CN106501043A - 一种有效观察油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有效观测油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法，包括石蜡切片过程中样品的取样固定、保存整染、水洗返蓝、脱水透明加碎蜡、透蜡包埋、修蜡块、切片、展片、粘片、烘干、封片、烘片、观片等步骤。本发明采用石蜡切片技术可有效获得油棕雌蕊结构完整的石蜡切片，样品经石蜡包埋后，样品不受其褐变影响，能够长久保存，切片时间随意，获得的切片平整、无皱褶、厚度均匀，显微结果清晰，有利于开展油棕种质资源解剖结构的观察和研究，在培育适合我国栽培的品种或筛选优良种质资源类型的工作中具有重要的意义。

Description

一种有效观察油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法

技术领域

本发明涉及显微观察植物样品技术领域，尤其涉及一种植物组织石蜡切片方法，具体涉及一种有效观测油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法。

背景技术

油棕(Elaeis guineensis Jacq.)属于棕榈科油棕属的多年生木本油料作物，是世界上生产效率最高的产油植物，有“世界油王”之称。油棕用途广泛，主要产品为棕榈油和棕榈仁油，在食品、化工及生物能源等方面都有使用。

油棕在自然界的生殖方式为有性生殖方式，花是其重要的生殖器官。油棕的花为雌雄同株异序，雌蕊包括柱头、花柱和子房，子房受精后发育成为果实，而子房中的胚珠发育成为种子。雌蕊解剖结构研究作为鉴定种质资源的重要依据之一，常作为评价植物结果情况和适应性强弱的重要手段，主要是通过利用植物组织切片在显微镜下观察其结构的特征而得以实现。因此，探索有效获得切片的方法在鉴定评价大量油棕种质时有重要的应用价值，有利于缩短油棕种质资源的鉴定周期。

作为植物组织切片的主要方式，冷冻切片虽然制作周期短，但由于油棕雌蕊本身组织结构易褐化、组织结构密实，冷冻切片切出的片子结构不易完整，切出片子无法长久保存，而且在冷冻切片过程每次都需取新鲜样品进行固定和切片，很受取样的限制，不够灵活，不适宜于油棕雌蕊的观察。

探索适合的石蜡切片技术应用于油棕组织解剖结构及细胞学研究中是一个重要问题，以前虽有其它植物组织石蜡切片的报道，但是，不同种类的植物组织有不同的特性，相关结果虽然有借鉴意义，却不能完全应用于油棕组织切片研究。

目前，尚未见将石蜡切片技术应用于油棕雌蕊解剖结构研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供了一种有效观测油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法，采用石蜡切片技术可有效获得结构清晰、完整的石蜡切片，有利于根据雌蕊的解剖结构开展油棕种质资源的鉴定和评价工作，对于培育或筛选适合我国栽培的油棕品种或种质资源具有重要意义。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种有效观察油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法，包括以下步骤：

(1)取样固定：首先摘取所要观察油棕整个的雌花序，带回实验室立刻进行选择分割，选择需要观察的雌蕊，把接近花托部位的雌蕊完全剥下来，之后将萼片剥掉，立刻用刀将柱头与子房分开，立刻将柱头与子房一块放入盛有卡诺固定液的高型称量瓶(40×70mm)里面，每瓶的样品数目为4～6个，当所需的样品选取完后，用橡皮筋将牙签扎有8～12个洞的塑料薄膜包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽真空1～1.5个小时；其中：样品与卡诺固定液的质量体积比为1：16～1：20(g/ml)，卡诺固定液是按体积比3：1将乙醇与乙酸均匀混合构成；后面所述步骤中的材料与浸泡液的质量体积比范围均为1：16～1：20(g/ml)；针对油棕雌蕊中胚珠非常接近花托部位的特点，本发明该步骤的取样操作能够有效观察到油棕雌蕊中的胚珠结构；

(2)保存：样品经抽真空固定后，经浓度95％乙醇、85％乙醇，每级浸泡20～25min，之后转入浓度70％乙醇中浸泡2～3d保存备用，保存温度为16～18℃。保存温度为16～18℃有利于降低油棕组织的生命代谢过程，而又不会对其产生冻害作用，可以保存较长时间。

