KR101364761B1

KR101364761B1 - 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 프로브, 프라이머 및 이의 이용방법

Info

Publication number: KR101364761B1
Application number: KR1020120003808A
Authority: KR
Inventors: 채치범; 김동욱; 강종훈; 최수영
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단; 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2014-02-18
Also published as: KR20130083185A; WO2013105801A1

Abstract

본 발명은 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 캡쳐 프로브 및 프라이머 세트와 이를 이용하는 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타입 검출 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 고체 지지체 표면에서 역전사반응, 중합효소 연쇄반응, 유전자 변성, 및 혼성화의 통합 수행에 의하여 BCR-ABL 변형 단백질의 타입을 검출할 수 있는 캡쳐 프로브와 증폭된 표적 DNA 사이에서의 가지상 핵산 복합체의 형성을 촉진시킴으로써, 민감성 및 정확성 등이 현저히 향상된 BCR-ABL 변형 단백질의 타입 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타입 검출 방법은 역전사 반응, 비대칭 중합효소 연쇄반응, 및 혼성화를 통합하였기 때문에, 기존의 방법에 비하여 민감성이 현저히 향상되었고, 검출 시간이 단축되었을 뿐만 아니라 검출 단계의 자동화를 가능하게 한다.

Description

만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 프로브, 프라이머 및 이의 이용방법{Capture probes and primers for genotyping of Chronic Myeloid Leukemia, and uses thereof}

본 발명은 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 캡쳐 프로브 및 프라이머 세트와 이를 이용하는 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타입 검출 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 고체 지지체 표면에서 역전사 반응, 중합효소 연쇄반응, 유전자변성 및 혼성화의 통합 수행에 의하여 BCR-ABL 변형 단백질의 타입을 검출할 수 있는 캡쳐 프로브와 증폭된 표적 DNA 사이에서의 가지상 핵산 복합체의 형성을 촉진시킴으로써, 민감성 및 정확성이 현저히 향상된 BCR-ABL 변형 단백질의 타입 검출 방법에 관한 것이다.

백혈병(Leukemia)은 백혈구가 비정상적으로 증식되는 질환을 총칭한다. 백혈병의 종류는 백혈병이 기원하는 백혈구에 따라‘골수성 백혈병’과‘림프성 백혈병’으로 나뉘고, 진행속도에 따라 급성백혈병과 만성백혈병으로 나뉜다. 백혈병의 임상양상은 질환의 유형과 침범된 세포의 성질에 따라 다양하다.

이 중, 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML)은 다양한 발병원인이 밝혀지고 있으며, 가장 일반적인 원인은 염색체의 전좌(translocation)에 의하여 발생하는 것으로 알려져 있는데, 특히, 9번 염색체와 22번 염색체의 전좌가 주된 발병원인으로 알려져 있다. 실제, 만성 골수성 백혈병 환자의 95% 정도에서 9번 염색체와 22번 염색체 사이의 전좌가 발견되며, 전기 전좌는 9번 염색체의 q34 위치에 존재하는 ABL(abelson oncogene) 유전자 일부가 22번 염색체 q11.2 위치에 존재하는 BCR(breakpoint cluster region) 유전자로 전위되어 형성되는데, 이러한 재배열을 BCR-ABL 재배열(BCR-ABL rearrangement)이라고 한다. 재배열된 BCR-ABL 유전자를 가진 염색체를 Philadelphia chromosome이라고 한다.

골수성 백혈병은 매년 10만명중 1-2명의 발병율을 보이며, 여자보다 남자가 많은 편이며, 50세 이상의 성인이 많은 편이다. 특히 서방국가에서는 성인 백혈병환자의 15-20%가 골수성 백혈병 환자이다.

아동의 급성 백혈병 중 70%가 급성 림프성모수 백혈병(ALL)이고, 성인의 급성 백혈병의 20%가 ALL이다. ALL 환자의 20-25%에서 BCR-ABL유전자가 결합된 필라델피아 염색체가 검출된다.

전기 BCR-ABL 재배열에 의한 만성 골수성 백혈병에는 글리벡(GlivecTM)이라는 상표로 판매되는 이마티니브 메실레이트(imatinib mesylate)가 특효약으로서 치료효과가 매우 뛰어나기 때문에, 전기 BCR-ABL 재배열의 조기진단은 환자의 치료방향 결정과 예후 판단에 매우 중요하다.

