JPH044898A - 野生型ｐ５３遺伝子の欠失の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、癌診断の分野に関する。更に詳細には、本発
明は、腫瘍細胞からの野生型ｐ５３遺伝子の欠失又は変
異の検出に関する。

近年の研究により、結腸直腸癌の進行の際にいくつかの
遺伝子的変化が起きることが示され、その中で最もよく
生じるものは第１７染色体の短腕（１７ｐ）の欠失であ
る。ＲＡＳ遺伝子変異などのいくつかの遺伝子変異は結
腸直腸癌進行の比較的初期に起きることが分かっている
のに対して、染色体１７ｐの欠失は良性（腺腫）から悪
性（癌腫）への転換と関連している後期の現象としてよ
く見られるものである。フォーゲルシュタイン（Ｖｏ（
ｃｌｓｋｅｉｎ）他、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕ
ｒｎａｔ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　Ｖｏｌ、３１９
．　ｐ５２ｓ、　１９１１ｇ参照。

前駆体である腺腫が一様に治療可能なのに対して、癌腫
はしばしば致死なので、この転換を媒介する分子的現象
は非常に重要なものである。染色体１７ｐの対立遺伝子
欠失現象は、結腸癌に加えて、乳癌、肺癌などを含む多
岐にわたっており、癌化過程において染色体１７ｐ上に
位置する遺伝子の重要性がさらに強調される。対立遺伝
子欠失は染色体１７ｐの広範な領域に渡ることが報告さ
れているので、癌化進行の原因となる遺伝子領域を定義
することが、本分野では必要とされている。

本発明の目的は、ヒトの腫瘍組織の診断法を与えること
である。

本発明の別の目的は、野生型ｐ５３５３遺伝子を、該遺
伝子機能を失った細胞に供給することである。

本発明のさらに別の目的は、ポリメラーゼ連鎖反応を用
いることにより、ｐ５３遺伝子のヌクレオチド配列を決
定するためのキットを与えることである。

本発明のさらに別の目的は、ヒトｐ５３遺伝子における
変異の検出のための核酸プローブを与えることである。

本発明の上記の目的およびその他の目的は、後述の一つ
またはそれ以上の態様によって与えられる。本発明の一
つの態様においては、ヒトの腫瘍組織の診断法は：ヒト
から癌の疑いのある組織を単離すること；野生型ｐ５３
遺伝子またはその発現産物の該組織からの欠失を検出す
ることであって、該欠失が組織の癌性を示唆するもので
あること；を含むものとして与えられる。

本発明の別の態様では、ｐ５３遺伝子内の変異のために
該遺伝子機能が失なわれた細胞に野生型ｐ５３５３遺伝
子を供給するための方法であって、野生型１）５３遺伝
子を該遺伝子機能を失った細胞に、該野生型遺伝子が細
胞内で発現するように導入することからなる方法が与え
られる。

本発明のさらに別の態様では、ポリメラーゼ連鎖反応に
よってｐ５３遺伝子のヌクレオチド配列の決定のための
キットが与えられる。キットは、−重鎖ＤＮＡプライマ
ーのペアのセットを含んでおり、該セットによりｐ５３
遺伝子コード配列の全ヌクレオチドの合成が可能となる
ものである。

本発明のさらに別の態様では、ヒト野生型ｐ５３遺伝体
音列に相補的で、変異型ｐ５３遺伝子とはミスマツチを
形成することかできる核酸プローブが与えられ、それに
よって酵素的または化学的切断、あるいは電気泳動度シ
フトによってそれらの検出か可能となる。

本発明は、ｐ５３遺伝子が実際に、腫瘍形成過程と関連
する染色体１７ｐ上の欠失および点変異の双方の標的で
あるという情報を本分野に供給する。この情報により、
特定の腫瘍組織の腫瘍状態を評価するための、高度に特
異的なアッセイを行うことが可能になる。

染色体１７ｐ上のｐ５３遺伝子内に、腫瘍形成と関連し
た突然変異現象か起きることは、本発明の発見である。

ある種の癌において、染色体１７ｐ上の対立遺伝子の欠
失が共通に見られることは既に知られていたが、その欠
失がｐ５３遺伝子を含む共通の領域を共有していること
はこれまで知られていなかった。さらに、欠失を有する
姉妹染色体上の第二の変異現象もｐ５３遺伝子内の変異
によって影響を受けることも知られてぃなかった。

姉妹染色体の変異は、欠失、挿入、あるいは逆位なとの
全体としての組み換えは含まず、ｐ５３遺伝子全体計わ
たる多様な位置における点変異を含んでいる。発明者ら
は以下の理論に捕られれることを望まないが、観察され
た結果を説明する可能なメカニスムとして次の理論か提
案される。点変異が最初に起こり、欠失現象が次に起き
、後者の現象が腺腫から癌腫状態への腫瘍状態の転換と
関連していると考えられる。

本発明の診断法により、野生型ｐ５３遺伝子の欠失か検
出される。欠失は、欠失現象および／または点変異のど
ちらかによるものと考えられる。

一方のｐ５３対立遺伝子にのみ変異が生じた場合、初期
の腫瘍状態が示される。しかし、双方の対立遺伝子に変
異が生じた場合には、後期腫瘍過程が示される。欠失し
ていないｐ５３対立遺伝子（すなわち、欠失を持つ染色
体の姉妹染色体の上に存在するもの）は、ミスセンス変
異、フレームシフト変異などの点変異に関してスクリー
ニングを行うことができる。これらのどちらの型の変異
によっても、機能しないｐ５３遺伝子産物となる。さら
に、点変異現象は、ｐ５３遺伝子のプロモーター内なと
の制御領域に起きる可能性もあり、それによりｐ　５３
ｍＲＮＡの発現の欠失または減少が引き起こされる。

組織中の野生型ｐ５３遺伝子の欠失を検出するためには
、周辺の正常組織を含まない組織を単離することが有用
である。腫瘍細胞を豊富にする組織調製法は、本分野で
は既知である。例えば、パラフィンまたはクリオスタッ
ト切片から組織を単離することができる。フローサイト
メトリーによって癌細胞を正常細胞から分離することも
可能である。正常細胞から腫瘍細胞を分離するためのこ
れらの技術およびその他の技術は本分野ではよく知られ
ている。腫瘍組織に正常細胞が高度に混入している場合
には、変異の検出はより困難になる。

点変異の検出は、腫瘍組織内に存在するｐ５３対立遺伝
子の分子的クローニング、および本分野で既知の技術を
用いてその対立遺伝子の塩基配列を決定することによっ
て行うことができる。あるいは、腫瘍組織由来のゲノム
ＤＮＡ調製物から直接ｐ５３遺伝子配体音増幅するため
に、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることも可能である。

引き続き、増幅された配列のＤＮＡ塩基配列を決定する
ことができる。ポリメラーゼ連鎖反応それ自体は本分野
ではよく知られている。サイキ（Ｓａｉｋｉ）他、５ｃ
ｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２３９．　ｐ、４８７．１９８
１１；米国特許第４，６８３，２０３号明細書、米国特
許第４，６８３，１９５号明細書参照。ｐ５３遺伝子を
増幅するために用いられる特異的プライマーは以下で詳
細に述べる。

ｐ５３遺伝子の特異的欠失も検出可能である。

例えば、ｐ５３遺伝子あるいは周辺のマーカー遺伝子に
対する制限断片長条型性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒ
ａｇｍｅｎｔ　Ｉｅｎｇ［ｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓ
ｍ　；　ＲＦＬＰ）プローブを１］５３対立遺伝子欠失
の評価に用いることが可能である。本分野で既知の、欠
失を検出するためのその他の技術も使用することができ
る。

野生型ｐ５３遺伝子の欠失は、ｐ５３遺伝子の野生型発
現産物の欠失に基づいて検出することも可能である。こ
のような発現産物としては、ｍＲＮＡおよびｐ５３タン
パク質産物自体の双方が含まれる。点変異は、ｍ　ＲＮ
　Ａを直接、またはｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡの分
子的クローニングを介して塩基配列決定を行うことによ
り検出される。クローニングされたｃＤＮＡの配列は、
本分野ではよく知られたＤＮＡ塩基配列決定法を用いて
決定することができる。ｃＤＮＡは、以下で詳細に述べ
るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって塩基配列決
定を行うことも可能である。

