JPH05506151A - Ｇｔｐ結合蛋白質をコードする遺伝子における点突然変異の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合 配　ＧＴＰ結合蛋白質をコードする遺伝子における点突然変異の検出 亥 本出願は、ここに参考として組入れる１９９０年２月７日出願の同時係属中の出 願番号第４７７．２６０号の一部係属出願である。

本発明は、ヒト試料中のＧＴＰ結合蛋白質をコードする核酸中の点突然変異の同 定に関するものである。ＧＴＰ結合蛋白質における点突然変異は、悪性疾患に関 連している。本発明は、これらの点突然変異および潜在的癌遺伝子の検出および 分類のための特異的プライマおよびプローブを提供する。癌遺伝子の同定は、細 胞成長および癌発生の研究に重要である。本発明は、特定の点突然変異を特定の 腫瘍型に関連付ける方法を提供する。好ましい実施態様において、点突然変異は 、Ｇ−蛋白質をコードする核酸中に記述されている。

Ｇ−蛋白質は、トランスメンブレン信号伝達経路における媒介物として機能する （Ｇｉｌｍａｎ、ｌ　９８７、Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｂｊｏｃｈｅｍ、５６　：　８１５　）　ｏこれらの経路は、レセプ タ類、Ｇ−蛋白質およびエフェクター類からなり、ＧＴＰおよびＧＤＰおよびＧ −蛋白質との周期的会合によって制御される。各Ｇ−蛋白質は、３種のサブユニ ット、α、βおよびγからなる。エフェクター分子との相互作用の特異性は、α サブユニットにより決定される。

数種類のＧ−蛋白質類が精製され、特徴付けがなされており、ＧｓおよびＧｉは 、それぞれアデニル酸シクラーゼ活性の刺激および阻害に関与する。３種類のＧ ｉαサブユニットＧｉαＬ　Ｇｉα２、およびＧｆα３か同定され、クローン化 されている（　ｒｔｏｈら、１９８８、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３　：　６６５６−６６６４）、Ｇｔは、光信号エネ ルギー変換に対する応答において、ｃ　ＧＭＰホスホジェステラーゼを活性化す る（Ｍａｔｔｅｒａら、１９８６、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２０６　：　３６−４ ２、およびＤｉｄｓ−ｂｕｒｙら、１９８７、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２１１　： 　１６０−１６４）。ＧＯおよびＧｚを含めて他のＧ−蛋白質は配列決定されて いる（　ＪｏｎｅｓおよびＲｅｅｄ、１９８７、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２６２　：　１４２４Ｉ−１４２４９、ならびにＳｔｒａｔｈｍａｎ ｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ；８６： ７４０７−７４０９）、加つるに、Ｇｋ　（Ｙａｔａｎｉら、１９８７．５ｃｉ ｅｎｃｅ　２３５　：　２０７）およびＧｏｌｆ（ＪａｎｅｓおよびＲｅｅｄ、 １９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：　７９０）が、Ｇ−蛋白質として同定さ れている。

Ｇｓ活性は、細胞内においてアデニル酸シクラーゼを刺激することによりＣＡＭ Ｐの水準を上昇させる。下垂体ソマトトロピン生成細胞において、ｃＡＭＰはヒ ト成長ホルモンの分泌を刺激し、細胞増殖を生じる。最近、ヒト下垂体腫瘍の部 分集合が、成長ホルモンおよびｃＡＭＰの上昇した水準を有するものとして記述 された（　Ｖａｌｌａｒら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３３０：５６６−５６８ 　）　ｏ　Ｌａｎｄｉｓらは、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４０　：　６９２− ６９６でＶａｌｌａｒらにより観察された異常細胞増殖が、ｃＡＭＰの蓄積を生 じるｃＡＭＰ制御に応答性のＧ−蛋白質の欠損の結果であることを提案した。Ｌ ａｆｌｄｉＳらは、過剰量の成長ホルモンを分泌する腫瘍を持った患者を同定し 、４種類の腫瘍が本質的に上昇した水準のＧｓ活性を有することを決定した。Ｒ ＮＡが新鮮な組織から精製され、逆転写され、クローン化された。ｃＤＮＡの全 ＧＳαコード領域の配列が決定され、２０１番口および２２７番目のコドン中に 点突然変異が同定された。これらの突然変異は、Ｇｓｐ変異である。Ｇｓｐ変異 は、Ｇｓを活性化する突然変異の一種であり、通常、チロトロピン（ＴＳＨ）に よる甲状腺細胞増殖、および甲状腺ホルモンの産生の刺激を媒介する（　Ｌｙｏ ｎｓら、１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　：　６５５−６５９　）。

アルギニン２０１は、コレラ毒素によるＧｓαの主要なＡＤＰ−リボシル化部位 である。この修飾は、本質的なアデニル酸シクラーゼ活性化を許容する（Ｌｏお よびｆ（ｕｇｈｅｓ、Ｉ　９８７、ＦＥＢＳＬｅｔｔ、２２４　：　１−３）。

グルタミン２２７は、ｒａｓｐ２１蛋白質のグルタミン６１に等価なＧｓαであ るものと予測されている（Ｌａｎｄｉｓらの前出文献）。ｒａｓｐ２１における Ｇｌｎ−６１の突然変異的な置換は、悪性疾患形質転換を促進する蛋白質を産生 ずる（　Ｄｅｒら、１９８６、Ｃｅ１ｌ　４４：ＩＯ２−１７６）。

該ｒａｓ遺伝子は、分子量約２１．０００ドルトンの高度に関連性をもった蛋白 質類（ｐ２１）をコードしている。

これらの蛋白質の細胞的信号伝達経路における正確な機能は知られていないが、 該ｐ２１は、Ｇ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ酵素活性を有しており、Ｇ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ活 性化蛋白質（ＧＡＰ）と相互作用する（Ｂｉｓｈｏｐ、ｌ　９８３、Ａｎｎ、　 Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

近接した関連性を育するＨａ−１ｋｉ−１およびＮ−ｒａｓ遺伝子を含めて、ヒ トｒａｓ遺伝子群は、多くのヒト悪性疾患の進展に関連する突然変異性の変化に 対する潜在的な標的の一つである（Ｂｏｓ、１９８８、ＭｕｔａｔｉｏｎＲｅｓ ｅａｒｃｈ　１９５　：　２５５−２７１　）　、これらの変化は、コドン１２ ．１３または６１の点突然変異であるか、または別法として、野生型遺伝子の５ −５０倍の増幅である。これらの変化は、ｒａｓ原生−癌遺伝子を癌遺伝子に転 換させる。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法は、腫瘍から単離されたゲノムＤＮＡのｒａ ｓ癌遺伝子における既知の点突然変異を検出するために使用されて、きた（　Ｖ ｅｒｌａａｎ−ｄｅＶｒｉｅｓ　ら、１９８６、Ｇｅｎｅ　５０　：　３１３− ３２０、およびＡｌｍｏｇｕｅｒａら、１９８８、Ｃｅ１ｌ、５：５４９−５５ ４　）　ｏ　Ｆａｒｒらは、１９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ。

性白血病（ＡＭＬ）にかかった患者から単離されたＤＮＡの特異的ｒａｓ遺伝遺 伝突点突然変異験するために、ＰＣＲをオリゴヌクレオチドドツトプロット法と 結合させた。

本発明は、Ｇ−蛋白質をコードする核酸のスクリーニング方法を提供するもので ある。ｒａｓ遺伝子のスクリーニング方法も提供される。核酸は、ＲＮＡまたは ＤＮＡであってよい。プライマ類およびプローブ類は、潜在的癌遺伝子の同定、 ならびに癌遺伝子または潜在的癌遺伝子の点突然変異の特徴付けのために提供さ れる。本発明は、内分泌腺腫瘍におけるＧｚ、Ｇｓ、Ｇｏ、ＧａおよびＧｉ蛋白 質をコードする核酸における点突然変異の検出に特に好適なプライマおよびプロ ーブを提供する。

本発明は、試料中のＧ−蛋白質αサブユニットをコードする核酸中の点突然変異 の存在の有無の検出方法を提供するものであって、該方法は、（ａ）　Ｇ−蛋白 質αサブユニットプローブを前記試料とハイブリッド形成させ、および（ｂ）ハ イブリダイゼーションの生起の有無を検出することを含んでなる。

別の実施態様において、該方法は、試料中のＧ−蛋白質αサブユニットをコード する核酸中の点突然変異の存在の有無を検出するに際し： （ａ）試料を、Ｇ−蛋白質αサブユニットプライマ、対、重合化試薬、およびデ オキシヌクレオシド５′　トリホスフェートと共に、各プライマの伸長生成物が 合成され掃る条件下で処理し、ここで前記プライマ類は、Ｇ−蛋白質αサブユニ ットの分節をコードする核酸の個々の鎖に対してハイブリッド形成するために充 分に相補的であって、前記プライマ対の一方の構成体から合成された伸長生成物 がその相補鎖から分離された場合に、前記対の他方の構成体の伸長生成物合成の ためのテンプレートとして機能し得るものであり： （ｂ）該伸長生成物が合成されるテンプレート上からプライマ伸長生成物を分離 して単鎖分子を形成し；（Ｃ）工程（ｂ）で生成される単鎖分子を工程（ａ）の プライマと、工程（ｂ）で生成される各単鎖分子をテンプレートとして使用して プライマ伸長生成物が合成される条件下で処理し； （ｄ）工程（ｂ）および（Ｃ）を少なくとも１回反復して増幅ＤＮＡを与え； （ｅ）　Ｇ−蛋白質αサブユニットプローブを前記増幅ＤＮＡとハイブリッド形 成させ、ここで前記プローブは、前記増幅ＤＮＡ中の野生型および変異型核酸配 列から選択される配列とハイブリッド形成するであろう核酸配列を含み；ならび に、 （ｆ）ハイブリダイゼーションの生起の有無を検出すること、 を含んでなる。

本発明は、Ｇ−蛋白質αサブユニットをコードする核酸中の潜在的癌遺伝子性点 突然変異の検出に有用な新規なプライマおよびプローブを提供する。

本発明は、また、Ｇ−蛋白質ｑサブユニットをコードする核酸中に点突然変異が 存在する場合、これを増幅し、検出するためのキットを提供する。

図１は、ＧｓαおよびＧｉα２遺伝子の点突然変異の同定を示す。Ｇｓαまたは Ｇｉα２遺伝子の示されたコドンを含む領域が、新鮮な冷凍組織またはパラフィ ン埋設組織のいずれかから単離されたゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅され た。点突然変異は、配列特異的オリゴヌクレオチドの増幅生成物への高度に厳密 なハイブリダイゼーションにより検出された。各パネルは、異なるオリゴヌクレ オチドとのハイブリダイゼーションを示している。

Ｇｓα遺伝子の分析は、図ＩＡに示され、例２に記述されている。この分析は、 ＧｓαのＡｒｇ２０１およびＧ１ｎ２２７コドンにおける突然変異を、１８種の 生化学的に１＃徴付けられたヒト成長ホルモン分泌性下垂体腫瘍で同定した。

Ｇｉα２遺伝子の分析は、図ＩＢに示され、例３に記述されている。この分析は 、Ｇｉα２のコドン１７９における突然変異を、３種のヒト副腎皮質腫瘍および １種の卵巣類粒層細胞腫瘍で同定した。

図２は、例５に記述されているように、正常ヒト膵臓およびに５６２細胞由来の ｒａｓ　ＲＮＡ／　Ｐ　ＣＲ生成物のＧＶＡ　（ゲル可視化分析アッセイ）を与 えている。

図３は、特徴付けられた細胞株における点突然変異の活性化に特異的なＡＳＯプ ローブを使用するｒａｓＲＮＡ／ＰＣＲ生成物のサザンプロット分析の結果を示 す。実験は、例６に記述されている。

図４は、例７に記述されているように、アルコール固定、パラフィン埋設試料か らのｒｌｓＲＮＡ／ＰＣＲのＧＶＡ分析を与えている。

図５は、例８に記述されているように、ヒト骨髄の染色または非染色顕微鏡スラ イドからのｒａｓＲＮＡ／ＰＣＲのＧＶＡ分析を与えている。

図６は、例９に記述されているように、野生型および突然変異ｒａｓオリゴヌク レオチドプローブの位置を示すｒａｓフォーマットＵフィルタの模式図である。

本発明は、Ｇ−蛋白質αサブユニットをコードする核酸において、存在する場合 に点突然変異の検出および特徴付けを行なう方法を提供する。これらの方法によ り検出される点突然変異は、発癌に関連をもつものと信じられる。該核酸は、Ｇ −蛋白質サブユニット遺伝子、ＲＮＡ転写生成物、ｃＤＮＡ生成物、またはそれ らの部分配列である。該方法は、少なくとも１個の興味あるＧ−蛋白質アミノ酸 をコードする核酸分節を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅することを含む。潜 在的な癌遺伝子性点突然変異を含むと予想される各核酸分節について、一対のオ リゴヌクレオチドプライマがポリメラーゼ連鎖反応における増幅のために与えら れる。該プライマは、野生型または突然変異核酸分節を増幅するであろう。Ｇ− 蛋白質をコードする遺伝子は、正常ツマトロピン状態における原生−癌遺伝子で あり、野生型と称されている。

点突然変異が存在する場合に、該遺伝子は推定される癌遺伝子である。しかして 、本願の方法、プライマおよびプローブは、当業者がこれらの２種類の型のＧ− 蛋白質遺伝子を区別することを可能とする。

以下に例示される発明の実施態様において、点突然変異がオリゴヌクレオチドプ ローブにより検出される。Ｇ−蛋白質をコードする核酸中の癌遺伝子的点突然変 異を検出するために、該プローブは、野生型核酸配列またはＧｓａの配列中のア ミノ酸４９．２０１および２２７に対応するコドン中の単一ヌクレオチドの変化 を含んでいる。２２６位のアミノ酸も同様に興味あるものであろう。

これらの単一のヌクレオチド変化は、遺伝子の翻訳生成物に影響を与える。当然 のことながら、ある種の試料においては、変異生成した癌遺伝子が存在しないで あろう。

このような試料では、野生型プローブのみが試料とハイブリッド形成する。かく して点突然変異が検出されない場合には、野生型プローブが試料中の増幅生成物 の存在を証明する機能をもつ。

Ｇ−蛋白質αサブユニットは、高い相同性を共有している。Ｍａｔｓｕｏｋａら は、１９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：　５３８４−５３８８ｉ：：おいて数種類のＧαサ ブユニットのアミノ酸配列の比較を与えている。

Ｇαサブユニットは、長さにおいて変化しているが、発表されているアミノ酸配 列の間の相同性の程度は、配列の整列が可能である程度に充分に高いものである 。このようにして、ＧＳ（Ｚ　ＧＩＹ４９、ＧＳ（Ｚ　Ａｒｇ２０１゜Ｇｓａ　 Ｇ１ｎ２２７およびＧｓａ　Ｇ１ｎ２２７に対応するアミノ酸が、すべてのＧα サブユニットについて決定され得る。例えば、Ｇｉα２において、Ａｒｇ１７９ およびＧ１ｎ２０５は、ＧｓａのＡｒｇ２０１およびＧ１ｎ２２７に対応する。

本発明は、ｒａｓ蛋白質をコードする核酸における点突然変異を検出するプロー ブも提供する。このようなプローブは、ｐ２１の１２．１３および６１位のアミ ノ酸をコードするコドンに対する野生型配列に加え、単一の塩基変化を含んでい る。

下記の例は、試料中に含まれる該酸配列の点突然変異の存在を検出する方法を記 述している。例えば、試験されるべき配列は、野生型プローブならびに各プロー ブが特定の位置に点突然変異を含むプローブのプールを使用してハイブリダイゼ ーションによりアッセイされ得る。

別法として、該方法は点突然変異の検出および分類に使用され得る。この場合、 プローブ類は一方が野生型配列を含み、他方が特定の部位において翻訳生成物に 影響を与える点突然変異を含むものが個々に使用される。この方法によれば、試 料核酸中に含まれる正確な核酸配列を含むプローブのみが、試料中の核酸とハイ ブリッド形成する。

当業者は、開示される方法およびプローブが、新たな癌遺伝子の検出および分類 を可能とすることを認識するであろう。これらの方法は、例えばＧｉα２をコー ドする遺伝子が原生−癌遺伝子であること等の発見を導いた。

本発明は、癌を生じるであろう新たな点突然変異の発見を導いた。加つるに、本 発明はＧｉα１．Ｇｉα３、ＧＯαおよびＧｚαをコードする遺伝子において、 癌遺伝子性点突然変異を、それが存在する場合に同定するために使用し得るプラ イマ類およびプローブ類を提供する。

同様にこれらの方法は、Ｇｔα、Ｇｋα、およびＧｏｌｆα等の他のＧ−蛋白質 αサブユニットにおける新たな癌遺伝子性点突然変異を同定するためのプライマ 類およびプローブ類を設計するために使用され得る。これらの点突然変異は、充 分に発癌と関連付けられ、それらの同定は発癌における実験的研究のための重要 な基礎となるであろう。発癌性とは別に、これらの点突然変異は、個体間の識別 に存用である。核酸配列間の差異に基づく個体間の識別は、例えば法医学におい て使用される。

Ｇ−蛋白質に関する開示される例は、ＧｓａおよびＧｉ２αをコードする核酸に おける点突然変異を検出し、分類するための方法、プライマ類およびプローブ類 を提供する。これらの方法は、Ｇ−蛋白質αサブユニットをコードする任意の核 酸において、存在する場合に点突然変異を検出し、これらの変異を分類するため にも好適である。表１−４は、Ｇｓａ、Ｇｉα１１Ｇｔａ２、Ｇｉα３、Ｇｏα およびＧｚαをコードする核酸における点突然変異を検出し、分類するために好 適なプライマ類およびプローブ類を与える。これらの方法は、他のＧαサブユニ ット、例えばＧｔα、ＧｋまたはＧ　ｏｆｆ等の点突然変異の検出に直接に適用 可能である。表４は、Ｇｓαサブユニットにおけるコドン４９．２０１および２ ２９に対応するプローブを提供する。