현재까지 백혈병 진단 방법으로는 혈액검사, 말초혈액도말검사, 골수검사, 면역표현형검사, 염색체구조 및 이상을 보기 위한 세포유전학검사 등을 거치나, 동일한 소견을 보이는 종양이라 하더라도 환자에 따라 매우 다른 임상결과를 나타내고 각종 치료에도 각기 다르게 반응을 보일 수 있기 때문에, 병리, 형태학적 특이성에 따른 진단 및 분류법은, 백혈병을 치료하기 위한 적합한 치료방법을 결정하는데 한계를 나타내고 있는 실정이다. 최근에는 분자유전학이 발달되고, 악성 혈액질환의 80-90% 이상에서 백혈병 특이 염색체 및 유전자의 이상이 규명이 되면서, 염색체 이상에 의한 분자생물학적 진단방법인 고 분염법, 형광 인시튜 하이브리드 법(in situ hybridization), 중합효소 연쇄반응법(PCR)등이 사용되어 진단성공율을 향상시키고 있다. 그럼에도 불구하고, 백혈병의 종류를 판단하기 위한 진단 정확도가 30 내지 40% 정도에 불과하며, 진단에 소요되는 시간이 길다는 단점이 개선되지 않고 있다.

필라델피아 염색체를 가진 CML이나 ALL의 경우, BCR 유전자와 ABL 유전자가 결합된 위치가 다른 종류(genotype)가 8가지가 규명이 되었으며, 공통적으로 ABL 유전자에 존재하는 단백질을 인산화시키는 효소가 BCR 유전자와 결합함에 따라 활성화되어 암의 발생과 암세포의 성장에 기여한다고 알려져 있다. 따라서 이 효소의 작용을 억제하는 약(예, 글리벡)이 암치료에 탁월한 성과를 나타내고 있다. 또한 이 두개의 유전자가 결합된 위치가 약물치료의 성과에 영향을 준다는 보고가 있다. 따라서 BCR/ABL 혼합유전자의 존재 뿐만 아니라, genotype을 결정하는 것이 필라델피아 염색체를 가진 CML이나 ALL 치료에 중요하다.

95%이상의 CML 환자는 M-bcr type, 즉 BCR 유전자 exon 14와 ABL 유전자 exon 2가 결합된 b3a2 type(혹은 e14a2라고도 명칭함)과 BCR exon 13과 ABL exon2가 결합된 b2a2 type(혹은 b13a2 type)의 chimera 유전자를 가지고 있다. 소수의 CML 환자에서 검출되는 M-bcr type으로는 BCR exon 1과 ABL exon 2가 결합된 e1a2 유전자가 있으며, 이 유전자는 ALL 환자의 60-70%에서 나타난다. 또 다른 소수의 CML 환자가 지니고 있는 c3a2유전자는 BCR exon 19와 ABL exon 2가 결합된 것이다. 이 네가지 융합유전자, 즉 b3a2, b2a2, e1a2, 그리고 c3a2는 98% 이상의 CML 환자가 지니고 있다.