(3)整染：将保存后的样品转入浓度50％乙醇-乙二醇混合溶液中浸泡5～6h后，转入爱氏苏木精稀释液中，用橡皮筋将扎有8～12个洞的塑料薄膜包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽真空1个小时后，继续放置在真空干燥器中，时间为20～24h，之后从真空干燥器中取出，盖上盖子，常温下继续放置48～52h；其中乙醇-乙二醇混合溶液是按体积比4：1将乙醇与乙二醇混合构成。乙醇-乙二醇混合溶液对样品的脱水较为温和，并且减少引起样品脱水过程中严重收缩和变硬的现象。针对油棕雌蕊结构密实的特点，将油棕雌蕊放入爱氏苏木精稀释液中进行真空抽气，不仅能够缩短染色时间，提高切片效率，而且能够使爱氏苏木精稀释液尽快渗透到油棕雌蕊内部，使油棕雌蕊内部组织染上颜色，提高染色质量。

(4)水洗、返蓝：样品经爱氏苏木精稀释液染色后，用蒸馏水浸洗样品，浸洗3～4次，中间每次浸泡1～2h，最后一次浸泡12～15h，之后用自来水返蓝，换水4～6次，每次2～3min，最后蒸馏水过一遍，浸泡5～7h。

(5)脱水、透明、加碎蜡：蒸馏水浸泡5～7h后，经过脱水剂逐级脱水后，再经氯仿逐级透明后，先加入纯氯仿40～50％体积的碎蜡沫，在36℃温箱中保温1h，再加入以有少量碎蜡沫漂浮在氯仿中，在36℃温箱中保温24h以上；其中脱水剂为七种，依次为：浓度30％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度50％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度70％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度85％乙醇-乙二醇混合水溶液、含浓度1％伊红的95％乙醇、无水乙醇-乙二醇混合溶液、无水乙醇；上述各种浓度的乙醇-乙二醇混合水溶液中，乙醇与乙二醇的体积比均为4：1；无水乙醇-乙二醇混合溶液中，无水乙醇与乙二醇的体积比为4：1；依次经七种脱水剂脱水时间依次为14～15h、3h、3h、3h、14～15h、3h、3h。

(6)透蜡、包埋：加碎蜡沫后的样品经浓度50％石蜡，浓度70％石蜡各浸泡3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯浸泡50min，包埋时样品横卧，样品与石蜡的体积比为1：60～1：80；

(7)修蜡块、切片：将包埋样品后的蜡块分割，修整，修整好的蜡块固定在底板后，进一步修成梯形，其中梯形的下底与雌蕊的高平行，油棕雌蕊纵切，切片厚度为11～15μm；

(8)展片、粘片、烘干：选取所需蜡带进行粘片，于温度为35℃的电热展片台展片后，将材料平放在铺有白色A4纸的托盘上，放置在温度为36℃鼓风干燥箱中，直至烘干；其中粘片时所选的高品质载玻片需用新医用脱脂棉擦干净，肉眼观察透亮无杂物，所选的蜡带长度小于封片时所用盖玻片长度。采用新医用脱脂棉擦高品质载玻片，观察的效果更加清晰，不会受到载玻片上杂物的影响，并且清洗载玻片速度快，节省时间。

(9)脱蜡、透明：烘片结束后，在二甲苯溶液中脱蜡、透明各一次，每次浸泡28～35min，此流程在通风橱内操作，其中在操作过程中，脱蜡缸与透明缸随手盖盖子。

(10)封片、烘片：将从透明缸里面取出的载玻片放在圆形滤纸上面，从右边方向立即滴2～3滴封片剂，封片后放置在温度为36℃烘箱中烘烤10～15d，待树胶烤干后，进行观察；其中封片剂是按体积比5：1将中性树胶与二甲苯混合构成。本发明采用的封片剂，封片过程中中性树胶稀稠度适宜，易操作，而且在封片烘干后不会因为二甲苯的大量挥发导致油棕雌蕊组织结构萎缩，影响观片效果，脱蜡后立即滴加该封片剂能够获得较好的观测视野和清晰的显微结构。