あるいは、ｐ５３遺伝子またはそのｍＲＮＡ産物中の点
変異を検出するために、ミスマツチ検出を行うことも可
能である。この技術は塩基配列決定よりは感度が落ちる
が、多数の腫瘍に関して行う場合にはより簡便である。

ミスマツチ切断法の例は、ＲＮアーゼ　プロテクション
法であり、ウィンター（Ｗｉｎｒｅｒ）他、Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、Ｖｏｌ、８２．　ｐ、７ｓ７５．１９＋１５、
およびメイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ）他、５ｃｉｅｎｃｅ
、　Ｖｏｌ、２３０．　ｐ、１２４２．１９８５に詳細
に記載されている。本発明の実施の際には、ヒト野生型
ｐ５３遺伝子に対して相補的な、標識されたリボプロー
ブがこの方法において用いられる。リボプローブと、腫
瘍組織から単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡのどちらか
とをアニール（ハイブリダイズ）させ、統いて、２量体
ＲＮＡ構造中のいくつかのミスマツチを検出することが
できる酵素ＲＮアーゼＡで消化する。ミスマツチがＲＮ
Ｎアーゼによって検出された場合には、ミスマツチ部位
で切断される。したがって、アニールさせたＲＮＡ調製
物を電気泳動ゲルマトリックス上で分離すると、ミスマ
ツチが検出されてＲＮＮアーゼによって切断された場合
には、リボプローブとｐ５３　　ｍＲＮＡとの２量体Ｒ
ＮＡ全長よりも短いＲＮＡ産物が検出されることになる
。リボプローブはｐ５３　　ｍＲＮＡまたは遺伝子全長
である必要はなく、どちらかの断片でよい。リボプロー
ブがｐ５３　　ｍＲＮＡまたは遺伝子の断片しか含んで
いない場合には、ミスマツチに関してｍ　ＲＮＡ配列全
体をスクリーニングするために、このようなプローブを
多数使用することが望ましい。

同様に、酵素的切断または化学的切断によりミスマツチ
を検出するために、ＤＮＡプローブを用いることも可能
である。コツトン（Ｃｏｔｔｏｎ）他、Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　　Ｖｏｌ
、ｇＳ、　３２９７゜１９８８；およびシェンク（Ｓｈ
ｅｎｋ）他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、７２．９８
９．１９７５参照。あるいは、マツチしている２量体と
比較した場合のミスマッチ２量体の電気泳動度のシフト
によってミスマツチを検出することも可能である。例え
ば、カリエロ（Ｃａｒｉｅｌｌｏ）、　Ｈ＋＋ｎ＋ａｎ
　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　ｖｏｌ、４２゜ｐ、７２６．１
９１１１１参照。リボプローブまたはＤＮＡプローブの
どちらを用いても、変異を含む可能性のある細胞性ｍＲ
ＮＡまたはＤＮＡを、ノ＼イブリダイゼーション前にＰ
ＣＲ（以下参照）によって増幅させることができる。

ポリメラーゼ連鎖反応の使用により増幅された、腫瘍組
織由来のｐ５３遺伝子のＤＮＡ配列は、対立遺伝子特異
的なプローブを用いてスクリーニングすることもできる
。このようなプローブは核酸すりゴマ−であり、その各
々が既知の変異を有するｐ５３遺伝子配体音領域を含ん
でいる。例えば、一つのオリゴマーは約３０ヌクレオチ
ドの長さであり、ｐ５３遺伝子配体音一部に対応する。

ｐ５３遺伝子の１７５番目のコドンをコードする位置で
、このオリゴマーは、野生型のコドンのバリンではなく
、アラニンをコードしている。このような対立遺伝子特
異的プローブのセットを用いることにより、ｐ５３遺伝
子内の既に同定されている変異の存在を同定するための
、ＰＣＲ増幅産物のスクリーニングを行うことができる
。対立遺伝子特異的プロニブと増幅されたｐ５３遺伝子
配体音のハイブリダイゼーションは、例えばナイロンフ
ィルター上で実施することができる。ある特異的なプロ
ーブのハイブリダイゼーションは、その対立遺伝子特異
的プローブと同じ変異は腫瘍組織内に存在していること
を示唆する。

野生型ｐ５３遺伝子の欠失は、野生型ｐ５３５３タンパ
ク質の欠失に関するスクリーニングを行うことによって
も検出可能である。ｐ５３タンパク質が間違いなく有す
るすべての機能はこれから解析されなければならないが
、少なくとも二つの特異的機能が既に知られている。タ
ンパク質ｐ５３はＳＶ４０ラージＴ抗原、およびアデノ
ウィルスＥ１Ｂ抗原に結合する。ｐ５３タンパク質がこ
れらの抗原の双方または一方に結合する能力を失うこと
は、遺伝子そのものの突然変異的変化を反映しているタ
ンパク質中の突然変異的変化を示唆する。あるいは、９
５３機能に関与する各エピトープがモノクローナル抗体
によって示されるような、モノクローナル抗体のパネル
を用いることもできる。パネル中のモノクローナル抗体
の結合の欠失または減衰は、ｐ５３タンパク質の突然変
異的変化、したがってｐ５３遺伝子自身の突然変異的変
化を示唆する。野生型ｐ５３遺伝子の欠失を検出するた
めには、変化したｐ５３タンパク質を検出するあらゆる
手段が使用可能である。

変異型ｐ５３遺伝子または遺伝子産物は、血清、糞便な
どの人体試料、または尿、喀痰などのその他の体液中で
検出可能である。組織中の変異型ｐ５３遺伝子または遺
伝子産物の検出のための上述の同し技術が、その他の人
体試料に適用される。

このような人体試料のスクリーニングを行うことにより
、多数の型の癌に対して簡便な初期診断を行うことかで
きる。さらに、化学療法や放射線療法の進行も、変異型
ｐ５３遺伝子または遺伝子産物ｊ口開してこのような人
体試料を試験することにより、より簡便に追跡すること
が可能である。

腫瘍組織の診断に関する本発明の方法は、広範な腫瘍に
わたって適用可能である。これらには、肺癌、乳癌、脳
腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、および
胃癌が含まれる。さらに、本方法は、白血病および骨髄
腫にも使用可能である。以上のように、ｐ５３遺伝子は
広い範囲の腫瘍の進行において役割を果たしていること
が示される。本発明の診断法は、ｐ５３が腫瘍形成に役
割を果たしているあらゆる腫瘍に対して適用可能である
。本発明の診断法は、臨床医が適当な処置法を決定でき
るようにするために有用なものである。例えば、双方の
ｐ５３対立遺伝子の欠失が示された腫瘍では、一方の１
）５３対立遺伝子の欠失が示された腫瘍よりも積極的な
治療法が薦められる。

本発明のキットは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いたｐ５
３遺伝子のヌクレオチド配列の決定に有用である。キッ
トは、ｐ５３遺伝子自体の増幅ＤＮＡ合成を開始させる
ために、ｐ５３遺伝子内、または周辺の配列にアニール
することができる一本鎖ＤＮＡのペアのセットを含んで
いる。完全なセットにより、ｐ５３遺伝子コード配列の
全ヌクレオチドの合成が可能となる。プライマーのセッ
トにより、イントロンとエクソン双方の配列の合成が可
能な場合も、可能でない場合もある。しかし、全てのエ
クソン配列の合成が可能であるべきである。

増幅された配列の、それに続くクローニングを容易にす
るために、プライマーの５′末端に制限酵素切断部位を
付加させることができる。したがって、プライマーの全
ヌクレオチドは、制限酵素切断部位を形成させるのに必
要な数ヌクレオチドを除いては、ｐ５３配列由来である
が、またハ、ｐ５３に隣接した配列由来である。このよ
うな酵素と部位は本分野ではよく知られている。プライ
マー自体は、本分野で既知の技術により合成することが
できる。一般に、プライマーは、市販の合成機を用いて
作製される。