본 발명에서는 CML 환자의 98%가 지니고 있는 genotype 4가지를 한번에 규명할 수 있는 유전자 진단칩을 개발하였다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 만성 골수성 백혈병 타입 검출용 캡쳐 프로브 및 프라이머 세트를 제공하는 것을 그 목적으로 한다. 또한 상기 캡쳐 프로브 및 프라이머 세트를 포함하는 만성 골수성 백혈병 타입 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것을 그 목적으로 한다. 또한 상기 캡쳐 프로브 및 프라이머 세트를 이용하는 만성 골수성 백혈병 타입 검출 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 6 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 캡쳐 프로브를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 프라이머를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 만성 골수성 백혈병 타입 검출용 캡쳐 프로브 및 프라이머 세트와 DNA 중합효소(polymerase), 역전사효소(reverse transcriptase), dNTP(dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 및 완충용액을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 프라이머 세트는 역방향 프라이머(reverse primer)인 서열번호 5의 염기서열을 포함하고, 전방향 프라이머(forward primer)인 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 프라이머 세트는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머를 1:1 내지 1:10의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 프라이머 세트는 5’ 말단에 형광 분자 또는 비오틴(biotin)으로 표지화된 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 만성 골수성 백혈병 타입 검출용 조성물을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 골수 또는 말초 혈액으로부터 추출한 세포를 파쇄하여 세포 추출물을 획득하는 단계; 상기 세포 추출물을 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 프라이머 세트, DNA 중합효소(polymerase), 역전사효소(reverse transcriptase), dNTP(dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 및 완충용액과 혼합하여 반응 혼합물을 제조하는 단계; 상기 반응 혼합물을 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 캡쳐 프로브가 고정된 고체 지지체 표면으로 전달하는 단계; 상기 반응 혼합물 중의 RNA를 cDNA로 역전사(reverse transcription)시키는 단계; 상기 cDNA 중에서 BCR-ABL(breakpoint cluster region-abelson oncogene) 유전자를 비대칭 중합효소 연쇄반응(asymmetric polymerase chain reaction)으로 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 유전자를 가열하여 변성(denaturation)시키는 단계; dNTP, 프라이머, 중합효소를 포함하는 반응혼합물 내에서 상기 변성된 유전자와 캡쳐 프로브간의 혼성화(hybridization)를 수행하여 가지상(branched) 핵산 복합체 형성을 촉진하는 단계; 및 상기 가지상 핵산 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타입 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 캡쳐 프로브는 카본 링커(carbon linker)를 이용하여 5’ 말단에 아민기를 추가하여 고체 지지체 표면에 고정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 세포 추출물을 획득하는 단계는 90℃ 내지 100℃에서 3분 내지 10분간 가열하여 세포를 파쇄한 후, 원심분리하여 상층액을 획득하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 역전사 단계 및 비대칭 중합효소 연쇄반응 단계는 통합되어 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유전자를 변성시키는 단계는 90℃ 내지 100℃에서 3분 내지 10분간 가열하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 혼성화 단계는 50℃ 내지 60℃에서 한 시간 이상 반응시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타입 검출 방법은 모든 과정을 단일 반응 혼합물(reaction mixture) 내에서 진행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 가지상 핵산 복합체를 검출하는 단계는 프라이머에 표지된 형광을 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 가지상 핵산 복합체를 검출하는 단계는 프라이머에 표지된 비오틴과 형광 혹은 발색 가능한 효소가 연결된 스트렙트타비딘(streptavidin)을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타입 검출 방법은 세포로부터 RNA를 추출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 캡쳐 프로브 및 프라이머를 이용한 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타입 검출 방법은 역전사 반응, 비대칭 중합효소 연쇄반응, 및 혼성화를 통합하였기 때문에, 기존의 방법에 비하여 민감성이 현저히 향상되었고, 검출 시간이 단축되었을 뿐만 아니라 검출 단계의 자동화가 가능하다. 뿐만 아니라, 통합과정을 통한 시그날과 민감도의 대폭 증가 효과가 있으며, 본 발명의 캡쳐 프로브 및 프라이머의 특이성이 매우 높아 만성 골수성 백혈병 타입을 조기에 정확하게 검출할 수 있다. 따라서 만성 골수성 백혈병을 보다 효과적으로 치료하고 그 예후를 판정하는데 중요하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1 은 본 발명의 프라이머 및 캡쳐 프로브가 키메라(chimerical) BCR-ABL mRNA 상에 결합하는 위치를 간략히 나타낸 모식도이다.
도 2 는 키메라(chimerical) BCR-ABL cDNA를 포함하는 플라스미드(plasmid)를 이용하여 프라이머 및 캡쳐 프로브의 특이성(specificity)을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3 은 본 발명의 프라이머와 캡쳐 프로브를 이용하여 2가지 이상의 융합 유전자의 혼합 발현을 검출할 수 있는지를 상기 BCR-ABL의 cDNA를 포함하는 플라스미드의 혼합물을 가지고 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4 는 본 발명의 캡쳐 프로브가 고정화 되어있는 고상에서 수행하는 통합된 역전사, 비대칭 PCR 및 혼성화 반응을 통한 시그날 및 검출 민감도를 증폭시킨 결과를 나타낸 도면이다.
도 5 는 본 발명의 캡쳐 프로브가 고정화 되어있는 고상에서 수행하는 통합된 역전사, 비대칭 PCR 및 혼성화 반응을 이용한 DNA 마이크로어레이의 BCR-ABL 융합 유전자 발현량에 대한 검출 한계를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6 은 본 발명의 캡쳐 프로브가 고정화 되어있는 고상에서 수행하는 통합된 역전사, 비대칭 PCR 및 혼성화 반응을 이용한 DNA 마이크로어레이를 이용하여 만성 골수성 백혈병 환자의 RNA로부터 BCR-ABL 융합 유전자 타입을 검출한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명자들은 간편하면서도 민감성 및 정확성이 향상된 BCR-ABL(breakpoint cluster region-abelson oncogene) 변형 단백질의 타입을 확인할 수 있는 검출 방법에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 서열번호 6 내지 12로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 캡쳐 프로브(capture probe) 및 서열번호 1 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 프라이머(primer)를 제공한다.