(11)观片：将完成的切片在显微镜上观测，获得所需图像。

本发明一种有效观察油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法，采用石蜡切片技术可有效获得油棕雌蕊结构完整的石蜡切片，切片平整、无皱褶、厚度均匀，显微结果清晰，具有经济实惠、易操作、结果清晰、可长期保存、不受取样时间限制、并可一次固定多份样品等优点，有利于开展油棕雌蕊解剖结构的观察和研究，在培育适合我国栽培的品种或筛选优良种质资源类型的工作中具有重要的意义。

附图说明

图1是不同厚度的石蜡切片结果比较。

图2是不同条件下显微图像结果比较。A、脱蜡后立即滴加中性树胶(中性树胶：二甲苯＝5：1)并用盖玻片封片；B、脱蜡后延迟滴加中性树胶(中性树胶：二甲苯＝1：1)，并用盖玻片封片；C、脱蜡后立即滴加中性树胶(中性树胶：二甲苯＝1：1)并用盖玻片封片；D、脱蜡后延迟滴加中性树胶(中性树胶：二甲苯＝5：1)，并用盖玻片封片。

图3是油棕雌蕊的冷冻切片与本发明石蜡切片效果比较。A、厚度为14μm的冷冻切片的显微图像；B、本发明厚度为14μm的石蜡切片的显微图像。

具体实施方式

实施例一

1、取样固定：首先摘取所要观察油棕的整个雌花序，带回实验室立刻进行选择分割，选择新鲜、正常、有代表性的雌蕊，把接近花托部位的雌蕊完全剥下来，之后将萼片剥掉，立刻用刀将柱头与子房分开，立刻放入盛有卡诺固定液(纯乙醇：乙酸＝3:1)的高型称量瓶(40×70mm)里面，每瓶的样品数目6个，材料与固定液的质量体积比为1：17(g/ml)，之后用牙签扎有10个洞的塑料薄膜用橡皮筋包裹在瓶口上面，放在真空干燥器(真空泵型号DP-01)中，抽气1.2个小时。后面所述步骤中的材料与浸泡液的质量体积比范围均为1：17(g/ml)。

2、保存整染：真空抽气后的样品依次经浓度95％乙醇，85％乙醇各浸泡20min，之后转入浓度70％乙醇中浸泡3d，保存温度为17℃。

3、整染：将保存后的样品从浓度70％乙醇中转入50％乙醇-乙二醇混合溶液中浸泡5h，转入爱氏苏木精稀释液中，用橡皮筋将牙签扎有10个洞的塑料薄膜用包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽气1个小时后，继续放置在真空干燥器中，时间为23h，之后从干燥器中取出，盖上盖子，常温下继续放置50h。

4、水洗、返蓝：样品经爱氏苏木精稀释液染色后，用蒸馏水浸洗样品，浸洗4次，中间每次浸泡1h，最后一次浸泡14h，之后用自来水返蓝，换水5次，每次2min，最后蒸馏水过一遍，浸泡6h。

5、脱水、透明、加碎蜡：蒸馏水浸泡6h后，经过脱水剂逐级脱水后，再经氯仿逐级透明后，先加入纯氯仿40％体积的碎蜡沫，在36℃温箱中保温1h，再加入以有少量碎蜡沫漂浮在氯仿中，在36℃温箱中保温24h以上；其中脱水剂为七种，依次为：浓度30％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度50％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度70％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度85％乙醇-乙二醇混合水溶液、含浓度1％伊红的95％乙醇、无水乙醇-乙二醇混合溶液、无水乙醇；上述各种浓度乙醇-乙二醇混合水溶液中，乙醇与乙二醇的体积比均为4：1；无水乙醇-乙二醇混合溶液中，无水乙醇与乙二醇的体积比为4：1。

