JP4201057B2 - ヒト転移サプレッサー遺伝子ｋａｉｉに由来する試薬を使用する診断方法及び遺伝子療法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は癌診断法及び治療法の分野である。特に、本発明は被験者における悪性癌の存在の確認に有用な野生型ＫＡＩ１遺伝子配列、ＫＡＩ１ ｍＲＮＡ及びＫＡＩ１タンパク質の変化の検出と、被験者における悪性疾患に対する遺伝的素因の検出とに関する。本発明はさらに野生型ＫＡＩ１遺伝子産物を修復するための遺伝子療法の使用に関する。
発明の背景
発癌現象が細胞増殖と分化との分子制御を不良に調節する遺伝的及び後成的（epigenetic）変化を含む多段階プロセスであることが、広く受け入れられている。これらの遺伝的変化は、腫瘍形成を開始させ、並びに腫瘍を進行させることができるプロト−癌遺伝子（proto-oncogene）の活性化及び／又は腫瘍サプレッサー遺伝子の不活化を包含しうる。例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３は結腸直腸癌の後期に関与する可能性があり（Ｂａｋｅｒ，Ｓ．Ｊ．等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：２１７〜２２１）、推定の転移サプレッサー遺伝子ｎｍ２３は転移腫瘍対非転移腫瘍においてダウン−レギュレートされることが判明した（Ｓｔｅｅｇ，Ｐ．Ｓ．等（１９８８）Ｊ，Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．，８０：２００〜２０４）。さらに、ｒａｓ癌遺伝子の活性化とＮ−ｍｙｃの増幅とが、例えば胸部癌（Ｌｉｕ，Ｅ．等（１９８８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３：３２３〜３２７）及び神経芽細胞腫（Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｇ．Ｍ．等，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：１１２１−１１２４；Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．等，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：４９４０−４９４４）のようなヒト腫瘍の進行に関係づけられているが、これらは腫瘍進行の万能的な決定因子であるとは思われない（Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．Ｂｉｏ Ｅｓｓａｙｓ，１３：３３７−３４２（１９９１））。
しかし、発癌現象の基礎をなす遺伝的変化の理解におけるこれらの進歩にも拘わらず、大抵の癌患者の主要な死因である転移（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｃａｎｃｅｒ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ ＰＡ １９８７））は依然として癌の最も重要な面であるにも拘わらず、殆ど理解されていない１面である（Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．等（１９９１）Ｃｅｌｌ，６４：３２７−３３６；Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，Ｇ．Ｌ．（１９９１）ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１３：３３７−３４２及びＳｔｅｅｇ，Ｐ．Ｓ．（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，４：１３４−１４１）。したがって、転移腫瘍サプレッサー遺伝子の単離は癌の診断と治療のために非常に重要である。
非転移性腫瘍細胞と転移性腫瘍細胞とのハイブリダイゼーションが腫瘍形成性であるがもはや転移性ではない細胞ハイブリッドを生成しているという、Ｒａｍｓｈａｗ等による細胞融合研究（（１９８３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３２：４７１−４７８）は、転移サプレッサー遺伝子の存在を実証した。さらに最近では、Ｉｃｈｉｋａｗａ等（１９９１）（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：３７８８〜３７９２）は、ラット前立腺癌細胞の転移能力が、非転移性癌細胞に融合した場合には抑制されること及び転移の再発現が正常ラット染色体の一貫した欠失に関係することを実証した。微小核細胞−仲介染色体転移を用いたその後の研究は、さらに、推定のヒト転移サプレッサー遺伝子をヒト染色体１１の１１ｐ１１．２〜１３領域にマッピングしている（Ｉｃｈｉｋａｗａ等（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：３４８６−３４９０）。この研究では、これらの研究者は、ヒト染色体１１ｃｅｎｔ−ｐ１３を保有するハイブリッドが転移の抑制を示すが、ヒト染色体１１ｃｅｎｔ−ｐ１１．２を保有するハイブリッドは示さないことを実証した。
要約すると、Ｉｃｈｉｋａｗａ等の論文に示されたデータは、ヒト染色体１１のｐ１１．２〜１３領域における推定サプレッサー遺伝子が転移において役割を有していることを示唆した。しかし、現在まで、この領域における、転移サプレッサー遺伝子の候補である遺伝子は同定されていない。したがって、この染色体領域におけるこのような遺伝子（単数又は複数）を同定し、このような遺伝子（単数又は複数）が転移に関係するかどうかを確認することが当該技術分野で必要とされている。
発明の概要
本発明は、野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化の検出が被験者における悪性癌の存在又は被験者における悪性疾患の遺伝的素因を検出するために有用である場合に、このような変化の検出方法に関する。野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化を検出する第１方法は、ＫＡＩ１遺伝子の突然変異に関して被験者のＤＮＡを分析することを含む。ＫＡＩ１遺伝子の変化を検出する第２方法は、ＫＡＩ１遺伝子のｍＲＮＡ産物の突然変異及び発現の変化に関して被験者のＲＮＡを分析することを含む。
それ故、本発明は野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化を検出するための核酸プローブを提供する。
本発明はさらに、野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化に関して被験者のＲＮＡ又はＤＮＡを分析する場合にＰＣＲプライマーとして有用な精製単離された核酸配列を含有する診断キットを提供する。これらのＰＣＲプライマーはＫＡＩ１対立遺伝子のヌクレオチド配列を決定するためにも使用可能である。
野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化を検出する第３方法は、ＫＡＩ１タンパク質の発現の変化に関して被験者のタンパク質を分析することを含む。
それ故、本発明はＫＡＩ１タンパク質に対する抗体と、被験者におけるＫＡＩ１タンパク質発現の変化を検出するために有用な、ＫＡＩ１タンパク質に対する抗体を含有する診断キットとに関する。
本発明はさらに、ＫＡＩ１タンパク質発現の変化を有する細胞に野生型ＫＡＩ１遺伝子を供給する方法であって、野生型遺伝子が細胞中で発現されるように、ＫＡＩ１タンパク質発現の変化を有する細胞に野生型ＫＡＩ１遺伝子を導入することを含む方法を提供する。
図面の説明
図１は、正常組織（ヒト前立腺）からと、転移腫瘍細胞（ＡＴ６．１、ＡＴ６．１−１１−２及びＡＴ６．１−１１−３）及び非転移腫瘍細胞（ＡＴ６．１−１１−１*）の両方からのｍＲＮＡのノーザン・ブロットの結果を示す。サンプルにつき２μｇのポリＡ⁺ＲＮＡを各レーンに装填し、ブロットをＫＡＩ１ ｃＤＮＡプローブとラットβ−アクチンプローブとによって連続的にハイブリダイズした。星印（*）は、１１ｐｃｅｎ−ｐ１３領域を含有し、転移能力を抑制されたハイブリッドＡＴ６．１−１１−１を同定する。
図２は、ヒト胎盤、齧歯類細胞（Ａ９及びＡＴ６．１）及びヒト−齧歯類微小核細胞ハイブリッド（Ａ９−１１ｎｅｏ、ＡＴ６．１−１１−１*、ＡＴ６．１−１１−２及びＡＴ６．１−１１−３）から単離されたＤＮＡのサザン・ブロット分析の結果を示す。各サンプルに関して、１５μｇのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩによって消化させ、１．２％アガロースゲル上で分離させ、ＫＡＩ１ ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。図１に示すように、星印（*）は、１１ｐｃｅｎ−ｐ１３領域を含有し、転移能力を抑制されたハイブリッドＡＴ６．１−１１−１を同定する。
