积的计算。
背景技术
油菜是产油效率最高的油料作物之一，菜籽油是中国传统的食用油，是国产食用植物油的第一大来源，在我国食用油市场中具有举足轻重的地位。在此背景下，我国油菜科技工作者正在引领和推动以高油、高产、高效为目标的油菜生产的技术飞跃。在提高油菜含油量的研究中不可避免的需要掌握油菜种子内的油脂积累规律，包括油菜种子中油脂在细胞和组织内的空间分布，油滴大小和数目，油滴密度等一系列形态规律。
目前，观察油菜种子内部油脂形态的主要方法有普通光学显微镜、激光共聚焦显微镜和电子透射显微镜等方法。付丽霞等(华中农业大学学报.(1993)12(6):556-560.)，韦存虚等.(中国油料作物学报(2009)31(4):445-448)，Zhi-Yong Hu等.(PLoS ONE(2013)8(4):e62099)利用透射电镜技术观察了油菜种子中油体大小、数目、形态等指标。董劲松等(植物学报.(2009),44(1):79-85)利用激光共聚焦显微镜观察了油菜高低油种子中油体数目、形态、分布特征，得到了油菜种子细胞中油体的数量和总面积与含油量之间存在正相关的结论。Jianwei Gu等(Front.PlantSci.(2017),7:1989)对高低油甘蓝型油菜种子进行透射电镜观察并应用image J软件对油体面积进行大量统计，得到了油体大小与含油量之间的规律关系。上述研究均在二维水平对油体大小形态进行统计分析。油滴在种子内部是以近似球体或椭球体形式存在的，因此，通过切片结合二维水平的显微观察容易出现大小或形态的偏差。近年来三维成像技术在组织、细胞成像领域的应用越来越多。Martine Miquel等.(Plant Physiology(2014)164:1866-1878)使用激光共聚焦显微镜对拟南芥种子内油滴进行深度断层扫描得到了油滴的三维立体图像，这是首次对含油种子内的油滴进行三维水平的可视化报道。但在细胞含油量计算方面，该现有技术仅能定性的判定细胞内的油滴大小，无法定量得出油滴的具体体积、以及油滴体积占细胞体积的占比。
长期以来，对油菜种子的含油量的定量解析主要在宏观水平，例如，索氏提取法测定种子总的含油量，这一测定技术对于衡量一个油菜品种的含油量是准确可行且广为接受。然而，随着研究的深入和精细化的研究需求，如何探索单细胞含油量或局部组织细胞含油量的变化规律，则成为未来的研究方向之一。在测定单细胞含油量或局部组织细胞含油量的研究中，目前没有有效的研究手段，也就是说，目前无法对单细胞含油量或局部组织细胞含油量进行测定，尤其是定量测定。现有技术中所采用的透射电镜、普通光学显微镜及共聚焦显微镜等技术，目前主要在二维、单张切片的层面上进行观察而无法对单细胞含油量或局部组织细胞含油量进行定量测定。因此，在单细胞含油量或局部组织细胞含油量测定方面存在技术空白。
以现有技术中Martine Miquel等.(Plant Physiology(2014)164:1866-1878)使用激光共聚焦显微镜对拟南芥种子内油滴进行深度断层扫描得到了油滴的三维立体图像为例，这是首次对含油种子内的油滴进行三维水平的可视化报道。但该技术仍无法对单细胞的含油量进行定量测定。Martine Miquel等的研究能够观察油滴融合过程，即，小油滴随着种子发育逐渐融合成一定大小的大油滴，能够得到定性的观察结果，但对细胞内的含油量仍无法进行测定。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种双荧光标记实现油菜种子单细胞及油滴三维可视化的方法，利用双荧光标记，并具体通过对染料的具体种类及具体染色过程(包括染色所采用的染色液的组分及其浓度、染色时间等)、后续激光共聚焦深层扫描所采用的扫描条件(如激发光波长、发射波长波段等)等进行改进及进一步优选，与现有技术相比能够有效解决油菜种子细胞或该油菜种子细胞内油滴其三维可视化处理难等问题，首次给出了对单细胞含油量或局部微观组织细胞含油量定量测定的方法，填补了这一技术的空白，该方法能够对油菜种子的细胞轮廓进行标记和扫描，计算细胞体积，可以实现油滴和细胞体积的精准测量。
为实现上述目的，按照本发明，提供了一种利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的三维可视化处理或体积计算的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)油菜种子的解剖及切片
选取油菜种子在解剖镜下去除种皮并保留种子胚胎；将剥离的种子胚胎分解为外子叶、内子叶及胚轴；将外子叶、内子叶及胚轴切成0.5-2mm厚的切片；
(2)油菜种子切片的尼罗红染色及DiO染色