癌遺伝子または原生−癌遺伝子中の点突然変異を検出および分類するための好ま しい方法において、興味ある領域を含む核酸は、検出に先立ってポリメラーゼ連 鎖反応により増幅される。これらの方法に有用なプライマは、活性化された原生 −癌遺伝子に加えて原生−癌遺伝子の増幅に好適である。当業者は、開示される 方法、プライマ類およびプローブ類によって新たな癌遺伝子が容易に検出され得 ることを認識するであろう。例えば本発明のプライマおよびプローブは、新たな 点突然変異、しかして新たな推定上の癌遺伝子Ｇｉα２の発見を導いた。Ｇｉα ！、Ｇｉα３、ＧｏαおよびＧｚαをコードする新規な癌遺伝子も、ここに提供 される方法および組成物によって発見されるであろう。本発明で使用されるプラ イマ類は、ＰＣＲ反応において該プライマがＧ−蛋白質ＤＮＡの特定領域を増幅 するように、ゲノムＤＮＡの部分にハイブリッド形成する。増幅される特定の領 域は、Ｇｓａ中のＧｌｙ４９、Ａｒｇ２０１またはＧ１ｎ２２７に対応する少な くとも１個のコドンを含む。

本発明の一実施態様において、プライマは得られる増幅断片がコドン２０１およ び２２７の両者（または対応するＧｔα２の１７９および２０５）を含むように 選択される。しかしながら、このことは本発明において本質的なことではない。

例えば、ゲノムＤＮＡにおいてこれらのコドンの間に大型のイントロンまたは１ 個以上のイントロンが存在する場合、あるいはある種のパラフィン埋設組織のよ うにＤＮＡが分解されている場合には、増幅プライマはコドン２０１を含む領域 について設計され、かつコドン２２７を含む領域について別個に設計される。

このような増幅反応は、別々に操作されるか、あるいは１個の反応容器中で同時 に行なわれる。

増幅は、試料中に存在するＤＮＡの分散的領域を増幅するであろうプライマ対の 使用を必要とする。これらのプライマ対はオリゴヌクレオチド対である。次いで これらのプライマから生成されるＰＣＲ生成物が、配列特異的なプローブとのハ イブリダイゼーションにより分析される。配列特異的プローブは、対立遺伝子特 異的プローブであってもよい。対立遺伝子特異的プローブ（ＡＳＯ）は、試料中 の核酸の対立遺伝子特異的配列にハイブリッド形成する。対立遺伝子特異的配列 は、個体の遺伝子型の成分である。配列特異的プローブは、対立遺伝子として存 在してもしなくてもよい特異的配列を含む。かくして、配列が少なくとも一個体 について同定されるまでは、配列特異的なプローブは対立遺伝子特異的である必 要はない。しかしながら、対立遺伝子特異的プローブなる用語が当業者に使用さ れているように、これらの用語はここにおいて交換可能に使用される。

ＰＣＲによるＤＮＡの増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号および４．６８ ３．２０２号（共にここに参考として組入れる）に開示されている。熱安定性酵 素を用いたＰＣＲによる核酸の増幅および検出方法は、ここに参考として組入れ る米国特許第４．９６５．１８８号に開示されている。ＤＮＡのＰＣＲ増幅は、 ＤＮＡの加熱−変性、増幅すべきＤＮＡ分節の側部を決定する２個のオリゴヌク レオチドプライマの配列へのアニール化、およびアニール化プライマのＤＮＡポ リメラーゼによる伸長の反復サイクルを含む。該プライマ類は、標的配列の逆の 鎖に対してハイブリッド形成し、ポリメラーゼによるＤＮＡ合成がプライマ類間 の領域にわたって進行してＤＮＡ分節の量を効果的に倍化するように配向する。

更に、伸長生成物がプライマ類に対して相補的で結合可能であるため、引続く各 サイクルは先行するサイクルで合成されたＤＮＡの量を本質的に２倍にする。こ のことは、特異的標的断片の、ｎをサイクル数としてサイクルあたり約２ｎの速 度で指数的蓄積を生じる。

開示される実施態様において、発明の本質的側面ではないが、Ｔａｑ　ＤＮＡポ リメラーゼが好ましい。熱安定性ポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼは、高 温で活性である。Ｔａｑの調製方法は、米国特許第４，８８９．８１８号に開示 されており、これをここに参考として組入れる。

ＰＣＲにて使用するプライマ類の選択は、増幅反応の特異性を決定する。本発明 において、プライマ類は試料中のＧ−蛋白質またはｒａｓ　ｐ　２１配列を増幅 するであろうものとして使用される。本発明のプライマ類は、縮重プライマを含 んでもよい。これらは、合成の間に選択された位置に組込まれた数種のヌクレオ チドのいずれの１種を有して合成されたオリゴヌクレオチドの混合物である。例 えば、プライマ類は、試料中に存在する任意のｒａｓＤＮＡのＤＮＡ配列を増幅 するためには全ての型のｒａｓ遺伝子に対して充分に相補的であろう。この型の 例示的プライマは、例えば“汎”　ｒａｓプライマ（ｐａｎ　ｒａｓｐｒｉｍｅ ｒｓ　）と称される。該プライマは、任意のｒａｓ　ｐ２１遺伝子：　ｃ　−Ｎ −ｒａｓ　、　ｃ−Ｈａ−ｒａｓまたはｃ−Ｋｉ−ｒａｓに特異的な配列を含む ＤＮＡ％ｃＤＮＡまたはＲＮＡの領域を増幅するために設計される。該“汎”ｒ ａｓプライマは、大型のイントロン配列にわたっているため、ｃＤＮＡおよびＲ ＮＡテンプレートが好ましい。従ってために使用され得る。

別法として、検出されるべき各遺伝子に特異的なプライマ対を使用することが望 ましい。このようなプライマ対は、例えばｃ−Ｋｉ　−ｒａｓ　、　ｃ　−Ｎ− ｒａｓ　１ｃｍＨａ−ｒａｓ　ＳＧ　ｉａ　１．　Ｇ　ｉａ２、Ｇｉａ３、Ｇｓ ａ、Ｇ。

αまたはＧｚα等をコードする特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ分節を増幅するであろ う。一実施態様において、ｒａｓプライマの３種の別個の対が、ｃ　−Ｎ−ｒａ ｓ　、　ｃ−Ｋ　ｉ−ｒａｓまたはｃ−Ｈａ−ｒａｓのいずれかを特異的に増幅 するように一つのＰＣＲ反応中に含められる。プライマ対は、各ＰＣＲ生成物が 離散的な大きさをもつように設計される。かくして、３種類のプライマ対は、数 種のＤＮＡまたはＲＮＡ分節を同時に増幅するために使用される。次いで、増幅 される分節の同定は、例えばゲル電気泳動および大きさ決定により行なわれ得る 。点突然変異の存在およびこのような変異の分類は、提供される方法によって引 続いて行なわれ得る。

１種以上の核酸分節が特徴付けられる場合、得られる増幅生成物が異なる大きさ であるようにプライマを設計することは、本質的なことではない。異なるプライ マ対を使用する増幅反応は、互いに独立して操作され、例えば１つのアクリルア ミドゲル上の別個のレーンを使用して同時に分析され得る。別法として、数種の プライマ対を１つの反応中で同時に使用し、そして増幅生成物を分割し、例えば 別々のプローブハイブリダイゼーションによって試料の特徴付けのための分析を 行ない得る。

本発明の別の実施態様において、入れ千成プライマＣｎｅｓｔｅｄ　ｐｒｊｎ＋ ｅｒｓ）が使用される（ここに参考として組入れるＭｕｌｌｉＳらの、１９８６ 、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｌｎｇ　ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｑｕａ ｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５　１　：　２　６　３　参照）。この 方法は、試料中の核酸の量が、例えば記録保管のパラフィン埋設試料が使用され る場合等、極めて限定されている際に好ましいであろう。入れ千成プライマが使 用される場合には、核酸は、最初に外側のプライマの組を用いて増幅される。こ の増幅反応物は、引続いて内側のプライマの組を用いた第２回目の増幅サイクル が行なわれる。

一旦、試料をＰＣＲに好適な条件下でプライマ対により処理した後、本発明の方 法は、好ましい実施態様において、増幅生成物の特徴付けを必要とする。本発明 の実施に本質的ではないが、増幅の生起を検出することが好ましい。ＰＣＲに対 する試料の適格性を確認するための内部増幅対照の使用は、本発明の範囲内にあ り、偽陰性の結果と思われるものを減少させる。増幅の生起の検出方法には種々 の方法がある。反応混合物の一部分がゲル電気泳動にかけられ、得られたゲルが エチジウムブロマイドで染色され、紫外線の照射を受けて期待される大きさの生 成物が存在するか否かが観察される。標識されたプライマ類またはデオキシリボ ヌクレオチド５′−トリホスフェートを、ＰＣＲ反応混合物に添加することがで き、増幅ＤＮＡへの標識の取込みが、増幅の生起を決定するために測定され得る 。増幅生起の決定のための別の方法は、ＰＣＲ反応混合物の一部について、増幅 ＤＮＡに対してのみハイブリッド形成するように設計された標識オリゴヌクレオ チドプローブまたはプローブ混合物とハイブリッド形成可能であるか否かを試験 することである。別法として、増幅の測定および点突然変異の特徴付けは、ＰＣ Ｒ反応混合物の一部を１種以上の特異的プローブとハイブリッド形成可能である か試験することによるｌ工程によって実施され得る。

ＰＣＲ工程によって、膨大な増幅が可能であることから、高ＤＮＡ水準の試料、 正対照のテンプレートまたは先行する増幅試料からの少量のＤＮＡの持越しは、 合目的的に添加されるテンプレートＤＮＡが存在しない場合であってもＰＣＲ生 成物を生じ得る。可能であれば、すべての反応混合物は、ＰＣＲ生成物の分析お よび試料調製から隔離された領域で準備される。ＲＮＡ／ＤＮＡ調製、反応物の 混合および試料の分析のために専用の、または使い捨ての容器、溶液およびピペ ット（好ましくは正の置換ピペット）を使用することによって交差的夾雑が最小 化されるであろう。ここに参考として組込れるＨｉｇｕｃｈｉおよびＫｗｏｋ、 １９８９、Ｎａｔｕｒｅ、　３３９　：　２３７−２３８ならびにＫｗｏｋおよ び叶ｒｅｇｏの、Ｉｎｎ１ｓ　ら纒、１９９０、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　： 　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＳ Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｓ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　、　ＣＡも 参照。

核酸増幅の交差的夾雑の影響を最小化する特定の方法が、ここに参考として組入 れる１９９０年１１月２日出願の米国特許出願第６０９，１５７号に記述されて いる。

この方法は、ｄＵＴＰ等の非慣用のヌクレオチド塩基の増幅生成物への導入、お よび生成りＮＡを続く増幅のためのテンプレートとして機能し得ないようにする 持越し生成物の酵素的および／または物理的−化学的処理を含む。例えば、ウラ シル−ＤＮＡグリコシラーゼは、この塩基を含むＰＣＲ生成物からウラシル残基 を除去するであろう。この酵素処理は、夾雑する持越ＰＣＲ生成物の分解を起こ し、増幅反応物を「殺菌」する作用をする。

本発明は、多くの未知の、または特徴付けられていない癌遺伝子の発見を導いた し、また導き続けるであろう。

例えば、本発明の方法、プライマおよびプローブを使用して、試験した４種類の 臨床的試料が、２種類の異なるＧｉα２癌遺伝子を含むことが発見された。これ らの新規な癌遺伝子は、これらを野生型と区別するものが点突然変異であること 、およびこれらの遺伝子配列に特異的な様式でハイブリッド形成するプローブと して、本発明の重要な一側面である。

一実施し！！様において、本発明は潜在的癌遺伝子の検出および特徴付けに使用 するための多くのプローブを提供する。ここで例示される特定のプライマおよび プローブは、限定された個数のヌクレオチド残基を育しているが、当業者は、典 型的には本発明方法におけるプライマまたはプローブの適切さに大きな影響を与 えることなく所定のプライマまたはプローブについて１個以上のヌクレオチド残 基を付加し、あるいは除去することができることを認識するであろう。これらの プローブの基本的な側面は、野生型および変異型配列の閏を識ｆｆ１Ｊするそれ らの能力である。ＰＣＲ反応混合物の一部分が、プローブにハイブリッド形成す るＤＮＡを含有する場合、該試料は、プローブの特異的配列に従って、野生型ま たは変異型配列を含むＤＮＡを含有している。

本発明の重要な側面は、本方法で使用するために提供される新規プローブの検出 に関連する。プローブが試料中に含まれるＤＮＡ配列にハイブリッドしたか否か を決定するには多くの方法がある。典型的には、プローブは、検出可能な様式で 標識され、標的ＤＮＡ　（すなわちＰＣＲ反応緩衝溶液中の増幅ＤＮＡ）が固体 担体に固定され、そしてハイブリダイゼーションの生起の測定は、単に該固体担 体上に標識が存在するか否かの測定を含む。しかしながら、この方法は変更する ことができ、標的を標識し、プローブを固体担体に固定した場合にも同様に機能 する。

ここにおいて開示されるハイブリダイゼーションプローブは、特徴付けすべき各 Ｇ−蛋白質αサブユニットコドンのための配列特異的なオリゴヌクレオチドプロ ーブである。上述したように、配列特異的プローブは、使用および用途において 対立遺伝子−特異性プローブと同様である。ＡＳＯの使用方法は、ここに参考と して組入れる５ａｉｋｉ　らの１９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２４　：　１６３− １６６に記述されている。該プローブ類は、例えば野生型配列検出のために個別 に使用してもよい。別法として、該プローブ類を腫瘍遺伝子型の特徴付けのため にパネル形式で使用することもできる。腫瘍遺伝子室は、例えば体組織または他 の腫瘍型と比較することができる。

該プローブ類は、種々の異なるハイブリダイゼーション形式で使用することがで きる。核酸プローブの相補的標的配列に対する溶液ハイブリダイゼーションは、 明らかに本発明の範囲内であるが、本発明の商業的実施では固定化プローブの使 用、しかして準“固相”ハイブリダイゼーションの使用もあり得る。この形式で は、プローブは固体担体に共有的に結合され、標的配列が該プローブにハイブリ ッド形成する。プローブ類の固体担体上への固定化の好ましい方法は、ここに参 考として組入れる１９８９年５月４日出願の米国特許出願番号第３４７，４９５ 号に開示されている。この方法によれば、配列特異的プローブは、ハイブリッド 形成配列が合成された後の自動化合成装置でのプローブ合成の間に付加される長 く伸びたＴＪ！Ｊ基を介して固体担体に結合される。

例えば、固定化プローブ形式においては、Ｇｓαをコードする遺伝子の２０１お よび２２７位のアミノ酸の点突然変異を検出するために、以下のプローブが有用 である。

表　１ ＪＰＬ３１６５’ＴＣＧＣＴＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＣ２０１ＪＦＬ３１７ ５’ＴＣＧＣＴＧＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＣＴ　２０１ＪＦＬ３１８５°ＴＣ ＧＣＴＧＣＧＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＣ２０１ＪＦＬ３１９５’ＴＣＧＣＴＧＣＴ ＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＣＴ　２０１ＪＦＬ３２０５’ＴＣＧＣＴＧＣＣＡＴＧＴ ＣＣＴＧＧＡＣＴ　２０１ＪＦＬ３２１　５’ＴＣＧＣＴＧＣＣＴＴＧＴＣＴＴ ＧＧＡＣＴ　２０１ＪＦＬ３２２　５’ＴＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＡＴ ＧＡ　２２７ＪＦＬ３２３　５’ＴＧＧＧＴＧＧＣＣＴＧＣＧＣＧＡＴＧＡ　２ ２７ＪＦＬ３２４５°ＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＧＣＧＣＧＡＴＧ　２２７ＪＦＬ３ ２５５’ＴＧＧＧＴＧＧＣＣＧＧＣＧＣＧＡＴＧ　２２７ＪＦＬ３２６５’ＴＧ ＧＧＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＡＴＧＡ　２２７ＪＦＬ３２７５’ＴＧＧＧＴＧＧ ＣＴＡＧＣＧＣＧＡＴＧＡ　２２７ＪＦＬ３２８５’ＴＧＧＧＴＧＧＣＣＡＴＣ ＧＣＧＡＴＧＡ　２２７ＪＦＬ３２９５’ＴＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＧＣＧＡＴ ＧＡ　２２７ＪＦＬ３３０５’ＴＧＧＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＣＧＡＴＧ　２２７ 固定化プロ一ブ形式は、他のｇＳｐ突然変異を検出するためにも好適であり、ま た例５においてｒａｓ遺伝子ＰＣＲ生成物の点突然変異の検出について例示され ている。

プローブまたは標的のいずれであっても、多くの核酸の標識方法がこの分野で知 られており、本発明の目的に好適である。以下に例示される一実施態様において 、プローブは放射標識ＡＴＰの存在下にポリヌクレオチドキナーゼで処理するこ とにより、放射性リンｓｔｐにより標識される。しかしながら、西洋ワサビパー オキシダーゼ−アビジン−ビオチン系等の他の非放射性標識系が好ましいであろ う。西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、そのジアミノベンジジンを青色 色素に変換する能力によって検出可能である。ＨＲＰに基づく検出のための好ま しい方法は、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｆｆｌ、３３　：１３６８　（１９８７）に記 述されているように、テトラメチル−ベンジジン（ＴＭＢ）を使用する。検出系 の別法は、Ａｍｅｒｓｈａｍから商業的に入手可能な増強化学発光（ＥＣＬ）検 出キットである。このキットは、製造者の指示書に従って使用される。その他の 種々の染料および発色剤ならびに対応する標識が、核酸検出系のために利用可能 である（１９８７年１２月１８日出願の米国特許出願第１３６．１６６号参照） 。