図３は、ＫＡＩ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（上部ライン、配列番号：１９）と演繹されたアミノ酸配列（下部ライン、配列番号：２０）とを示し、これらの配列においてアミノ酸残基の略号は次の通りである：Ａ，Ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙｓ；Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ；Ｙ，Ｔｙｒ．４個の推定上の膜通過ドメインは点線の下線によって表示され、可能なＮ−結合グリコシル化部位は二重に下線を施される。
図４は、ヒト正常前立腺組織からと、ヒト転移前立腺癌由来の細胞株から単離された総ＲＮＡ（１５μｇ）のノーザン・ブロット分析の結果を示す。ブロットはＫＡＩ１プローブとヒトβ−アクチンプローブとによって連続的にハイブリダイズさせた。
図５は、図５の頂部に表示した種々なヒト組織から製造されたポリＡ⁺ＲＮＡ（２μｇ）のノーザン・ブロット分析の結果を示す。ブロットはＫＡＩ１プローブとヒトβ−アクチンプローブとによって連続的にハイブリダイズさせた。
図６は、図６の頂部に表示した種々な種のＥｃｏＲＩ消化されたゲノムＤＮＡの“ズー（zoo）”ブロットの結果を示す。ブロットはＫＡＩ１プローブによってハイブリダイズさせた。
発明の詳細な説明
本発明はヒト染色体１１上の転移サプレッサー遺伝子のクローニング及び特徴づけに関する。本明細書ではＫＡＩ１と呼ばれる、この遺伝子のヌクレオチド配列と演繹アミノ酸配列とを図３に示す。図３に示したヌクレオチド配列は転移抑制細胞ハイブリッドクローンＡＴ６．１−１１−１*からクローン化されたものであり、野生型ＫＡＩ１配列を表す。
ＧｅｎＢａｎｋデータベースとＥＭＢＬデータベースとにおけるＫＡＩ１ ｃＤＮＡ配列の探求は、ＫＡＩ１ ｃＤＮＡ配列が異なる実験室によってＣ３３、Ｒ２及びＩＡ４と呼ばれる、ヒトリンパ球からの３種のｃＤＮＡクローンと同じであることを明らかにした（Ｉｍａｉ，Ｔ．等（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４９，２８７９−２８８６（１９９２）；Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，Ｋ．等（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１３９４−１４０１（１９９２）；Ｇａｕｇｉｔｓｃｈ，Ｈ．Ｗ．等（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１，３７７−３８３（１９９１）；Ｇｉｌ，Ｍ．Ｌ．等（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，２８２６−３３（１９９２））。Ｃ３３はウイルス誘導シンシチウム形成の阻害に関係する（Ｉｍａｉ，Ｔ．等（１９９２）；Ｆｕｋｕｄｏｍｅ，Ｋ．等（１９９２））。Ｒ２はマイトジェン活性化ヒトＴ細胞中で強度にアップ−レギュレートされ（Ｇａｕｇｉｔｓｃｈ，Ｈ．Ｗ．等（１９９１））、ＩＡ４は数種のＢリンパ球ライン中に高度に発現される（Ｇｉｌ，Ｍ．Ｌ．等（１９９２））。しかし、これらの３種のクローンのいずれも転移に作用するとは示唆されていず、これらのクローンによってコードされるタンパク質の機能は本発明の前には知られていなかった。
本発明はさらに、野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化と転移との関係に関する。したがって、本発明は被験者における野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化を検出する方法に関し、このような方法は診断及び予後情報を与えることができる。例えば、転移前立腺腫瘍ではＫＡＩ１遺伝子の発現喪失が観察されているので、これらの腫瘍は、ＫＡＩ１が転移に関係している腫瘍である。したがって、被験者における野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化の検出は、臨床医によって選択される治療コースに影響を与える。さらに、ＫＡＩ１は脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、血液白血球、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及び膵臓を含めた、あらゆる被験組織に発現されるので、野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化がこれらの組織における転移に寄与すると考えられる。
さらに、本発明の方法が、野生型ＫＡＩ１の変化が生じる任意の腫瘍に対して適用可能であることが当業者によって理解される。その上、本発明に開示される検出方法は胎児をスクリーニングするために胎児期に使用可能であるか、又は被験者の家族歴に基づいて癌を有する危険性にある被験者をスクリーニングするために前兆的に使用可能である。本発明の目的のためには、被験者とは哺乳動物を意味する。
本発明の診断方法によると、野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化を検出する。明細書と請求の範囲とを通して用いる“野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化”は野生型ＫＡＩ１遺伝子の突然変異を含み、このような突然変異は野生型ＫＡＩ１遺伝子の欠失、逆位、挿入、転換又は点突然変異を包含する。腫瘍組織中に見い出される多くの突然変異はＫＡＩ１タンパク質の発現を低下させるような突然変異であると考えられる。しかし、非機能性遺伝子産物をもたらす突然変異は悪性疾患をも生じる可能性がある。点突然変異が調節領域（例えば、プロモーター）において発生しうるか、又は正常なＲＮＡプロセシングを妨害して、ＫＡＩ１遺伝子産物の発現をそれぞれ喪失させうることがさらに理解される。
明細書と請求の範囲とを通して用いる“野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化”は、野生型ＫＡＩ１特異的ｍＲＮＡ及びＫＡＩ１タンパク質の発現の変化に基づいて検出されることができる。これらのＫＡＩ１遺伝子産物の発現の変化は、野生型レベルに比べてＫＡＩ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルの喪失若しくは低下として検出されることもできる。或いは、ＫＡＩ１タンパク質の発現の変化はＫＡＩ１タンパク質の機能の喪失を包含する可能性がある。それ故、ＫＡＩ１遺伝子産物の発現変化が、非限定的に、野生型ＫＡＩ１遺伝子の突然変異、ＫＡＩ１タンパク質の翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）の変化、又はＫＡＩ１遺伝子の転写のために必要なトランス作用因子の喪失を包含する多様なイベントによって惹起されうることは、当業者に理解されると考えられる。
図３に示すＫＡＩ１ ｃＤＮＡと演繹されたアミノ酸配列とを提供されるならば、野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化の検出に有用な特定のプローブの設計は、充分に当業者の技能の範囲内である。
本発明の１実施態様では、ＫＡＩ１遺伝子の変化を検出する方法は、野生型ＫＡＩ１遺伝子の突然変異に関して被験者のＤＮＡを分析することを含む。ＤＮＡの分析のために、被験者から生物学的標本を採取する。本発明の方法に用いるために入手することができる生物学的標本の例は、非限定的に、組織バイオプシー、全血、リンパ球及び腫瘍を包含する。腫瘍細胞に関して組織標本を富化させる手段は当技術分野で公知である。例えば、組織をパラフィン切片又はクライオスタット（cryostat）切片から単離することができる。癌細胞も当技術分野で周知のフローサイトメトリー及び他の方法によって正常細胞から分離することができる。或いは、当業者に公知の方法を用いて一次細胞培養物を腫瘍バイオプシーから確立することができる。