望ましい態様においては、プライマーのペアのセットは
、いかに示す５つのプライマーのペアを含む。プライマ
ーペア１　：　Ｓ’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＡＣＧＧ
ＴＧＡＣＡＣＧ−３’およびＳ’　−ＧＧＡＡＴＴＣＧ
ＧＴＧＴＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’：ペア２：５
″−ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣ
−３″およびＳ’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＣＴＧＴ
ＧＡＣＴＧＣＴＴＧ−３°：ペア３：５′ＧＧＡＡＴＴ
ＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧ−３’および５　’　
−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＧＣＣＣＡＴＧＣＡＧ−３
’　、ペア４：５″−ＧＧＡＡＴＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡ
ＣＣＡＣＣＡＴＣＣ−３’および５’−ＧＧＡＡＴＴＣ
ＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＴＴＴＣ−３゜；ペア５　：
　５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣ
ＴＣＣ−３’および５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧ
ＧＣＡＧＧＧＧＡＧＧＧ−３’。

本発明で与えられる核酸プローブは、上述の、点変異を
検出するためのＲＮアーゼプロテクション法に有用であ
る。これらは、その他の技術を用いてｐ５３遺伝子また
はｍＲＮＡとのミスマッチの検出にも使用されうる。ミ
スマ・ノチは、他の酵素（例工ばＳ１ヌクレアーゼ）、
化学物質（例えば、ヒドロキシルアミン、あるいはオス
ミウムテトロキシド、およびピペリジン）、あるしＸは
完全にマツチしている／１イブリ・ンドと比較した場合
のミスマツチしている７％イブリッドの電気泳動度の変
化を用いて検出することも可能である。これらの技術は
本分野では既知のものである。コ・ントン（前出）、シ
エンク（前出）、マイヤーズ（前出）、ウィンター（前
出）、およびノヴアソク（Ｎｏｖ＊ｃｋ）他、Ｐｒｏｃ
、　Ｎｘｔｌ、　Ａｃ５ｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　ｖ
ｏｌ、８３．　ｐ、Ｈ６、１９８６参照。ｍＲＮＡとの
ミスマ・ノチの検出にリボプローブを用いる場合には、
リボプローブ１まヒト野生型９５３遺伝子のｍ　ＲＮ　
Ａと相補的である。したがって、センス鎖と逆の極性で
あるＩこめ、ｐ５３タンパク質をコードしていなし１と
ｌ、％う点で、リボプローブはアンチセンスプローブで
ある。

般に、リボプローブは本分野で知られてしする方法のい
ずれかを用いて、放射性標識が施される。ＩＪボブロー
ブをＤＮＡとのミスマ・ンチの検出に使用する場合には
、リポプローブはセンスまたはアンチセンスのどちらの
極性でもよい。同様に、ＤＮＡプローブもミスマツチの
検出に使用可能である。

プローブはｐ５３遺伝子の変異型対立遺伝子に相補的で
もよい。これらは、ミスマツチよりも、ハイブリダイゼ
ーションに基づいて、他の患者における同様の変異を検
出するのに有用である。これらに関しては上で既に述べ
てあり、対立遺伝子特異的プローブと呼んでいる。

本発明によって、変異型ｐ５３対立遺伝子を有する細胞
に、野生型ｐ５３の機能を供給する方法も与えられる。

野生型ｐ５３遺伝子またはその一部を、遺伝子が染色体
外で維持されるようなベクターにつなぎ、細胞に導入す
ることができる。このような状況で、染色体外で、その
細胞が野生型ｐ５３遺伝子を発現するようになる。細胞
内に存在する変異型ｐ５３遺伝子が発現されている場合
には、野生型ｐ５３遺伝子または該遺伝子の一部は変異
型一部はよりも高レベルで発現されなければならない。

これは、変異型タンパク質が野生型タンパク質と多量体
を形成すると考えられているためである。（エリャフ（
Ｅｌｉｙａｂｕ）他、０ｎｃｏＢｎｅ。

Ｖｏｌｉ、　Ｌ３１３．１９８ｇ。）変異型ｐ５３対立
遺伝子を有する細胞に遺伝子の一部が導入され、発現さ
れる場合には、遺伝子部分は細胞の非腫瘍性増殖に必要
なｐ５３５３タンパク質をコードしていなければならな
い。より望ましい状況は、野生型ｐ５３遺伝子またはそ
の一部が、細胞内に存在する内在性変異型ｐ５３遺伝子
と組み換えを起こすように変異型細胞に導入されること
である。ｐ５３遺伝子変異を訂正することになる、この
ような組み換えは二重の組み換え現象が必要である。組
み換え、および、染色体外維持の双方をを目的とする、
遺伝子導入用ベクターは本分野では既知であり、適当な
ベクターは全て使用可能である。

ｐ５３活性を有するポリペプチドまたはその他の分子は
、変異型ｐ５３対立遺伝子を有する細胞に供給すること
ができる。活性分子は例えば、マイクロインジェクショ
ン、またはリポソームによって細胞に導入可能である。

あるいは、このような活性分子のあるものは、細胞によ
って活発に、または拡散によって取り込まれる。４のよ
うな活性分子の供給は、初期腫瘍過程に効果があるであ
ろう。　癌に対する素因は、ヒトの正常組織を試験する
ことによって確認し得る。例えば、ｐ５３変異型生殖系
列を受は継いだ人は、癌にかかりやすい傾向がある。こ
れは、人体のいかなる組織由来のＤＮＡを試験すること
によっても決定可能である。もっとも簡便には、血液を
採取し、血液細胞からＤＮＡを抽出することができる。

点変異、または欠失のいずれかによる野生型９５３対立
遺伝子の欠失は、上述のいずれの方法によっても検出可
能である。ＤＮＡはこの目的のために、胎児組織から抽
出し、試験することもできる。

以下に述べるものは、例示のみを目的とするものであり
、上述のように広い意味での本発明の範囲を制限するこ
とを意図したものではない。

実施例１ 本実施例は、ヒトの結腸直腸癌の染色体１７ｐ上の欠失
が１７ｐ１２と１７ｐ１３．３のバンドの間の共通の領
域を含んでいることを示すものである。

染色体１７ｐ上の制限断片長条を性（ＲＦ　Ｌ　Ｐ）を
検出する２０のＤＮＡプローブを、結腸直腸癌中の対立
遺伝子欠失パターンの試験に使用した。

これらのプローブは、染色体１７ｐの一部を含むヒト−
１歯類体細胞ハイブリッドとのノ＼イブリダイゼーショ
ンに基づいて、１７ｐの７つの分離した領域にマツピン
グされている［Ｐ、ヴアン・チュイネン（ｖｓｎ　Ｔｕ
ｉｎｅｎ）、　Ｄ、Ｃ，リッチ（Ｒｉｃｈ）、　Ｋ、Ｍ
、サマーズ（Ｓａ＋＊ｍｃｒｓ）、　Ｄ、■、レドベタ
ー（Ｌｅｄｂｅｔｊｅｒ）。

Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｌ、　３フ４　（１９８７）；Ｐ、
ヴアン・チュイネン他、＾ｒｂｊ、　［ｌｕｍ、Ｇｅｎ
、　４３．０７　（１９１１１１）；　Ｐ、Ｒ，７フィ
ン（Ｆａｉｎ）他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１，３４０（１
９ｇ？）ＨＤ、ｔｌ、レドベターとり、Ｆ、バーカー（
Ｂｓｒｋｅｒ）の未発表データ］。

ＤＮＡを５８の癌試料から調製し、隣接した正常結腸粘
膜由来の口Ｎ八と比較した。正常細胞内に存在する二つ
の対立遺伝子のうちのどちらかが、腫瘍細胞由来ＤＮＡ
で失われていた場合に、対立遺伝子欠失として数えた。