具体为：依次经七种脱水剂脱水时间依次为14h、3h、3h、3h、14h、3h、3h。最后一次无水乙醇浸泡3h后，吸出20％无水乙醇后，加入相同体积的纯氯仿，浸泡2.5h后，依次进行3次吸出20％溶液，加入相同体积的纯氯仿，依次浸泡2.5h，14h，2.5h。之后吸出全部溶液，依次经100％纯氯仿2次，依次浸泡2.5h，1h。加氯仿过程全部在通风橱内完成。第二次浸泡氯仿后，将提前刮好的碎蜡沫加入氯仿中，加入碎蜡沫与氯仿的体积比在40％，至于36℃温箱中保温1h后，再次加入提前刮好的碎蜡沫，以有少量碎蜡沫漂浮在氯仿中为好，在36℃温箱中保温24h以上。

6、透蜡、包埋：先将放置好自制活动铝盒(长×宽×高为7.0cm×2.0cm×2.0cm)的提篮浸泡在50％石蜡杯中，之后将样品等共同转入活动铝盒内，并将顶部用铅笔标写名称序号白色A4纸条(长×宽＝8.0cm×0.7cm)竖放在铝盒内，并将放有样品的50％石蜡杯在42℃温箱中保温3h。随后将放有样品的提篮转入到75％石蜡蜡中浸泡，并在50℃温箱中保温3h。之后放有样品提篮分别经纯蜡A杯、纯蜡B杯、纯蜡C杯浸泡，都在58℃温箱中保温50min。选用光滑、有一定硬度的白纸，纸的大小为(10.5cm×12cm)，折叠好后，用红色特种铅笔在纸盒底部或者侧面写上材料编号。先将电磁炉调节到100℃，溶解提前熬制和过滤好的石蜡3-5min；再将电磁炉调节到70℃，将石蜡完全溶解后，用电磁炉上的余热保温。将自来水浸湿吸水纸放置在大小为(7cm×9cm)的玻璃板上，其上再放折叠好的纸盒，用蜡勺盛蜡于纸盒中后平放，再将纯蜡C杯中的铝盒取出放入纸盒中，将铝盒拆开，将材料落入盒中，将4-6个样品平均分布到纸盒中(样品与石蜡的体积比为1：60)，样品横卧。静置到蜡块表面结膜后可连同玻璃片一起移入水中，然后慢慢抽出玻璃片，使包埋盒浮于水中。以此类推。

7、修蜡块、切片：首先在桌上垫一张A4纸，纸上放一块小木板，之后将包埋好的蜡块的纸剥掉，正面放在小木板上，先用单面刀片在所要切取的材料四周蜡块上划数条直线，四周相接与直线之间也划线，之后轻轻的加深刀口，然后用两手的大拇指和食指夹住蜡块轻轻用力折断。用单面刀将分割的蜡块修成小块。将修好的蜡块按组装入自封袋中，自封袋上写好编号。将所要切片的材料的蜡块牢固粘在底板上，当底板上的蜡块冷却后，再进一步修整成梯形，其中梯形的下底与雌蕊的高平行，并将切面表面的石蜡仔细削去，只剩下薄薄一层覆盖在材料上。将已固着和修整好的蜡块装在样品固定器上，油棕雌蕊的高与刀的方向平行，并固定好。将切片刀装在切片机(型号LEICA RM 2235)的刀架上，调节切片刀的角度为15°左右，并固定好。调节切片的厚度：转动厚度调节器调节至所需的切片厚度，一般在11μm。打开停刀扎，进行切片，将切好，连成带的片子放在白色A4纸上，用剪剖刀切断蜡带，蜡带的长度小于封片时盖玻片长度。在粘片前，将电热展片台温度调至35℃。

8、展片、粘片、烘干：先用铅笔在载玻片左侧磨砂处标好编号和粘片顺序号码，然后用新医用脱脂棉将载玻片擦干净，肉眼观察无杂物。选择所需的蜡带进行粘片，粘贴剂(蛋清甘油配制)，将蘸有蛋清甘油的细竹签的一小滴涂2张载玻片，用洗干净的小手指涂抹均匀，之后在载玻片上滴3-4滴纯水，将提前切割好的蜡带用小镊子转移载玻片上的蒸馏水中，然后平移到提前预热好的电热展片台上(金华益迪/YD-AB)，用镊子轻轻促动蜡带边缘，使材料摆放整齐和蜡带展开，放置2.5小时以上。之后平移到铺有白色A4纸的托盘上，放置在鼓风干燥箱(36℃)中，直至烘干。