生物学的標本から単離されたＤＮＡを野生型ＫＡＩ１遺伝子の突然変異に関して、非限定的に、適当な制限酵素による消化後のサザン・ブロッティング（制限フラグメント長さ多形現象，ＲＦＬＰ）（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．（１９８０）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６９：２０１〜２０５）、変性勾配電気泳動方法（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１３：４９５〜４９８）、オリゴヌクレオチド ハイブリダイゼーション（Ｃｏｎｎｅｒ，Ｒ．等（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１３３２１〜１３２６）、プローブＲＮＡとターゲットＤＮＡの間のジュープレックス（Duplex）のＲＮアーゼ消化（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅ．等（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：７５７５〜７５７９）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ，Ｐ．Ｋ.等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７〜４９１；米国特許第４，６８３，１９５号と第４，６８３，２０２号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ヨーロッパ特許出願第０．３２０，３０８号と第０．４３９，１８２号）、並びにＰＣＲ一本鎖コンフォーメーション分析（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．等（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５：８７４〜８７９；Ｄｅａｎ，Ｍ．等（１９９０）Ｃｅｌｌ，６１：８６３〜８７１）を包含する多様な方法によって分析することができる。
好ましい１実施態様では、サザン・ブロット分析を用いて、ＫＡＩ１遺伝子の全体的な再配列（rearrangement）転位に関して被験者から単離されたＤＮＡを試験することができる。サザン分析によって分析すべきＤＮＡを１種以上の制限酵素によって消化させる。制限消化後に、得られたＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動によって分離し、フラグメントを標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって検出する（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３〜５１７）。
サザン分析にプローブとして用いる核酸配列を一本鎖又は二本鎖形で標識することができる。核酸配列の標識は当業者に公知の方法によって実施することができる。このような標識方法は放射性標識と酵素を包含することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等（１９８９）“分子クローニング、実験室マニュアル”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。さらに、ピリミジン及びプリン環に化学成分を取り付ける方法（Ｄａｌｅ，Ｒ．Ｎ．Ｋ．等（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７０：２２３８〜２２４２；Ｈｅｃｋ，Ｒ．Ｆ．（１９６８）Ｓ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９０：５５１８〜５５２３）、化学ルミネセンスによる検出を可能にする方法（Ｂａｒｔｏｎ，Ｓ．Ｋ．等（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：８７３６〜８７４０）、ビオチニル化核酸プローブを用いる方法（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｋ．等（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３３：１２６〜１３１；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．等（１９８２）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，５１：２４１〜２４９；Ｍａｔｔｈａｅｉ，Ｆ．Ｓ．等（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５７：１２３〜１２８）並びに商業的に入手可能な製品を用いて蛍光による検出を可能にする方法を含めて、非放射性のシグナル増幅方法が知られている。サザン分析にプローブとして用いられる核酸配列の各々は野生型ＫＡＩ１遺伝子に由来する。好ましいプローブは図３に示すｃＤＮＡ配列を有して得られる。
分離されたＤＮＡフラグメントを標識核酸プローブにハイブリダイズさせたならば、オートラジオグラフィによって制限消化パターンを可視化して、野生型ＫＡＩ１遺伝子の制限消化パターンと比較することができる。野生型制限パターンに比べて被験者のＤＮＡの制限パターン中の制限フラグメント長さ多形現象（ＲＦＬＰ）の有無は、野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化を実証する。
他の好ましい実施態様では、ゲノムＤＮＡを野生型ＫＡＩ１遺伝子中の突然変異に関してＰＣＲ−ＳＳＣＰによって分析することができる。この方法では、ＰＣＲに用いるために選択されたプライマー対の各々を野生型ＫＡＩ１遺伝子の配列とハイブリダイズするように設計し、増幅させ、次にこの変性した増幅生成物中の突然変異を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出する。１実施態様では、図３に示したＫＡＩ１ ｃＤＮＡ配列からプライマー対が誘導される。
他の実施態様では、野生型ＫＡＩ１遺伝子のゲノムＤＮＡ突然変異の分析に有用なプライマー対を、ＫＡＩ１遺伝子のある一定のエキソンの５’末端と３’末端に接するイントロン配列から誘導することができる。ＫＡＩ１遺伝子の特異的エキソンの特異的増幅を可能にするプライマー対の例は下記配列を包含する：

上記配列において配列番号：１と２はエキソン３に結合し；配列番号：３と４はエキソン４に結合し；配列番号：５と６はエキソン６に結合し；配列番号：７と８はエキソン７に結合し；配列番号：９と１０はエキソン８に結合し；配列番号：１１と１２はエキソン９に結合した。
対の各プライマーは、二本鎖ターゲット配列の鎖の１つの３’末端の配列に相補的である約１５〜約５０塩基対長さの一本鎖オリゴヌクレオチドである。ＫＡＩ１遺伝子配列に充分に特異的にハイブリダイズさせるための増幅反応の最適化は、充分に当該技術分野の技能の範囲内であり、好ましくは、アニーリング温度を調節することによって達成される。さらに他の実施態様では、ＫＡＩ１遺伝子の突然変異に関してＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰによって分析することができる。この方法では、一本鎖ｃＤＮＡを全ＲＮＡから又はポリＡ⁺富化ＲＮＡから逆転写酵素を用いて調製する。この方法では、得られた一本鎖ｃＤＮＡのＰＣＲに用いるために選択した各プライマー対を遺伝子中の適当な距離（少なくとも約１００〜３００ヌクレオチド）離れたＫＡＩ１ ｃＤＮＡ中の配列とハイブリダイズするように設計して、増幅させ、次にこの変性した増幅生成物中の突然変異を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出する。このようなプライマー対は図３に示したＫＡＩ１ ｃＤＮＡ配列から誘導することができる。各対は一般に約１００〜約３００塩基対によって分離された各鎖上の配列に相補的な、このような２プライマーを含む。
本発明のプライマーはオリゴヌクレオチド合成の公知方法を用いて合成することができる（例えば、Ａｇａｒｗａｌ等のホスホジエステル方法（１９７２）Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１１：４５１；Ｈｓｉｕｎｇ等のホスホトリエステル方法（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：１３７１；若しくはＢｅｕａｃａｇｅ等の自動化ジエチルホスホルアミダイト方法（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９〜１８６２），又はこれらは天然に生成するＤＮＡ若しくはクローン化ＤＮＡの単離フラグメントであることができる。さらに、当業者は、オリゴヌクレオチドが種々な製造業者から販売される自動化機器を用いて合成されうること又は商業的に注文されて、製造されうることに気づくと考えられる。１実施態様では、プライマー伸長生成物を検出及び／又は同定するために適した検出可能なラベル（例えば、ビオチン、アビジン若しくは放射性標識されたｄＮＴＰ）を含むように、又は増幅生成物の単離を容易にする物質（例えば、ビオチン及びアビジン）によって、プライマーを誘導体化することができる。
それ故、本発明はＫＡＩ１遺伝子の突然変異を検出するための診断キットを提供する。この診断キットは、ＤＮＡ又はＲＮＡを野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化に関して分析するためのハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとして有用な、精製単離された核酸配列を含む。