はとんどの固体腫瘍はかなりの数の非腫瘍性間質細胞お
よび炎症細胞を含んでいるため、腫瘍全体から調製した
ＤＮＡにおいて対立遺伝子欠失を検出することは困難で
ある。そのため、腫瘍細胞を高率で含んでいる腫瘍領域
を組織病理学的に同定してから単離し、既に報告されて
いるように、これらの領域のラジオスタット切片からＤ
ＮＡを調製した［Ｓ、ゴルノ（Ｇｏｅｌｚ）、　Ｓ、Ｒ
，ハミルトン（Ｈｓｍｉｌｔｏｎ）、　Ｂ、フォゲルシ
ュタイン（Ｖｏｌｅｌｓｔｅｉｎ）、Ｂｉｏｃｈｉｅｍ
、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｎ＋ｍｕｎ、　Ｈｏ、　　１１ｇ　（１
９１１ｓ）；　Ｅ、Ｒ，フィーロン（Ｆｅａｒｏｎ）、
　Ａ、７　フィンバーブ（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ）、　Ｓ、
Ｒ。

ハミルトン、Ｂ、７オーゲルシユタイン、Ｎａｔｕｒｅ
　３１８、３７７（１９１５）］。腫瘍に隣接している
、はとんどが正常な結腸粘膜を各患者から得、コントロ
ールＤＮＡの調製に使用した。

各患者の正常粘膜において、２０のＲＦＬＰマーカーの
うち少なくとも５種で、２つの親の対立遺伝子を区別す
ることができた（各場合に関して“含情報″マーカー）
。腫瘍の７７％で、少なくとも３種のマーカーの対立遺
伝子欠失が示された。

染色体１７ｐ上の幾つかの、しかし全てではないマーカ
ーに関してヘテロ接合性を保持する８個のＭｇＫの研究
により、欠失の共通領域の決定が可能となった。

第１図は二人の患者から採取したデータの試料を示して
いる。患者５５１と５１０３の正常（Ｎ）および癌（Ｃ
）組織由来のＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで消化し
、断片を電気泳動で分離した。

ナイロンフィルターへのトランス７７−後、ＤＮＡを放
射性標識プローブとハイズリダイズさせた。

ＤＮＡ精製、制限エンドヌクレアーゼ消化、電気泳動、
トランスファー、およびハイブリダイゼーションで用い
られた技術は、以前に報告されているように実施した［
Ｂ、フォーゲルシュタイン他、Ｎ、　ＥＢＩ　Ｊ、　ｏ
ｒ　ＭＣｄ、　３１９．５２５　（１９８ｇ）；　ゲル
ツ（前出）：フイーロン（前出）］。パネルＡ、Ｂ、Ｃ
。

およびＦではＴｘｑｌ消化を行い、パネルＤではＢａｌ
１ａｌ。

／＜　４　）しＥではＭｓｐｌを用いｔ二。つオツンユ
しｔこフィルターのオートラジオグラフを示している。

“１”および“２″で表されている対立遺伝子は、正常
ＤＮＡ試料に存在する、それぞれ大きい多型性対立遺伝
子および小さい多型性対立遺伝子を示している。

使用したプローブは、Ａ　：　ＭＣ丁３Ｓ、２．　Ｂ　
：　ＥＷ３０１；Ｃ：　ＹＮ［１３７１，Ｄ　：　ＹＮ
２２１１；　Ｅ　：　ＭＣＴ３Ｓ、１．　Ｆ　：　ＥＷ
５０５であった。パネルＡおよびＥで、対立遺伝子ｌの
欠失が見られる；　パネルＢおよびＤでは対立遺伝子２
の欠失が見られる。

患者３５１由来の腫瘍は、１７ｐの末端側由来の３つの
マーカーの親の対立遺伝子を二つとも保持していたが、
情報を含んでいる、より連結部に近い全てのプローブは
、一つの対立遺伝子が欠失していた（第１図、Ａ−Ｃ）
。これにより、この腫瘍における対立遺伝子欠失の標的
は、３種の保持されたマーカーよりも連結部に近いこと
が示唆された。マーカー欠失パターンの解析を第２図に
示す。患者３１０３由来の腫瘍は、ＥＷＳＯ５よりも連
結部に近い全ての含情報座位で双方の対立遺伝子を保持
していたが、いくつかのより末端側のマーカーの対立遺
伝子欠失が見られた（第１図、Ｄ−Ｆ）。第２図で示さ
れデータを統合すると、欠失の最も小さい共通領域は、
１７ｐ１２のバンド内のマーカーと、１７ｐ１３．３の
バンド内のマーカーとの間にわたることが示唆された。

この位置は、全ての腫瘍において欠失の標的が同一の１
７ｐ座位であるという過程に基づいたものである。

実施例２ 本実施例は、ｐ５３の欠失をもつ結腸直腸癌において、
欠失していないｐ５３対立遺伝子が組み換えを起こして
いないことを示すものである。

まず、２０，０００塩基対以上にわたるエクソンを検出
するｐ５３　　ｃＤＮＡプローブ（全てのタンパク質を
コードするエクソンを含む）［Ｐ、ラム（Ｌａ＋＊ｂ）
。

Ｌ、Ｖ、クロ７オード（Ｃｒａｖｆｏｒｄ）、Ｍｏ１．
　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

６、　　Ｎ７９　（１９１６）；　Ｒ，ザクートーホウ
リ　（２ｚｋｕｔ。

Ｈｏｕｒｉ）、　Ｂ、ビエンツータドモア（ｌｉｅｎｚ
−Ｔａｄｍｏｒ）、Ｄ。

ギポル（Ｇｉｖｏｌ）、　Ｍ、オレン（Ｏｒｓｎ）、　
ＥＭＢＯＪ、ｉ、　１２５１　（１９８５）；　Ｎ、ハ
リス（Ｈａｒｒｉｓ）、　Ｅ、プリル（Ｂｒｉｌｌ）。

０．７＋ハト（Ｓｈｓｈａｔ）、　Ｍ、プロコシマー（
Ｐｒｏｋｏｃｉｍｅｒ）、　Ｔ、Ｅ、アトマス（Ａｄｍ
ｘｓ）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、。

６、４６５０　（１９８６）、　Ｇ、マドラシュースキ
ー（Ｍａｉｌｉｓｈｅｖｓｋ　ｉ）他、Ｍｏ１．　Ｃｅ
１１．　Ｂｉｏｌ、　７．９６１　（１９ｇ７）；　Ｖ
。

Ｌ、バックマン（Ｂａｃｈｍａｎ）他、ＧｔｎｃＴｏ、
　ＵＳ　（１９０）］を、］サザンブロッティング実で
８２の結腸直腸癌（５０の一次標本と３２の細胞系）の
ＤＮＡを試験するために使用した。

ＥｃｏＲＩまたはＢａｍｔ［Ｉ消化によって、ｐ５３遺
伝子の組み換えは見いだされず、双方の対立遺伝子の欠
失も見られなかった。ｐ５３の発現は、ｐ５３コード配
列から遠くに離れた、全体としての遺伝子変化によって
影響を受けている可能性があるため、ｐ５３５３遺伝子
の大きな制限断片を調べるために、パルスフィールド電
気泳動を用いた。制限エンドヌクレアーゼＥｅｏＲＶ、
　ＰａｃＲ７１，Ｎｏｔｌ、および５ＪＩＩによる切断
によって、正常細胞のＤＮＡから４５−３５０ｋｂのｐ
５３遺伝子を含む断片が生成された。これらの４種の各
酵素で調べた２１の結腸直腸癌細胞系由来のどのＤＮＡ
にも、変化は検出されなかった。

実施例３ 本実施例は、ｐ５３欠失を含む結腸直腸癌において欠失
していないｐ５３対立遺伝子が正常なサイズで、はとん
どの場合正常な量のｍＲＮＡを発現することを示すもの
である。