9、脱蜡、透明：取10片玻璃脱蜡缸4个，在缸的外壁的一侧贴上脱蜡、透明字样的标签，用玻璃胶布覆盖，之后放在通风厨里面，在蜡缸里面加入脱蜡剂二甲苯，二甲苯的量与齿槽高度平齐。将待脱蜡的载玻片放在脱蜡缸里面，有材料的一面朝向标签和人，每个卡槽放至一张载玻片，注意勿粘贴住，之后盖上盖子，放置30min后转入透明缸中。

10、封片、烘片：将从透明缸里面取出的载玻片放在圆形滤纸上面，从右边方向立即滴2滴封片剂(封片剂是按体积比5：1将中性树胶与二甲苯混合构成)；之后将盖玻片从右侧盖住，平放在铺有白色A4纸的托盘上。装满一盘后放置在烘箱中烘烤(36℃)烘箱中烘烤10d，待树胶烤干后，进行观察。

11、观片：将完成的切片至于显微镜(型号：Leica DM 2500)上观察油棕雌蕊解剖结构，拍照获取所需图像。

实施例二

1、取样固定：首先摘取所要观察油棕的整个雌花序，带回实验室立刻进行选择分割，选择新鲜、正常、有代表性的雌蕊，把接近花托部位的雌蕊完全剥下来，之后将萼片剥掉，立刻用刀将柱头与子房分开，立刻放入盛有卡诺固定液(纯乙醇：乙酸＝3:1)的高型称量瓶(40×70mm)里面，每瓶的样品数目6个，材料与固定液的质量体积比为1：20(g/ml)，之后用牙签扎有12个洞的塑料薄膜用橡皮筋包裹在瓶口上面，放在真空干燥器(真空泵型号DP-01)中，抽气1.2个小时。后面所述步骤中的材料与浸泡液的质量体积比范围均为1：20(g/ml)。

2、保存整染：真空抽气后的样品依次经浓度95％乙醇，85％乙醇各25min，之后转入浓度70％乙醇中浸泡2d，保存温度为18℃。

3、整染：将保存后的样品从浓度70％乙醇中转入50％乙醇-乙二醇混合溶液中浸泡6h，转入爱氏苏木精稀释液中，用橡皮筋将牙签扎有12个洞的塑料薄膜用包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽气1个小时后，继续放置在真空干燥器中，时间为20h，之后从干燥器中取出，盖上盖子，常温下继续放置52h。

4、水洗、返蓝：样品经爱氏苏木精稀释液染色后，用蒸馏水浸洗样品，浸洗4次，中间每次浸泡2h，最后一次浸泡13h，之后用自来水返蓝，换水5次，每次2min，最后蒸馏水过一遍，浸泡6h。

5、脱水、透明、加碎蜡：蒸馏水浸泡5h后，经过脱水剂逐级脱水后，再经氯仿逐级透明后，先加入纯氯仿50％体积的碎蜡沫，在36℃温箱中保温1h，再加入以有少量碎蜡沫漂浮在氯仿中，在36℃温箱中保温24h以上；其中脱水剂为七种，依次为：浓度30％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度50％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度70％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度85％乙醇-乙二醇混合水溶液、含浓度1％伊红的95％乙醇、无水乙醇-乙二醇混合溶液、无水乙醇；上述各种浓度乙醇-乙二醇混合水溶液中，乙醇与乙二醇的体积比均为4：1；无水乙醇-乙二醇混合溶液中，无水乙醇与乙二醇的体积比为4：1。