他の実施態様では、核酸プローブをＫＡＩ１遺伝子の突然変異対立遺伝子にハイブリダイズするように選択することができる。これらの対立遺伝子特異的なプローブは、ミス対合ではなくハイブリダイゼーションに基づいて、他の被験者における同様な突然変異を検出するために有用である。このような核酸プローブがＫＡＩ１遺伝子配列の突然変異にハイブリダイズするプライマー対である場合には、これらのプライマー対を用いて、生物学的サンプル中に存在する特異的な突然変異遺伝子配列をＰＣＲによって増幅させることができる。
ＰＣＲの増幅生成物は直接又は間接的に検出することができる。増幅生成物の直接の検出はプライマー対の標識によっておこなわれる。本発明のプライマーの標識に適したラベルは当業者に公知であり、放射性ラベル、ビオチン、アビジン、酵素及び蛍光性分子を包含する。増幅反応をおこなう前に望ましいラベルをプライマーに組み入れることができる。好ましい標識方法は放射性標識ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとを用いる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等（１９８９）“分子クローニング，実験室マニュアル”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）。或いは、増幅反応中に１種以上の標識ｄＮＴＰとして望ましいラベルをプライマー伸長生成物に組み入れることができる。本発明では、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）又はＰＣＲ生成物の直接の配列決定によるＰＣＲ生成物の分離を介して、標識された増幅ＰＣＲ生成物をＫＡＩ１遺伝子の突然変異に関して分析することができる。
さらに他の実施態様では、非標識増幅生成物をＫＡＩ１疾患遺伝子の突然変異に関して、サザン・ブロット又はドット・ブロットにおいて、放射性標識された若しくはビオチン標識された核酸プローブとのハイブリダイゼーションを介して分析することができる。この実施態様に有用な核酸プローブはサザン分析に関して前述したようなプローブである。さらなる実施態様では、図３に示すｃＤＮＡ配列を用いて腫瘍組織中に存在する対立遺伝子を分子クローニングし、次にこの対立遺伝子を当技術分野で周知の方法を用いて配列決定することによって、点突然変異を検出することができる。
野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化を検出する第２方法は、被験者のＲＮＡを突然変異と、ＫＡＩ１特異的ｍＲＮＡの発現の変化とに関して分析することを含む。
この方法によるＲＮＡの分析に関して、ＲＮＡを例えば前記被験者から入手した腫瘍バイオプシーサンプルから単離することができ、前記腫瘍は非限定的に前立腺腫瘍を包含する。
分析すべきＲＮＡは血液又は腫瘍バイオプシーサンプルから、全細胞ＲＮＡとして又はポリ（Ａ）⁺ＲＮＡとして単離することができる。全細胞ＲＮＡは当業者に公知の方法によって単離することができる。このような方法は示差沈降によるＲＮＡの抽出（Ｂｉｒｎｂｉｏｍ，Ｈ．Ｃ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：１４８７〜１４９７）、有機溶媒によるＲＮＡの抽出（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．等（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６２：１５６〜１５９）及び強変性剤によるＲＮＡの抽出（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．等（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４〜５２９９）を包含する。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡはオリゴｄ（Ｔ）カラム上でのアフィニティクロマトグラフィーによって全細胞ＲＮＡから選択することができる（Ａｖｉｖ，Ｈ．等（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：１４０８〜１４１２）。
ＲＮＡを突然変異と、ＫＡＩ１特異的ｍＲＮＡの発現の変化とに関して分析する方法はノーザン・ブロッティング（Ａｌｗｉｎｅ，Ｊ．Ｃ．等（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５３５０〜５３５４）、ドット及びスロットハイブリダイゼーション（Ｋａｆａｔｏｓ，Ｆ．Ｃ．等（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７：１５４１〜１５２２）、フィルターハイブリダイゼーション（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．等（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；９：１７４〜１７９）、Ｓ₁分析（Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．等（１９８０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６５：７５０〜７６８）、ＲＮアーゼ保護（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等（１９８９）“分子クローニング：実験室マニュアル”，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．等（１９９２）“組換えＤＮＡ”，第２版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）並びにＲＴ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰを包含する。
ＫＡＩ１ ｍＲＮＡの発現を測定する場合には、ＫＡＩ１ ｍＲＮＡ発現の減少が野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化を示唆する。ＫＡＩ１特異的ｍＲＮＡ発現のレベルの変化を測定するための好ましい１方法はノーザン・ブロッティングであり、この方法ではＫＡＩ１特異的ｍＲＮＡ発現を検出するためのプローブとして用いられる核酸配列は図３に示すＫＡＩ１ ｃＤＮＡ配列の全て又は一部に対して相補的である。
ＫＡＩ１特異的ｍＲＮＡ発現のレベルの変化を測定するための好ましい第２方法は、生物学的サンプルから単離されたＲＮＡから形成されたＲＴ−ＰＣＲ生成物に対するＫＡＩ１ ｃＤＮＡ配列に由来する核酸プローブのハイブリダイゼーションによるＫＡＩ１ ｍＲＮＡ発現の検出である。
野生型ＫＡＩ１遺伝子の変化を検出するための第３方法は、被験者のタンパク質を野生型ＫＡＩ１タンパク質の変化に関して分析することを含む。１実施態様では、野生型ＫＡＩ１タンパク質の変化は生物学的サンプル中のＫＡＩ１タンパク質の発現レベルの喪失又は減少を包含する。
ＫＡＩ１タンパク質の発現レベルの測定に有用なイムノアッセイの例は、非限定的に、免疫沈降、ラジオイムノアッセイ、ウェスタン・ブロット分析、免疫蛍光分析、エンザイムイムノアッセイ、化学発光分析、イムノヒストケミカル（immunohistochemical）分析及びエンザイムリンクト・イムノソルベント・アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay）（ＥＬＩＳＡ）を包含する。さらに、上記イムノアッセイは、例えば免疫沈降と、その後のウェスタン・ブロットのように、組み合わせて用いることもできる。上記方法はＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＰｒｉｃｅとＮｅｗｍａｎ編集，Ｓｔｃｃｈｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９９１に述べられている。このような分析は当該技術分野で述べられているように、直接、間接、競合又は非競合イムノアッセイでありうる（Ｏｅｌｂｒｉｃｋ，Ｎ．（１９８４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：８９５〜９０４）。このような方法によって分析されるタンパク質は例えば腫瘍バイオプシーのような生物学的サンプルから得ることができ、タンパク質は粗溶解物として得ることができるか、又はＫＡＩ１タンパク質に対する抗体を用いるイムノアフィニティ・クロマトグラフィーを包含する当業者に公知の方法によってさらに精製することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等（１９８９）“分子クローニング：実験室マニュアル”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）。或いは、固定した又は凍結した腫瘍切片のイムノヒストケミストリーによってＫＡＩ１タンパク質レベルを検出することができる。