２２の結腸直腸癌（６の一次腫瘍と１６の細胞系）由来
のＲＮＡに関してノザンプロット分析を行った。ｐ５３
の発現は細胞増殖および／またはトランスフォーメーシ
ョンと関連しているので、同様に発現が制御されている
その他の遺伝子をコントロールとして用いた（ｃ−ｍｙ
ｃ、　ヒストン［１３゜および、ホスホグリセレートキ
ナーゼ）。

ＲＮＡはほとんどが正常である結腸粘膜、−沈痛標本、
または腫瘍細胞系から精製し、電気泳動で分離した。細
胞系は一般に、Ｄ、およびＭ、ブラテイン（Ｂｒａ口５
ｉｎ）から供与されたものが、あるいはアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（米国メリーランド州
ロックビル）から入手したものである。全細胞性ＲＮＡ
は、酸−グアニジウム抽出法によって単離した［Ｐ、コ
ムチンスキー（Ｃｈｏｓｅ２ｙｎｓｋｉ）、　Ｎ、サッ
チ（Ｓａｃｃｈｉ）、　Ａｌｌ！１．　Ｂｉｏｃｈｅ＋
ｅ、　１６２、１５６　（１９８７）］。５マイクログ
ラムを１．５％　２（Ｎ−モルホリノ）エタン硫酸−ホ
ルムアルデヒド　アガロースゲルを用いて電気泳動によ
って分離し、ナイロンフィルターに電気泳動的にトラン
スファーした。ＲＮＡはナイロンフィルターにトランス
ファーされ、放射性標識を施したｐ５３遺伝子プローブ
とハイブリダイズさせた。プローブの標識、ハイブリダ
イゼーション、洗浄、および、オートラジオグラフィー
は、既に報告されているように行った［フィーロン（Ｆ
ｅｘｒｏｎ）他、５ｃｉｓ＋＋ｃｓ。

Ｖｏｌ、２３ｇ、　ｐ、Ｉ９３１９８７；　フォーゲル
シュタイン他、Ｎ、　ＥＢｌ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｍｅｄ、
、　Ｖｏｌ、３１９．　ｐ、５Ｎ、　１９０；およびゴ
ルフ（前出）；およびフィーロン、Ｎ１ｔｕｒｅ。

（前出）］。オートラジオグラフは１ｇ−２４時間感光
させた。

ｐ５３プローブは、Ｄ、ギポル（Ｇｉｖｏｌ）が寛大に
も提供してくれた、ｐ５３　　ｃＤＮＡクローンの１．
８ｋｂ　Ｘｂｘｌ断片を用いた［ＥＭＢＯＪ、　Ｖｏｌ
、４．　ｐ、Ｎ５１　（１９８５）］。ｃ−ａｙｅのプ
ローブは、ｅ−ａｙｅの第２エクソンを含む１．６ｋｂ
　５ｓＬＩゲノム断片を用いた［Ｋ。

アリタロ（Ａｌｉｊ＊ｌｏ）他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃ５ｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８０．１７０７　（１９ｇ３）］。シグナルを
フィルターから除去し、ｃ−ＩＩｌｙｅ遺伝子プローブ
をプロットに再ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ
させたフィルターのオートラジオグラフを第３図に示す
。

検出されたｐ５３　　ｍＲＮＡのサイズは２．８ｋｂで
あり、Ｃ−ｌＦｃのｍＲＮＡは２．５ｋｂであった。

レーン１−６およびレーン１２のＲＮＡは、ヒト組織［
正常結腸粘膜（Ｎ）または癌生検（Ｃ）１から調製した
。レーン７−１１および１３のＲＮＡは、結腸直腸癌細
胞系から調製した。レーン１．２：患者５３４５．それ
ぞれＮおよびＣ０レーン３．４：患者５３５３．それぞ
れＮ８よびＣ０レーン５．６：患者５３６９．それぞれ
ＮおよびＣ０レーン７：５Ｗ８３７．　　レーン８：５
Ｗ４８０゜レーン９　：　ＬｏＶｏ、　　レーン１０：
５Ｗ９４８゜レーン１１：５Ｗ１４１７．レーン１２：
患者５１１５、Ｃ，レーン１３　：　ＲＫＯ０ｐ５３　
　ｍＲＮＡのサイズは、２２の全ての腫瘍で正常（２，
８ｋｂ）であった。さらに、ｐ５３遺伝子のｍＲＮＡの
相対量は常に、少なくとも結腸直腸癌細胞程度で、正常
結腸粘膜と同程度であり、カラブレツタ（Ｃａｌａｂｒ
ｅｌｆａ）他の結果を確認するものであッｌ二（Ｃａｒ
ｅｅｒ　Ｒｅ５ｅｉｒｃｈ、　Ｖｏｌ、４６．　ｐ、７
３Ｂ（１９８６））。しかし、４つの腫瘍では（レーン
１０１３）、他の腫瘍と比較して、比較的ｐ５３のｍ　
ＲＮ　Ａの発現が少ないことが観察された。この９５３
の低レベルの発現は特異的なものであり、同じ４つの腫
瘍でｃ−ｍｙｃ、ヒストン■３、およびホスホグリセレ
ートキナーゼのｍＲＮＡは他の結腸直腸癌と同様のレベ
ルで発現されており、少なくとも非ｍ瘍性結腸粘膜と同
程度に発現されていた。

実施例４ 本実施例は、−次腫瘍中の欠失していないｐ５３対立遺
伝子がコドン１４３に点変異を有することを示すもので
ある。

染色体１７ｐの対立遺伝子欠失を有するが、かなりの量
のｐ５３　　ｍＲＮＡが発現されている腫瘍を選択した
。残存しているｐ５３対立遺伝子由来のｃＤＮＡクロー
ンを単離し、遺伝子産物が異常であるかどうかを、塩基
配列を調べることにより決定した。

実際的な理由から、この試験には、ヌードマウス異種移
植片（Ｃｘ３）の−次腫瘍を選択した。−次腫瘍はｐ５
３　　ｍＲＮＡに寄与しうる非腫瘍性細胞を含んでいる
が、異種移植片では（マウス由来の）非腫瘍性細胞はヒ
トｐ５３　　ｃＤＮＡクローン源とはなり得ない。７５
％以上の結腸直腸癌と同様に、　Ｃｘ３は染色体１７上
のいくつかのＲＦＬＰ（制限断片長条型性）マーカーの
対立遺伝子欠失を有しており、かなりの量のｐ５３　　
ｍＲＮＡを発現した。

通常の技術を用いて、Ｃｘ３　　ｍＲＮＡからほぼ全長
のｐ５３ｃＤＮＡをクローニングした。Ｕ、ガブラー（
Ｇｕｂｌｅｒ）とＢ、Ｊ、ホフマン（Ｈｏｆｌｍａｍ）
、　Ｇｅｎｅ２５、２６３　（１９ｇ３）に記述されて
いる様に、二本鎖のｃＤＮＡを合成し、ラムダｇｔ　１
０ベクターにクローニングした。ｃＤＮＡインサートを
ブルースクリプトＫＳ（ストツタジーン・クローニング
・システム、米国カリフォルニア州うホラ）にサブクロ
ーニングし、エクソヌクレアーゼＩ１１によって重なり
合った欠失を作製した（Ｓ、へ不コフ（Ｈｅ＋＋ｅｋｏ
ｌｌ）、　Ｇｅｎｅ　２Ｊ　３５１　（１９８４））。

Ｓ、ティパー（Ｔａｂｏｒ）とＣ，Ｃ，リチャードソン
（Ｒｉｃｂｘｒｄｓｏｎ）、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａ１１．＾ｃｘｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４．４７
６７　（＋９８７）、およびＲ。

クラフト（Ｋｒａｆ＋）、　Ｊ、ターディフ（Ｔａｒｄ
百ｐ、　Ｋ、Ｓ。

クララター（Ｊｒａｕｔｅｒ）、および１．Ａ、レイン
ワンド（Ｌｅｉｎｖａｎｄ）、　ＢｉｏＬｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ　６．５４４　（１９１１１１）によって報告さ
れているように、修飾されたＴ７ポリメラーゼを用いて
、二本鎖鋳型から塩基配列を決定し　ｔこ　。