具体为：依次经七种脱水剂脱水时间依次为14h、3h、3h、3h、14h、3h、3h。最后一次无水乙醇浸泡3h后，吸出20％无水乙醇后，加入相同体积的纯氯仿，浸泡2.5h后，依次进行3次吸出20％溶液，加入相同体积的纯氯仿，依次浸泡2.5h，14h，2.5h。之后吸出全部溶液，依次经100％纯氯仿2次，依次浸泡2.5h，1h。加氯仿过程全部在通风橱内完成。第二次浸泡氯仿后，将提前刮好的碎蜡沫加入氯仿中，加入碎蜡沫与氯仿的体积比在50％，至于36℃温箱中保温1h后，再次加入提前刮好的碎蜡沫，以有少量碎蜡沫漂浮在氯仿中为好，在36℃温箱中保温24h以上。

6、透蜡、包埋：先将放置好自制活动铝盒(长×宽×高为7.0cm×2.0cm×2.0cm)的提篮浸泡在50％石蜡杯中，之后将样品等共同转入活动铝盒内，并将顶部用铅笔标写名称序号白色A4纸条(长×宽＝8.0cm×0.7cm)竖放在铝盒内，并将放有样品的50％石蜡杯在42℃温箱中保温3h。随后将放有样品的提篮转入到75％石蜡蜡中浸泡，并在50℃温箱中保温3h。之后放有样品提篮分别经纯蜡A杯、纯蜡B杯、纯蜡C杯浸泡，都在58℃温箱中保温50min。选用光滑、有一定硬度的白纸，纸的大小为(10.5cm×12cm)，折叠好后，用红色特种铅笔在纸盒底部或者侧面写上材料编号。先将电磁炉调节到100℃，溶解提前熬制和过滤好的石蜡3-5min；再将电磁炉调节到70℃，将石蜡完全溶解后，用电磁炉上的余热保温。将自来水浸湿吸水纸放置在大小为(7cm×9cm)的玻璃板上，其上再放折叠好的纸盒，用蜡勺盛蜡于纸盒中后平放，再将纯蜡C杯中的铝盒取出放入纸盒中，将铝盒拆开，将材料落入盒中，将4-6个样品平均分布到纸盒中(样品与石蜡的体积比为1：80)，样品横卧。静置到蜡块表面结膜后可连同玻璃片一起移入水中，然后慢慢抽出玻璃片，使包埋盒浮于水中。以此类推。

7、修蜡块、切片：首先在桌上垫一张A4纸，纸上放一块小木板，之后将包埋好的蜡块的纸剥掉，正面放在小木板上，先用单面刀片在所要切取的材料四周蜡块上划数条直线，四周相接与直线之间也划线，之后轻轻的加深刀口，然后用两手的大拇指和食指夹住蜡块轻轻用力折断。用单面刀将分割的蜡块修成小块。将修好的蜡块按组装入自封袋中，自封袋上写好编号。将所要切片的材料的蜡块牢固粘在底板上，当底板上的蜡块冷却后，再进一步修整成梯形，其中梯形的下底与雌蕊的高平行，并将切面表面的石蜡仔细削去，只剩下薄薄一层覆盖在材料上。将已固着和修整好的蜡块装在样品固定器上，油棕雌蕊的高与刀的方向平行，并固定好。将切片刀装在切片机(型号LEICA RM 2235)的刀架上，调节切片刀的角度为15°左右，并固定好。调节切片的厚度：转动厚度调节器调节至所需的切片厚度，一般在14μm。打开停刀扎，进行切片，将切好，连成带的片子放在白色A4纸上，用剪剖刀切断蜡带，蜡带的长度小于封片时盖玻片长度。在粘片前，将电热展片台温度调至35℃。

8、展片、粘片、烘干：先用铅笔在载玻片左侧磨砂处标好编号和粘片顺序号码，然后用新医用脱脂棉将载玻片擦干净，肉眼观察无杂物。选择所需的蜡带进行粘片，粘贴剂(蛋清甘油配制)，将蘸有蛋清甘油的细竹签的一小滴涂2张载玻片，用洗干净的小手指涂抹均匀，之后在载玻片上滴3-4滴纯水，将提前切割好的蜡带用小镊子转移载玻片上的蒸馏水中，然后平移到提前预热好的电热展片台上(金华益迪/YD-AB)，用镊子轻轻促动蜡带边缘，使材料摆放整齐和蜡带展开，放置2.5小时以上。之后平移到铺有白色A4纸的托盘上，放置在鼓风干燥箱(36℃)中，直至烘干。