イムノアッセイによってＫＡＩ１タンパク質を検出するために、本発明は抗ＫＡＩ１抗体を提供するが、このような抗体はポリクローナル又はモノクローナルでありうる。ポリクローナル抗体が望ましい場合には、ＫＡＩ１タンパク質に対するポリクローナル抗体を含有する血清を用いることができるか、又はポリクローナル抗体を血清中に存在する他の抗原からイムノアフィニティ・クロマトグラフィーによって精製することができる。或いは、ＫＡＩ１に対するモノクローナル抗体は当業者によって容易に製造することができる。モノクローナル又はポリクローナル抗体の製造方法は当業者に公知である（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（１９８３）モノクローナル抗体：原理と実際，Ｐｌｏｄｅｒｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社，ＮＹ，ＮＹ．５６〜９７頁；Ｈｕｒｎ，Ｂ．Ａ．Ｌ．等（１９８０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７０：１０４〜１４１）。
本発明のポリクローナル又はモノクローナル抗体の製造に用いることができる適当な免疫原は、組換えＫＡＩ１タンパク質によってトランスフェクトされた細胞から製造された細胞溶解物、部分的若しくは実質的に精製された組換え若しくはネイティブＫＡＩ１タンパク質、又は図３に示すＫＡＩ１アミノ酸配列から誘導されるペプチドを包含する。組換え若しくはネイティブＫＡＩ１タンパク質の精製が望ましい場合には、示差沈降、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点フォーカシング（focusing）、ゲル電気泳動、アフィニティ及びイムノアフィニティクロマトグラフィー等を包含することができる、当技術分野で公知の標準的タンパク質精製方法によって、この精製をおこなうことができる。イムノアフィニティクロマトグラフィーの場合には、ＫＡＩ１タンパク質に特異的な抗体がそれに結合した樹脂を含有するカラムに通すことによって組換えタンパク質を精製することができる。
好ましい実施態様では、免疫原は組換えによって製造されたＫＡＩ１タンパク質又はそのフラグメントである。組換えＫＡＩ１タンパク質又はそのフラグメントの製造は、適当な発現ベクターに挿入された天然又は合成核酸配列によって導かれることができる。好ましい核酸配列は図３に示すＫＡＩ１ ｃＤＮＡ配列である。１実施態様では、ＫＡＩ１のコーディング配列を含有する、全長ｃＤＮＡ又はそのフラグメントを含有する制限消化フラグメントを適当な発現ベクター中に挿入することができる。適当な発現ベクターとは、真核細胞又は原核細胞中で機能することができ、ＫＡＩ１タンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸配列を有するか又は発現することができるベクターを意味する。このようなベクターと、組換えタンパク質の製造へのそれらの使用とは当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等（１９８９）“分子クローニング：実験室マニュアル”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）。
本発明の免疫原は例えば生理的食塩水若しくは水のような適当な希釈剤中、又は完全若しくは不完全アジュバント中で用いることができる。さらに、免疫原はタンパク質を免疫原性にするためにキャリヤーに結合することも、結合しないことも可能である。このようなキャリヤー分子の例は、非限定的に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド等を包含する。免疫原は、例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下等のような、抗体産生のために適当な任意のルートで投与することができる。免疫原は抗ＫＡＩ１抗体の有意な力価が得られるまで、１回に又は定期的な間隔をおいて投与することができる。抗体は血清中でイムノアッセイを用いて検出することができる。
抗体又は抗原結合フラグメントも遺伝子工学によって産生することができる。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＨ鎖（heavy chain）とＬ鎖（light chain）の両方を発現させる方法はＰＣＴ特許出願；公開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３及びＷＯ９０１４４２４並びにＨｕｓｅ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５〜１２８１の主題である。
或いは、免疫原としての抗イディオタイプ抗体を投与することによって、抗ＫＡＩ１抗体を誘導することができる。便利には、上述したように調製した精製抗ＫＡＩ１抗体を用いて、宿主動物に抗イディオタイプ抗体を誘導することができる。適当な希釈剤中の組成物を宿主動物に投与する。投与後に、通常は反復投与後に、宿主は抗イディオタイプ抗体を産生する。Ｆｃ領域に対する免疫源反応を除去するために、宿主動物と同じ種によって産生された抗体を用いることができ、又は投与された抗体のＦｃ領域を除去することができる。宿主動物における抗イディオタイプ抗体の誘導後に、血清又は血漿を取り出して、抗体組成物を得る。この組成物は抗ＫＡＩ１抗体に関して上述したように、又はアフィニティマトリックスに結合した抗ＫＡＩ１抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって精製することができる。
他の実施態様では、本発明の抗体をｉｎ ｓｉｔｕで用いて、細胞又は組織中のＫＡＩ１タンパク質を検出することができる。１実施態様では、この抗体を直接又は間接的免疫蛍光に用いる。直接的方法では、例えばフルオレセインイソチオシアネート、ローダミンＢイソチオシアネート等のような蛍光試薬で標識された抗ＫＡＩ１抗体を細胞又は組織中に存在するＫＡＩ１と直接反応させる。間接的方法では、未標識の抗ＫＡＩ１抗体を細胞又は組織中に存在するＫＡＩ１タンパク質と反応させる。次に、未標識抗ＫＡＩ１抗体を標識された第２抗体と反応させる。第２抗体は上述したように蛍光タグによって標識することができる。次に、蛍光標識された細胞又は組織を、例えば蛍光活性化細胞ソーター、蛍光灯を用いる光学顕微鏡検査等のような、当業者に公知の方法を用いて検出することができる。或いは、ＫＡＩ１タンパク質をｉｎ ｓｉｔｕで、放射性標識された抗ＫＡＩ１抗体を用いて、又は未標識の抗ＫＡＩ１抗体を用い、次に抗ＫＡＩ１抗体と反応する放射性標識された第２抗体を用いて検出することができる。
本発明の抗体を用いて、タンパク質の混合物からＫＡＩ１タンパク質を免疫沈降させることもできる。タンパク質混合物中のターゲット抗原を検出し、定量するための敏感で特異的な方法としての免疫沈降の使用は当業者に周知である（“分子クローニング：実験室マニュアル”，第２版，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等編集（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
本発明の抗体は、イムノアフィニティ・クロマトグラフィーによるＫＡＩ１タンパク質の単離に用いるために、固体支持体に固定することもできる。イムノアフィニティ・クロマトグラフィー方法は当該技術分野において公知であり（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．とＬａｎｅ，Ｄ．（１８８８）“抗体：実験室マニュアル”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、抗体を固体支持体に、抗体がそれらの免疫選択性活性を保有するように固定する方法も包含する；用いられる方法は抗体が支持体に吸着される方法並びに抗体が支持体に共有結合される方法であることができる。一般に、これらの方法は抗原を固体支持体に共有結合するのに用いられる方法と同じであるが；抗体の抗原結合部位がまだアクセス可能であるように二官能性カップリング剤にスペーサー基を包含させることができる。
上述した抗体と、その抗原結合フラグメントとは、ＫＡＩ１タンパク質の発現の変化を検出するために有用な診断キットとして供給されることができる。
第２実施態様では、野生型ＫＡＩ１タンパク質の変化はＫＡＩ１タンパク質の機能の喪失を包含する。それ故、本発明の方法はＫＡＩ１タンパク質の機能状態を測定するために有用な分析を含む。例えば、Ｎ−結合オリゴ糖のプロセシングと転移表現型との関係は充分に実証されているので（Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．Ｉ．（１９８９）Ａｄｖａｎｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２：２５７〜３３１；Ｄｅｎｎｉｓ，Ｊ．Ｗ．等（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３６：５８２〜５８５；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．等（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４８：６６５〜６７０）、ＫＡＩ１タンパク質が転移サプレッサーとして機能するためには、ＫＡＩ１タンパク質のグリコシル化が必要であると考えられる。したがって、グリコシル化の不存在によって実証されるＫＡＩ１タンパク質の機能の喪失の検出は、被験者における転移癌の存在を示唆する。