クローンは、翻訳開始部位に関連のある刊９８の位置か
らポリアデノシンテイルまで、２５６７ヌクレオチドに
渡った。クローンはジデオキシ法によって塩基配列を決
定し、報告されているｐ５３ｃＤＮＡ配列［ラム（前出
）；ザクートーホウリ（前出）；ハリス（前出）；マド
ラシュースキー（前出）；およびバックマン（前出）参
照］と比較した結果、つのヌクレオチドの相違が同定さ
れた。コドン■３内でＴからＣへの変換が起こっており
（ＧＴＧからＧＣＧ）、コードするアミノ酸がバリンか
らアラニンに変わる。

配列の変化がｃＤＮＡクローニングの人工物ではないこ
とを確認するために、ＣＩ３のゲノムＤＮＡの推定され
る変異の周辺Ｉｌｌ塩基対（ｂｐ）を増幅するために、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ。

［サイキ（Ｓａｉｋｉ）他、５ｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ、
　２３９．　ｐ、４８７゜１９１１８）］　　を用いた
。

Ｔａｑポリメラーゼの存在下でＤＮＡを、コドン１４３
の６８塩基対上流と４３塩基対下流の配列に相補的なプ
ライマーオリゴマーとともにインキュベートした。用い
た上流のプライマーは５’−ＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧ
ＣＡＧＴＡＣＴＣＣ−３’であった；このプライマーの
６ヌクレオチドを除いてはバックマン他（前出）によっ
て決定されたｐ５３の第４イントロン由来の配列である
。下流のプライマーは、５’−ＧＡＣＧＣ［、ＧＧＴＧ
ＣＣＧＧＧＣＧＧ−３°であった。変性（１分、９０℃
）、アニーリング（２分、５５°Ｃ）、および伸長（２
分、７０　”Ｃ）を３５サイクル行い、ｌ１ｌｂｐの増
幅されたＤＮＡ断片が形成された。続いて電気泳動によ
り、１ｌｌｂｐの増幅された断片をポリアクリルアミド
ゲルから溶出し、フェノールとクロロポルム抽出によっ
て精製し／二。

ＰＣＲ産物の解析は、予測される変異が新しく１ｌｈａ
ｌ部位（ｎｔＨ７−４３０のＧＣＧＣ）を形成すること
を観察することにより、容易になった。精製した各ＤＮ
Ａ断片のアリフートをＨｈｘｌ”’Ｃ消化し、非変性ポ
リアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離し、
ナイロンフィルターに電気泳動的にトランスファーした
。断片を、Ｄ、ギポルがら供与されたｐ５３　　ｃＤＮ
Ａクローンの１．８ｋｂ　Ｘｂａｌ断片（ザコートーハ
ウリ、前出）から作成した放射活性ｐ５３プローブとハ
イブリダイズさせた。

腫瘍Ｃｘ３由来の１ｌｌｂｐ　ＰＣＲ産物をｌ１ｌｈａ
ｌで切断し、予想された６８と４３ｂｐのサブ断片が生
成された（第４図、レーン５．６）。Ｃｘ３を供与した
患者の正常細胞のＤＮＡ由来（７）Ｉｌｌｂｐ　　Ｐ　
ＣＲ産物ハ１ｌｈｉｌで切断されず（レーン７．８）、
他の患者の正常組織、−次結腸直腸癌、または異種移植
片から調製した３７の他のＤＮＡ試料のＰＣＲ産物も切
断されなかった（例えば第４図、レーン１−４）。した
がって、この腫瘍中に存在するバリンからアラニンへの
置換は、患者の生殖系列には存在しない特異的な点変位
の結果であった。

はとんどの溶出物に、少量の７３塩基対ＰＣＲ産物が混
入していた；しかじ、混入物はｔｌｂｘｌでは切断され
ず、分析を阻害することはなかった。

実施例５ 本実施例は、別の患者の第二の腫瘍が、ｐ５３遺伝子の
コドン１７５に点変異を含んでいたことを記述するもの
である。

結腸直腸癌異種移植片ＣＸＩは、Ｃｘ３と同様に、染色
体１７ｐ上の幾つかのマーカーが対立遺伝子欠失を起こ
しているが、正常なサイズの９５３ｍＲＮＡをかなりの
量発現していた。ｃＤＮＡの第一の鎖は、逆転写酵素の
存在下でランダムなヘキサマーを用いてＣ！Ｉ　　ＲＮ
Ａから調製した［Ｅ。

ヌーナン（Ｎｏｏｎｘｎ）と１．Ｂ、ロニンソン（Ｒｏ
ｎｉｎｓ＋＋ｏｎ）、Ｎｏｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、　！６．１１１３６６　（ｎｏ）コ。このｃＤＮ
Ａを５つの独立のＰＣＲ反応に使用し、ヌクレオチド−
５９から２４６（プライマーペア１）、＋１９かう５０
ｇ（）５　イ？−ヘア２）、４４３カラ７４０（７’　
５　イ？−ペア３）、６７９がら９７９（プライマーペ
ア４）、および９２５から１２４１１（プライマーペア
５）に対応する断片が生成された。これらの断片は、Ｉ
）５３遺伝子の全てのコード領域を含んでいた。　プラ
イマーペアＩ：　５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＡＣＧ
ＧＴＧＡＣＡＣＧ−３’および５’−ＧＧＡＡＴＴＣＧ
ＧＴＧＴＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’　；ペア２：
　５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＧ
ＧＣ−３°オヨび５　’　−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧ
ＣＴＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＧ−３’　；ペア３：　５’
−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧ−３’
オ、ｉび５’　−ＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＧＣＣＣＡ
ＴＧＣＡＧ−３’　ｉペア４：　５’−ＧＧＡＡＴＴＣ
ＴＧＡＣＴにＴＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣ−３’オヨヒ５’
−ＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＧＴＴＴＣ−
３’　、ペア５：　５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＣＡ
ＡＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−３’および５　’　−ＧＧＡ
ＡＴＴＣＡＡＡＡＴＧにＣＡＧＧＧＧＡＧＧＧ−３’。

全てのプライマーは、クローニングを容易にするために
５°末端にＥｃｏＲＩ切断部位を含む外来性ヌクレオチ
ドを含んでいた。ＰＣＲ産物はブルースクリプトＳＫの
ＥｃｏＲ１部位にクローニングし、実施例４で述べたよ
うに塩基配列決定を行った。ただｌ塩基対の変化が同定
され（ＣＧＣがらＣＡＣへの変化）、コドン１７５にお
けるこの変化は、二つの独立のクローンで見いだされた
。

塩基配列の変化が、多型性ではなく変異を表すものであ
ることを確認するために、腫瘍Ｃｘｌと正常細胞のゲノ
ムＤＮＡ由来のコドン１７５を含む断片をＰＣＲで増幅
した。ＰＣＲは、第５イントロンとその周辺のエクソン
配列を含む３１９塩基対断片の増幅に使用した。上流の
プライマーはプライマーペア３で使用されたものと同一
で、下流のプライマーは、Ｓ　’　−ＣＧＧＡＡＴＴＣ
ＡＧＧＣＧＧＣＴＣＡＴＡＧＧＧＣ−３’を用いた。Ｐ
ＣＲは実施例４と同様に行った。２％アガロースゲルで
の電気泳動に続き、グラスビーズへの結合によって３１
９ｂｐ断片を精製した［フォーゲルシュタイン他、Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎｓ口、　Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡＳＶｏｌ、７６、　ｐ、６１５．　（１９７９）
］　、　ＤＮＡ断片を５ｌｙｌを用いてｎｔ４７７で切
断し、ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノー断片と３２Ｐ−
ｄＣＴＰを用し）て、フィルインによって末端を標識し
た。非変性ポリアク１ノルアミドゲルによる反応混合液
の電気泳動ｊこ統し＼て、末端が標識されておりコドン
１７５を含んでし蔦る２Ｂｂｐ　５ｌｙｌ断片（ｎ１４
７７−７５８）を溶出し、フェノールとクロロホルムで
抽出して精製した。溶出したＤＮＡの一部をＲｈ！！で
切断し、断片を６％の塩基配列決定用ゲル上の電気泳動
によって分離した。