본 발명자들은 BCR-ABL 타입에 따른 특이성을 가지는 프라이머 및 캡쳐 프로브를 제작하기 위하여, BCR mRNA(accession number X02596)와 ABL mRNA(accession number X16416)의 서열을 기초로 하여 프라이머 및 캡쳐 프로브를 제작하였다. 본 발명의 프라이머 중 역방향 프라이머 A2-R(서열번호 5)은 RNA로부터 역전사 과정에 의해 만들어진 cDNA로부터만 PCR이 일어나도록, ABL A2 엑손과 A3 엑손 경계 부위에 결합하도록 디자인되었다. 본 발명의 캡쳐 프로브 B3-P, B2-P, E1-P, C3-P 및 A2-P(서열번호 6, 7, 8 및 9)는 BCR-ABL 융합 유전자와 정상 유전자의 발현을 동시에 재현성 있게 검출하기 위해 각 BCR cluster region(엑손1, 엑손13, 엑손14)과 ABL 엑손2 부분에 특이적으로 결합하도록 디자인되었다. 본 발명의 캡쳐 프로브 B3A2, 및 B2A2(서열번호 10 및 11)는 B3A2 유형의 융합 유전자 발현과 B3A2와 B2A2 유형의 융합 유전자 혼합 발현을 추가로 구분하기 위해 각 유형(B2A2, B3A2)의 BCR-ABL 유전자 경계 부분에 결합하도록 디자인되었다. 본 발명의 프라이머 및 캡쳐 프로브가 키메라(chimerical) BCR-ABL mRNA 상에 결합하는 위치는 도 1 에 나타내었다. 도 1의 B2, B3, 및 C3는 중단점(breakpoint)을 포함하는 BCR 엑손(exon) 부분을 나타낸다.

상기 서열번호 1 내지 4의 염기서열은 전방향 프라이머(forward primer)이고, 서열번호 5의 염기서열은 역방향 프라이머(reverse primer)로, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 이용하기 위하여 역방향 프라이머(reverse primer)인 서열번호 5의 염기서열을 포함하고, 전방향 프라이머(forward primer)인 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 염기서열을 포함하는 프라이머 세트를 제작하여 이용하였다. 또한 검출을 용이하게 하기 위하여 상기 프라이머의 5’ 말단에 표지화할 수 있다. 표지화하는 방법으로는 방사성 동위원소, 형광물질, 또는 비오틴을 사용할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일예로는, 상기 프라이머가 해당 타겟의 BCR-ABL 타입을 특이적으로 증폭시키며, 프로브가 각각의 BCR-ABL 타입에 결합된 것을 확인할 수 있었으며, 또한 DNA 마이크로어레이를 이용하여 서로 다른 BCR-ABL 융합 유전자가 섞여있는 시료에서 만성 골수성 백혈병의 타입을 검출할 수 있다는 것을 확인하였다(실시예 1 참조).

따라서 본 발명은 상기 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 캡쳐 프로브 및 프라이머 세트와 DNA 중합효소(polymerase), 역전사효소(reverse transcriptase), dNTP(dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 및 완충용액을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 조성물을 포함하는, 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는, 대칭 PCR(전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 비율이 1:1)에 비하여 비대칭 PCR(전방향 프라이머와 역방향 프라이머의 비율이 1:10)의 경우 검출 신호가 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 역전사, 비대칭 PCR 및 혼성화를 캡쳐 프로브가 고정된 유리 슬라이드 상에서 전 과정을 통합하여 수행할 경우 검출 신호가 혼성화만 유리 슬라이드 상에서 수행한 경우에 비교하여 15배 이상 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여 모든 과정을 단일 반응 혼합물(reaction mixture) 내에서 통합된 역전사, 비대칭 PCR 및 혼성화 반응을 진행하는 것은 검출의 민감도를 극적으로 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다. 그러나 이에 제한되지는 않는다.

따라서 본 발명은 골수 또는 말초 혈액으로부터 추출한 세포를 90℃ 내지 100℃에서 3분 내지 10분간 가열하여 파쇄한 후, 원심분리하여 상층액(세포 추출물)을 획득하는 단계; 상기 세포 추출물을 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 프라이머 세트, DNA 중합효소(polymerase), 역전사효소(reverse transcriptase), dNTP(dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 및 완충용액과 혼합하여 반응 혼합물을 제조하는 단계; 상기 반응 혼합물을 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 캡쳐 프로브가 고정된 고체 지지체 표면으로 전달하는 단계; 상기 반응 혼합물 중의 RNA를 cDNA로 역전사(reverse transcription)시키며 동시에 역전사된 cDNA 중에서 BCR-ABL(breakpoint cluster region-abelson oncogene) 유전자를 비대칭 중합효소 연쇄반응(asymmetric polymerase chain reaction)으로 증폭시키는 단계; 상기 증폭된 유전자를 90℃ 내지 100℃에서 3분 내지 10분간 가열하여 변성(denaturation)시키는 단계; dNTP, 프라이머, 중합효소를 포함하는 반응혼합물 내에서 상기 변성된 유전자와 캡쳐 프로브간의 혼성화(hybridization)를 수행하여 가지상(branched) 핵산 복합체 형성을 촉진하는 단계; 및 상기 가지상 핵산 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타입 검출 방법을 제공한다. 그러나 본 발명의 프라이머 및 캡쳐 프로브를 이용하여 만성 골수성 백혈병 타입을 검출하는 방법이라면, 이에 제한되지 않는다.