本発明はまた、野生型ＫＡＩ１遺伝子を表す核酸配列を含有する発現ベクターをＫＡＩ１遺伝子の突然変異を有する被験者に投与する遺伝子療法にも関する。野生型ＫＡＩ１遺伝子を表す核酸配列は図３に示す配列である。このような核酸配列を当業者に公知の方法によって、適当な発現ベクターに挿入することができる。インビボで高効率の遺伝子転移（gene transfer）を生じるために適した発現ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス及びワクシニアウイルスベクターを包含する。
野生型ＫＡＩ１遺伝子を表す核酸配列を含有する発現ベクターは静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内又は経口投与することができる。好ましい投与ルートは腹腔内である。
本明細書に引用した論文又は特許は本明細書に援用される。下記実施例は本発明の種々な態様を説明するために提示するものであり、本発明の範囲の限定を意図するものでは決してない。
実施例
材料と方法
細胞ライン：ＡＴ６．１は高度に転移性のＤｕｎｎｉｎｇラット前立腺癌細胞ラインである。ＡＴ６．１−１１クローンは、ＡＴ６．１細胞中の唯一のヒト遺伝物質としてヒト染色体１１の一部を有する微小核細胞ハイブリッドである。微小核細胞ハイブリッドＡＴ６．１−１１−１*はヒト染色体１１のフラグメント，ｃｅｎ−ｐ１３（セントロメアからｐ１３領域まで）を含有し、転移能力に関して抑制されたものであった。微小核細胞ハイブリッドＡＴ６．１−１１−２及び−３はセントロメアからｐ１１．２までのヒト染色体１１のより小さいフラグメントを有し、転移能力に関して抑制されていなかった。これらの細胞ラインの特徴と増殖条件は既に詳細に述べられている（Ｉｃｈｉｋａｗａ等（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：３４８６〜３４９０）。Ａ９−１１ｎｅｏはヒト染色体１１ｐｔｅｒ−ｑ２３を含有するマウスＡ９細胞ラインである（Ｋｏｉ等（１９８９）Ｍｏｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，２：１２〜２１）。
ＫＡＩ１ ｃＤＮＡクローンの単離と配列決定
ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを指数関数的に増殖するＡＴ６．１−１１−１*細胞からＦａｓｔＴｒａｃｋ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて単離した。Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）を用いて、５μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡからの第１鎖ｃＤＮＡ合成を開始した。販売者（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）が薦める方法によって、二本鎖ｃＤＮＡをプラスミドｐＳＰＯＲＴ １ベクターにクローン化した。ヒトＡｌｕ配列プライマーＡｌｕ５５９（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．等（１８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６６８６〜６６９０）を用いて、抑制ハイブリッドＡＴ６．１−１１−１*と非抑制クローンＡＴ６．１−１１−２とからゲノムＤＮＡをＰＣＲによって増幅させた。ＡＴ６．１−１１−１*の多重Ａｌｕ−ＰＣＲフラグメントをＴ−末端ベクターｐＣＲ１０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローン化した。Ａｌｕ−ＰＣＲ生成物の各フラグメントに対応する個々のクローンを、これらのＡｌｕ−ＰＣＲ生成物のサイズを臭化エチジウムによって染色したアガロースゲル中の分子量マーカーと比較した後に、単離した。ＡＴ６．１−１１−１*に特有な１１個のフラグメントをランダムプライミング（random priming）（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）によって標識して、ストリンジェント洗浄条件（０．１ｘＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で６５℃、３０分間）下でｃＤＮＡライブラリーの５ｘ１０⁴組換え体をスクリーニングするために用いた。５種類の独立したクローンが得られ、これらのインサートをＳｅｑｕｅｎａｓｅキット（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて配列決定した。ＤＮＡ配列をＧＣＧパッケージ（バージョン７．３，１９９３，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって分析した。ＲＮＡ分析： ＡＴ６．１、ＡＴ６．１−１１−１*、−２及び−３からの細胞質ＲＮＡを指数関数的に増殖する細胞からＦａｓｔＴｒａｃｋ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて調製した。他のポリ（Ａ）⁺ＲＮＡと、ヒトマルチプル組織ノーザン・ブロットとはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。２μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡをホルムアミドによって変性させ、ホルムアミド緩衝剤中の１．２％アガロースゲル上で分画した。次に、ＲＮＡをナイロン膜上に移し、８０℃のオーブン中で９０分間焼成してから、ＱｕｉｃｋＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中で標識プローブに、６８℃において１．５時間ハイブリダイズさせ、０．１％ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で６８℃において３０分間洗浄し、オートラジオグラフィー分析した。
ＤＮＡ分析： １５μｇのゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩによって消化させ、１．２％アガロースゲル上で分離させた。変性及び中和後に、ゲル中のＤＮＡをナイロン膜に移した。ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリ及び酵母からのＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡを含有する“ズー”ブロット（Ｚｏｏ−ブロット）はＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。サザン・ブロットをさらにハイブリダイズさせ、ノーザン・ブロットに関して上述したと同じ条件下で洗浄した。
ＰＣＲ： この試験における全てのＰＣＲは２５ｐｍｏｌの各プライマー、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、５００ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチン、２５０ｍＭの各ｄＮＴＰ及び０．２５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐａｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を含む５０μｌ中でおこなった。初期ＤＮＡ変性を９５℃において５分間おこなった後に、９４℃変性１分間、５５℃アニーリング１分間、７２℃伸長（extension）４分間の３５サイクルをおこない、７２℃、８分間の最終的伸長をおこなった。