他の非放射性検出の別法は、ターミナルトランスフェラーゼ（Ｔ　ｄｉ）および ビオチン化ｄＵＴＰを、オリゴヌクレオチドプローブにホモポリマーチイルを付 加するために使用する。ビオチンは、検出可能な残基として機能する。プローブ のハイブリダイゼーシヨンに続いて、フィルタが常法にて洗浄される。ハイブリ ッド形成したビオチンは、製造者の指示書に従って、ストレブーアビジン（ｓｔ ｒｅｐ−ａｖｉｄｉｎ）接合ＨＲＰ　（Ｃｅｔｕｓから入手可能な５ｅ−ｅｑｅ ｎｃｅ　＠　）を用いて検出される。次いで、ＥＣＬ系がビオチン−ＨＲＰ生成 物を可視化するために使用される。

プローブは、典型的には、これを放射標識ＡＴＰの存在下にポリヌクレオチドキ ナーゼで処理することにより放射性リンｚｔｐにより標識される。しかしながら 、商業的目的のためには、西洋ワサビパーオキシダーゼ−アビジン−ビオチンま たはアルカリホスファーターゼ検出系等の非放射性標識系が好ましいであろう。

ＨＲＰは、多くの方法で使用され得る。例えば、ＰＣＲ増幅で使用されるプライ マまたは１種以上のｄＮＴＰが、プローブに代えて標識される場合（例えばＬＯ らの１９８８、Ｎｕｃ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ｌ　８　：　８７１９に記述されているビオチン化ｄＵＴ Ｐ誘導体）、ハイブリダイゼーションは、標識ＰＣＲ生成物の存在についてのア ッセイによって検出され得る。好適な実施態様において、プローブがビオチン化 され、上述したＥＣＬ系を用いて検出される。例えば、ビオチン化プローブは、 ＰＣＨの間のビオチン−ｄＵＴＰの取込みではなくして、オリゴヌクレオチドの 直接的ビオチン化により調製される。オリゴヌクレオチドの５′ビオチン化のた めに、ホスホラミダイトを含むビオチンを使用する直接固相合成法が、Ａｌｖｅ ｓらの１９８９、任意の内部的または末端（５′または３′）位置のビオチン化 オリゴヌクレオチドの固相合或は、同様にビオチン化プライマおよびプローブの 調製のために好適である（Ｐｉｅｌｅｓら、■９８９、ＮＡＩ？　１８　：　４ ３５５、およびＭｉｓｉｕｒａら、１９８９、ＮＡＲ１８：４３４５）、別法と して、プローブおよびプライマは、例えばＷｏ　８９／２９３２およびＢｅａｕ ｃａｇｅらの１９８１　、　Ｔｅｔｒａ、　Ｌｅｔｔ。

２２：１８５９−１８６２に開示された方法によってＨＲＰに接合される。これ らの文献をここに参考として組入れる。

当業者は、上の記述によって、新規なＧ−蛋白質点突然変異を増幅し、検出し、 および特徴付けるためのプライマおよびプローブが容易に得られることを認識す るであろう。また、同様に当業者には、例において得られる特定のプライマおよ びプローブが、発明の単なる例示にすぎないことは明らかであろう。本発明のプ ライマおよびプローブは、ここで特定的に例示されるもの以外のＧ−蛋白質配列 の領域中の配列変化、例えばＧｓα４９に対応するコドンを増幅し、検出するた めに調製されてもよい。

本発明の方法は、ＧＴＰ結合蛋白質をコードする遺伝子、またはこの遺伝子の発 現生成物の点突然変異を検出するために適用され得る。しかして、この方法は、 ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは両者を含む試料中の特定の点突然変異を検出し得 る。試料が、ＲＮＡを含む場合には、該核酸は増幅に先行して逆転写され、二ｔ ＭＩＤＮＡテンプレートが与えられる。ＲＮＡの逆転写方法は公知である（Ｍａ ｎｉａｔｉＳら、１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　ＡＬａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 、　ＮＹ参照）。

一実施態様において、該方法はＲＮＡ中の点突然変異の検出に使用される。

別法として、ＲＮＡが富有である場合に、プローブ（またはプローブ配列の相補 体）は、試料中、あるいは逆転写ｃＤＮＡ生成物中に存在すると予想される癌遺 伝子または原生−癌遺伝子の直接的検出および特徴付けに適している。同様に、 例えば新鮮組織試料のようにＤＮＡが富有である場合には、該プローブは遺伝子 配列の直接検出に育用である。かくして、ＰＣＲによる増幅は、本発明の本質的 な要素ではない。

記述される方法による分析のために好適な試料は、新鮮なものであっても、また 記録保管的であってもよい。

新鮮試料は、例えば腫瘍の生検試料、組織試料または血液であってよい。記録保 管的試料は、例えば冷凍またはパラフィン埋設であってもよい。本発明の一実施 態様において、パラフィン埋設試料がＧ−蛋白質プライマおよびプローブを用い て分析される。別の実施態様において、外科的生検試料または培養細胞から精製 されたＲＮＡにおけるｒａｓ遺伝子検出のための方法が与えられる。またＲＮＡ を空気乾燥骨髄側部およびアルコール固定、パラフィン埋設組織から抽出するた めの方法が与えられる。

完全なりＮＡを含むパラフィン埋設組織について、表２は、Ｇｉｓ　、Ｇｉｚ　 、Ｇｓα、Ｇ　ｔ　Ｉ　、Ｇ　ｔおよびＧ０中の潜在的癌遺伝子部位を増幅のた めのプライマおよび条件を与える。

ある場合には、ＤＮＡ試料は充分に良く保存されておらず、従って長い分節の増 幅は問題を含む。例１は、ｇｓｐの癌遺伝子性領域を含むＤＮＡの短い分節を増 幅するためのプライマを記述している。

かくして本発明は、ゲノム（ＤＮＡ）水準で活性化癌遺伝子を検出する方法を提 供する。この方法は、原生−癌遺伝子および癌遺伝子の発現の監視にも好適であ る。

癌遺伝子の発現の水準は、例えば化学療法的処置の間およびそれに続いて監視さ れ得る。癌の小康および再発も監視され得る。遺伝子水準において、原生−癌遺 伝子の癌遺伝子への活性化を、ｍＲＮＡの水準における活性化癌遺伝子の発現と 比較することは、発癌および治療の分析について重要な情報を与える。これらの 方法は、特定の悪性疾患へのかかり易さに関する情報も与えるであろう。

本発明は、発癌の分析に有用かつ必要な道具を提供する。プローブは、特定の癌 遺伝子について対立遺伝子的優勢を決定するために提供される。例えば、Ｇｉα ２対立遺伝子に特異的なプローブは、腫瘍細胞に加え体細胞の分析にも使用され 得る。これらのプローブは、ある腫瘍が、１つの変異と１つの野生型対立遺伝子 とを含む場合に、これらの対立遺伝子のｍＲＮＡ生成物の相対的富育性を識別す ることができる。当業者は、変異生成に関する研究の後、および研究に際して、 このような分析の有用性を認識するであろう。

別の側面において、記述されるプライマおよびプローブは、細胞の表現型決定の 方法を提供する。該細胞は、腫瘍細胞あるいは体細胞であってよい。本発明方法 を用いた分析は、細胞の原生−癌遺伝子および癌遺伝子の様相に関する情報を提 供する。この方法において、例えば１種以上のＧ−蛋白質点突然変異の存在に関 連する事象を識別し、これは従来検出不可能であった。

これらの方法は、特定の悪性疾患を特定の癌遺伝子または点突然変異に関連付け る方法を提供する。例えば、３０６個の試料がＧｓαについて１５種の腫瘍型に 関して試験され、１８個の点突然変異が検出され、１８のＧＳα癌遺伝子のすべ てが下垂体腺腫および甲状腺腫瘍で検出された。Ｏｆα２プライマおよびプロー ブを使用する別の例においては、１４種の異なる腫瘍型を代表する２５４個の試 料が分析された。２つの型の４個の腫瘍がＧｉα２癌遺伝子を存し、１個は卵巣 類粒層腫瘍、また３個は副腎皮質腫瘍であった。該方法およびプローブを使用す る分析は、Ｇ−蛋白質αサブユニットをコードする原生−癌遺伝子が内分泌腺腫 瘍において活性化されているという発見を導いた。これらの研究は、Ｇｓαおよ びＧｉα２癌遺伝子の分布が特定の内分泌系の標的細胞に限定されていることを 示唆している。

Ｇ−蛋白質癌遺伝子および腫瘍特異性の分析は、未だ特定されていないＧ−蛋白 質の役割を決定する際に有用な情報を提供する。例えば、データは、Ｇｓ、アデ ニリルシクラーゼおよびｃＡＭＰを介したコルチゾール分泌を刺激するコルチコ トロピン（Ａ　ＣＴ　Ｈ）か、ＡＣＴＨ標的細胞の増殖の刺激にＧｓおよびｃＡ ＭＰを使用しないことを示唆している。副腎皮質細胞（ＡＣＴＨの標的細胞）か ら誘導される腫瘍は、Ｇｓα癌遺伝子を保有していない。当業者は、本発明の方 法が、Ｇｉα２（別法としてここでｇｉｐ　２と称される）等の新たな癌遺伝子 を同定し、また内分泌標的細胞の増殖制御を媒介する信号伝達経路の多様な混合 を調査するための基本的な道具を提供することを認識するであろう。

また、本発明は、従来知られていなかった多（の点突然変異を提供する。これら の配列は、対応する変異蛋白質をコードし、新規な変異蛋白質の合成に使用され 得る。

このような蛋白質、または蛋白質のサブユニットもしくは部分配列は、変異Ｇ− 蛋白質の検出に有用な抗体類の生成に使用され得る。これらの抗体類は、例えば 変異Ｇ−蛋白質を検出するための生検組織をスクリーニングするために重要な道 具を提供し、しかして個体の遺伝子的構成または試料組織の発癌状態に関する重 要な情報を与える。

変異Ｇ−蛋白質は、発癌が他の事象により引金を引かれない限り、インビボにお いて正常Ｇ−蛋白質に支配されている。かくして、本発明により可能となる抗体 は、例えば潜在的癌遺伝子性複合物の指示薬として移植組織のスクリーニングに おいて用途が見出される。

当業者には、本発明の方法か、試料中の１種以上の核酸の定量のためのキットと して商業化されることを許容することは明らかであろう。例えば、その最も単純 な実施態様において、そのようなキットは、Ｇ−蛋白質αサブユニット分節の増 幅のためのオリゴヌクレオチドプライマ対および対応する野生型オリゴヌクレオ チドプローブを提供する。別の実施態様において、キットは、固体担体上に固定 されたＧ−蛋白質プローブの列、およびＧ−蛋白質サブユニットをコードする遺 伝子の癌遺伝子性点突然変異を増幅し、検出するための対応するプライマ対を含 んでよい。別の実施態様において、キットはオリゴヌクレオチドプライマ対、対 応するＧ−蛋白質αサブユニットの野生型および変異型プローブ、ＤＮＡポリメ ラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレオチドトリホスフェート、制 限酵素、ならびに緩衝溶液を、ｃＤＮＡ合成、制限酵素消化およびＰＣＲによる 増幅を行なうために含んでもよい。更に該キットは、例えばＴｈｅｒｍｕｓ　ａ ｑｕａｔｉｃｕｓから単離される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＴａｑ等の熱安定 性ＤＮＡポリメラーゼを重合試薬として含んでもよい。

本発明の理解を進めるために、以下に簡単な定義を示す。

「原生−癌遺伝子」は、アミノ酸配列に影響を与える点突然変異が、発癌または 腫瘍発生効果を有する蛋白質をコードする野生型の遺伝子を指す。

［癌遺伝子」は、点突然変異を含み、コードする蛋白質が発癌性または腫瘍発生 効果を有する原生−癌遺伝子を意味する。癌遺伝子は、ここにおいては別に［活 性化原生−癌遺伝子Ｊとも称される。

「Ｇ−蛋白質αサブユニットプライマＪは、Ｇ−蛋白質αサブユニットをコード する核酸の相補鎖に）１イブリツドし、ＰＣＲ反応において点突然変異を保育す ると考えられる１個以上のコドンを含む核酸分節を増幅するために機能するプラ イマ対を意味する。開示される実施態様において、これらのコドンはＧｓαのア ミノ酸４９．２０１および２２７位に対応するアミノ酸をコードする。

しかしながら当業者は、潜在的癌遺伝子性点突然変異は、他の位置にも存在し得 ることを認識するであろう。Ｇ−蛋白質αサブユニットプライマは、ここに記述 される方法に従って、このような領域を増幅するように容易に設計され得る。

ここで使用される「Ｇ−蛋白質αサブユニットプローブ」、「Ｇ−蛋白質プロー ブ」または「プローブ」は、点突然変異を含むと予想される位置のアミノ酸をコ ードする核酸配列を特徴付けるように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを 指す。本発明の好ましい実施態様において、個々のプローブは、特定のコドン内 に野生型核酸配列または点突然変異を含む核酸を含んでなる。特定のコドンは、 非天然型配列により置換された場合にＧ−蛋白質癌遺伝子を生じるＧ−蛋白質を コードする核酸中の任意のコドンを含む。この例においては、該特定のコドンは 、各Ｇ−蛋白質αサブユニットについて、ＧＯαアミノ酸の４９．１０２および ２２７位に対応するアミノ酸をコードするコドンを含む。

任意の特定のコドンおよび特定のＧ−蛋白質について、１種類の野生型プローブ および９種類の点突然変異プローブが設計され、本発明方法で使用される。しか しながら、プローブがこれらの方法の実施についてのみ含まれることは、発明の 本質的な面ではない。実際、唯１種類のプローブの使用が、２つの個体間の識別 、または点突然変異の存在の有無の識別のために充分であろう。

以下の例は、本発明の例示を与えるものである。それらは、本発明の範囲を限定 するものではない。当業者は、開示されるプライマおよびプローブが、例えばオ リゴヌクレオチドの長さを変更することにより、記述される発明の目的および効 果を変えることなく修飾可能であることを認識するであろう。

ヒト下垂体腫瘍試料は、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｗｉｌｓｏｎ　（カリフ中ルニア大学 、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　）から供給され、Ａｎｎａ　Ｓｐａｄａ（Ｍｉ ｌａｎ、　Ｉｔａｌｙ）は、生化学的に特徴付けられた下垂体試料を提供した。

付加的な試料は、オーストリア、［ｎｎ５ｂｒｕｃｈ大学のＨａｎｓ　Ｆｅｉｃ ｈｔｉｎｇｅｒおよびＫｕｒｔＧｒ’ｉ　ｎｅｗａｉｄ、ならびにサンフランシ スコ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ大学のＣ１ａｕｄｉａ　Ｌａｎｄｉｓ、　Ｇｒｉｆ ｆｉｔｈ　Ｈａｒｓｈ、　Ｑｕａｎ−Ｙａｎｇ　Ｄｕｈおよび０ｒｌｏ　Ｃ１ａ ｒｋにより提供された。

Ｂ、試料の調製 パラフィン埋設組織からゲノムＤＮＡを単離するために、３−５隣接５ｍｍ切片 をパラフィンブロックから切出し、ガラススライド上に載置した（ここに参考と して組入れるＷｒｉｇｈｔらの、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　：　Ａ　Ｇｕｉｄ ｅ　ｔ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、編集Ｍ、　Ｉｎｎ１ｓＳ Ｄ、　Ｇｅ１ｆａｎｄ。

Ｊ、　５ｎｉｎｓｋｙ、およびＴ、　Ｗｈｉｔｅ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、　ＳａｎＤｉｅｇｏ　、　ｐｐｌ　５３−１５８）　、　１ツのスライド は、ヘマトキシリンおよびエオシンにより染色され、他のスライド上の完全に腫 瘍からなる領域を選択するための指標として使用された。カミソリの刃を用いて 、非染色スライドから、過剰なパラフィンおよび不要な組織を除去し、残る腫瘍 組織を滅菌した１、５ｍｌの微量遠心用チューブ中にかき取った。夾雑するパラ フィンを除去するために、５ｍｌのオクタン（無水、Ａｌｄｒｉｃｈ　）または Ｈｏｍｏ−Ｄｅ（Ｆｉｓｃｈｅｒ）を用いて、試料を振とうしつつ室温にて３０ 分間インキュベートした。該組織試料を遠心（５分間、１０１０００Ｘによりペ レット化し、上澄を除去した。

該組織試料を５００ｍ１の無水エタノールで２回抽出して痕跡量のオクタンを除 去し、次いで真空中で乾燥させた。

組織を消化し、ゲノムＤＮＡを放出させるために、試料を１００ｍ１の消化用緩 衝溶液（５０ｍＭ）リス、ｐＨ８，５；１ｍＭ　ＥＤＴＡ；０．５％トウイーン ２０）中で、３７°Ｃにて一夜、０．２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼにで処理し ｔこ。