상기 검출 방법은 세포 추출물로부터 RNA를 추출하는 단계를 더 포함하여 정확성을 향상시킬 수 있다.

핵산 복합체를 검출할 수 있는 방법에는 제한이 없다. 예를 들어, 프라이머를 표지화하는 방법, 형광표지된 dNTP를 포함시키는 방법, DNA 염색 시약(예, EtBr, SYBR green 등)을 사용하여 염색하는 방법, 비오틴으로 표지된 프라이머를 이용하여 캡쳐 프로브에 결합된 DNA를 형광물질 혹은 효소가 결합된 스트렙타비딘(streptavidin)과 결합시킨 후 효소반응을 통한 신호(signal)를 측정하는 방법 등이 있다.

상기 유전자 변성은 단일 가닥(single strand)의 DNA를 형성하는 것을 의미하며, 통상적으로 90℃ 이상의 온도에서 두 가닥(double strand)의 DNA는 단일 가닥의 DNA로 분리된다. 상기 혼성화는 단일 가닥(single strand) DNA의 두 가닥 사이의 이중나선(duplex)의 형성 또는 염기 상보성에 의한 DNA 사슬과 RAN 사슬 사이의 이중나선의 형성을 의미한다. 상기 가지상 핵산 복합체는 3개 이상의 단일 가닥 DNA가 서로 부분적으로 결합하여 측쇄를 가진 응집된 형태의 DNA를 의미한다. 또한 상기 고체 지지체는 표적 핵산을 검출하기 위한 캡쳐 프로브가 부착될 수 있는 기재(substrate)를 의미한다. 고체 지지체의 종류에는 제한이 없다. 바람직하게는 다수의 캡쳐 프로브의 어레이를 결합시킬 수 있는 유리 슬라이드, 금속, 플라스틱 같은 평면의 기판일 수 있으나, 유리, 플라스틱, 혹은 고분자 비드(bead) 등의 구형의 기재도 가능하며, 유리나 플라스틱 용기, 즉 튜브(tube)와 같은 다양한 재질의 기재가 사용될 수 있다. 상기 캡쳐 프로브를 고체 지지체 표면에 결합시키기 위하여, 프로브의 3’ 또는 5’ 말단에 링커 분자를 결합시켜 고정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. DNA 마이크로어레이를 이용한 만성 골수성 백혈병의 타입 검출

1-1. 만성 골수성 백혈병 검출을 위한 프라이머 및 캡쳐 프로브 제작

DNA 마이크로어레이(microarray)를 이용하여 만성 골수성 백혈병의 타입을 검출하기 위하여, 대부분의 만성 골수성 백혈병 환자들이 가지고 있는 키메라(chimerical) BCR-ABL RNA(b3a2, b2a2, e1a2, 및 c3a2)의 검출을 위한 PCR용 프라이머(primer)와 캡쳐 프로브(capture probe)를 제작하였다. 본 발명의 전방향 프라이머 B2-F, E1-F(서열번호 1 및 2)는 각 BCR 엑손13, 엑손1 서열에 결합하도록 디자인 되었고, C3-F(서열번호 3)는 BCR 엑손18 서열에 결합하도록 디자인 되었다. 본 발명의 전방향 프라이머 A2-F(서열번호 4)는 ABL 엑손2 서열에 결합하도록 디자인 되었다. 본 발명의 역방향 프라이머 A2-R(서열번호: 5)은 RNA로부터 수행하는 역전사 과정에 의해 만들어진 cDNA로부터만 PCR이 일어나도록, ABL A2 엑손과 A3 엑손 경계 부위에 결합하도록 디자인되었다. 본 발명의 캡쳐 프로브 B3-P, B2-P, E1-P, C3-P 및 A2-P(서열번호 6, 7, 8 및 9)는 BCR-ABL 융합 유전자와 정상 유전자의 발현을 동시에 재현성 있게 검출하기 위해 각 BCR cluster region(엑손1,엑손13, 엑손14)과 ABL 엑손2 부분에 특이적으로 결합하도록 디자인 되었다. 본 발명의 캡쳐 프로브 B3A2, B2A2(서열번호 10 및 11)는 B3A2 유형의 융합 유전자 발현과 B3A2와 B2A2 유형의 융합 유전자 혼합 발현을 추가로 구분하기 위해 각 유형 (B2A2, B3A2)의 BCR-ABL 유전자 경계 부분에 결합하도록 디자인 되었다. 그 서열과 위치는 표 1 및 도 1에 나타내었다. A2-F 프라이머를 제외한 프라이머는 5’ 말단에 형광 분자(Cy3)로 표지화하여 사용하였고, 캡쳐 프로브는 5’ 말단에 아민기를 이용하여 고상에 고정화하여 사용하였다.