9、脱蜡、透明：取10片玻璃脱蜡缸4个，在缸的外壁的一侧贴上脱蜡、透明字样的标签，用玻璃胶布覆盖，之后放在通风厨里面，在蜡缸里面加入脱蜡剂二甲苯，二甲苯的量与齿槽高度平齐。将待脱蜡的载玻片放在脱蜡缸里面，有材料的一面朝向标签和人，每个卡槽放至一张载玻片，注意勿粘贴住，之后盖上盖子，放置30min后转入透明缸中。

10、封片、烘片：将从透明缸里面取出的载玻片放在圆形滤纸上面，从右边方向立即滴3滴封片剂(封片剂是按体积比5：1将中性树胶与二甲苯混合构成)；之后将盖玻片从右侧盖住，平放在铺有白色A4纸的托盘上。装满一盘后放置在烘箱中烘烤(36℃)烘箱中烘烤10d，待树胶烤干后，进行观察。

11、观片：将完成的切片至于显微镜(型号：Leica DM 2500)上观察油棕雌蕊解剖结构，拍照获取所需图像。

试验过程：

重复上述步骤，将实施例一所得的修整好的蜡块分别在厚度8μm、9μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm下进行切片，之后按照实施例一方法进行下面的步骤，然后将完成的切片置于显微镜(型号：Leica DM2500)下拍照获取所需显微图像，部分结果见图1。结果表明在相同放大倍数条件下，切片厚度小于10μm时，蜡带薄，切片过程中蜡带褶皱，放置在展片机上也无法展平，但获得视野清晰，而观察结果有重叠褶皱情况。切片厚度在11～15μm时，切片过程中，蜡带平滑，不弯曲，材料不破碎，观察结构清楚，无叠褶皱情况。切片厚度大于16μm时，切片过程中，蜡带不相连，无叠褶皱情况，切片结果清晰，但厚度厚，透光性差。

将实施例一所得切片采用不同的封片剂进行封片：1、脱蜡后立即滴加封片剂(中性树胶：二甲苯＝5：1)并用盖玻片封片；2、脱蜡后延迟滴加封片剂(中性树胶：二甲苯＝1：1)，并用盖玻片封片；3、脱蜡立即滴加封片剂(中性树胶：二甲苯＝1:1)并用盖玻片封片；4、脱蜡后延迟滴加封片剂(中性树胶：二甲苯＝5：1)，并用盖玻片封片。所获得的显微图像结果见图2，脱蜡后立即滴加封片剂(中性树胶：二甲苯＝5：1)获得较好的观测视野和清晰的雌蕊解剖结构(图2A)；脱蜡后延迟滴加封片剂(中性树胶：二甲苯＝1：1)易导致油棕雌蕊解剖结构萎缩，使其结构失去真实结构，而无法达到观察效果(图2B)；脱蜡后立即滴加封片剂(中性树胶：二甲苯＝1：1)，温箱中烘干后，其观察结果较延迟滴加封片剂(中性树胶：二甲苯＝1：1)获得观察结果清晰，但由于中性树胶太少，温箱中烘干过程中，二甲苯挥发，导致其组织结构萎缩，无法达到所需观察效果(图2C)；脱蜡后延迟滴加封片剂(中性树胶：二甲苯＝5：1)获得观察效果(图2D)中有细胞结构不清晰，无法获得清晰的显微结构图片，其原因是由于在延迟的过程中，二甲苯挥发所致细胞结构萎缩。其中所涉及到的延迟过程均指从透明缸中拿出载玻片后延迟30s～60s滴加封片剂。

对照：采用冷冻切片法制备油棕雌蕊厚度为14μm的切片样品，在Leica DMIL LED倒置生物显微镜下观察拍照。结果如图3A。

由图3B可以看出，本发明所采用的石蜡切片技术得到的油棕雌蕊切片平整、无皱褶、厚度均匀，其显微结果结构完整、排列整齐，清晰，苏木精对细胞核的染色效果好，与冷冻切片技术相比，具有易操作、不受取样时间限制、结果清晰等优点，有利于开展油棕雌蕊解剖结构的观察和研究，在培育适合我国栽培的品种或筛选优良种质资源类型的工作中具有重要的意义。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (1)