該試料を遠心して未消化残砕物を除去し、ＤＮＡ含有上澄を９５°Ｃにて８分間 インキュベートして蛋白質分解酵素およびヌクレアーゼを変性させた。

新鮮な冷凍試料を、Ｖｅｒｌａａｎ−ｄｅ　Ｖｒｉｅｓらの１９８６、ＰＣＲ増 幅工程において、特異性および収率を改善するために、入れ子式増幅プライマを 使用した（Ｍｕｌｌｉｓらの前出文献）。ゲノムＤＮＡ（新鮮組織からの１００ −５００ｎＨのＤＮＡまたは、パラフィン埋設組織からの１０ｍ１のＤＮＡ溶液 ）を、最初に３０　ｐｍｏｌの外側プライマ（表１参照）を用いて、１００ｍ１ の０．１ｍＭ　ｄＮＴＰ；５０ｍＭ　Ｋｃｌ；　２０ｍＭ）リス、ＰＨ８，３； 　２．５　ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ：１００ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ；および１．５単位Ｔａ ｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）中で増幅した。増幅 のためにサーモサイクラ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を使用した 。増幅プログラムは：９５℃にて５分間に続いて、３０サイクルを、９５℃にて １分間、５０°Ｃにて２分間、および７２℃にて２分間であった。３０　ｐｍｏ ｌの内側プライマを使用する′！Ｊ２番目の増幅を、２μｌの最初の増幅混合物 を用いて、上記と同じｄＮＴＰおよび緩衝溶液条件で、０．５単位のＴａｑポリ メラーゼにて行なった。２番目の増幅反応のプログラムは、９４℃にて３０秒間 、５７°Ｃにて４０秒問および７２°Ｃにて４５秒間であった。５μｍの最終生 成物を、２％Ｎｕｓｉｅｖｅ　Ｓ１％Ｓｅａｋｅｍアガロースゲル上で大きさ分 けし、エチジウムブロマイド染色により可視化した。５２６塩基対の断片が、Ｇ ｓαについて、また５０４ｂｐ断片がＧｉα２について得られた。

Ｄ、ドツトプロット法 ナイロンフィルタ（Ｐａｌｌ　Ｂｉｏｄｙｎｅ−８，０，４５０１１１１）を水 で簡単にすすぎ、Ｂｉｏ−ＲＡＤのドツトプロット装置上に載置した。各最終増 幅生成物４ｍｌを、０．４　Ｎ　ＮａＯＨおよび２５０１Ｍ　ＥＤＴＡ中で５分 間で変性させ、フィルタ上にスポットした。ＤＮＡを、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅ ｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）セットを用いて自動交差結合機（ａｕｔｏ　ｃｒｏ ｓｓｌｔｎｋ）にてフィルタに交差結合させた。該フィルタを、５Ｘ　５ＳＰＥ および０．５％ＳＤＳ中で５０℃にて３０分間でブレノ）イブリダイズさせた。

該ブレハイブリダイゼーション溶液にＩｎＨの２１ｐ末端標識オリゴヌクレオチ ドを加え、５ツド形成させたフィルタを、２Ｘ　５ＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ 中で室温にて簡単に洗浄し、続いて、３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム、０， ２％ＳＤＳ、および５０ＩＩＩＭトリス、ｐＨｓ、　Ｏ（ＴＭＡＣＩ　）中にて １０分間のインキュベーションを次の温度にて行なった二ＧＳαコドン２０１に ついて６４．５℃；ＧＳαコドン２２７について６７℃：Ｇｉα２コドン１７９ について６１，５℃；Ｇｉα２コドン２０５について６７．５°Ｃ０他のプロー ブを用いた場合にも、ハイブリダイゼーションは上述したと同様に行なわれる。

次いでフィルタをＴＭＡＣＴ中で５８℃にて１０分間洗浄した。洗浄温度は、野 生型および変異体の信号のみが検出されるまで、ｌ″Ｃづつ調節した。

このようにして、適切な洗浄温度が決定される。これらの条件のもとに、選択さ れた温度は、完全に相補的なハイブリッドのみが形成されて残り、フィルタ上に 正のドツトを生じることを可能とする。該フィルタは、１（ｏｄａｋＸ−ＡＲフ ィルムに増感スクリーンを用いて、−７０℃にて２−６時間露光された。異なる オリゴヌクレオチドを用いた引続くハイブリダイゼーションのために、ナイロン フィルタを２Ｘ　５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で５分間煮沸して浄化し、次いで 上述したように処理した。

Ｅ、配列決定 ＰＣＲ生成物の二重鎖配列決定のため、適切な大きさをもった単一バンドを、Ｕ Ｖ光のもとてエチジウムブロマイド染色アガロースゲルから切出した。切出した バンドを、Ｃｏ５ｔａｒ　５ｐａｎ−Ｘ　０．２２　μｍセルロースアセテート フィルタユニット中に入れ、−７０°ＣにてｌＳ分間凍結させ、そしてＥｐｐｅ ｎｄｏｒｆ微量遠心機にて最高回転速度で１５分間回転させた。ＤＮＡ−含有溶 出液を微量遠心チューブに移し、２０μｇのグリコーゲンを添加し、０．２容の ３Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．３容のイソプロパツールを用いてＤＮＡを沈殿さ せた。ＤＮＡを微量遠心機でベレット化し、７０％エタノールで洗浄し、真空下 で乾燥させ、そして２０μｍの２回蒸留水に再懸濁した。該試料を、７．７５μ ｌのＤＮＡ溶液および２．５　Ｐ［ｌｌ０Ｌの配列決定プライマを使用して５ｅ ｑｕｅｎａｓｅ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ）の プロトコールに従って配列決定した。

Ｆ、オリゴヌクレオチド 表３は、癌遺伝子性点突然変異を含む可能性のある核酸分節を増幅するためのプ ライマ対を与える。プライマ配列が、αサブユニットのコード領域内（エクソン ）にある場合には、該プライマ対はＤＮＡまたはｃＤＮＡテンプレートのいずれ を増幅するためにも好適である。Ｇ−蛋白質αサブユニットの核酸配列は、Ｇｉ α（Ｂｒａｙら、ｌ９８７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ　８４　：　５１１５−５１１９参照）　、Ｇ　ｓ　ａ　（Ｋｏｚａｓａ ら、１９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５ 　：　２０８１−２０８５参照）　、　Ｇｏａ　（Ｌａｖｕら、１９８８、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ−ｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、１５０：８１１−８ １５参照）およびＧ　ｚ　ａ　（Ｆｏｎｇら、１９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８５：３０６６−３０７０参照）について文献発表されている。各プラ イマ対について、ゲノムＤＮＡテンプレートからの増幅生成物の大きさを示しで ある。Ｇｉαｌ、Ｇｉａ２、Ｇｉａ３、ＧｏａおよびＧｚａに対する２０１およ び２２７の表記は、Ｇｓαのアミノ酸配列における２０１および２２７位に対応 するアミノ酸をコードするコドンを示していることに注意されたい。

表３ Ｇ−蛋白質点突然変異の検出のための徳用プライマ、旧、７０　５’　ＣＧＣＡ ＧＧ　ＧＧＧ筋川頁用Ａ石Ｃい　イントロンＧｓα２０１乙ツ内側プライマ（５ ２６ｂｐ）ＪＦＬ１３５　５’廁ＡπＭＧいＧ灯弘ＣＴＡＴ口　エクソンＪＦＩ 、１３６　５’　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＧＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡ　ＧＡＴ弘Ｔｘク ソン肌１３５　５’廁ＡπＡＡＧいＧ麿弘ＣＴＡＴ簗　エクソンＪＦＬ１３６　 ５’　ＧＣＴαπα’ｌ：　ＣＡＣＱＡＣＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ｘクソンＪ ＦＬ２２７　５’　ＣＣＣＣＣＣ’ＩＥ　ＡＣＡ　ＧＡ’ＡＴＣＡＣＡ　（’Ｉ Ｔ　イントロンＧｉα１−２０１／２２７ ＪＦＬ２２３　５’″ＴＴＧ　ＧＡＣＡＧＡ　ＡＴＡ　ＧＣＩ’　ＣＡＡ　ＣＣ Ａ　ＡＡＴ　エクソン、Ｒ２２４５’　ＴＡＧ　ＡＡＣいＧ口頁隔匝Ａσ　エク ソンＪＬ５７　５’　π：Ｔ　ＣＡＣＣＡＴ　ＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＴＣ工’） 　”）　ン／イ：／トロンＧｉα２−２０１／２２７内側プライマ（５０４ｂｐ ）几５５　５’　ＡＴｒＧＣＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴｃＣＣＣエクソン 几５６　５’　ＧＧＣＧＣＴ　ＣＡＡ　ＧＧＣＴＡＣＧＣＡ　ＧＡＡ　エクソン 表　３（ｊｒｃき） Ｇｓα３−２０１外側プライマ ＪＦ′Ｌ１０９　５°π’；ｒ　ＣＴＴ　ＴｒＡ　Ｔ［Ｔ　ＡＧＴ　ＡＴＣＭ　 工’）　ラン／イントロンＪＦＩ、１１０　５’ＧＡＴＣＴＧＧＡＴＡＧＡＡＴ ＡＥＣＡＧ　工’）”）ン／イントロンＪＦＩ、１１２　５’ガーＡπ］訂薗Ｔ ＡＣＭＴ　エクソンＪＦＬ１１３　５’η℃（ト）１℃（８）Ａ圓Ａ霜ηＴＳＰ ＩＯ５’ＧＡＧＧＴｆ”（ＴｒＧＭＧＧＡＡ（Ｘα汀　エクソンＳＰ　１１　５ ’　Ｃ１，ＧＡＧ　ＣＡＣ（’ｒＣＧｒＣＡＴＡ　ＧＣＣＧＣＴ　エクソン５Ｐ １５　５°ＡＡＣＧＡＣ（３）弘Ｇ□□□Ａπ煎　エクソン表　４ ＧＴＡ　ＶａＩ ＣＴＴ　Ｌｅｕ ＣＡＴ　Ｈｉｓ ＡＣＡ　Ｔａｒ ＡＴＡ　［１ｅ ＣＡＣＨｉｓ ＧＧＣｃｔｙ ＴＧＣＣｙｓ ＣＡＣＨｊｓ ＣＴＣＬｅｕ ＧＡＧ　Ｇｌｕ ＣＡＴ　Ｈｉ　５ ＣＡＣＨｉｓ ＡＧＴ　５ｅｒ ＧＧＡ　Ｇｌｙ ＡＡＡ　Ｌｙｓ ＧＡＡ　Ｇｌｕ ＡＧＴ　５ｅｒ ＣＴＧ　Ｌｅｕ 特徴付けられるべき各Ｇ−蛋蛋白ココトンついて、オリゴヌクレオチドプローブ が表４に示されている。各位置、すなわちＧｓα２０１について、完全なプロー ブ配列が野生型対立遺伝子に対して示されている。潜在的癌遺伝子性部位におけ る野生型のコドンには下線を付し、翻訳されるアミノ酸を右側に示しである。プ ローブの組が、特徴付けられるべきコドンを除いて野生型と同じ配列について与 えられる。しかして、非野生型プローブについては、そのコドンおよび翻訳され るアミノ酸生成物のみが表中に示されている。野生型のアミノ酸とは異なるアミ ノ酸をコードする点突然変異のみが示されている。

表５は、を髄動物、酵母および変形菌のＧ−蛋白質α鎖において高度に保存的で あるアルギニン−２０１およびグルタミン−２２７の周囲のＧｓα配列の拡がり を示している。文献発表された配列は、ラットのＧｓα、Ｇｉａ２、Ｇｉａ３お よびＧｏａ、ヒトＧ　ｚ　ａ　（ＫａｔａｄａおよびＶｉ、１９８２、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９：３］２９）、ウシ網膜桿 状細胞のＧ　ｔ　ａ　（Ｃｈａｍｂａｒｄら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ　３２６ 　：　８００　）　、Ｓａｃｃｈａｒｏ−ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに おけるフェロモン信号伝達を媒介するＧ−蛋白質（ＧＰＡＩ／ＳＣＧ　１と称さ れる）のα鎖（Ｃｏｒｖｅｎら、１９８９、Ｃｅ１ｌ　５９、およびＩｔｏｈら 、１９８８、Ｊ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈｅｔｎ、２６３：６６５６）、ならびにＤ ｉｃｈｙｏ　ｓｔｅｌｉｕｍ　ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ由来のα鎖（Ｇａ４）（Ｚ ａｒｂｌ　ら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ　１１５：３８２）を含む。各配列に続 く括弧内の数字は、示された配列の最後のアミノ酸の実際のアミノ酸位置である 。上記表において、１文字アミノ酸コードは次のとおりに使用されている。

Ｄ　＝　Ａ　ｓｐ　Ｋ　＝　Ｌ　ｙｓ Ｌ＝Ｌｅｕ　Ｇ＝Ｇ］ｕ Ｒ＝Ａｒｇ　Ｍ＝Ｍｅｔ Ｃ＝　Ｃｙｓ　Ａ　＝　Ａ　ｌａ Ｖ　＝　Ｖａｌ　Ｑ　−Ｇ　Ｉｎ Ｔ−Ｔｈｒ　Ｆ＝Ｐｈｅ Ｓ　＝　Ｓ　ｅｒ　Ｅ　＝　Ｇ　Ｉｕ Ｉ＝Ｉｌｅ ロー１１１１１１ 例２ Ｇｓα遺伝子におけるＧ−蛋白質点突然変異の同定下垂体および他の腫瘍でのＧ ｓα遺伝子のコドン２０１および２２７における突然変異の頻度を測定するため に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてゲノムＤＮＡの特定領域を増幅し 、かつ増幅生成物中の点突然変異を検出するために配列特異的オリゴヌクレオチ ドの高度に厳密なハイブリダイゼーシヨンを使用した。Ｇｓａ中の突然変異を検 出するために、コドン２０１および２２７ならびに介在するイントロンを含む単 一領域を、例１に示したように新鮮な冷凍またはパラフィン埋設試料から調製さ れた腫瘍ゲノムＤＮＡから増幅した。ｒＧｓα２０１／２２７外側プライマ」お よびｒＧｓｃｚ２０１／２２７内側プライマＪと称した表３中に示される増幅プ ライマを、上述の方法に従って使用した。野生型またはコドン２０１（６個の起 こり得るミスセンス変異）もしくはコドン２２７（７個の起こり得るミスセンス 変異、１個のナンセンス変異）における単一塩基変異体に対して特異的なオリゴ ヌクレオチドを、増幅生成物に対してハイブリッド形成させた（表４）。３００ 以上の腫瘍由来のゲノムＤＮへを、新鮮組織から調製された高分子量ＤＮＡの形 態において、あるいはパラフィン埋設組織から得られる形態のいずれかについて 分析した。グループｌの腫瘍は、刺激物質に正常に応答する低い基底のアデニリ ルシクラーゼ活性を育し、グループ２の腫瘍は、刺激剤にほとんと応答しない顕 著に上昇した基底のアデニリルシクラーゼ活性を存していた。

ハイブリダイゼーションの結果は、図ＩＡに示されている。表４に示されたハイ ブリダイゼーションプローブは、次のとおりに使用された：Ｒ２０１は、Ｇｓα のＡｒｇ２０１に対する野生型プローブを示し、Ｒ２０１Ｃは、使用したプロー ブがシスティンをコードする点突然変異（ＣＧＴからＴＧＴに）を含むことを示 し：ならびにＲ２０１Ｈは、使用したプローブがヒスチジンをコードする点突然 変異（ＣＧＴからＣＡＴに）を含むことを示している。第４のパネルは、アルギ ニンをコードする点突然変異（ＣＡＧからＣＧＧに）を含むＧ１ｎ２２７に対応 するプローブを用いてプローブにかけられた。

分析した多くの腫瘍型のうち、下垂体線のＧＨ−分泌性腫瘍においてのみ変異が 検出された。４２個のＧＨ−分泌性下垂体腫瘍のうち、１８個（４３％）がＧｓ α変異を含んでいた。これらのうち、１６個の変異はコドン２０１（１４個はア ルギニンがシスティンに、２個はアルギニンがヒスチジン）に、また２個はコド ン２２７（両者ともにグルタミンがアルギニン）にあった。これらの結果は、表 ６に要約されている。Ｇｓａ点突然変異が腫瘍中に検出された２人の患者につい て、白血球細胞試料か利用可能であり、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローン（２）の配列決 定により、または対立遺伝子−特異性オリゴヌクレオチド分析のいずれにより評 価された場合にも、いずれの試料も変異Ｇｓα遺伝子を含まなかった。この結果 は、変異が体細胞的であり、従って腫瘍の進展において直接原因となる役割を演 じたものと思われることを示している。更に、正常Ｇｓα対立遺伝子は、変異対 立遺伝子が検出されるすべての腫瘍中に存在し、Ｇｓを活性化させる変異が優勢 であることを示している。

４２個のＧＨ−分泌性下垂体腫瘍のうち、１６個は、アデニリルシクラーゼ活性 について生化学的に特徴付けられた。上昇したアデニリルシクラーゼを示す８個 の腫瘍は、活性化されたＧｓαを保有することが予想され、これらの腫瘍のそれ ぞれは、コドン２０１またはコドン２２７（図ＩＡ）に変異を含んでいた。正常 なアデニリルシクラーゼ活性を示した８個の腫瘍には、変異が検出されなかった 。別のコドンにおけるＧｓα変異もＧＴＰａｓｅを阻害するが、上昇したアデニ リルシクラーゼ活性とコドン２０１または２２７の変異との強い一致は、他の部 位における活性化変異が比較的低頻度であることを示している。

表６は、Ｇｓαのコドン２０１および２２７、ならびにＧｉα２のコドン１７９ および２０５における変異についてスクリーニングされたヒト腫瘍を要約してい る。

ＰＣＲ増幅（Ｍｕｌｌｉｓらの前出文献）のためのＤＮＡは、新鮮組織から（Ｖ ｅｒｌａａｎｄｅ　Ｖｒｉｅｓら、１９８６、Ｇｅｎｅ　５０：３１３）、また はパラフィン埋設組織から（Ｋｏｚａｓａら、１９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：　２０８１）単離した。１８個の成 長ホルモン（ＧＨ）分泌性下垂体腺腫は、Ｇｓαのコドン２０１または２２７の いずれかに変異を含んでいた。１個の卵巣類粒層細胞腫瘍および３個の副腎皮質 腫瘍（２つは腺腫、１つは癌）は、Ｇｉα２のコドン１７９に変異を含んでいた 。

理 表７は、ＧｓαおよびＧｉα２遺伝子における保存的アルギニンおよび保存的グ ルタミンについての野生型コドンのリストを与える。この表は、単一ヌクレオチ ド塩基変化（太字）および生じるアミノ酸変化も示している。