将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在尼罗红染色液中染色5-10min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在DiO染色液中染色5-15min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；
或者，将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在DiO染色液中染色5-15min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在尼罗红染色液中染色5-10min，染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；
(3)油菜种子双荧光标记切片标本制作
将所述步骤(2)得到的完成了双荧光染色的种子切片置于载玻片与盖玻片之间，由此制作切片标本；
(4)激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描
将所述步骤(3)得到的所述切片标本放到激光共聚焦显微镜下，然后打开559nm激发通道和488nm激发通道，发射波长分别为570-670nm和510-550nm；对一层细胞从一侧到另一侧进行深度扫描，扫描完成后，将扫描得到的所有图像进行保存；
(5)油菜种子细胞双荧光标记信号的三维重构
使用三维重构软件分别对488nm和559nm光激发通道得到的图像进行逐张信号分割并重构，由于得到所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的三维立体图像，或进一步基于积分原理计算得出所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的体积。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，所述尼罗红染色液中的磷酸盐缓冲液为pH为7.0-7.4的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，该尼罗红染色液中尼罗红的浓度为1mg/L；染色时间优选为10min；优选的，所述磷酸盐缓冲液为pH为7.2的0.2mol/L磷酸盐缓冲液。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，所述DiO染色液中的磷酸盐缓冲液为pH为7.0-7.4的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，该DiO染色液中DiO的浓度为5μmol/L；染色时间优选为10min；优选的，磷酸盐缓冲液为pH为7.2的0.2mol/L磷酸盐缓冲液。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(4)具体是将所述步骤(3)得到的所述切片标本放到激光共聚焦显微镜下，使用100倍物镜，数值孔径为1.4，在镜头和玻片之间滴加一滴松柏油，打开559nm激发通道和488nm激发通道，发射波长分别为570-670nm和510-550nm；对一层细胞从一侧到另一侧进行深度扫描，扫描步长0.38nm；扫描完成后，将扫描得到的所有图像保存为tiff格式。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述油菜种子具体为双受精后发育15-60天的油菜种子或成熟的油菜种子；
所述切片为徒手切片，具体是在解剖镜下用手术刀将外子叶、内子叶及胚轴切成0.5-2mm厚的切片。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(3)具体是将所述步骤(2)得到的完成了双荧光染色的种子切片放到载玻片中央，在载玻片中央滴加50μl体积比为10％的甘油溶液，盖上盖玻片，从而制作得到切片标本。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(5)中，所述三维重构软件具体为三维重构软件AMIRA。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于利用细胞膜特异染料DiO和油脂特异染料尼罗红对油菜种子进行双荧光染色，通过切片(尤其是徒手切片)在共聚焦显微镜下实现双荧光信号的连续断层扫描；通过现有三维重构软件实现油滴和细胞的三维可视化及体积计算。相较于单一荧光标记仅能定性的测定油滴大小、无法准确得到细胞体积和含油量数据，本发明所采用的双荧光标记，可以对细胞膜与油滴同时成像并计算体积，例如，在激光共聚焦显微镜下扫描单层细胞或组织(由于一个切片标本里可能含有若干层细胞，而本发明的激光共聚焦显微镜可以扫描其中的一层细胞，如表面的一层细胞)，实现了油滴和细胞膜的双荧光标记成像并最终利用AMIRA商业化软件在三维水平上计算了含油量，得到油滴体积和细胞体积，因此可以计算含油量(包括油滴在细胞内的体积占比等参量)，解决了该领域技术人员长久渴望解决但迟迟未找到合适解决方法的微观水平下油滴和细胞体积的精准测量(即，单细胞含油量或局部微观组织细胞含油量定量测定)的问题，填补了该领域的空白。