推測される変異は、通常コドン１７５（Ｉｌ１５２２か
ら５２５のＧＣＧＣ）に存在するＨｈｘ１部位を失った
。したがって、ＣＸＩを供与する患者の正常細胞のＤＮ
Ａ由来のＰＣＲ産物（第５図、レーン３．４）のＢｈａ
＋切断、または他の患者の腫瘍由来のＰＣＲ産物（レー
ン５．６）は、コドン１７５が野生型であると期待され
た場合の４１１ｂｐの産物しか産生じなかった。

それに対して、腫瘍Ｃｘｌ由来のＰＣＲ産物はｏｔ５２
４（コドン１７５に対応する）で切断されず、ｎＬ５４
２の正常な下流のＨｈｘ１部位での切断による、より大
きな６６ｂｐ断片しか見られなかった。パラフィン固定
した一次腫瘍、および肝臓転移試料由来のＰＣＲ産物の
解析でも、変異の存在を示唆する、特徴的な６６ｂｐ　
Ｈｈａｌ断片が示された。

実施例６ 本実施例は、ＲＮアーゼプロテクション法で試験した２
１の癌のうち５つが、野生型ｐ５３　　ＲＮＡ配列に対
する、検出可能な配列のミスマツチを含むｍＲＮＡ分子
を産生したことを示すものである。

ｐ５３アンチセンスＲＮＡプローブと９５３ｍＲＮＡと
のハイブリッドは、配列のミスマツチの部分でのみ、Ｒ
ＮアーゼＡによって切断される筈である。この方法は決
定的なものではなく、塩基配列決定はど感度もよくない
が、多数の腫瘍の迅速なスクリーニングが可能となる。

２１の結腸直腸癌（６の一次腫瘍および１５の細胞系）
を、ｐ５３コード領域のほとんどを含むプローブで試験
した。

ＩＯμｇの細胞性ＲＮＡを放射性標識したアンチセンス
ｐ５３　　ＲＮＡプローブとハイブリダイズさせ、　ハ
イブリッドをＲＮアーゼＡで消化した。

３２ｐで標識したＲＮＡプローブは、ブルースクリプト
（ストツタジーン・クローニング・システムズ、　米国
カリフォルニア州うホラ）にサブクロニングしたｐ５３
　　ｃＤＮＡからｉｎ　ｖｉｔｒｏで作製した。プロー
ブはｐ５３　　ｍＲＮＡコード配列の５６Ｉｎ＋　（翻
訳開始部位に対してｎ１４７３−１０３４）およびベク
ター由来の６０ｎＬを含んでいた。

プロテクトされた断片を、変性ポリアクリルアミドゲル
で電気泳動して分離した；ゲルのオートラジオグラフを
第６図に示す。ＲＮＡの由来は、レーンｌ　：　５１１
５．癌生検；レーン２：　５Ｗ１４１７；　レーン３：
　ＳＷ９４ｇ、　　レーン４：　ＲＫＯ；　　レーンＳ
：　５Ｗ４８０；レーン６：　ｆｃＡ、　　レーン７：
　ＧＥＯ，レーン８：　ＦＥＴ；　レーン９：異種移植
片Ｃｘ３；　レーン１０：正常結腸粘膜；レーン１１：
酵母ｒＲＮＡ；　レーン１２：　プローブのみ（ＲＮア
ーゼＡで消化していない）；レーン１３：５ＷＩ４１７
（長い感光時間のもの）である。レーン５．６および１
３で矢印で示した断片は、他の試料には存在しない。レ
ーン１３のオートラジオグラフの感光時間は７２時間で
あり、新しい断片を適切に可視化させた：他の全てのレ
ーンの感光時間は１０時間であった。

５つの癌由来のＲＮＡが、正常細胞由来のＲＮＡで見ら
れるものと異なるサイズの断片をプロテクトした。二つ
の場合には、新しい断片は検出される主要な断片であっ
た（第６図、レーン６．１３、矢印）。その他の場合に
は、新しい断片は、完全にプロテクトされた断片と比較
して弱い強度を示した（例えば、レーン５の５Ｗ４８０
）。コノヨうな部分的切断は予期されなかったものであ
る；Ｃｘ３とＣＸＩにおける変異は、ＲＮアーゼプロテ
クション法によっては検出されず（データは示していな
い）、多くのＲＮＡ配列のミスマツチは、ＲＮアーゼＡ
に対して部分的に、あるいは完全に耐性であることが示
されている。

同様の技術を用いて、さらに５つの結腸直腸癌、２つの
乳癌、および一つの肺癌に関してｐ５３遺伝子変異につ
いて調べた。全ての場合に、ｐ５３遺伝子の点変異が観
察された。