野生型および掲げられた各ミスセンス（ｍｉｓｓｅｓｃｅ）またはナンセンス（ ｎｏｎｓｅｎｃｅ）単一塩基変化に対して特異性なオリゴヌクレオチドを、何も 生じない塩基変化（アステリクスを付した）を除いてヒト腫瘍のスクリーニング に使用した。腫瘍中に検出された表６中に示す変異には下線を付した。ｒＴｅｒ ｍ４は、終止または停止信号を示している。

例　３ Ｇｉα２遺伝子におけるＧ−蛋白質点突然変異の同定他のＧ−蛋白質により媒介 される信号伝達経路の変異性活性化が、異常増殖または腫瘍形成を導く可能性を 評価するために、ヒト腫瘍の大型のパネルをＧｉα遺伝子の変異についてスクリ ーニングした。Ｇｉα２においては、試験されるべき２つのコドン、アルギニン −１７９（Ｇｓα　Ａｒｇ２０１に対応）およびグルタミン−２０５（ＧＳ（２ Ｇ１ｎ２２７に対応）の間のコード配列およびイントロンは、両コドンを含む単 一ゲノムＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を許容する程度に短い（Ｉｔｏｈら、１９８８ 、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２８３　：　６６５６）。

Ｇｉα２の検出および特徴付けに使用されるプライマおよびプローブは、表３お よび４に示されている。試料は、例１に記述されたのと同様に調製し、分析した 。ハイブリダイゼーションの結果は、図ＩＢに示されている。

図中、各パネルの最初の２つの列は、コドンＡｒｇ１７９（ＲＩ７９）に対する 野生型プローブを用いてプローブにかけた。第３および第４列は、システィンを コードする点突然変異（ＣＧＴまたはＴＧＴ）を含む表２のＧｉｃｒ２／２０１ プローブ（Ｒ１７９ｃ）にハイブリッド形成させた。各パネルの最後の２列は、 ヒスチジンをコードする点突然変異（ＣＧＴまたはＣＡＴ）を含む表４に示した Ｇｉα２／２２７ブローブ（Ｒ１７９）ｒ）にハイブリット形成させた。増幅方 法は例１に記述されている。

表６は、ハイブリダイゼーションの結果を要約している。Ｇｉα２のコドン】７ ９の変異が、２種類の異なる内分泌系腫瘍、すなわち１１個の副腎皮質腫瘍中の ３個、および６個の卵巣顆粒層細胞腫中の１個において検出された。野生型対立 遺伝子を欠失する副腎腫瘍は、腺癌であり、また他の２つの副腎腫瘍は腺腫てあ った。コドン２０５には、何らの変異も見出されなかった。２つの関連する細胞 型の腫瘍におけるコドン１７９の変異の高い頻度は、これらの変異がＧｉα２遺 伝子を癌遺伝子に転換したことを示唆しており、ここでｇｉｐ２（Ｇｉ蛋白質− ２について）と称する。

驚くべきことに、Ｇｉα２においてアルギニン−１７９を置換するアミノ酸、シ スティンおよびヒスチジンは、下垂体腫瘍中に見出されたＧｓα癌遺伝子生成物 （Ｌａｎｄ−ｉｓ）らにおける２０１位の同種のアルギニンを置換するものと同 じであった。ＧｓαおよびＧｉα２のこれらのコドンにおける単一塩基変化によ り生じ得る６個の起こり得るミスセンス変異のうち、これらの変異蛋白質のみが 生物学的に活性であることはありうることである。

ＧＳαまたはＧｉα２のいずれかにおいて、これまで見出されたすべての変異は 、遷移的変異であり、従って、これらの変異は、通常の変異生成機構を反映する であろう。

副腎皮質中の１種の腫瘍においては、Ｇｉα２の正常な対立遺伝子が検出されな かった（図ＩＢ）。ＰＣＲ生成物の配列分析は、コドン１７９の変異に対応する 単一の配列を明らかにした。この結果は、両対立遺伝子が同じ変異を含む可能性 を排除することはできないが、正常な対立遺伝子を欠く可能性を示している。正 常対立遺伝子の欠失は、その蛋白質生成物が変異蛋白質の癌遺伝子性効果に干渉 し、正常Ｇｉα２の発現の欠失が、他の対立遺伝子の活性化Ｇｉα２変異を保有 する細胞に付加的な選択的利点を与えることを示唆する。

例　４ 微少切断によるパラフィン埋設試料中のｇＳｐ変異の検出ｇＳｐ変異に影響され る２個のＧｓαコドン中の変化は、ヒト腫瘍のホルマリン固定、パラフィン埋設 組織ブロックについて、ゲノムＤＮＡを単離し、適切なＧｓα配列をポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、増幅生成物を対立遺伝子特異的オリゴヌク レオチドとハイブリッド形成する能力についてスクリーニングすることによって 検出された。例１−３においては、５ＩＩＩＩ１１組織切片中のすべての細胞由 来のＤＮＡが分析された。１つの甲状腺層重由来のＤＮＡは、野生型対立遺伝子 に加えて２種類の興なるｇＳｐ変異を育していた。２種類の変異が、５ｍｍ組織 切片の同じ腫瘍に由来するものであるか知るために、同じ腫瘍の隣接する５ｍｍ 切片を数個の小さい断片に分割し、ゲノムＤＮＡを各断片から別々に単離し、Ｐ ＣＲ増輻増幅け、そして対立遺伝子特異的才リゴヌクレオチドによりスクリーニ ングを行なった。２種類のｇＳｐ変異は、異なる断片中に検出され、加つるにい くつかの断片は、Ｇｓαの２０１および２２７位に野生型のコドンのみを含んで いた。

後者の観察は、５ｍｍ切片中の変異の不均質な分布が、変異を含まない切片の部 分の細胞に由来する野生型ＤＮＡ配列による希釈のために検出されなかったもの であろう。従って、この微小切断方法を、付加的な腫瘍に適用した。先の試験で 負であった腫瘍のいくつかで、ｇｓｐ変異の高い行き渡りの同定は、この方法が ｇｓｐ変異の検出においてより高感度であることを示唆している。

Ａ、　悪性甲状腺腫瘍 悪性甲状腺腫瘍の病原論におけるｇｓｐ変異の役割を調査する−ために、分化し た甲状腺癌をもった３７人の患者由来の初期腫瘍またはリンパ節転移の組織ブロ ックに、微小切断技術を用いた。これらの組織断片は、３種類のヒトｒａｓ遺伝 子の特異的コドンにおける変異についても試験を行なった。

これらの外科的試料由来の染色切片は、試験され、各微小切断断片は、悪性また は良性の甲状腺組織として分類され、すべての場合において病理学的診断が断片 中の細胞の少なくとも９０％に適用された。病理学的診断およびＤＮＡ分析の両 者は、盲検的様式において行なった。

病理学者は、組織断片の組織学診断を、変異の存在または不在の知識なしに行な い、またＤＮＡ分析は、コードされた試料上で行なわれた。

Ｂ、　試料の調製 複数の５ａ１ｍ切片を各組織ブロックから切出し、一つをヘマトキシリンおよび エオシンにより染色した。３０−１００ｍｍ”の面積の染色スライドの領域を、 ペンにより区分して番号付けし、可能であれば区画は組織学的に識別可能な領域 に分けた。染色ラスイドをテンプレートとして用いて隣接する非染色の５ｍｍ切 片を、カミソリの刃で対応する断片に分けた。これらの断片を別々のチューブに 移し、それぞれを例１に記述したと全く同様にしてＰＣＲおよびハイブリダイゼ ーシタンスクリーニングのために処理した。

Ｃ，ＰＣＲ増幅 １　ヒトＧｓα遺伝子のコドン２０１および２２７の上流および下流側の２０− ２５塩基対（ｂｐ）オリゴヌクレオチドプライマを使用し、テンプレートは、長 さにおいて１６５から１，２００ｂｐの範囲にある。ヒトＨ−ｒａｓ。

Ｋｉ−ｒａｓおよびＮ　−ｒａｓ遺伝子のコドンＩ２、■３および６１周辺の領 域のＰＣＲ増幅のために選択されるプライマは、１１２−１１７ｂｐの生成物を 生じた。ホルマリン保存、パラフィン埋設組織の増幅は、比較的短いＰＣＲ生成 物によって最も効果的であった。入れ予成（ｎｅｓｔｅｄ）プライマによる増幅 が、大きいＤＮＡ断片の最初のＰＣＲが不充分な量の増幅ＤＮＡを、アガロース ゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色から判断して、生成する場合には 必要であった。

ＰＣＲ条件は、例】に一般的に記述されているか、使用したオリゴヌクレオチド およびサイクル温度は、次のとおりであった。

Ｇｓαコドン２０１−２２７の入れ予成プライマ増幅について：外側センス（Ｊ ＦＬ６９）５’　ＧＣＧＣＴＧＴＧＡＡＣＡＣＣＣＣＡＣＣ；ＴＧＴＣＴ　、外 側アンチセンス（ＪＦＬ７０）、５’　ＣＧＣＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＣＧＧＴＣ ＡＣＴＣＣＡ　、生成物１，２００ｂｐ：最適ＰＣＲ条件、９５°１５０°／７ ２°にてｌ、２および２分間の３０サイクル；内側センス（ＪＦＬ　ｌ　３５） 　。

５’　ＧＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＧＴＧ；内側アンチセンス （ＪＦＬ１３６）、５’　ＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＴＧＡＴ 　、生成物、５２６ｂｐ、最適ＰＣＲ条件、９５°１５７°／７２°において３ ０，４０および４５秒間の３０サイクル。

Ｇｓαコドン２０１についてコセンス（ＪＦＬＩ３５）、５°ＧＴＧＡＴＣＡＡ ＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＧＴＧ　、アンチセンス（ＪＦＬ２８６）、５’　 ＴＡＡＣＡＧＴＴＧＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＡ　：生成物２２２ｂｐ；最適ＰＣＲ 条件、９５’１５５’／７２°において３０．３０および３０秒間を４０サイク ル。Ｇｓαコドン２２７について：センス（ＪＦＬ２２９）、５’　ＣＣＣＣＡ ＧＴＣＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＡＡＣＣＡＧ　；アンチセンス（ＪＦＬ１３６）、 ５’　ＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＴＧＡＴ　；生成物１６５ｂ ｐ、最適ＰＣＲ条件、９５°１５５°／７２°において６０．３０および３０秒 間を５０サイクル。

ｒａｓ遺伝子増幅については、９５°７５５°／７２゜において６０．３０およ び３０秒間を５０サイクル行なう原準的ＰＣＲ条件を使用した。Ｒａｓプライマ は、次のとおりである。

Ｈａ−ｒａ５−ｙトン１２およびＩ３：センス（ＪＦＬ２４３）５’　ＡＧＡＣ ＣＣＴＧＴＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＧＧＣＣ；アンチセンス（ＪＦＬ２４４） 、５’　ＡＴＡＧＴＧＧＧＧＴＣＧＴＡＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡ、生成物１５０ 　ｂｐ。

Ｈａ−ｒａｓコドン６１について：センス（ＪＦＬ２５２）５’　ＧＴＣＡＴＴ ＧＡＴＧＧＧＧＡＧＡＣＧＴＧ；アンチセンス（ＪＦＬ２５３）、５’　ＡＣＡ ＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣ、生成物１１２ｂｐ。

Ｋｉ−ｒａｓコドン１２および１３について：センス（ＥＫ３７１）、５’　Ｃ ＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＡＡ　；アンチセンス（ＥＫ３ ７２）。

５’　ＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＧＴＣＣＡＣＡ；生成物２１８ｂ ｐ。

Ｋｉ−ｒａｓコドン６１について：センス（ＪＦＬ２４８）、５’　ＧＴＡＡＴ ＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧ；アンチセンス（ＪＦＬ２４９）、５’　ＡＴ ＡＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＣ、生成物１１２ｔｌｐ。

Ｎ　−ｒａｓコドン１２および１３について：センス（ＪＦＬ２１６）、５’　 ＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＣ，ＡＣＴ　；アンチセンス（ＪＦＬ２５７ ）、５°　ＧＧＴＧＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＴＡ　：　生ｔｃ物１５０ｐ Ｏ Ｎ−ｒａｓ：＋トン６】について：センス（ＪＦＬ２１８）、５’　ＧＴＴＡＴ ＡＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＴＧ；１ンｆセンス（ＪＦＬ２４２）、５’　ＣＧ ＣＡＡＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＴＣ；生成物１１２＋１１）ａ 示されるようなハイブリダイゼーシミンドットプロットは、上述したようなＡＭ ＢＩＳ放射分析用造影系において計数することにより評価される。隣接する５龍 切片の繰返しのＰＣＲ増幅および分析は、同様な結果を生じ、該方法が感度に加 えて精度および再現性を有することが示される。

変異の不在における変異プローブのＰＣＲ生成物に対する非特異的ハイブリダイ ゼーションによる偽陽性を防止するために、ハイブリダイゼーションの水準を、 特定の変異について負であると考えられる試料の水準より低くした。この水準は 、試料中の非変異ＤＮＡに対する野生型プローブのハイブリダイゼーションによ って検出される信号の２０％として設定された。ハイブリダイゼーション信号は 、この水準より低くなければ再現性をもって検出される。従って、正の結果（増 幅ＤＮＡの２０％以上が変異を含んでいる）は、多（の体細胞性変異に対（して 期待されるように、各細胞がＩＩＩの野生型および１個の変異対立遺伝子を有し ている場合、アッセイした組［織断片中の細胞の少なくとも４０％が変異を含ん でいることを示している。

Ｄ、　点突然変異のハイブリダイゼーションおよび検出変異特異的オリゴヌクレ オチドハイプリダイゼーシ３ンのために、ＰＣＲ生成物をスポットしくドツト− プロット装置、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ナイロンフィルタ（Ｐａｌｌ　Ｂｉｏｄｙｎ ｅ−Ｂ、　０．４５ｕｍ）に自動交差結合の設定（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ　 。

Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）においてＵＶ−光を使用して共在的に結合させた。（” Ｐ）−放射標識変異特異的オリゴヌクレオチド２Ｏｂｐ長を用いるハイブリダイ ゼーションを、例１の記述と全（同様に行なった。

Ｅ、　変異の存在に関する基準 点突然変異の存在を証明するために、各変異（ＣＰＵ５）または野生Ｗ（ＣＰＭ ｗｔ）についてフィルタ上のドツトから放射される放射能を測定するＡＭＢ　Ｉ Ｓ放射分析造影系（Ａｍｂｉｓ　Ｃｏ、、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）を用い て、すべてのａｓハイブリダイゼーション反応物について走査した。高度に厳密 な洗浄の後に同フィルタに非特異的に結合している変異オリゴヌクレオチドの（ ”Ｐ）ｂ放射能を、背景活性（ＣＰＭｂ）と称し、野生型ハイブリダイゼーショ ン信号の５−１０％の範ｓである。（ＣＰＭｍ　−ＣＰＭｂ　）を、（ＣＰＭｗ ｔ−ＣＰＭｂ　）で割った商が０．２に等しいかそれ以上である場合、ドツトは ｇｓｐ変異を表すと考えられる。しかしてこの基準は、変異について正と判断さ れる増幅ＤＮＡ試料が、野生型で観察されるものの２０％の変異信号を示さねば ならないことが必要である。この基準の適用は、ｇｓｐ−正の試料由来のＤＮＡ によるｇＳｐ−負の試料の夾雑から生じる見かけ上の正の結果が生じる機会を最 小にする。

Ｆ、　対照 微小切断方法は、上皮小体摘出時に取出された正常連結組織およびヒト甲状腺の 切片中のＧｓαおよびｒａｓ変異については、負の結果を与える。正の結果を確 認するために、ハイブリダイゼーションの結果が例示された切断点（２２−３５ ％）近傍であるＲ２０ＩＣを示す６個の断片のＰＣＲ生成物を、配列決定した。

ゲノムＤＮＡを、１種のビオチン化プライマおよび１種の非ビオチン化プライマ を使用して増幅し、一方のみビオチン化したＰＣＲ生成物を生じさせた。ビオチ ン化ＰＣＲ生成物をストレプトアビジン被覆ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、　Ｄ ｙｎａｌ）　ｉ：結合した後、泪補鎮を変性させ、単鎖ＤＮＡを残して吸引した 。配列決定は、５ｅｑｕｅｎａｓｅキツト（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ。

ＵＳＢ）使用して行なわれた。６個の場合のすべてにおいて、配列決定ゲルは野 生型および変異２０１コドンの両者を示し、ドツトプロットハイブリダイゼーシ ョンの結果が確認された。

Ｇ、　変異の数と分布 ｇｓｐ変異は、分化した甲状腺癌をもった３７人の患者中、２４人（６５％）の 外科的試料に見出された。これらの患者におけるｇｓｐ変異は、２６６個の甲状 腺組織断片中、検出されたｇｓｐ変異を含む８１個（３０，５％）の微小切断断 片に不均質に分布していた。少なくとも１個のｇＳｐ正の断片をもった２４個の 外科的試料のうち、１２０個のＩＩＩＬ織学的に悪性の断片中、６０個（５０％ ）にｇＳｐ変異が見出された。変異は、明らかに悪性の組織を育する断片とは一 致しないが、実際、同じ腫瘍において６０個の組織学的に良性の断片中、２■個 （３６，２％）も、ｇｓｐ変異を含んでいた。

微小切断技術によってｇｓｐ変異が発見された２４人の患者中、わずか５人が、 単一の試料として全部で５ｍｍの切片を用いる従前の試験方法に基づいた場合に ｇｓｐを保有すると予想されていた。これらのあらかじめ正とされた５人の場合 の各々において、新規な方法で試験された断片の半数以上はｇｓｐ変異に対し正 であり、頻度は他の場合わずか１人が見出されるのみである。これらの観察は、 微小切断を行なわない場合には、変異を育さない領域由来のＤＮＡによる希釈の ために、甲状腺ｇｓｐ変異の実質的な部分−多分７５％以上−がみすごされ得る ことを示している。