プローブとオリゴヌクレオチド配列： サザンブロット分析とノーザンブロット分析とに用いたＫＡＩ１プローブ（ＫＡＩ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド６４〜１０９４）は、配列番号：１３ ＡＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧと配列番号：１４ ＴＣＡＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＡＧＧに示すプライマーを用いてＰＣＲによって形成した。ヒト及びラットのβ−アクチンプローブは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した鋳型とプライマーとによって形成したＰＣＲ生成物であった。ヒトβ−アクチンのプライマー配列は配列番号：１５ ＧＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡ及び配列番号：１６ ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧＧＡＧＧＧＧＣＣとして示され、ラットβ−アクチンのプライマー配列は、配列番号：１７ ＴＴＧＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＴＡＴＧＧと配列番号：１８ ＧＴＣＴＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＴＧＣＴＡＧＧとして示される。
実施例１
ＫＡＩ１遺伝子のクローニング
ＡＴ６．１前立腺癌細胞の転移抑制の一因となるヒト染色体１１上の遺伝子をクローン化するために、ｐ１１．２−１３領域からのゲノムＤＮＡフラグメントを、転移抑制微小核細胞ハイブリッドＡＴ６．１−１１−１*と、非抑制ハイブリッドＡＴ６．１−１１−２及びＡＴ６．１−１１−３とからのＤＮＡと共に、ヒト特異的Ａｌｕ要素仲介ＰＣＲ（Ａｌｕ−ＰＣＲ）（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６６８６〜６６９０）を用いて単離した。ＡＴ６．１−１１−１ＤＮＡにのみ見い出されるＡｌｕ−ＰＣＲフラグメントを次に、プローブとして用いて、ヒト染色体領域１１ｃｅｎ−ｐ１３を含有する抑制細胞ハイブリッドクローンＡＴ６．１−１１−１*から形成されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。得られた５種類のｃＤＮＡクローンについて、これらのｃＤＮＡ配列に由来するプライマーを用いる逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出したときに、抑制ハイブリッドには全てが発現したが、非抑制ハイブリッドには発現しなかった。ヒト前立腺からと、細胞ラインＡＴ６．１、ＡＴ６．１−１１−１*、−２及び−３から単離されたＲＮＡのノーザン分析は、ｃＤＮＡクローンの２つがそれぞれヒト組織と抑制ＡＴ６．１−１１−１*細胞とにおいて２．４ｈｂと４．０ｋｂ転写体を検出したことを明らかにした。Ｋａｎｇ Ａｉ（抗癌に対する中国語）に対してＫＡＩ１と名付けられた、このようなクローンの１つのノーザン・ブロットの結果を図１に示すが、これはＫＡＩ１ ｍＲＮＡが転移抑制ＡＴ６．１−１１−１*細胞中に多く存在するが、親のＡＴ６．１細胞と非抑制ハイブリッドには存在しないことを明白に実証する。それ故、ＫＡＩ１クローンをさらに分析した。
ＫＡＩ１遺伝子が転移抑制に関係するヒト染色体１１のｐ１１．２−１３領域から単離されたことを確証するために、ヒト胎盤、齧歯類細胞（Ａ９とＡＴ６．１）、及びヒト−齧歯類微小核細胞ハイブリッド（ＡＴ６．１−１１−１*、ＡＴ６．１−１１−２及びＡＴ６．１−１１−３）からの１５μｇのゲノムＤＮＡに対してサザン・ブロット分析をおこない、ＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、１．２％アガロースゲル上で分離させ、ＫＡＩ１プローブによってハイブリダイズさせた。図２に示す結果は、転移抑制に関係するｐ１１．２−１３領域を有する細胞ハイブリッド（ＡＴ６．１−１１−１*）のみが、ＫＡＩ１プローブにハイブリダイズしたときに、正常なヒトＤＮＡで観察されるパターンを有することを実証する。ＫＡＩ１プローブの中期染色体に対する蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションはＫＡＩ１をｐ１１．２領域にさらに局在化した。
実施例２
ＫＡＩ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と演繹アミノ酸配列
ＫＡＩ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と演繹アミノ酸配列を図３に示す。ＫＡＩ１ ｃＤＮＡはヌクレオチド位置１６６から９６６までの単一のオープンリーディングフレームを有し、算出分子量２９，６１０ダルトンを有する、２６７アミノ酸のタンパク質であると予測される。Ａｌｕ要素はｃＤＮＡの３’−非翻訳領域に存在した。予測されたタンパク質は４個の疎水性の、恐らく膜通過ドメインと、１個の大きい細胞外親水性ドメインとを、３個の可能なＮ−グリコシル化部位と共に有する。上述したように、ＫＡＩ１ ｃＤＮＡ配列はヒトリンパ球Ｃ３３，Ｒ２及びＩＡ４からの３種類のｃＤＮＡクローンと同じである。
実施例３
ＫＡＩ１が転移サプレッサー遺伝子であることの確認
ＫＡＩ１がＡＴ６．１−１１−１*における転移抑制の一因である遺伝子であるかどうかを研究するために、ＫＡＩ１ ｃＤＮＡを構成発現ベクターにサブクローン化し、親ＡＴ６．１細胞に次のようにトランスフェクトした。要約すると、ＫＡＩ１ ｃＤＮＡをｐＣＭＶｎｅｏにクローン化したが、ｐＣＭＶｎｅｏでは転写が構成ヒトサイトメガロウイルス プロモータによっておこなわれる（Ｅｌｉｙａｈｕ，Ｄ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８９）８６：８７６３〜８７６７）。得られるプラスミドｐＣＭＶ−ＫＡＩ１をリン酸カルシウム沈殿方法によってＡＴ６．１細胞にトランスフェクトさせ、ベクターのみも負の対照としてトランスフェクトさせた。個々のトランスフェクタント（transfectant）を選択培地（ＲＰＭＩ−１６４０ プラス １０％ウシ胎児血清、２単位／ｍｌのペン−ストレップ（pen-strep）及び５００μｇ／ｍｌのネオマイシン）中で単離させた。指数関数的に増殖する非トランスフェクトＡＴ６．１、ＡＴ６．１−１１−１*及びＡＴ６．１−１１−２細胞と、指数関数的に増殖するベクター（ＡＴ６．１ＶＥＣ−１、ＡＴ６．１ＶＥＣ−２及びＡＴ６．１ＶＥＣ−３）と、ＫＡＩ１（ＡＴ６．１ＫＡＩ−１、ＡＴ６．１ＫＡＩ−２及びＡＴ６．１ＫＡＩ−３）トランスフェクタントとをスクラッピングによって回収し、細胞塊を穏やかなピペッティング（pipetting）によって破壊した。細胞懸濁液を管に入れ、室温において３０分間放置した。上清懸濁液からの細胞を回収し、洗浄し、冷ＰＢＳ中に１０⁶細胞／ｍｌで再懸濁させた。生後４〜５週間雄Ｎｃｒ ｎｕ／ｎｕヌードマウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に、０．１ｍｌの指定細胞懸濁液（１０⁵細胞）（表１の“クローン”なる表示の欄）を頭蓋基部から尾基部までの距離の約１／４の右側と左側の両方の側面中央の部位に皮下注射した。注射から約６週間後に、腫瘍を計量し、肺をＢｏｕｉｎ溶液で膨張させた。肺表面の腫瘍病巣を切開用（dissecting）顕微鏡下で評価した。個々のトランスフェクタントをＫＡＩ１発現と、肺転移を抑制するそれらの能力とに関して分析し、１実験の結果を表１に示す。

提示した結果は、ＫＡＩ１発現がマウス当たりの肺転移数の有意な抑制を生じたが、原発腫瘍の増殖速度には影響を与えないことを示す。さらに、親ＡＴ６．１細胞は、ヌードマウスに皮下注射されたときに、マウス当たり５８転移を生じたが、ＡＴ６．１−１１−１*細胞に観察された高レベル発現と同じＫＡＩ１ｍＲＮＡ発現レベルを有する２トランスフェクタントは動物当たりわずか６乃至７転移を生じたにすぎない。これに反して、３個のベクター対照トランスフェクタントはマウス当たり３０〜４７肺転移を生じ、これは平均すると高いＫＡＩ１ｍＲＮＡ発現を示した２ＫＡＩ１トランスフェクタント（ＡＴ６．１ＫＡＩ−１とＡＴ６．１ＫＡＩ−２）によって観察された転移数の５．５倍である。さらに、低いＫＡＩ１発現を示したＡＴ６．１ＫＡＩ−３は２３肺転移を生じたが、これは対照トランスフェクタントの肺転移の平均数よりもまだかなり低かった。最後に、ノーザン分析は、ＫＡＩ１トランスフェクタントからの２８肺転移においてＫＡＩ１発現が検出不能であるか又は非常に低いことを実証し、このことはＫＡＩ１発現が無いか又は少ない細胞の選択が転移形成を生じたことを示唆する。これらの結果は、ＡＴ６．１細胞の転移能力がＫＡＩ１発現によって抑制されることを実証する。
実施例４
転移ヒト前立腺腫瘍に由来する細胞ラインにおけるＫＡＩ１ ｍＲＮＡ発現