타입	명칭	서열 (5‘ → 3’)	서열번호
프라이머	B2-F	5'-[Cy3]GGGAGCAGCAGAAGAAGTG-3'	서열번호 1
	E1-F	5'-[Cy3]CAACAGTCCTTCGACAGCAG-3'	서열번호 2
	C3-F	5'-[Cy3]GAGTCAAGATTGCTGTGGTCAC-3'	서열번호 3
	A2-F	5'-GCCAGTAGCA TCTGACTTTGAG-3'	서열번호 4
	A2-R	5'-[Cy3]CCTAAGACCCGGAGCTTTTCACCTT-3'	서열번호 5
프로브	B3-P	5'-[T₁₀]TGAATGTCATCGTCCACTCAGCCACTG-3	서열번호 6
	B2-P	5'-[T₁₀]CCAGACTGTCCACAGCATTCCGCTGA-3'	서열번호 7
	E1-P	5'-[T₁₀]GGTTGTCGTGTCCGAGGCCACCATC-3'	서열번호 8
	C3-P	5'-[T₁₀]CACGGACATCCAGGCACTGAAGGCAGC-3'	서열번호 9
	A2-P	5'-[T₁₀]GTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCC-3'	서열번호 10
	B3A2	5'-[T₁₀]TTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCA-3'	서열번호 11
	B2A2	5'-[T₁₀]CCATCAATAAGGAAGAAGCCCTTCA-3'	서열번호 12

제작된 프라이머 및 캡쳐 프로브의 특이성(specificity)을 확인하기 위하여, 다양한 BCR-ABL RNA를 골수(bone marrow)와 말초혈관(peripheral blood)의 단핵세포로부터 추출하고, 표 1에 기재된 프라이머 4 세트(전방향(forward) 프라이머: B2-F, E1-F, C3-F, A2-F, 및 역방향(reverse) 프라이머: A2-R)를 각각 이용하여 역전사(reverse transcription)를 통해 4개의 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 pCR2.1-TOPO 플라스미드에 삽입한 후, DNA 시퀀싱(sequencing)을 통하여 염기서열을 확인하였다.

캡쳐 프로브의 특이성을 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 및 혼성화(hybridization)를 수행하기 위하여, 상기 플라스미드는 캡쳐 프로브가 고정된 유리 슬라이드 상에서 PCR 반응 혼합물(dNTP(200uM, dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 완충용액(10mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl), DNA 중합효소(polymerase)(2U Taq DNA polymerase), 프라이머 세트)과 혼합하여 PCR(95℃에서 5분 반응 후에, 94℃에서 15초, 55℃에서 15초, 72℃에서 15초 반응시키는 단계를 45회 반복)을 통해 증폭한 후, 동일 반응혼합물내에서 94℃에서 5분간 가열하여 변성(denaturation)시키고 55℃에서 1시간동안 혼성화시켰다. 혼성화 반응 후에 상기 용액을 제거하고, 1X SSC + 0.1% SDS, 0.1X SSC + 0.1% SDS, 1X SSC 용액을 차례대로 이용하여 3분씩 세척하였다. 세척된 슬라이드는 건조시킨 후에 LAS4000 이미지 분석기(ScanArrayExpress Microarray Scanner, PerkinElmer, Waltham, Massachusetts 02451, USA)를 이용하여 형광을 측정하였다. 상기 PCR 생성물을 전기영동을 통하여 분석한 결과는 도 2A에 나타내었고, DNA 마이크로어레이를 이용하여 캡쳐 프로브의 특이성을 분석한 결과는 도 2B에 나타내었다.

도 2A에 나타난 바와 같이, b3a2(lane 1)는 394 bp와 183 bp, b2a2(lane 2)는 319 bp와 183 bp, e1a2(lane 3)는 353 bp와 183 bp, c3a2(lane 4)는 361 bp와 183 bp, a2(lane 5)는 183 bp 크기의 유전자가 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, PCR을 통해 증폭된 생성물은 올바른 크기인 것을 확인할 수 있었고, 이를 통해 프라이머가 플라스미드의 정확한 위치에 결합하여 DNA가 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 또한 도 2B에 나타난 바와 같이, A2-P 캡쳐 프로브에는 BCR-ABL 타입과 관계없이 모두 결합된 것을 형광을 통해 확인할 수 있었고, B3-P, B2-P, E1-P, 및 C3-P 캡쳐 프로브에는 각각 BCR-ABL 타입에 따라 특이적으로 결합된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여 제작된 프라이머 및 캡쳐 프로브의 특이성을 확인할 수 있었다.