相较于现有技术中关于油菜种子中油滴和细胞形态大小的研究主要在二维水平，无法定量进行计算，本发明首次在油菜种子中应用三维重构技术对油滴和细胞轮廓进行重构可视化和体积定量的研究方法，可以对细胞膜与油滴同时成像并定量计算体积，得到油滴体积和细胞体积、计算含油量。本发明具体是先对解剖、切片后的油菜种子进行尼罗红染色，再进行DiO染色(当然，也可以先进行DiO染色，再进行尼罗红染色)，通过控制染色所采用的染料的具体种类，尤其是使用尼罗红染料对油菜种子切片进行尼罗红染色，能够同时得到针对同一切片的细胞内油滴以及细胞轮廓的信息，并且细胞内油滴以及细胞轮廓这两种信息不会相互干扰，细胞膜染料Dio能够特异性针对细胞膜染色而不会对其他细胞成分染色；同样，尼罗红染料只针对油滴染色不会对其他细胞成分染色。本发明成像方法为激光共聚焦深层扫描，在该激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描过程中，本发明通过将激发光波长控制为559nm和488nm，发射波长分别控制在570-670nm和510-550nm波段，能够与两种染料相对应(细胞膜染料发射波长为510-550nm，尼罗红染料激发波长为570-670nm)，在同一共聚焦显微镜下同时对上述两种信号可以实现同时扫描成像，而不会出现发射波长叠加造成信号串扰。
除了激发光波长、发射波长的具体设置外，本发明中的扫描条件还优选使用100倍物镜，并数值孔径为1.4，能够有效识别单细胞内的油滴信息。此外，本发明可优选采用徒手切片将油菜种子切成0.5-2mm厚的切片，一方面徒手切片具体简单易行、操作简便的特点，另一方面切片处理也能够带来其他常规优点，例如，切片可以使样品表面相对水平，在使用激光共聚焦扫描时可以保证更多的荧光信号在同一扫描面被采集到(如果不事先切片的话，扫描时会因为样品表面厚度不一，影响最终扫描信号)；此外，本发明虽然使用了切片的方法，但由于共聚焦采用激光光源，激光可以穿透细胞但并不损坏细胞，可以做到无损成像，相比常规二维切片技术保证了样品的完整性。
本发明既可以得到油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的三维立体图像，并且还可以利用积分原理(如商业化软件AMIRA的积分功能)计算导出细胞膜和油脂信号的体积。本发明所提供的方法在三维立体水平上实现了油菜种子内部油滴和细胞轮廓的可视化；首次定量的测定了单细胞及组织水平上油滴与细胞体积，对单细胞及组织水平上研究油的积累提供研究手段。本发明可以实现油滴和细胞的三维重构和体积计算，为研究种子胚胎内油滴形态分布提供新的方法。
附图说明
图1是本发明利用双荧光标记实现油菜种子油滴和细胞三维可视化方法流程图。
图2是本发明利用双荧光标记实现油菜种子油滴和细胞体积计算的应用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
概括来说，本发明中的油菜种子油滴和细胞三维重构的方法，主要包括以下步骤：a.选取油菜种子并对种子胚胎徒手切片；b.将切片置于尼罗红染液中染色；c.将切片置于细胞膜探针染料中染色；d.利用激光共聚焦显微镜断层扫描；e.对油体和细胞扫描图片实现三维重构并计算油滴体积占比。以下为具体实施例：
实施例1：
(1)油菜种子解剖及徒手切片
选取双受精后发育30至60天未成熟油菜种子在解剖镜下去除种皮并保留种子胚胎；将剥离的种子胚胎分解为外子叶、内子叶及胚轴。解剖镜下用手术刀将外子叶、内子叶及胚轴切成0.5-2mm厚的切片。
(2)油菜种子切片的尼罗红染色
将上步得到的种子胚胎切片在尼罗红染液(0.2mol/L PH7.2的磷酸盐缓冲液+尼罗红1mg/L；磷酸盐缓冲液的pH值还可以是7.0-7.4范围内的其他值)染色5-10min。染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次。
(3)油菜种子切片的DiO染色
将上步得到的种子胚胎切片在DiO染液(0.2mol/L PH7.2的磷酸盐缓冲液+DiO 5μmol/L；磷酸盐缓冲液的pH值还可以是7.0-7.4范围内的其他值)染色5-15min。染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次。
(4)油菜种子双荧光标记切片制作
将完成双荧光染色的种子切片放到载玻片中央，在玻片中央滴加50μl体积比为10％的甘油溶液，盖上盖玻片待观察。