３７人の患者中６人は、２種類の異なるｇｓｐ変異を育し、また１人の癌患者（ 表８の２２番）は３種類の異なるｇｓｐ変異を有していた。これらの多重変異は 、これらの試料中の別個の断片に見出された。１種より多いｇｓｐ変異を育する 患者において試験された３１個のｇｓｐ正の断片中、わずかに１個の断片のみが ２種類の変異を含んでいた。単一腫瘍の多重ｇＳｐ変異は、腫瘍の臨床的症状の 程度または他の特徴と相関をもたなかった（表８）。

試験した３７の試料中、１５個は、元々の初期腫瘍および正常甲状腺組織の両方 から物理的に離れた領域への腫瘍転移、すなわち、筋帯を越えて１３個の場合は リンパ節へ、また２個の場合は肺への転移から得られた。これらの１５個の試料 中、ｉｔ個がｇｓｐ変異を保存していた。３つの場合（患者１２、Ｉ９および２ ４）には、これらの転移は２種類の異なるｇＳｐ変異が明らかになった。

予備的報告は、腫瘍中の１種以上のｒａｓ変異を記述している（例えば、ヒト皮 膚黒色腫、Ｖａｎ’　ｔ　Ｖｅｅｒら、１９８９、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１ ．　９：３１１４−３１１６参照）。

本研究は、個々の腫瘍における単一癌遺伝子の多重変異の高い出現率を見出した 最初のものである。微小切断技術は、他の腫瘍の癌遺伝子についても同様な多重 性を明らかにするであろう。

Ｈ，Ｒａｓ変異 １）　２１　””の３個の重要な位置、グリシン−１２、グリシン−１３および グルタミン−６１におけるアミノ酸残基の突然変異的置換は、ＧＴＰ加水分解を 阻害し、また新形成的転換の引金を引く能力を向上する。他の研究者は、甲状腺 腫瘍中のｒａｓ変異の広がりを１７−６０％の範囲として報告している（ＬｅＭ ｏｉｎｅら、１９８９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、４　：　１５９−１６４およびＷｒ ｉｇｈｔら、１９８９、Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、６０：５７６−５７７ ）。従って、甲状腺癌を存する患者由来の３７個の外科的試料を、３種のヒトｒ ａｓ遺伝子の３個の重要なコドンに影響を与える癌遺伝子性変異について試験し た。３７人の患者中、１２人（３２％）に由来する微小切断断片は、Ｎ　−ｒａ ｓ変異を含んでいた。これらは、コドン−６１変異（Ｑ６ＩＲ）を有する１２個 の断片、１８個のコドン−Ｉ３変異（９個のＧＩ３Ｃ，９個のＧ１３Ｄ）、およ びコドン−１２変異（Ｇ１２Ｃ）を存する１個の断片を含んでいた。

Ｎ　−ｒａｓ変異は、いくつかの点でｇＳｐ変異に類似している二両者は、不均 質に分布し、ある場合には１人の患者中に多重的であり、また悪性の甲状腺組織 に加えて良性のものにも存在する（表８）。１２人のｒａｓ−正の患者において 試験した１１７個の微小切断断片中、３１個（２６％）がＮ　−ｒａｓ変異を含 んでいた。２人９患者は、１種より多い異なったｒａｓ変異を育していた。

同じ微小切断断片中のｒａｓおよびｇｓｐ変異の検出は、両変異が同じ細胞中に 存在することを意味するものではなく、実際のところ、更なる微小切断は、多分 、異なる細胞集合が各々の変異を含むことを区別するであろう。

■、　新規なｇｓｐ変異 甲状腺腫瘍は、アルギニン−２０１に対するプロリンまたはセリンによる置換お よびグルタミン−２２７に対するヒスチジンまたはプロリンによる置換を含む４ 種類の従来報告されていない変異を示した。

Ｊ、　結論 点突然変異発見のための微小切断技術は、組織中の５ｍＸ３０−１００ｍ＋ｎ’ 断片の数千側の細胞の４０％以上に存在する変異が検出可能となるという点で、 ある種の癌遺伝子の検出について実際的な解決方法を大きく広げた。微小切断は 、非甲状腺腫瘍についても、癌遺伝子の不均質な分布を発見するために役立つで あろう。この技術の向上した感度は、特定の癌遺伝子変異が腫瘍中に存在するの ではないという結論が誤りであろうことを示すであろう。腫瘍の大きい断片のＰ ＣＲ増幅に基づく場合には、そのような否定的結論が評価されるであろう。実際 、負の結果は、変異が腫瘍断片中の細胞のほとんどの部分に存在しないことを示 すのみである。この分析の結果は、表８中に示しである。

１５人の患者（番号１１．１２．１３、］５．１６．１７、　ｌ　９．２１．２ ４．２５．２６．２７．３２．３４および３７）は、甲状腺床の外部にリンパ節 転移を有し２人（番号１９および２６）は、肺への転移も有していた。５番目の カラム（Ｒ）は、患者が、手術前に治療的な放射線療法ＣＩ２’Ｉまたは外部的 ）を受けている場合を（＋）、いない場合を（−）で示した。

表９は、例１−４で同定された下垂体ｇｓｐ変異の要約例　５ ヒト組織は外科的生検から得られ、ただちにＲＮＡを抽出するか、あるいは使用 するまで一７０℃に急速冷凍した。すべてのヒト組織は、カリフォルニア大学の Ｄａｖ−ｉｓ　Ｈｕ＋ｎａｎ　５ｕｂｊｅｃｔｓ　Ｒｅｖｉｅｗ　Ｃｏｒｎｍｉ ｔｔｅｅの許諾の合意通知のもとに得た。組織は、Ｄｒ、　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｄ、 　Ｃａｒｄｉｆｆの指示のもとに、カリフォルニア大学のＴｉ５ｓｕｅ　Ｂａｎ ｋ　ｏｆ　ｔｈｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙからも供給 された。

骨髄を塗抹標本化した顕微鏡スライドも分析した。１つはヘマトキシリンおよび エオシン（Ｈ十Ｅ）で染色したスライドであり、他方は単に空気乾燥した骨髄で あった。両スライドともＲＮＡ抽出に先立って室温にて数ケ月間保存されている 。

他の記録保存的試料は、パラフィン中への埋設に先立って、メタノールまたはエ タノールのいずれかで固定されている。

Ｂ、　細胞株 種々のｒａｓ対立遺伝子中の既知の活性点を存するものとして既に特徴付けられ ているヒト腫瘍細胞株を使用した。細胞株ＥＪＴ２４（膀胱遷移細胞癌）　（Ｔ ａｂｉｎら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ　３００　：　ｌ　４３−１４９、および Ｒｅｄｄｙ　ら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ　３００　：　ｌ　４９−１５２）お よび５Ｋ−Ｎ−ＳＨ（神経芽種）　（Ｔａｐａｒｏ＊ｓｋｙら、１９８３、並置 　３４４　：５８１−５８６）は、叶。

Ｒ，Ｃａｒ４ｉｆｆから贈与された。Ｃａ１ｕ−１（肺癌）、５Ｗ４８０（結腸 癌）、およびＰＡ−１（奇形癌）は、Ａｍｅｒｉ−ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ａ　Ｔ　ＣＣ）から入手した（　Ｃａｐｏｈ 　ら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ　３０４　：　５０７−５１３、およびＴａ１ｎ ｓｋｙら、１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２Σ：６４３−６４５）。ＨＬ−６０ Ｃ前骨髄球性白血病）は、Ｄｒ、　Ｊ、　Ｌａｗｒｅｎｃｅからの贈与であった （Ｍｕｒｒａｙら、１９８３、垣貝　囲ニア４９−７５７）。

他の細胞株を、それらが活性化された対立遺伝子を含むことが知られていないこ とからｒａｓ変具についての負の対照として使用した。Ｋ５６２Ｃ赤白血病）は 、Ｃｅｔ−ｕｓ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ｃ Ｔ　ＣＣ）から供給された（Ｌｏｚｚｉｏおよびしｏｚｚｉｏ、Ｉ　９７５、Ｂ ｌｏｏｄ　４５　：　３２１−３３４）。細胞株Ｇ−２１０１（腎清澄細胞癌） は、当研究室に由来する（　Ｇｕｍｅｒｌｏｃｋら、１９８８、［ｎＶｉｔｒｏ 　Ｃｅ１ｌ　Ｄｅｖｅｌ、　Ｂｉｏｌ、　２４　：　４２９−４３４　）　ａ細 胞株Ｔ−３８９１（胎児性肺）は、正常、非不死化線維芽培養物である（Ｒｏｓ ｓｉｔｔｏら、ｌ９８８、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　Ｉ　４０：４３１−４３５）。上 記のすべての細胞株は、供給者の指示に従って維持された。

Ｃ１新鮮または凍結組織および細胞株からのＲＮＡの抽出 全細胞ＲＮＡは、先に記述されているグアニジニウム−イソチオシアネート−フ ェノール−クロロホルム法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ、１９０頁、およびＣｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ８　：　５２９４−５２９９　）の修飾を用いて、組織および細胞株から抽出し た。グアニジニウムイソチオシアネート溶液（５Ｍグアニジニウムイソチオシア ネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０゜５％サルコシル、ｐＨ７，０）（Ｇ ＩＴＣ）は、使用の直前に５％β−メルカプトエタノール（ＧＩＴＣ−ＭＥ）に 対して調製した。組織片を、モルタル中で、液体窒素中で粉末化し、更にモルタ ル中でＧＩＴＣ−ＭＥを添加してすりつぶし、１．５ｍｌのスラリーを１３Ｘ５ １ｍｍポリアロマーチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ）内 の塩化セシウム（Ｃ３ＣＬ）密度勾配上に積層した。ＣｓＣｌ密度勾配は、２０ ｍＭトリス−ＨＣｌ　、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５（ＴＥ）中の４０％　 ＣｓＣ１溶液１．５ｍｌを、ＴＥ中の５．７　Ｍ　ＣｓＣ１２、Ｏｍｌ上に積層 することによって調製された。ＲＮＡを、５ｗ−５ｏ、ｔロータ中で室温下、４ ０．０００ｒｐｍにて１６−１９時間超遠心にかけることにより、この密度勾配 を通してペレット化した。

該ＲＮＡペレットを、微量遠心用チューブ内で、フェノール−クロロホルム抽出 のために５０μＩのＴＥ−３ＤＳ（１０’ｍＭトリスーＨＣｌ　、１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ、　ｐＨ７，４，０，５％５ＤＳ）中に懸濁した。ＴＥ飽和フェノールを、 １：ｌ（ｖ／ｖ）でクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：　１）溶液と 混合した。このフェノール：クロロホルム溶液の等容をＲＮＡ溶液に加え、１０ 秒間激しく回転撹拌し、２分間の微量遠心により相分離させた。この抽出を反復 し、ＲＮＡを含む水性相を、沈殿生成のために２ｍｌの微量遠心チューブに入れ た。ＲＮＡを、５ＭＮａＣｌの添加により、最終濃度０．３　Ｍ　ＮａＣ１を生 成させ、続いて２容の水冷１００％エタノールを添加することに沈殿させた。こ の溶液を、−７０℃に少なくとも１時間静置した。次いで、該チューブを室温ま で温めて氷を融解させ、微量遠心機で４°Ｃにて１５分間回転させてＲＮＡ沈殿 をペレット化した。上溝をデカントし、残留する液体を真空乾燥により除去した 。はぼ乾燥した後、ＲＮＡベレットをＴＥ　（ＳＤＳを含まない）中に再度溶解 させ、２回目の沈殿を行なった。このとき、ＲＮＡペレットは、５０−１００μ ｍの０．２ＸＴＥ中に再溶解させた。ＲＮＡ濃度は、分光光度計にて２６０ｍｍ における光学密度を測定し、１．０　０．Ｄ、が０１１あたり４０℃ｇＲＮＡに 等しい設定により計算して決定された。

Ｄ、　空気乾燥骨髄スライドからのＲＮＡの抽出ヒト骨髄の顕微鏡スライドを、 ＲＮＡについて抽出した。１つはＨ＋Ｅにより染色され、他方は単に空気乾燥さ れて未染色のままであった。これらのスライド上の細胞をカミソリの刀で微量遠 心チューブ内にかき取った。

チューブに１ｍｌのＧ　ＩＴＣ−ＭＥを加え、該チューブを回転振とう器上で６ ０分間激しく振とうさせて細胞を溶解させた。次いで該溶液を２ｍｌの微量遠心 チューブ内に入れた。ＤＮＡを溶液中のＲＮＡから沈殿除去するために、２Ｍ酢 酸ナトリウム（ｐＨ４，８）　０．１　ｍｌを各チューブに加えた。ＤＮＡ沈殿 および抽出は、１ｍｌのフェノール：クロロホルムをチューブに加え、該チュー ブを複数回倒置し、湿った氷上に１５分間置くことによって行なった。ＤＮＡの ＲＮＡからの沈殿除去を含む迅速ＲＮＡ抽出の方法は、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ および５ａｃｃｉ、１９８７、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２　：　１ ５６−１５９により記述されている方法の変法である。氷上のインキュベーショ ンに続いて、ＤＮＡは有機相と水性相との境界面に残る。該チューブを微量遠心 機で４°Ｃにて２００分間回転せ、ＲＮＡを含む水性相を取出して新たな２ｍｌ チューブにＲＮＡの沈殿のために移した。各チューブに７５０μｌのイソプロパ ツールを加え、該チューブを数回倒置させた後に、−２０℃にて１時間静置した 。沈殿したＲＮＡを微量遠心機にて０℃で２００分間回転せてペレット化した。

該ＲＮＡを３００μｍのＧＩＴＥ−ＭＥ中に再溶解させ、３００μｌのイソプロ パツールの添加および一２０℃、１時間の静置により２回目の沈殿を行なった。

ＲＮＡを上述と同様にして再度ペレット化し、上溝を廃棄し、ＲＮＡベレットを １ｍｌの７０％エタノールで洗浄した。再度、ＲＮＡをペレット化し、上清を廃 棄し、該ベレットを真空乾燥下に乾燥させた。該ＲＮＡを、最終的に５０μｍの ０．２ＸＴＥ中に再度溶解させ、定量した。

両スライドは、各々１５μｇを越えるＲＮＡを生じた。

Ｅ、　アルコール固定パラフィン埋設組織からのＲＮＡ駐 パラフィンブロックの５０ミクロンの切片を切出し、ｌｌｌ１ｌのキシレン中で 微量遠心チューブ内にて３０分間激しく振とうすることにより脱パラフイン化し た。組織片を微量遠心に５分間かけてペレット化し、キシレンをデカントした。

残留するキシレンを１００％エタノールで洗浄し、組織片をペレット化すること により除去した。

組織に上述したＧＩＴＣ−ＭＥを１ｍｌ加えた。チューブを、回転振どう器上で １時間、激しく振とうさせて組織を溶解させた。ＲＮＡ単離の引続くすべての工 程は、上述したＤＮＡのＲＮＡからの沈殿除去を含む骨髄スライドについての方 法と同じである。各５０ミクロン切片は、約２５μｇのＲＮＡを生じた。

Ｆ、ＲＮＡ／ＰＣＲ法 ポリメラーゼ連鎖反応におけるｍＲＮＡ配列の増幅方法（ＲＮＡ／ＰＣＲ）は、 既に記述されている方法に基づ＜　（Ｋａｗａｓａｋｉら、１９８８、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｅｔ。

ＵＳＡ　８５：５６９８−５７０２）。全細胞ＲＮＡを、逆転耳によってｃＤＮ Ａの貯留に変換した。次いで、このｃＤＮＡを遺伝子特異的プライマ対を用いる ＰＣＲにかけた。該プライマ対は、１１１以上のイントロンにより分離されてい るエクソン配列に対応するように設計された。対のうちの上流側プライマである プライマＡは、遺伝子のＲＮＡ転写に使用された非−テンプレートとじて決定さ れるものと同じ配列（５°→３′）を含む（ウラシルをチミジンに置換したＲＮ Ａと同じ配列）。下流側プライマであるプライマＢは、非−テンプレート鎖に対 して相補的であり、かつ反平行となるように設計される。

プライマは、一般的にＧＣ含有量が４０−６０％の２１−２４塩基対の長さく２ １−２４量体）であった。

イントロンにまたがるプライマ対を用いると、スプライスされたｍＲＮＡのＰＣ Ｒ増幅は、遺伝子のエクソン配列のみを含む予想された長さの増幅生成物を生じ る。

スプライスされないＲＮＡまたはＲＮＡ１ｌ製物中の夾雑ゲノムＤＮＡの増幅は 、イントロン配列を含んだ大きい生成物を生じる。スプライスされたｍＲＮＡか ら予想されるより小さい生成物が、興味ある遺伝子から転写され、スプライスさ れたｍＲＮＡが存在する場合には生成されるであろう。従って、エチジウムブロ マイド染色ゲル上の予想されるバンドの存在は、その遺伝子の転写または発現に 関する明白なアッセイである。このアッセイは、遺伝子発現のゲル可視化アッセ イ（Ｇｅｔ　ＶｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎＡｓｓａｙ　ＧＶＡ）と称されている 。

予想される増幅生成物は、ＰＣＲ生成物に対する内部側プローブハイブリダイゼ ーションを使用して確認された。このため、オリゴヌクレオチドは、３個の組と して調製される：２個はアンブリマ（ａｍｐｌｉｍｅｒ）対として、また３番目 には、ＰＣＲによる生成物に対するプローブとして使用されるための両アンブリ マに対して内部側のものである。しかしなから、予想されるバンドの確認を伴っ て、ＧＶＡは、極めて迅速かつ高感度な様式で遺伝子発現のスクリーニングのた めに使用され得る。