【図面の簡単な説明】

第１図は二人の患者、Ｓ５１および５１０３のヒト組織
中の染色体１７ｐ上の対立遺伝子欠失解析を示している
。 第２図は、結腸直腸癌における染色体１７ｐ上の共通な
欠失領域のマツプを示している。染色体１７ｐ由米の２
０の制限断片長条型性（ＲＦ　Ｌ　Ｐ）マーカーの、染
色体上の位置が示されている。これらのマーカーは、す
でに７つのサブ染色体領域（ＡからＦで示されている）
にマツピングされている。８つの腫瘍に対する結果が右
側に示されており、患者の同定番号が下に示されている
。閉じた円は、腫瘍中の一つの親の対立遺伝子における
欠失を示唆している；斜線の円は双方の親対立遺伝子の
保持を示唆している；開いた円は、マーカーが含情報的
ではない、すなわち患者の正常組織がそのマーカーに関
してヘテロではないことを示している。合成したパター
ンの前提は、１７ｐ上には単一の標的遺伝子があるとい
うことである。 、したがって、８個の腫瘍のすべてでヘテロ接合性が保
持されたマーカー（すなわち、斜線の円）は、標的座位
の外側に存在すると考えられる。 第３図は、結腸直腸癌中のｐ５３　　ｍＲＮＡのノザン
プロット分析を示している。レーンｌから６、および１
２のＲＮＡは、ヒト組織（正常結腸粘膜（Ｎ）または癌
生検（Ｃ））から調製されたものである。レーン７から
１１、および１３のＲＮＡは、結腸直腸癌細胞系から調
製されたものである。 第４図は、ｐ５３遺伝子コドン１４３の周辺のＩＩＩｂ
ｐ断片のポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物の解析を示し
ている。レーンｌ、２：結腸直腸癌異種移植片ＣＸＩ；
　レーン３．４：　ＣＸＩを供与した患者由来の正常繊
維芽細胞；レーン５．６：結腸直腸癌異種移植片ＣＸ３
　；　レーン１、Ｂ：　Ｃｘ３を供与した患者由来の正
常繊維芽細胞。 第５図は、ｐ５３コドン１７５のポリメラーゼ連鎖反応
分析を示している。レーン１１２：結腸直腸癌異種移植
片ＣＸＩ；　レーン３．４：　Ｃｘｌを供与した患者由
来の正常繊維芽細胞；レーン５．６：結腸直腸癌異種移
植片ＣＸ３゜偶数番号のレーンの試料のみがＨｈｘｌで
消化されている。 第６図は、ｐ５３　　ｍＲＮＡのＲＮＮアーゼプロチク
９３フ析を示している。細胞性ＲＮＡを放射性標識した
アンチセンスｐ５３　　ＲＮＡプローブとハイブリダイ
ズさせ、ハイブリッドをＲＮアーゼＡで消化した。ＲＮ
Ａの由来は、レーンｌ：ｓ！１５．癌生検；　１．−−
ン２：　５ＷＩ４１７；　レーン３：　５Ｗ９４８；　
　レーア４：　ＲＫＯ；　　レーア５：　５Ｗ４８０；
　　レーア６：　ＲＣＡ：　レーン７：　ＧＥＯ，レー
ン８：　ＦＥＴ、　レーン９：異種移植片Ｃｘ３　；　
レーンＩｏ：正常結腸粘膜；レーン１１：酵母ｆＲＮＡ
；　レーン１２：　プローブのみ（ＲＮアーゼＡで消化
していない）；レーン１３：　ｓｗ目１７（長時間感光
）である。レーン５．６、および１３で矢印で示した断
片は、他の試料には存在しない。 ＦＩＧ、　３ ｐ５３−−ｍ− 一一瞼 ％２図 ｆ′！体　　７−ワーＣｒ　マーＶ− イ立ｊ１−□ マーカ 欠失ハ９り〜： 複合バ？−〉 ＦＩＧ、４ 一―−−嘲−１−・ 嘲―嘲― Ｈｈａ　ト ＋ ＋ ＋ ＋ ＦＩＧ、　６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトから腫瘍の疑いがある組織を単離し；該組織か
   ら、野生型ｐ５３遺伝子の欠失、またはその発現産物の
   欠失を検出する；こと からなるヒトの腫瘍組織を診断する方法であって、該欠
   失が組織の腫瘍性を示唆するものである前記方法。 ２、発現産物がｍＲＮＡ分子である、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３、発現産物がタンパク質分子である、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ４、野生型ｐ５３遺伝子の欠失を、ポリメラーゼ連鎖反
   応を用いてｐ５３遺伝子の全部または一部の塩基配列を
   決定することによって検出する、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ５、（ｉ）該組織におけるｐ５３遺伝子またはｐ５３ｍ
   ＲＮＡ、と（ｉｉ）ヒト野生型ｐ５３遺伝子に相補的な
   核酸プローブとが２量体を形成するようにハイブリダイ
   ズさせた場合の分子（ｉ）と分子（ｉｉ）との間のミス
   マッチを同定することによって、野生型ｐ５３遺伝子の
   欠失を検出するものである、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ６、核酸プローブがリボプローブである、特許請求の範
   囲第５項記載の方法。 ７、核酸プローブがＤＮＡプローブである、特許請求の
   範囲第５項記載の方法。 ８、ミスマッチが酵素的切断によって検出されるもので
   ある、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ９、ミスマッチが化学的切断によって検出されるもので
   ある、特許請求の範囲第５項記載の方法。 １０、酵素的切断が、ＲＮアーゼＡおよびＳ１ヌクレア
   ーゼからなる群から選択されるものである、特許請求の
   範囲第８項記載の方法。 １１、分子（ｉｉ）が野生型ｐ５３遺伝子またはｐ５３
   ｍＲＮＡにハイブリダイズする際に形成される２量体の
   電気泳動的移動度と比較した場合の２量体の移動度の変
   化を観察することによってミスマッチを同定するもので
   ある、特許請求の範囲第Ｓ項記載の方法。 １２、ｐ５３遺伝子配列の増幅と、増幅されたｐ５３配
   列の、変異型ｐ５３対立遺伝子と相補的な核酸プローブ
   へのハイブリダイゼーションとによって野生型ｐ５３遺
   伝子の欠失を検出するものである、特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 １３、ｐ５３遺伝子の分子的クローニングおよび、その
   全体、または一部の塩基配列を決定することによって野
   生型ｐ５３遺伝子の欠失を検出するものである、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 １４、ＳＶ−４０ラージＴ抗原およびアデノウィルスＥ
   １Ｂ抗原からなる群から選択された抗原と複合体を形成
   する能力の損失によって、野生型ｐ５３タンパク質分子
   の欠失を検出するものである、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 １５、野生型ｐ５３遺伝子の欠失の検出が、点変異のス
   クリーニングを含むものである、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 １６、点変異がミスセンス変異である、特許請求の範囲
   第１５項記載の方法。 １７、野生型ｐ５３遺伝子の欠失の検出が、フレームシ
   フト変異のスクリーニングを含むものである、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 １８、野生型ｐ５３遺伝子の欠失の検出が、欠失変異の
   スクリーニングを含むものである、特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 １９、野生型ｐ５３遺伝子の欠失の検出が、点変異のス
   クリーニング、および欠失変異のスクリーニングを含む
   ものである、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ２０、肺癌、乳癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、前立
   腺癌、肝臓癌、および胃癌からなる群から腫瘍組織が選
   択されるものである、特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ２１、肺癌、乳癌、および結腸直腸癌からなる群から腫
   瘍組織が選択されるものである、特許請求の範囲第２０
   項記載の方法。 ２２、腫瘍組織が結腸直腸癌である、特許請求の範囲第
   ２１項記載の方法。 ２３、ｐ５３遺伝子内の変異により野生型ｐ５３遺伝子
   の機能を失っている細胞に対して野生型ｐ５３遺伝子機
   能を供給する方法であって、野生型ｐ５３遺伝子を該遺
   伝子機能を失った細胞に該遺伝子が細胞内で発現される
   ように導入することからなる前記方法。 ２４、該野生型ｐ５３遺伝子が、細胞内に存在するいか
   なる変異型ｐ５３遺伝子よりも高レベルで発現するもの
   である、特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５、導入された野生型ｐ５３遺伝子が二重組み換え現
   象によって細胞内に存在する内在性変異型ｐ５３遺伝子
   と組み換えをおこし、ｐ５３遺伝子変異を修正するもの
   である、特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２６、ｐ５３遺伝子内の変異によって野生型ｐ５３遺伝
   子機能を失った細胞に、野生型ｐ５３遺伝子機能を供給
   する方法であって、該方法は野生型ｐ５３遺伝子の一部
   を該部分が細胞内で発現されるように、該遺伝子機能が
   失われた細胞に導入することからなり、該遺伝子の一部
   が該細胞の非腫瘍性増殖に必要なｐ５３タンパク質の一
   部をコードしているものである前記方法。 ２７、ポリメラーゼ連鎖反応によってｐ５３遺伝子のヌ
   クレオチド配列を決定するためのキットであって、該キ
   ットは一本鎖ＤＮＡプライマーのペアのセットを含んで
   おり、該セットはｐ５３遺伝子コード配列のすべてのヌ
   クレオチドの合成を可能にするものであるキット。 ２８、各プライマーの５′末端に制限酵素切断部位が存
   在する、特許請求の範囲第２７項記載のキット。 ２９、プライマーのペアのセットが、プライマーペア１
   ：５′−【遺伝子配列があります】−３′および５′−
   【遺伝子配列があります】−３′；ペア２：５′−Ｇ【
   遺伝子配列があります】−３′および５′−【遺伝子配
   列があります】【遺伝子配列があります】−３′；ペア
   ３；５′−【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があ
   ります】−３′および５′−【遺伝子配列があります】
   −３′；ペア４：５′−【遺伝子配列があります】−３
   ′および５′−【遺伝子配列があります】−３′；ペア
   ５：５′−【遺伝子配列があります】−３′および５′
   −【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】
   −３′；を含む物である、特許請求の範囲第２７項記載
   のキット。 ３０、ヒト変異型ｐ５３遺伝子と相補的な核酸プローブ
   。 ３１、リボプローブである、特許請求の範囲第３０項記
   載のプローブ。 ３２、ＤＮＡプローブである、特許請求の範囲第３０項
   記載のプローブ。 ３３、人体から試料を単離し； 該試料中の変異体ｐ５３遺伝子またはその発現産物を検
   出する；こと からなる、ヒトの腫瘍組織の存在を検出する方法。 ３４、該人体試料が、血清、糞便、尿、および喀痰から
   選択されるものである、特許請求の範囲第３３項記載の
   方法。 ３５、血液および胎児組織からなる群から選択される人
   体試料を単離し； 該試料からＤＮＡを抽出し； 該ＤＮＡから野生型ｐ５３遺伝子の欠失を検出する；こ
   と からなる、ヒトの癌に対する遺伝的素因を検出する方法
   。