1-2. DNA 마이크로어레이를 이용한 만성 골수성 백혈병의 타입 검출

상기에 제작된 프라이머와 캡쳐 프로브를 이용하여 서로 다른 키메라 유전자가 섞여있는 시료에서 만성 골수성 백혈병의 타입을 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 서로 다른 키메라 BCR-ABL cDNA를 포함하는 플라스미드를 동량으로 섞은 후에 실시예 1-1과 동일한 방법으로 PCR 및 혼성화를 수행하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, PCR을 통해 증폭된 생성물은 올바른 크기인 것을 확인할 수 있었고, 다양한 유전자가 섞여있는 경우에도 B3-P, B2-P, E1-P, 및 C3-P 캡쳐 프로브에 각각 BCR-ABL 타입에 따라 특이적으로 결합된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여 서로 다른 타입의 키메라 BCR-ABL RNA가 섞여있는 경우에도, 제작된 프라이머와 캡쳐 프로브를 이용하여 만성 골수성 백혈병의 타입을 정확히 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 다양한 방법을 이용한 검출 민감도 증폭

검출의 민감도를 증폭시키기 위하여, 다양한 방법을 이용하여 DNA 마이크로어레이를 수행하였다. 시료로 b3a2 RNA(10,000개의 분자)를 포함하는 K562세포로부터 추출된 RNA를 One-step RT-PCR reaction mixture, 즉 역전사 효소(reverse transcriptase), 중합효소(Taq DNA polymerase), dNTP, PCR 프라이머, 완충액을 포함하는 용액에 첨가하고 다음과 같은 과정을 수행하였다. 역전사를 위하여 45℃에서 30분, 변성(denaturation)을 위하여 95℃에서 5분, PCR을 위하여 다음을 45회 반복(94℃에서 15초, 55℃에서 15초, 72℃에서 15초), 마지막으로 72℃에서 5분을 수행하였다. Microarray 슬라이드에서 PCR 과정과 혼성화를 진행 하는 경우, 반응혼합물을 슬라이드 표면위에 형성된 간이 chamber에 첨가하고 실시예 1과 동일한 방법으로 PCR, heat denaturation, 혼성화를 진행하였다. 또한 실시예 1에서와 같이 슬라이드를 세척하고 laser scanner로 형광을 측정하였다.

첫 번째 시료는 전방향 프라이머(B2-F, E1-F, C3-F, A2-F)와 역방향 프라이머(A2-R)가 동량(5 pmol)으로 존재하는 반응혼합물에서 역전사(reverse transcription)와 대칭(symmetric) PCR을 수행한 후, PCR 생성물을 분리 정제하여3X SSC 용액에서 유리 슬라이드에 고정된 B2-P 캡쳐 프로브와 50℃에서 한 시간 동안 혼성화를 수행하였다(도 4A). 두 번째 시료는 캡쳐 프로브가 고정된 유리 슬라이드 상에서 역전사, 대칭 PCR 및 혼성화를 수행하여 준비하였다(도4B). 세 번째 시료는 추출된 RNA를 5 pmol 전방향 프라이머(B2-F, E1-F, C3-F, A2-F)와 50pmol 역방향 프라이버(A2-R) 존재하에 역전사와 비대칭(asymmetric) PCR을 수행한 후, PCR 생성물을 분리정제하여 3X SSC 용액에서 유리 슬라이드에 고정된 캡쳐 프로브 B2-P와 55℃에서 한 시간 동안 혼성화하여 준비하였다(도4C). 네 번째 시료는 캡쳐 프로브 B2-P가 고정된 유리 슬라이드 상에서 반응혼합물(완충용액(50mM Tris-HCl(pH 8.3), 50mM KCl), 100uM dNTPs, 2.5mM MgCl₂, 2U Taq DNA polymerase, 및 40U reverse transcriptase)과 1μg RNA를 첨가하고 역전사, 비대칭 PCR 및 혼성화를 수행하여 준비하였다(도4D). 그리고 형광을 LAS4000 이미지 분석기를 이용하여 형광을 측정하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 대칭 PCR(A 및 B)에 비하여 비대칭 PCR(C 및 D)의 경우 검출 신호가 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 역전사, 비대칭 PCR 및 혼성화를 캡쳐 프로브가 고정된 유리 슬라이드 상에서 통합하여 수행(D)할 경우 통상적인 방법, 즉 정제된 대칭 PCR product를 슬라이드상에서 혼성화(A)하는 것에 비교하여 약 15배 이상 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여 슬라이드 상의 통합된 역전사, 비대칭 PCR 및 혼성화 반응은 검출의 민감도를 극적으로 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 3. 검출 한계 측정