Ｇ、Ｒａｓプライマおよびプローブ ｒａｓ−特異的ＲＮＡ／ＰＣＲプライマの７つの組が設計され、表６に示されて いる。３種類のヒトｒａｓ遺伝子、ｃ−Ｎ−ｒａｓ（ブライ７ＥＫ２２１）　、 　ｃ−Ｈａ　−ｒａｓ−１（ＥＫ２２２）およびｃ−Ｋｉ　−ｒａｓ　−２（Ｅ Ｋ２２３）の各々におけるエクソン１に特異的な上流側プライマを調製した。こ れらは、各々包括的エクソン２の下流側プライマ（ＥＫ２２５）との組合せにお いて、保存領域を標的として８４個に使用される。更に、包括的上流側プライマ （ＥＫ２２４）を、　“汎″−ｒａｓ発現を検出するためにＥＫ２２５と対にし て使用した。これらのプライマの組の生成物の予想される大きさは２００ｂＰで あった。

異なった大きさのＲＮＡ／ＰＣＲ生成物を生じさせるために、３種類の遺伝子に ついて各々プライマ対を設計した。遺伝子の発現を評価するためにＧＶＡを使用 すれば、異なる大きさの生成物の生成は、３種類すべての遺伝子発現アッセイを 、同じ反応混合物中で同時に走らせ、次いでゲルの単一レーン中で観察すること を可能とする。

結果として酵素の消費が節減され、スクリーニングされる試料の数を３倍に拡大 することができる。

ｃ−Ｎ−ｒａｓ（ブライ７ＥＫ３６５およびＥＫ３６６）　、ｃ−Ｈａ　−ｒａ ｓ　−１（ＥＫ３６７およびＥＫ３６８）およびｃ−Ｋｉ　−ｒａｓ　−２（Ｅ Ｋ３６９およびＥＫ３７０）からのＲＮＡ／ＰＣＲ生成物は、２９９ｂｐ、２５ ９ｂｐおよび２３４ｂｐをそれぞれ発信する。各上流側プライマは、他のｒａｓ 信号の交差的増幅を防止するために、他の２つの上流側プライマとは６個以上の 塩基の不一致を存するように設計されている。これらの３組のプライマは、同し 反応混合物中で同時に使用され得る。

これらの実験において、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プロー ブハイブリダイゼーションを、ｒａｓ対立遺伝子の活性他点突然変異をスクリー ニングするための１２番目および６１番目のコドンにおける点突然変異を検出す べく使用した。使用した２０量体プローブを表７に示しである。これらのプロー ブは、Ｆａｒｒらの１９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 ＵＳＡ　８５　：　９２６８−９２７２に記述されている方法に従って使用した 。

Ｈ，ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成 相補的ＤＮＡを、抽出された全細胞ＲＮＡから基本的には既に記述されているよ うにして合成した（Ｋａｗａｓａｋｉら、１９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５　：５６９８−５７０２）。１マイクａグラ ムの全ＲＮＡを、Ｍｏ１ｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）の逆 転写酵素ＣＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） を用いて、２０ＵのＲＮ　Ａ　ｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１μｌの１０ｍ１Ｊ ヌクレオチドトリホスフエートの各保存物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰＳｄＧＴＰおよ びｄＴＴＰ）　、および１００　ｐｍｏｌの無作為６量体プライマを含むＩＸＰ ＣＲ緩衝溶液（５０ｍＭ　ＫＣＩ　、２０ｍＭｈリスー１（ＣＩ　、　ｐｉ（８ ，３，２，５ｍＭ　ＭｇＣ１ｔおよび０．０１％ＢＳＡ）中の２０℃ｍ反応物中 で逆転写した。オリゴｄｉプライマの無作為６量体プライマへの変更は、ＲＮＡ ／ＰＣＲ生成物のより良い収率を示している最近の報告に基づいている（　Ｎｏ ｏｎａｎおよびＲｏｎｉｎｓｏｎ、１９８８、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ 、１６　：　１０３６６）逆転写反応物を室温で１５分間、４２℃で３０分間、 ９５°Ｃで５分間インキュベートした。９５℃のインキュベーションは、Ｍ。

−ＭｕＬＶ逆転写酵素の加熱変性のために行なった。これらのｃＤＮＡを、ＰＣ Ｒ反応で使用するまで４℃にて保存した。

１、　ｃＤＮＡを使用するＰＣＲ反応 ＰＣＲ法を、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来する組換え熱安定性Ｄ ＮＡポリメラーゼ（ｒ　Ｔａｑ）　（Ｐｅｒｋｉｍ　Ｅｌｍｅｒ　−Ｃｅｔｕｓ ）を使用して、ＤＮＡについて記述されているように５ａｉｋｉ　らに従って使 用した。わずかな変更は、プライマの量を各々１０　ｐｍｏｌｅに低減したこと 、ｄＮＴＰを、上述のように１０ｍＭの各保存溶液１μｍに低減したこと、およ びｒＴａｑ酵素を全１００μ】反応物中、１反応あたり２Ｕとしたことである。

ＲＮＡ／ＰＣＲの基質は、上述した２０μ］ｃＤＮＡの２μｍである。この量は 、逆転写反応に用いた全細胞ＲＮＡの最初のｌμｇ中の１１００ｎに対応する。

３種類の遺伝子反応を同時に走らせる場合、これは１μｇの全細胞ＲＮＡから、 最小３０の遺伝子発現研究に対応している。

９５℃にて１分間（二重鎖の変性）、５５℃にて３０秒ｍ（アンブリマのアニー ル化）、および７２°Ｃにて３（［１！ｊ　（ＤＮＡ合成）＋７）ＰＣＲ温度ｍ 式を、プロクラム可能なヒートブロック（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕ ｓ）にて３０−５０サイクル行なった。７２℃における３０秒の合成工程は、少 なくとも９３５ｂｐのＲＮＡ／ＰＣＭ生成物を生じさせるために充分であった。

Ｊ、ｍＲＮＡ発現のゲル可視化アッセイ（ＧＶＡ）離散的遺伝子発現を、ＲＮＡ ／ＰＣＨに続いてゲル可視化アッセイ（ＧＶＡ）により評価した。ＲＮＡ／ＰＣ Ｒ生成物を、９μｌの反応混合物をトリス−ホウ酸ＥＤＴＡ緩衝溶液（ＴＢＥ） 中の２％ＮｕＳｊｅｖｅ（Ｆ　Ｍ　Ｃ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＤ）、１％アガロ ースゲル中で走らせることによりスクリーニングした。大きさのマーカとして、 １２３ｂｐＤＮＡラダー（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｔｅｓ）を使用した。７５ｍ１のゲルを、幅広のミニサブセル（ｍｉｍｉ −ｓｕｂ　ｃｅｌｌ）（Ｂｉｏ　−Ｒｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）内でＴ ＢＥ中、一定の１００ボルトにて約９０分間走らせた。ゲルをエチジウムブロマ イド溶液（０，５μｇ／ｍｌ）中で３０分間染色し、３０分間脱色し、紫外光の もとにＰｏ１ａｒｏｉｄ　Ｌａｎｄカメラを用いて撮影した。

Ｋ、ＲＮＡ／ＰＣＲ生成物のＡＳＯプローブ処理プローブにかけられるべきＲＮ Ａ／ＰＣＲ生成物を、ミニゲル系内でトリス−ホウ酸ＥＤＴＡ電気泳動緩衝溶液 （ＴＢＥ）中の２％アガロースゲル内を走らせた。ウィックアクショントランス ファ（ｗｉｃｋ−ａｃｔ　ｉｏ口ｔｒａｎｓｆｅｒ）内で、Ｚｅｔａ　−Ｐｒｏ ｂｅナイロンフィルタＣＢｉｏ−Ｒｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　ヘのア ルカリ移送を、０．４　Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を用いて行なった。移送は、９０分 間進行させた。

移送に続いて、プロットを２ＸＳＳＣ中で５分間中和した。プロットを、３Ｍテ トラメチルアンモニウムクロライド（ＴＭＡＣ）　、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ 　、　ｐＨ７，５，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、および ０．３％ＳＤＳの溶液中で、５５℃にて１時間、円形に振とうしつつプレハイブ リッド形成させた。ガンマ−”Ｐ−ＡＴＰで標識されたキナーゼであるＡＳＯプ ローブとのハイブリダイゼーシヨンを、ｍｌあたり２　Ｘ　１０　”　ｃｐｍの プローブを加えた上述のＴＭＡＣ緩衝溶液５ｍｌ中で行なった。ｌＸイブリダイ ゼーションは、５５℃にて１時間継続させた。

ハイブリダイゼーション緩衝溶液および０．１％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣの最初 の洗浄液（５０ｍｌ）は、室温にて放射性廃棄物として廃棄した。プロットをＤ ｅｎｈａｒｄｔ溶液を含まないＴＭＡＣ緩衝溶液中で迅速にすすぎ、次いで同じ 緩衝溶液中で６１℃にて１時間、よく洗浄した。この洗浄は、ＡＳＯプローブが 点突然変異を識別する能力に対して臨界的であった。次いでプロットをＷｈａｔ ｍａｎｎ　３ＭＭろ紙に打って乾燥させ、−７０℃にて１時間、Ｋｏｄａｋ　Ｘ ＡＲフィルムに露光した。次いでフィルムを自動処理装置中で現像し、データの 解釈を行なった。

表ｌ０ ｒａｓ　ＲＮＡ／　Ｐ　ＣＲに対するオリゴヌクレオチドプライマ。すべての配 列は５′→３′の方向で示される（ＥＫ２２４においてに＝ＴまたはＧ、ＥＫ２ ２５にお（１てＲ＝ＡまたはＧ） ８に２２４　：包括的ｒａｓ　ｘクソン１（上流）ＡＴＧＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡ ＡＡＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＫＧＧ εに２２５：包括的ｒａＳ　Ｘクラン２（下流）　ＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣ ＣＴＣＡＴＧＧＣＲＣＧ ｒａｓＡｓｏプローブについてのオリゴヌクレオチド。

すべての配列は、５′→３′の方向で示される（Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｈ＝Ｃ，Ａま たはＴ：Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ：Ｓ＝Ｇ、ＡまたはＴ） ＪＮ　０２：　Ｈａ−ｒａｓ−１１２−Ｉ　ＧＴＧＧＧＣＧＣＣＨＧＣＧＧＴＧ ＴＧＧＧヒトｒａｓ＊ｍＲＮＡのＲＮＡ／ＰＣＲ増幅のＧＶＡの結果を図２に示 す。使用された試料は、正常膵臓および細胞株に５６２であった。レーンｌおよ び１４は、１２３　ｂｐＤ　Ｎ　Ａラダーを含む。各反応についての負の対照（ ＲＮＡではない）は、レーン４．７．１０および１３に示される。レーン２−４ は、正常ヒト膵臓、Ｋ５６２５６２細胞よびＲＮＡを含まない負の対照にそれぞ れ由来するＲＮＡに対する、　“汎“ｒａｓプライマＥＫ２２４およびＥＫ２２ ５を使用したＲＮＡ／ＰＣＲ生成物が示される。予想されるように、２００ｂｐ の増幅生成物が存在する。レーン５−７は、ｃ−Ｎ−ｒａｓ−特異的プライマＥ Ｋ３６５およびＥＫ３３６を使用した結果を示す。

試料は、同じ配列について示され、予想されたように２９９ｂｐの生成物が存在 し、ヒト細胞の両試料よおけるｃ−Ｎ−ｒａｓ遺伝子の発現を示した。ｃ−Ｈａ 　−ｒａｓ　−１の発現は、レーン８−１０に示される。プライマＥＫ３６７お よびＥＫ３６８は２５９ｂｐの生成物を生し、このことはレーン９（Ｋ５６２細 胞）に明確に見られる。

正常ヒト膵臓（レーン８）から単離されたＲＮＡからは、何らの生成物も見られ ない。生成物の欠如は、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ−２ｍＲＮＡの欠失、または正常ヒト 膵臓のＲＮＡ／ＰＣＲの３０サイクル後においては、信号の水準が検出限界以下 であることを反映するものと解釈される。この結果は、ＲＮＡ／ＰＣＲ後のｍＲ ＮＡの検出についてＧＶＡの有用性を示している。

レーン１１−１３は、ｃ−Ｋｉ　−ｒａｓ　−２プライマＥＫ３６９および３７ ０を用いたＲＮＡ／ＰＣＲ生成物を含んでいる。予想された２３４ｂｐの生成物 はレーンｌｌ（正常ヒト膵臓ＲＮＡ）およびレーン１２（Ｋ−５６２ＲＮＡ）の 両方に存在し、両試料中での遺伝子の発現を示しているが、信号の量は、正常ヒ ト膵臓におけるものが、Ｋ５６２５６２細胞合より少ない。

例　７ 活性化点突然変異のスクリーニングにおけるｒａｓＲＮＡ／ＰＣＲ生成物の使用 異なる点突然変異特異的プローブとのＡＳＯプローブのハイブリダイゼーション は、例５に記述されているように行なわれた。結果は図３に示される。

細胞株の各プロット上の試料は同じである：レーン１、ブライ７ＥＫ２２２およ びＥＫ２２５　（ｃ−Ｈａ　−ｒａｓ−１）により増幅されたＥＪ／Ｔ２４ＲＮ Ａ　；レーン２、プライマＥＫ２２４およびＥＫ２２５　（’汎’　ｒａｓ　） 　ニより増幅されたＥＪ／Ｔ２４ＲＮＡ；レーン３、ブライ７ＥＫ２２１および ＥＫ２２５　（ｃ　−Ｎ−ｒａｓ　）により増幅されたＰＡ−Ｉ　ＲＮＡ；レー ン４、プライマＥＫ２２３およびＥＫ２２５　（Ｃ−Ｋｉ　−ｒａＳ−２）によ り増幅された５Ｗ−４８ＲＮＡ　、レーン５、プライマＥＫ２２４およびＥＫ２ ２５（“汎″ｒａｓ　）により増幅された５Ｗ−４８０ＲＮＡ；レーン６、プラ イマＥＫ２２１およびＥＫ２２５　（Ｃ−Ｎ−ｒａｓ　）　ニより増幅されたＨ Ｌ−６０ＲＮＡ；レーン７、プライマＥＫ２２３およびＥＫ２２５　（ｃ−Ｋｉ 　−ｒａｓ−２）により増幅されたＣａ１ｕ　−Ｉ　ＲＮＡ　；レーン８、ブラ イ７ＥＫ２２４およびＥＫ２２５（“汎−ｒａｓ　）により増幅されたＣａ１ｕ −ＩＲＮＡ　、レーン９、プライマＥＫ２２４およびＥＫ２２５（″汎’　ｒａ ｓ　）により増幅されたＧ２１０１ＲＮＡ。

レーン２０．１２３塩基対のＤＮＡラダー。パネルＡ中のプロットは、ｃ　−Ｈ ａ　−ｒａｓ　−１の１２番目のコドンの第２のヌクレオチドにおける活性化点 突然変異に特異的なオリゴヌクレオチドのプールを用いてプローブにかけられた （ＪＮＯ３）。

予想されるように、Ｅ　Ｊ／Ｔ　２４　ＲＮＡを含むレーンおよび２は、ｃ−Ｈ ａ　−ｒａｓ−１プライマおよび“汎″ｒａｓプライマの両者で増幅され、特徴 付けられるＥＪ／Ｔ２４変異に対して正である。パネルＣプロットはＣ−Ｎ−ｒ ａｓ　（ＪＮ１７）の１２番目のコドンの第２のヌクレオチドにおける活性化点 突然変異に特異的なオリゴヌクレオチドのプールを用いてプローブにかけられた 。

ＰＡ−２細胞株は、この位置に変異を含むことが知られており、レーン３は、予 想どおりに正である。パネルＣプロットは、ｃ−Ｋｉ　−ｒａｓ−２のコドンＩ ２の第１のヌクレオチドにおける変異を原的とするオリゴヌクレオチドブールＪ ＮＯ９を用いてプローブにかけられた。

５Ｗ−４８０細胞株は、これらの変異の１つを含み、この細胞株についてのＲＮ Ａ／ＰＣＲ生成物を含むレーン４および５は正である。レーン５の信号は極めて 弱いことから、このレーンに対して”汎“ｒａｓプライマを使用したため、この 細胞における他のすべてのｒａｓ信号に関して変異対立遺伝子の信号か少ないこ とを示すか、あるいは汎“ｒａｓプライマは、他の２種類のｒａｓ遺伝子に関し て、ｃ−Ｋｉ　−ｒａｓ　−２信号の増幅にあたって効率的でないことを示して いる。

パネルＣプロットは、ｃ−Ｎ−ｒａｓの６１番目のコドンの第２の位置における 変異に特異的なブールＪＮ２２を用いてプローブにかけられた。細胞株ＨＬ−６ ０は、この位置に変異を育しており、レーン６において正である。このパネルは 、パネルＢとの組合せにおいて、ブライ７ＥＫ２２１およびＥＫ２２５　（ｃ　 −Ｎ−ｒａｓ　）により増幅されたＲＮＡ／ＰＣＲ生成物が、この遺伝子の１２ ．１３および６１番目のコドンの再配列を含むことを例示している。このことは 、２つの活性点が、大きいイントロンに隔てられたエクソン１とエクソン２とに 存在するために、ゲノムＤＮＡをスクリーニングする場合には２つの反応か必要 となることとは対照的に、単一のＰＣＲ反応が単一の生成物において両活性点の スクリーニングを可能とする点において、ｒａｓ点突然変異のスクリーニングに 対して育意な利点を有するものである。

ｍＲＮＡにおける発現された変異のスクリーニングは、非発現対立遺伝子の変異 を検出する可能性に対しても不可的に価値をもつものである。

アルコール固定、パラフィン埋設試料からのＲＮＡ／ＰＣＲ生成物をＧＶＡによ り分析した（図４）。レーン１．５および１２は、１２３ｂｐＤＮＡラダーを含 む。レーン２．６および９の試料は、プライマＥＫ３６５および３６６　（ｃ　 −Ｎ−ｒａｓ　、　２９９ｂｐ）により増幅され、レーン３．７およびｌＯでは プライマＥＫ３６７およびＥＫ３６８　（ｃ−Ｈａ−ｒａｓ−１：２５９ｂｐ） により増幅され、またレーン４．８および１１ではプライマＥＫ３６９およびＥ Ｋ３７０　（ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ−２：２３４ｂｐ）により増幅された。レーン２ −４は、ＲＮ　Ａ　／ＰＣＲの逆転写酵素反応にＲＮＡを添加しない負の対照で ある。