1.一种有效观察油棕雌蕊解剖结构的石蜡切片方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取样固定：首先摘取所要观察油棕整个的雌花序，立刻进行选择分割，选择需要观察的雌蕊，把接近花托部位的雌蕊完全剥下来，之后将萼片剥掉，立刻用刀将柱头与子房分开，立刻将柱头与子房一块放入盛有卡诺固定液的高型称量瓶里面；当所需的样品选取完后，用橡皮筋将扎有8～12个洞的塑料薄膜包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽真空1～1.5个小时；其中：样品与卡诺固定液的质量体积比为1：16～1：20g/ml，卡诺固定液是按体积比3：1将乙醇与乙酸混合构成；

(2)保存：样品经抽真空固定后，经浓度95％乙醇、85％乙醇，每级浸泡20～25min，之后转入浓度70％乙醇中浸泡2～3d保存备用，保存温度为16～18℃；

(3)整染：将保存后的样品转入浓度50％乙醇-乙二醇混合溶液中浸泡5～6h后，转入爱氏苏木精稀释液中，用橡皮筋将扎有8～12个洞的塑料薄膜包裹在瓶口上面，放在真空干燥器中，抽真空1个小时后，继续放置在真空干燥器中，时间为20～24h，之后从真空干燥器中取出，盖上盖子，常温下继续放置48～52h；其中乙醇-乙二醇混合溶液是按体积比4：1将乙醇与乙二醇混合构成；

(4)水洗、返蓝：样品经爱氏苏木精稀释液染色后，用蒸馏水浸洗样品，之后用自来水返蓝，最后用蒸馏水浸泡；

(5)脱水、透明、加碎蜡：蒸馏水浸泡5～7h后，经过脱水剂逐级脱水后，再经氯仿逐级透明后，先加入纯氯仿40～50％体积的碎蜡沫，在36℃温箱中保温1h，再加入以有少量碎蜡沫漂浮在氯仿中，在36℃温箱中保温24h以上；其中脱水剂为七种，依次为：浓度30％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度50％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度70％乙醇-乙二醇混合水溶液、浓度85％乙醇-乙二醇混合水溶液、含浓度1％伊红的95％乙醇、无水乙醇-乙二醇混合溶液、无水乙醇；乙醇-乙二醇混合水溶液中，乙醇与乙二醇的体积比均为4：1；无水乙醇-乙二醇混合溶液中，无水乙醇与乙二醇的体积比为4：1；

(6)透蜡、包埋：加碎蜡沫后的样品经浓度50％石蜡，浓度70％石蜡各浸泡3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯浸泡50min，包埋时样品横卧，样品与石蜡的体积比为1：60～1：80；

(7)修蜡块、切片：将包埋样品后的蜡块分割，修整，修整好的蜡块固定在底板后，进一步修成梯形，其中梯形的下底与雌蕊的高平行，油棕雌蕊纵切，切片厚度为11～15μm；

(8)展片、粘片、烘干：选取所需蜡带进行粘片，于温度为35℃的电热展片台展片后，将材料平放在铺有白色A4纸的托盘上，放置在温度为36℃鼓风干燥箱中，直至烘干；其中粘片时所选的高品质载玻片需用新医用脱脂棉擦干净，肉眼观察透亮无杂物，所选的蜡带长度小于封片时所用盖玻片长度；

(9)脱蜡、透明：烘片结束后，在二甲苯溶液中脱蜡、透明各一次，每次浸泡28～35min；

(10)封片、烘片：将从透明缸里面取出的载玻片放在圆形滤纸上面，从右边方向立即滴2～3滴封片剂，封片后放置在温度为36℃烘箱中烘烤10～15d，待树胶烤干后，进行观察；其中封片剂是按体积比5：1将中性树胶与二甲苯混合构成；

(11)观片：将完成的切片在显微镜上观测，获得所需图像。