(5)激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描
将上步做好的玻片放到激光共聚焦显微镜下，使用100倍物镜，数值孔径为1.4，在镜头和玻片之间滴加一滴松柏油，打开559nm激发通道和488nm激发通道，发射波长分别为570-670nm和510-550nm；对一层细胞从一侧到另一侧进行深度扫描，扫描步长0.38nm；扫描完成后，将扫描得到的所有图像保存为tiff格式。
(6)油菜种子细胞双荧光标记信号的三维重构
使用三维重构软件AMIRA分别对488nm和559nm光激发通道得到的图像进行逐张信号分割并重构。得到三维立体图像，并利用商业化软件AMIRA的积分功能计算导出细胞膜和油脂信号的体积。上述三维重构和计算方法已经为行业内广泛认可和熟知。
实施例2：
(1)油菜成熟种子解剖及徒手切片
选取成熟油菜种子，加入无菌水浸泡10min，然后在解剖镜下去除种皮并保留种子胚胎；将剥离的种子胚胎分解为外子叶、内子叶及胚轴。解剖镜下用手术刀将外子叶、内子叶及胚轴切成0.5-2mm厚的切片。
(2)油菜成熟种子切片的尼罗红染色
将上步得到的种子胚胎切片在尼罗红染液(0.2mol/L PH7.2的磷酸盐缓冲液+尼罗红1mg/L；磷酸盐缓冲液的pH值还可以是7.0-7.4范围内的其他值)染色5-10min。染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次。
(3)油菜成熟种子切片的DiO染色
将上步得到的种子胚胎切片在DiO染液(0.2mol/L PH7.2的磷酸盐缓冲液PH7.2+DiO 5μmol/L；磷酸盐缓冲液的pH值还可以是7.0-7.4范围内的其他值)染色5-15min。染色完毕用0.2mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次。
(4)油菜成熟种子双荧光标记切片制作
将完成双荧光染色的种子切片放到载玻片中央，在玻片中央滴加50μl体积比为10％的甘油溶液，盖上盖玻片待观察。
(5)激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描
将上步做好的玻片放到激光共聚焦显微镜下，使用100倍物镜，数值孔径为1.4，在镜头和玻片之间滴加一滴松柏油，打开559nm激发通道和488nm激发通道，发射波长分别为570-670nm和510-550nm；对一层细胞从一侧到另一侧进行深度扫描，扫描步长0.38nm；扫描完成后，将扫描得到的所有图像保存为tiff格式。
(6)油菜成熟种子细胞双荧光标记信号的三维重构
使用三维重构软件AMIRA分别对488nm和559nm光激发通道得到的图像进行逐张信号分割并重构。得到三维立体图像，并利用商业化软件AMIRA的积分功能计算导出细胞膜和油脂信号的体积。上述三维重构和计算方法已经为行业内广泛认可和熟知。
使用上述方法，本发明对3个低油量油菜种子和3个高油量油菜种子(这些油菜种子油量高低的判断是基于现有宏观水平的测量手段，例如，索氏提取法测定种子总的含油量)其微观单细胞水平上的油滴体积的占比进行了验证，计算结果如图2所示，与宏观测量结果相符。
本发明是基于现有的三维重构和计算方法，以所使用的三维重构软件AMIRA为例，其三维重构和计算方法已经为行业内广泛认可和熟知。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1. 一种利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的体积计算的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)油菜种子的解剖及切片
选取油菜种子在解剖镜下去除种皮并保留种子胚胎；将剥离的种子胚胎分解为外子叶、内子叶及胚轴；将外子叶、内子叶及胚轴切成0.5-2 mm厚的切片；
(2)油菜种子切片的尼罗红染色及DiO染色，使细胞膜染料DiO特异性地对细胞膜染色，尼罗红染料只针对油滴染色，具体的：
将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在尼罗红染色液中染色5-10 min，染色完毕用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在DiO染色液中染色5-15 min，染色完毕用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；