これらのレーンでは、上記プライマ２量体以外に生成物ＲＮＡ／ＰＣＲ生成物を 含み、３種類の遺伝子のすべてに由来するｒａｓ信号に対応する生成物が存在す る。レーン９−１１は、細胞株Ｇ−２１０１由来のＲＮＡ／ＰＣＲ生成物を含む 。この場合、Ｃ−Ｈａ　−ｒａｓ−ｉ由来の信号を欠き、発現の欠如が示される 。

これらの反応は、ＲＮＡ／ＰＣＲの５０サイクルによって行なわれ、これは背景 バンドの存在を増大させるが、ＲＮＡの調製に使用されるＲＮＡからのＤＮＡの 沈殿除去技術も完全に効率的ではなく、ＲＮＡ調製物中に夾雑ゲノムＤＮＡを生 じ得る。夾雑ゲノムＤＮＡは、エクソン１および２の間のイントロンを含むｒａ ｓ遺伝子の特異的増幅を生じ得、しかしながら、それはスプライスされたｍＲＮ Ａについて予想されるものよりかなり大きいものであろう。

例　９ “汎”ｒａｓプライマを、逆転写ＲＮＡ生成物の増幅に使用した。試料の調製お よび増幅方法は、例４に記述されたものと同様である。

ヒト骨髄の空気乾燥染色顕微鏡スライドから単離されたＲＮＡの“汎″ｒａｓ増 幅の結果を、図５に示す。プライマＥＫ２２４およびＥＫ２２５を使用した予想 される２００ｂｐのＲＮＡ／ＰＣＲ生成物は、レーン２の負の対照（ＲＮＡ無し ）に隣接する非染色スライド（レーン３）および染色スライド（レーン４）につ いて示され、またレーン１に１２３ｂｐＤＮＡラダーが示される。これらは、５ ０サイクルのＲＮＡ／ＰＣＲ操作の結果である。

ビオチン化プライマの合成、プローブのポリＴティリング、および様式［Ｉフィ ルタの調製は、ここに参考として組入れる共通して誼渡され、同時係属中の米国 特許出願１９７．０００号に記述されているものと同様である（Ｃｈｉａｎｇら 、ｌ　９８９　、　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７　（４）　：　３　６０も 参照）。

Ｎ−１Ｈ−およびＫ　−ｒａｓに対する２１種の変異特異的オリゴプローブを提 示するフィルタの３つの組は、それぞれ図６に示されている。ｒａｓプローブの 配列は、表１２に示されている。すべてのプローブは、略同じ融点（〜５０−５ ２°Ｃ）を育してハイブリダイゼーション条件をすべてのオリゴヌクレオチドに ついて標準化し得るように設計されている。各テイル付加プローブの５μｍｏｌ を、Ｂｉｏｄｙｎｅナイロン膜（Ｐａｌｌ　Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ　、　ＮＹ） 上にスポットし、ＵＶにて固定化した。

ｒａｓオリゴヌクレオチド結合フィルタを、５　Ｘ５ＳＰＥ。

０．５％ＳＤＳ中で、アルカリ変性させたＰＣＲ生成物と４２℃にて６０分間ハ イブリッドさせた。洗浄を、３Ｍのテトラメチルアンモニウムクロライド中で行 なって、種々のヌクレオチド間の塩基組成の影響を最小にした。

該フィルタを、２ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳによって簡単にすすぎ、同様な緩 衝溶液中で２μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−西洋ワサビパーオキシダーゼ接 合物（“５ｅｑｕｅｎｃｅ”　、Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共に 室温にて３０分間インキュベートした。次いで、該フィルタを５分間、接合物を 含まない同様な緩衝溶液で洗浄した。ＥＣＬ遺伝子検出系（Ａｍｅｒｓｈａｍ） の試薬を添加し、室温にて１分間インキュベートした。次いで、フィルタをサラ ンラップで包み、そして発生する光信号を、Ｋｏｄａｋ　ＸＲＰフィルムに２０ 秒から１分間露光することにより検出した。

表１２ 様式目検出のための各ｒａｓプローブ Ｎ−ｒａｓ　：ｌトン１２　ＹＺＩ　ＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＹＺ２ １　ＧＡＧＣＡＡＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＹＺ２２　ＧＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＧＴ ＴＧＧＹＺ２３　ＧＡＧＣＡＣＧＴＧＧＴＧＴＴＧＧＹＺ２　ＧＡＧＣＡＧＡＴ ＧＧＴＧＴＴＧＧＹＺ２４　ＧＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＹＺ２５　ＧＡ ＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＧＮ−ｒａｓコドン１３　ＹＺ２６　ＧＣＡＧＧＴ ＡＧＴＧＴＴＧＧＧＡＹＺ５０　ＧＣＡＧＧＴＴＧＴＧＴＴＧＧＧＡＹＺ２７　 ＧＣＡＧＧＴＣＧＴＧＴＴＧＧＧＡＹＺ２８　ＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＧＧ ＡＹＺ２９　ＧＣＡＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＧＧＡＹＺ３　ＧＣＡＧＧＴＧＧＴＧ ＴＴＧＧＧＡＮ−ｒａｓ　：ｌトン１６　ＹＺ４　ＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＡＡ ＧＡＧＴＹＺ３０　ＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴＹＺ５　ＣＡＧＣＴＧ ＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＹＺ３１　ＡＧＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＹＺ６　 ＡＧＣＴＧＧＡＣＴＡＧＡＡＧＡＧＴＹＺ３２　ＡＧＣＴＧＧＡＣＣＡＧＡＡＧ ＡＧＹＺ５１　ＡＧＣＡＧＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＴＹＺ３３　ＡＧＣＡＧＧＡＣ ＡＣＧＡＡＧＡＧＨ−ｒａｓ　コドン１２　ＹＺ７　ＧＧＡＧＣＣＧＧＣＧＧＴ ＧＹＺ３４　ＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＴＧＴＹＺ３５　ＧＧＣＧＣＣＴＧＣＧＧ ＴＧＴＹＺ３６　ＧＧＣＧＣＣＣＧＣＧＧＴＧＹＺ３７　ＧＧＣＧＣＣＧＡＣＧ ＧＴＧＴＹＺ８　ＧＧＣＧＣＣＧＴＣＧＧＴＧＴＹＺ３８　ＧＧＣＧＣＣＧＣＣ ＧＧＴＧＹＺ９　ＧＣＣＧＧＣＴＧＴＧＴＧＧＧＹＺ４０　ＧＣＣＧＧＣＣＧＴ ＧＴＧＧＧＹＺ４１　ＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＧＹＺ４２　ＧＣＣＧＧＣＧ ＣＴＧＴＧＧＧＹＺ４３　ＧＣＣＧＧＣＧＴＴＧＴＧＧＧＹＺＩＩ　ＧＣＣＧＧ ＣＧＡＧＧＡＧＧＡＹＺ４４　ＣＧＣＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＧＹＺ４５　ＧＣＣ ＧＧＣＣＧＧＧＡＧＧＹＺ４６　ＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＹＺ４７　ＧＣ ＣＧＧＣＣＣＧＧＡＧＧＹＺ４８　ＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＹＺ４９　Ｇ ＣＣＧＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＹＺ５３　ＧＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＣＧＴＡＧＹＺ ５４　ＧＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＣＧＴＡＧＹＺ５５　ＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＣ ＧＴＡＹＺ５６　ＧＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＴＡＧＹＺ５７　ＧＧＡＧＣＴＧ ＣＴＧＧＣＧＴＡＹＺ５８　ＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＧＫ−ｒａｓ　コ ドン１３　ＹＺ５９　ＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＴＡＧＧＣＹＺ６０　ＧＣＴＧＧＴ ＴＧＣＧＴＡＧＧＣＹＺ６１　ＧＣＴＧＧＴＣＧＣＧＴＡＧＧＣＹＺ６２　ＧＣ ＴＧＧＴＧＡＣＧＴＡＧＧＣＹＺ６３　ＧＣＴＧＧＴＧＴＣＧＴＡＧＧＣＹＺ６ ４　ＧＣＴＧＧＴＧＣＣＧＴＡＧＧＣＫ−ｒａｓ　：Ｉトン６１　ＹＺ６５　Ａ ＧＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＹＺ６６　ＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧ ＹＺ６７　ＡＧＣＡＧＧＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＴＹＺ６８　ＧＣＡＧＧＴＣＧＡ ＧＡＧＧＡＧＹＺ６９　ＡＧＣＡＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＡＧＹＺ７０　ＧＣＡＧ ＧＴＣＣＡＧＡＧＧＡＧＹＺ７１　ＡＧＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＡＧＹＺ７２ 　ＧＣＡＧＧＴＣＡＣＧＡＧＧＡＧ浄書（内容に変更なし） 要　約　書 本発明は、ＧＴＰ結合蛋白質または蛋白質サブユニットをコードする核酸におい て、点突然変異か存在するか否かを検出する方法を提供する。該方法は、存在す る場合に、点突然変異の特徴付けを与える。好適な実３Ｉｌｉ態様において、本 方法は核酸分節の増幅および引続く配列特異的プローブのハイブリダイゼーショ ンを含む。該方法は、Ｇ−蛋白質αサブユニットまたはｐ　２１　ｒａｓ蛋白質 をコードする核酸に対して好適である。

手続補正書泪地 １−事件の表示 エフ、ホフマン　−　ラ　ロシュ　アーゲー４−代理人 ６−補正により増加する請求項の数 ７−櫂正の対象 明細書、請求の範囲及び要約１翻訳文 闇ａｉｍ査報告 国際調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．生物学的試料に存在する核酸分節中のＧ−蛋白質αサブユニットの点突然変 異を検出するに際し：（ａ）試料を、Ｇ−蛋白質αサブユニットプライマ対、重 合化試薬、およびデオキシヌクレオシド５′トリホスフェートと共に、各プライ マの伸長生成物が合成され得る条件下で処理し、ここで前記プライマ類は、Ｇ− 蛋白質αサブユニットの分節をコードする核酸の個々の鎖に対してハイブリッド 形成するために充分に相補的であって、前記プライマ対の一方の構成体から合成 された伸長生成物がその相補鎖から分離された場合に前記対の他方の構成体の伸 長生成物合成のためのテンプレートとして機能し得るものであり； （ｂ）該伸長生成物が合成されるテンプレート上からプライマ伸長生成物を単離 して単鎖分子を形成し；（ｃ）工程（ｂ）で生成される単鎖分子を工程（ａ）の プライマと共に、工程（ｂ）で生成される各単鎖分子をテンプレートとして使用 してプライマ伸長生成物が合成される条件下で処理し； （ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を少なくとも１回反復して増幅ＤＮＡを与え； （ｅ）Ｇ−蛋白質αサブユニットプローブを前記増幅ＤＮＡとハイブリッド形成 させ、ここで前記プローブは、前記増幅ＤＮＡ中の野生型および変異型核酸配列 から選択される配列にハイブリッド形成するであろう核酸配列を含み；ならびに （ｆ）ハイブリダイゼーションの生起の有無を検出すること、 を含んでなるＧ−蛋白質αサブユニット点突然変異の検出方法。
2. ２．工程（ｂ）および（ｃ）が少なくとも５回反復され、前記重合化試薬が熱安 定性ＤＮＡポリメラーゼである請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼである請求の範囲 第２項に記載の方法。
4. ４．前記試料がヒト腫瘍から取出される請求の範囲第１項に記載の方法。
5. ５．前記ヒト腫瘍が内分泌腺腫瘍である請求の範囲第５項に記載の方法。
6. ６．前記プライマ対が、Ｇｉα１、Ｇｉα２、Ｇｉα３、Ｇｚα、Ｇｏα、およ びＧｓαからなる群から選択されるＧ−蛋白質αサブユニットの部分配列をコー ドする核酸分節を増幅する請求の範囲第１項に記載の方法。
7. ７．前記核酸分節が、Ｇｓα４９、２０１、および２２７に対応するアミノ酸か らなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸をコードする請求の範囲第６ 項に記載の方法。
8. ８．前記プライマ対が、ＪＦＬ６９とＪＦＬ７０；ＪＦＬ１３５とＪＦＬ１３６ ；ＪＦＬ２２８とＪＦＬ１３５；ＪＦＬ２２９とＪＦＬ１３６；ＪＦＬ２２６と ＪＦＬ２２７；ＪＦＬ２２３とＪＦＬ２２４；ＪＬ５４とＪＬ５７；ＪＦＬ１０ ９とＪＦＬ１１０；ＪＦＬ１１０とＪＦＬ１１２：ＪＦＬ１１３とＪＦＬ１１４ ；ＪＦＬ１１５とＪＦＬ１１３；ＳＰ９とＳＰ１０；ＪＦＬ１３９とＳＰ１１； ＪＦＬ２０１とＳＰ１５；ＪＬ５５とＪＬ５６；ＪＦＬ２２３とＳＰ３３；ＪＦ Ｌ２２４とＳＰ３４；ＪＦＬ２３５とＪＦＬ２３７；ＪＬ５５とＪＦＬ２１２； ＪＦＬ２１５とＪＬ５６；およびＪＦＬ１３５とＪＦＬ２８６からなる群から選 択される請求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．前記プローブが、Ｇｉα１、Ｇｉα２、Ｇｉα３、Ｇｏα、ＧｓαおよびＧ ｚαからなる群から選択されるＧ−蛋白質サブユニットの部分配列をコードする ＤＮＡにハイブリッド形成する配列を含む請求の範囲第１項に記載の方法。
10. １０．前記プローブが、４９、２０１または２２７位のＧｓαアミノ酸に対応す るアミノ酸をコードするＧ−蛋白質部分配列にハイブリッド形成する請求の範囲 第１項に記載の方法。
11. １１．前記プローブが： 【配列があります】および 【配列があります】 からなる群から選択される請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. １２．前記核酸がＲＮＡであり、工程（ａ）に先立って逆転写されて二重鎖ｃＤ ＮＡ転写物を与える請求の範囲第１項に記載の方法。
13. １３．前記試料が、パラフィン埋設組織である請求の範囲第１項に記載の方法。
14. １４．Ｇ−蛋白質αサブユニットをコードする核酸の部分配列増幅のためのプラ イマ対であって、前記部分配列が、４９、２０１および２２７からなる群から選 択される位置のＧｓαアミノ酸に対応するアミノ酸をコードする核酸配列を含ん でなるオリゴヌクレオチドプライマ対。
15. １５．前記Ｇ−蛋白質αサブユニットが、Ｇｓα、Ｇｏα、Ｇｉα１、Ｇｉα２ 、Ｇｉα３およびＧｚαからなる群から選択される請求の範囲第１４項に記載の オリゴヌクレオチドプライマ対。
16. １６．Ｇ−蛋白質αサブユニットをコードする癌遺伝子および原生−癌遺伝子の 間を区別するためのオリゴヌクレオチドプローブであって、該プローブが、４９ 、２０１および２２７位のＧｓαアミノ酸に対応するアミノ酸からなる群から選 択されるアミノ酸をコードする核酸領域にハイブリッド形成するオリゴヌクレオ チドプローブ。
17. １７．Ｇ−蛋白質αサブユニットをコードする核酸の部分配列の増幅用オリゴヌ クレオチドプライマ対であって、ＪＦＬ６９とＪＦＬ７０；ＪＦＬ１３５とＪＦ Ｌ１３６；ＪＦＬ２２８とＪＦＬ１３５；ＪＦＬ２２９とＪＦＬ１３６；ＪＦＬ ２２６とＪＦＬ２２７；ＪＦＬ２２３とＪＦＬ２２４；ＪＬ５４とＪＬ５７；Ｊ ＦＬ１０９とＪＦＬ１１０；ＪＦＬ１１０とＪＦＬ１１２；ＪＦＬ１１３とＪＦ Ｌ１１４：ＪＦＬ１１５とＪＦＬ１１３；ＳＰ９とＳＰ１０；ＪＦＬ１３９とＳ Ｐ１１；ＪＦＬ２０１とＳＰ１５；ＪＬ５５とＪＬ５６；ＪＦＬ２２３とＳＰ３ ３；ＪＦＬ２２４とＳＰ３４；ＪＦＬ２３５とＪＦＬ２３７；ＪＬ５５とＪＦＬ ２１２；ＪＦＬ２１５とＪＬ５６；およびＪＦＬ１３５とＪＦＬ２８６からなる 群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマ対。
18. １８．Ｇ−蛋白質αサブユニットの分節をコードする核酸中の点突然変異検出用 プローブであって：【配列があります】および 【配列があります】 からなる群から選択されるプローブ。
19. １９．試料中のＧ−蛋白質αサブユニットをコードする核酸において、存在する 場合に点突然変異を検出する方法であって： （ａ）Ｇ−蛋白質αサブユニットプローブを前記試料にハイブリッド形成させ、 および （ｂ）ハイブリダイゼーションの生起の有無を測定すること、 を含む検出方法。
20. ２０．別個の容器に、 （ａ）ＰＣＲ反応において増幅Ｇ−蛋白質ＤＮＡ分節を与えるために好適なＧ− 蛋白質プライマ対；（ｂ）前記ＤＮＡ分節に、野生型である場合にハイブリッド 形成する野生型配列を含むＧ−蛋白質プローブ；および （ｃ）点突然変異が前記ＤＮＡ分節に存在する場合に該点突然変異を検出するた めの、点突然変異を含む配列を含んでなるＧ−蛋白質プローブ、 を含んでなるＧ−蛋白質αサブユニットをコードする核酸の点突然変異検出用キ ット。