CN103776657B - 一种椰子叶片冷冻切片的制作方法 - Google Patents
一种椰子叶片冷冻切片的制作方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种椰子叶片冷冻切片的制作方法，是取椰子叶片切成小段样品；将纸质长方体粘在底座上，然后将叶片组织样品垂直置于平放在样品托上，再用冷冻包埋剂将样品完全包裹住，并放在样品台上进行冷冻切片；将切片贴到载玻片上，经烤片、染色后加盖玻片，待切片刚刚干燥时即可在显微镜下观察拍照。本发明采用冷冻切片的方式可快速获得结构完整的冷冻切片，可以有效地缩短制片的周期，材料不易变形，且切片显微观察的效果好，有利于较快开展对椰子种质资源的鉴定评价研究，对椰子种质资源的结构观察和分类鉴定具有重要的意义，为培育适合我国大面积栽培的椰子新品种奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于显微组织切片技术领域，涉及一种植物冷冻切片的制作，具体是一种椰子叶片冷冻切片的制作方法。
背景技术
椰子（CocosnuciferaL.）是一种典型的热带亚热带木本油料作物和食品能源作物，具有投资少、管理简单、易生长，经济寿命长，投资风险小，抗自然灾害能力强，营养丰富，用途广泛等优点，深受人们的喜爱。椰子全身是宝，椰肉可加工成椰干、椰蓉、椰麸、椰奶和椰油，椰子水可加工成高纤维椰子果冻；椰子外衣可加工成高级床垫、坐垫、无土栽培介质和专用有机肥；椰子硬壳可加工成活性炭和工艺品等。
目前我国椰子种植品种以海南本地高种为主，该品种具有投产慢（7-8年）、产量低、外观一般、果型大、单价低等缺点，因而导致椰子种植业经济效益偏低，农民对种植椰子缺乏热情，导致椰子产业发展速度缓慢。从椰子产业可持续发展的角度出发，迫切需要打破目前单一的品种布局，发展经济效益高的椰子品种，使品种多元化，以满足不同市场的需求。而矮种椰子主要从国外引进，对其在我国的适应性尤其抗寒强弱难以确定，需要经过长期的引种试种观察，才能确定能否在我国生产上应用。因此，开展椰子种质资源鉴定评价，对种质资源的创新利用至关重要。叶片解剖结构鉴定常作为评价植物适应性强弱的重要手段，主要是通过不同植物组织切片方法在显微镜下观察其结构的特征而实现的。
植物组织切片方法常用有徒手切片法、石蜡切片法、冷冻切片法等。徒手切片法是指手持刀片将实验材料切成薄片的制作方法，由于样品不能固定，在切片时易产生厚薄不匀现象，难以获得完整的切片；石蜡切片法虽是最常用的方法，但由于材料切片前需经过固定、脱水、透明和包埋等一系列步骤，过程繁琐，材料容易变形；冷冻切片法是利用冷冻包埋剂包埋样品后利用冷冻切片机进行切片的一种快速方法，制片周期较短，观察效果好，获得的材料结构完整。
目前椰子解剖结构的研究主要是通过制作叶片石蜡切片，然后在显微镜下观察其结构特征，但制作石蜡切片需要40个小时或更长时间，效率低，而采用冷冻切片法制作椰子叶片冷冻切片进行结构显微观察的研究尚未开展。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种椰子叶片冷冻切片的制作方法，采用冷冻切片的方式可快速获得结构完整的冷冻切片，有利于较快开展对椰子种质资源的鉴定评价研究，对椰子种质资源的鉴定和分类，筛选对我国适应性较强的种质，为培育适合我国大面积栽培的椰子新品种奠定基础。
本发明所采用的技术方案：
一种椰子叶片冷冻切片的制作方法，其步骤如下：
1、材料前处理：取椰子叶片，洗净擦干后迅速用刀片切成2×4mm的小段样品。
2、样品固定：在LeicaLM1900冷冻切片机的冷台底座先加l～2滴OCT冷冻包埋剂，用硬质纸做成边长4～6mm、高7～10mm的长方体粘在底座上，然后再将叶片组织样品垂直置于平放在样品托上，再加3～6滴OCT冷冻包埋剂将叶片组织样品完全包裹住，并放在LeicaLM1900冷冻切片机中的样品台上，放置10～20min，即可进行冷冻切片。
所述叶片组织样品垂直置于平放的冷台前，先用清水冲洗，然后用纸将其表面上的残余液体吸干。
3、冷冻切片：切掉样品的外面纸盒，把带有椰子叶片的包埋剂块（以下简称样品块）切成3×5mm的大小；将刀片水平放稳，然后将粘有叶片的冷台固定在冷冻切片机的冷台固定槽上；先将切片厚度调节旋钮调至切片厚度35～50um对样品块进行修片，待能够出现平整均匀的切片后调至5～7μm，箱体最低控制温度为-20℃，切片头最低控制温度为-10℃（温度过低，叶片在切的过程中容易碎；温度过高，样品变软，不易成片），摇动旋转手轮进行切片。
4、展片和烤片：将切下来的切片贴到载玻片上，然后进行烤片，烤片时间在20～30min和温度为45℃。每块载玻片贴上5～12张切片。
5、染色：把烤好的切片放入1%番红水溶液染色3～8h，然后用蒸馏水洗涤3～5次，放入30%酒精中静置30s～1min，95%乙醇洗涤至切片不褪色后，滴加50%甘油于材料表面，加盖玻片；待切片刚刚干燥时，立即在LeicaDMILLED倒置生物显微镜下观察拍照。