ＫＡＩ１ ｍＲＮＡ発現が正常なヒト前立腺における発現に比べてヒト転移前立腺腫瘍において軽減しているかどうかを確認するために、ヒト正常前立腺組織からと転移前立腺癌に由来する細胞ライン（Ｋａｉｇｈｎ，Ｍ．Ｅ．等（１９７９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｕｒｏｌ．１７：１６；Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ，Ｊ．Ｊ．等，「前立腺癌モデル」，Ｇ．Ｐ．Ｍｕｒｐｈｙ編集（Ａｌａｎ．Ｒ．Ｌｉｓｓ社，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）１１５〜１３２頁；Ｔ．Ｉｉｚｕｍｉ等（１９８７）Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３７：１３０４；Ｄ．Ｄ．Ｍｉｃｋｅｙ等，「前立腺癌モデル」，Ｇ．Ｐ．Ｍｕｒｐｈｙ編集（Ａｌａｎ．Ｒ．Ｌｉｓｓ社，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０）６７〜８４頁）からの１５μｇの総ＲＮＡをホルムアミドによって変性させ、電気泳動させ、１．２％アガロースゲル上で分画し、ＫＡＩ１とヒトβ−アクチンプローブに連続的にハイブリダイズさせた。このノーザンブロット分析の結果は図４に示すが、これらの結果は正常な前立腺（前立腺）に比べた場合に、転移前立腺腫瘍に由来するヒト細胞ライン（ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ＴＳＵ−Ｐｒ１およびＤＵ１４５）においてＫＡＩ１発現がかなり減少したことを明白に実証する。さらに、図４（−８０℃において一晩）に示したオートラジオグラムよりも長時間の暴露（−８０℃において４日間）は全ての腫瘍細胞におけるＫＡＩ１ ｍＲＮＡの発現を示したが、発現レベルは正常前立腺におけるよりも非常に低かった。
ＫＡＩ１による転移抑制が間接的な免疫機構によるものである可能性を排除するために、他の２つの実験をおこなった。第一に、親ＡＴ６．１細胞、細胞ハイブリッドクローンＡＴ６．１−１１−１*、又はＫＡＩ１トランスフェクタント（ＡＴ６．１ＫＡＩ−１）を重度な複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの脚に５ｘ１０⁵細胞／マウスで接種した。腫瘍が３〜５ｃｍ³に達したときに、腫瘍を有する脚を手術によって切除し、接種後５０〜６０日まで、動物を追跡した。各マウスの肺転移を表１に記載するように分析した。ＡＴ６．１に関しては、９／９マウスが８３／マウスの平均数で肺転移を有した。ＡＴ６．１−ｌｌ−１*に関しては、４／９マウスが６／マウスの平均数で肺転移を有した。ＡＴ６．１ＫＡＩ−１に関しては、２／７マウスが２／マウスの平均数で肺転移を有した。これらの試験は、ヌードマウスよりも免疫抵抗性減弱した（immune compromised）ＳＣＩＤマウスにおいても、転移抑制が観察されたことを実証した。
第二に、微小核細胞−仲介染色体転移によってＫＡＩ１遺伝子が導入された高度に転移性のラット乳癌細胞は、ハイブリッドが同様なレベルのＫＡＩ１ ｍＲＮＡを発現したとしても、それらの転移力（ability to metastasize）を保有した（Ｒｉｎｋｅｒ−Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｃ．Ｗ．等（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４：６２４９〜６２５６）。これらのデータに基づくと、ＫＡＩ１による転移抑制の原因はより直接的な機構であるように思われる。この可能性に一致して、高ＫＡＩ１発現性ＡＴ６．１−１１−１*ハイブリッド細胞は、Ｂｏｙｄｅｎチャンバーアッセイ（chamber assay）において親ＡＴ６．１細胞又は非抑制ＡＴ６．１−１１−２ハイブリッド細胞に比べて、それらの侵襲力（invasive ability）を約５０％低下させる。要約すると、Ｂｏｙｄｅｎチャンバー侵襲性分析をＪ．Ｖｕｋａｎｏｖｉｃ等（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５３：（１９３３）が述べているように、マトリゲル（matrigel）被覆フィルターと、下部孔におけるケモアトラクタント（chemoattractant）としての５％ウシ胎児血清とを用いて、おこなった。１２時間の分析中に、高電界につき１９±３親ＡＴ６．１細胞がマトリゲルフィルターから侵入し（invade）、これに対して、転移抑制ＡＴ６．１−１１−１*ハイブリッド細胞では１０±２、非抑制ＡＴ６．１−１１−２ハイブリッド細胞では１８±２であった。
実施例５
ヒト組織におけるＫＡＩ１遺伝子の発現
種々なヒト組織におけるＫＡＩ１遺伝子の発現レベルを評価するために、マルチプルヒト組織から単離したＲＮＡに対してノーザン分析をおこなった。要約すると、、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入したヒトマルチプル組織ノーザン・ブロットを方法の項で述べた条件下でＫＡＩ１プローブ及びヒトβ−アクチンプローブと逐次ハイブリダイズさせた。図５に提示する結果は、２．４ｋｂ ＫＡＩ１転写体が試験した全てのヒト組織で検出され、前立腺、肺、肝臓、腎臓、骨髄及び胎盤に多く含まれ；乳腺、膵臓、骨格筋及び胸腺には中程度に含まれ；脳、心臓、卵巣、胃及び子宮には低く発現されることを示す。
実施例６
種におけるＫＡＩ１遺伝子の保存
種においてＫＡＩ１遺伝子が進化において保存されているかどうか確認するために、種々な種からのＥｃｏＲＩ−消化ゲノムＤＮＡを含有するズーブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入し、ＫＡＩ１プローブにハイブリダイズさせた。図６に提示する結果は、ＫＡＩ１コーディング配列の進化における保存がヒト、サル、イヌ及びウサギにおいて高度であり、ウシ、ラット、マウスにおいて中程度であることを示す。ＫＡＩ１の進化における保存と広範囲な組織分布とは、この遺伝子が重要な生物学的機能を有することを示唆する。
実施例７
ヒト組織サンプルにおけるＫＡＩ１発現の変化と転移との相関関係
前立腺癌患者からの肝臓転移の腫瘍バイオプシーと、健康な患者からの肝臓バイオプシーとを、ノーザンブロッティングによるＫＡＩ１ ｍＲＮＡ発現に関して分析した。腫瘍サンプルではＫＡＩ１ ｍＲＮＡ発現が喪失し、このことは前立腺癌患者における肝臓転移の存在がＫＡＩ１発現の変化と相関することを実証する。
配列表

Claims (14)

1. 被験者における悪性癌の存在をインビトロで検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
   （ａ）ＫＡＩ１ ｍＲＮＡの存在に関して被験者から単離したｍＲＮＡを分析する工程、および
   （ｂ） 前記被験者のＫＡＩ１ ｍＲＮＡを、配列番号：２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、正常なヒト由来の野生型ＫＡＩ１ ｍＲＮＡと比較することを含み、該野生型と比較した前記被験者のＫＡＩ１ ｍＲＮＡの発現の喪失または低下の存在が、前記被験者における悪性癌の存在を実証する方法。
2. 分析する工程がノーザンブロット分析を含む、請求項１記載の方法。
3. 分析する工程がＲＴ−ＰＣＲを含む、請求項１記載の方法。
4. ＰＣＲ工程に用いられるプライマーが、配列番号：２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＫＡＩ１ ｃＤＮＡから誘導される、請求項３記載の方法。
5. ＰＣＲ工程がプライマー対を使用し、プライマー対の一方のプライマーが、配列番号：１〜１４のいずれかに示される核酸配列からなる、請求項４の方法。
6. 分析する工程がＲＴ−ＰＣＲ−ＳＳＣＰを含む、請求項１記載の方法。
7. ＰＣＲ工程に用いられるプライマーがＫＡＩ１ ｃＤＮＡから誘導される、請求項６記載の方法。
8. プライマーが、配列番号：１〜１４に示される核酸配列から選択される、請求項７の方法。
9. 被験者における悪性癌の存在をインビトロで検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
   （ａ）ＫＡＩ１タンパク質の存在に関して、被験者由来のサンプルにおいてタンパク質を分析する工程、および
   （ｂ） 前記被験者のＫＡＩ１タンパク質を、配列番号：２０に示されるアミノ酸配列からなる、正常なヒト由来の野生型ＫＡＩ１タンパク質と比較することを含み、該野生型タンパク質と比較した前記被験者のＫＡＩ１タンパク質の発現の喪失または低下の存在が、前記被験者における悪性癌の存在を実証する方法。
10. 分析する工程がウェスタンブロッティングを含む、請求項９記載の方法。
11. 分析する工程がイムノヒストケミストリーを含む、請求項９記載の方法。
12. 配列番号：１〜１４のいずれかに示される群から選択される核酸配列からなる、精製単離されたプライマー。
13. 被験者における悪性癌の存在の検出に用いるための診断キットであって、配列番号：１〜１４から成る群から選択される核酸配列からなるプライマーを含むキット。
14. 被験者に野生型ＫＡＩ１遺伝子を供給するための薬剤の製造のための、配列番号：２０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、正常なヒト由来の野生型ＫＡＩ１遺伝子を含む組換えベクターの使用。

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