或者，将所述步骤(1)得到的种子胚胎切片先在DiO染色液中染色5-15 min，染色完毕用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述DiO染色液为磷酸盐缓冲液与DiO的混合液；接着，再将该种子胚胎切片在尼罗红染色液中染色5-10 min，染色完毕用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3-5次；所述尼罗红染色液为磷酸盐缓冲液与尼罗红的混合液；
(3)油菜种子双荧光标记切片标本制作
将所述步骤(2)得到的完成了双荧光染色的种子切片置于载玻片与盖玻片之间，由此制作切片标本；
(4)激光共聚焦显微镜双荧光深层扫描
将所述步骤(3)得到的所述切片标本放到激光共聚焦显微镜下，然后打开559 nm激发通道和488 nm激发通道，发射波长分别为570-670 nm和510-550 nm；对一层细胞从一侧到另一侧进行深度扫描，扫描完成后，将扫描得到的所有图像进行保存；
(5)油菜种子细胞双荧光标记信号的三维重构
使用三维重构软件分别对488 nm 和559 nm光激发通道得到的图像进行逐张信号分割并重构，由此得到所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的三维立体图像，并进一步基于积分原理计算得出所述油菜种子细胞及该油菜种子细胞内油滴的体积。
2.如权利要求1所述利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的体积计算的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述尼罗红染色液中的磷酸盐缓冲液为pH为7.0-7.4的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液，该尼罗红染色液中尼罗红的浓度为1 mg/L；染色时间为10 min。
3.如权利要求2所述利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的体积计算的方法，其特征在于，所述尼罗红染色液中的磷酸盐缓冲液为pH为7.2的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的体积计算的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述DiO染色液中的磷酸盐缓冲液为pH为7.0-7.4的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，该DiO染色液中DiO的浓度为5 μmol/L；染色时间为10 min。
5.如权利要求4所述利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的体积计算的方法，其特征在于，所述DiO染色液中的磷酸盐缓冲液为pH为7.2的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求1所述利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的体积计算的方法，其特征在于，所述步骤(4)具体是将所述步骤(3)得到的所述切片标本放到激光共聚焦显微镜下，使用100倍物镜，数值孔径为1.4，在镜头和玻片之间滴加一滴松柏油，打开559nm激发通道和488 nm激发通道，发射波长分别为570-670 nm和510-550 nm；对一层细胞从一侧到另一侧进行深度扫描，扫描步长0.38 nm；扫描完成后，将扫描得到的所有图像保存为tiff格式。
7.如权利要求1所述利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的体积计算的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述油菜种子具体为双受精后发育15-60天的油菜种子或成熟的油菜种子；
所述切片为徒手切片，具体是在解剖镜下用手术刀将外子叶、内子叶及胚轴切成0.5-2mm厚的切片。
8.如权利要求1所述利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的体积计算的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体是将所述步骤(2)得到的完成了双荧光染色的种子切片放到载玻片中央，在载玻片中央滴加50 μl体积比为10%的甘油溶液，盖上盖玻片，从而制作得到切片标本。
9.如权利要求1所述利用双荧光标记实现油菜种子细胞及其内油滴的体积计算的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述三维重构软件具体为三维重构软件AMIRA。
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