本发明采用冷冻切片的方式可快速获得结构完整的冷冻切片，材料不易变形，可以有效地缩短制片的周期，在4-10个小时就可以完成从样品的前处理到显微镜下观察拍照，获得清晰图像的整个过程，且切片显微观察的效果好，有利于较快开展对椰子种质资源的鉴定评价研究，对椰子种质资源的结构观察和分类鉴定具有重要的意义，为培育适合我国大面积栽培的椰子新品种奠定基础。
附图说明
图1是采用本发明制备的椰子叶片切片样品的显微结构观察效果图。
图2是采用石蜡切片法制备的椰子叶片切片样品的显微结构观察效果图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
1、材料前处理：取2年生椰子幼苗自顶端的第三片叶，把叶片用清水洗2遍，再用蒸馏水清洗一遍，轻轻洗净后擦干后迅速用刀片切成2mm×4mm的小段样品；
2、样品固定：在LeicaLM1900冷冻切片机的冷台底座先加2滴组织OCT冷冻包埋剂，用硬质纸做成边长6mm、高8mm的长方体粘在底座上，然后再将步骤1）得到的叶片组织样品垂直置于平放在样品托上，再加5滴冷冻包埋剂将叶片组织样品完全包裹住，并放在LeicaLM1900冷冻切片机中的样品台上，放置15min，即可进行冷冻切片。
3、冷冻切片：切掉样品的外面纸盒，把带有椰子叶片的包埋剂块（以下简称样品块）切成3×5mm的大小。然后检查刀片是否锋利，水平放稳，然后将粘有叶片的冷台固定在冷冻切片机的冷台固定槽上，拧紧固定螺丝，先将切片厚度调节旋钮调至切片厚度45um对样品块进行修片，待能够出现平整均匀的切片后调至6μm，箱体最低控制温度为-20℃，切片头最低控制温度为-10℃，摇动旋转手轮进行切片。
4、展片：先将载玻片靠近切片刀，每切一张切片，用毛笔轻轻地将切片移到载玻片上，每块载玻片贴上5～12张切片；或直接用载玻片吸贴切片。
5、烤片：贴好切片后即可进行烤片，烤片时间在25min、温度为45℃。
6、染色：把烤好的切片放入1%番红水溶液染色6h，然后用蒸馏水洗涤5次，放入30%酒精中静置50s，95%乙醇洗涤至材料不褪色后，滴加50%甘油于材料表面，加盖玻片。
7、显微观察与拍照：待切片刚刚干燥时，立即在LeicaDMILLED倒置生物显微镜下观察拍照。结果如图1所示（20倍放大）。
对照：采用传统石蜡切片法制备椰子叶片切片样品，在LeicaDMILLED倒置生物显微镜下观察拍照。结果如图2所示（20倍放大）。
将本发明方法与石蜡切片制作方法的制作步骤和时间周期进行比较，结果见表1。
表1本发明方法与石蜡切片制作方法的制作步骤和时间周期比较
实验结果：图1显示本发明所采用的冷冻切片法得到椰子叶片的显微结构，包括角质层、表皮、海绵组织、栅栏组织、维管束结构等。结构完整、排列整齐，还可用于进一步的结构分析研究。与传统石蜡切片法相比可以有效的缩短制片的周期，材料不易变形，显微观察的效果好，对椰子种质资源的结构观察和分类鉴定仅有重要的意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种椰子叶片冷冻切片的制作方法，其特征在于，其步骤如下：
1）、材料前处理：取椰子叶片，洗净擦干后迅速用刀片切成2×4mm的小段样品；
2）、样品固定：在LeicaLM1900冷冻切片机的冷台底座先加l～2滴OCT冷冻包埋剂，用硬质纸做成边长4～6mm、高7～10mm的长方体粘在底座上，然后再将叶片组织样品垂直置于平放在样品托上，再加3～6滴OCT冷冻包埋剂将叶片组织样品完全包裹住，并放在LeicaLM1900冷冻切片机中的样品台上，放置10～20min，即可进行冷冻切片；
3）、冷冻切片：切掉样品的外面纸盒，把带有椰子叶片的包埋剂块——样品块切成3×5mm的大小；将刀片水平放稳，然后将粘有叶片的冷台固定在冷冻切片机的冷台固定槽上；先将切片厚度调节旋钮调至切片厚度35～50μm对样品块进行修片，待能够出现平整均匀的切片后调至5～7μm，箱体最低控制温度为-20℃，切片头最低控制温度为-10℃，摇动旋转手轮进行切片；
4）、展片和烤片：将切下来的切片贴到载玻片上，然后进行烤片，烤片时间在20～30min和温度为45℃；
5）、染色：把烤好的切片放入1%番红水溶液染色3～8h，然后用蒸馏水洗涤3～5次，放入30%酒精中静置30s～1min，95%乙醇洗涤至切片不褪色后，滴加50%甘油于材料表面，加盖玻片；待切片刚刚干燥时，立即在LeicaDMILLED倒置生物显微镜下观察拍照。
2.根据权利要求1所述的椰子叶片冷冻切片的制作方法，其特征在于：所述叶片组织样品垂直置于平放的冷台前，先用清水冲洗，然后用纸将其表面上的残余液体吸干。
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