상기 통합된 역전사, 비대칭 PCR 및 혼성화 반응을 이용한 DNA 마이크로어레이의 검출 한계를 측정하기 위하여, K562 세포주(b3a2 양성)와 HeLa 세포주(b3a2 음성) 세포주로부터 총 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 중에서 K562 세포주의 b3a2 RNA와 HeLa 세포주의 ABL RNA의 양을 실시간(real-time) PCR을 통하여 정량한 후, 1X10⁶copies의 ABL RNA에 0.1 내지 1X10⁶ copies의 b3a2 RNA를 다양한 농도로 섞어준 후 통합된 역전사, 비대칭 PCR 및 혼성화 반응을 수행하였다. 상기 실험을 수행할 때, 전방향 프라이머(B2-F, A2-F)와 역방향 프라이머(A2-R)를 섞은 경우(singleplex PCR)와 전방향 프라이머(B2-F, E1-F, C3-F, A2-F)와 역방향 프라이버(A2-R)를 섞은 경우(multiplex PCR)를 나누어 실험을 수행하였고, 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, singleplex PCR의 경우에는 b3a2/ABL RNA의 비율이 10^-5(b3a2 10 copies)까지 검출이 되었고, multiplex PCR의 경우에는 약 10^-4(b3a2 200 copies)까지 검출이 되었다. 상기 결과를 통해 4개의 전방향 프라이머를 모두 섞어 DNA 마이크로어레이를 진행할 경우 민감도가 20배 정도 감소된다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 만성 골수성 백혈병 환자의 타입 검출

실시예 1-1에서 제작된 프라이머와 캡쳐 프로브를 이용하여 실질적으로 만성 골수성 백혈병 환자의 타입을 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 만성 골수성 백혈병 환자들의 RNA를 추출하여 통합된 역전사, 비대칭 PCR 및 혼성화 반응을 수행하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 시료 2, 3, 5 및 10번은 캡쳐 프로브 B3-P와 B2-P에서 모두 신호가 검출되었고, 캡쳐 프로브 B3A2-P에서도 신호가 검출되었다. 시료 4, 6 및 7번은 캡쳐 프로브 B2-P와 B2A2에서 신호가 검출되었고, 시료 1과 9번은 캡쳐 프로브 E1-P에서 신호가 검출되었고, 시료 8번은 캡쳐 프로브 C3-P에서 신호가 검출되었다. 대조군으로 사용한 K562 세포와 HeLa 세포주의 경우에는 이전에 알려진 대로 b3a2와 정상 ABL RNA를 가지고 있는 것을 확인하였다. 상기 결과는 통상적인 방법을 이용하여 확인된 만성 골수성 백혈병의 타입과 동일하다는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 캡쳐 프로브 및 프라이머는 실제 환자의 만성 골수성 백혈병 타입을 검출하는데 사용 가능하다는 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

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(a) 골수 또는 말초 혈액으로부터 추출한 세포를 파쇄하여 RNA를 포함하는 세포 추출물을 얻는 단계;
(b) 서열번호 6 내지 12로 구성되는 염기서열을 가지는 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타이핑용 캡쳐 프로브가 모두 고정된 고체 지지체 표면 위에 형성된 챔버(chamber)에 상기 RNA를 포함하는 세포 추출물 및 반응혼합물을 한꺼번에 첨가하는 단계;
(c) 상기 챔버 상에서 RNA를 cDNA로 역전사(reverse transcription) 시키는 단계;
(d) 상기 cDNA 중에서 BCR-ABL(breakpoint cluster region-abelson oncogene) 유전자를 비대칭 중합효소 연쇄반응(asymmetric polymerase chain reaction)으로 증폭시키는 단계;
(e) 상기 증폭된 유전자를 가열하여 변성(denaturation)시키는 단계;
(f) 상기 변성시킨 유전자 및 캡쳐 프로브로 혼성화(hybridization)를 수행하여 핵산 복합체를 형성시키는 단계; 및
(g) 상기 핵산 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 만성 골수성 백혈병 융합 유전자형 타입의 검출 방법으로,
상기 (b) 단계의 반응혼합물은 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 역방향 프라이머(reverse primer) 및 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 구성되는 전방향 프라이머(forward primer)를 모두 포함하는 다중 PCR용 프라이머 세트, DNA 중합효소(polymerase), 역전사효소(reverse transcriptase), dNTP(dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 및 완충용액을 포함하는 용액이며,
상기 방법은 각 단계별 산물을 별도로 분리정제하는 과정없이 통합하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
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제 9 항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 전방향 프라이머와 역방향 프라이머를 1:1 내지 1:10의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 5’ 말단에 형광 분자 또는 비오틴(biotin)으로 표지화된 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
삭제
제 9 항에 있어서,
상기 캡쳐 프로브는 카본 링커(carbon linker)를 이용하여 5’ 말단에 아민기를 추가하여 고체 지지체 표면에 고정하는 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 (a) 단계는 90℃ 내지 100℃에서 3분 내지 10분간 가열하여 세포를 파쇄한 후, 원심분리하여 상층액을 획득하는 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
삭제
제 9 항에 있어서,
상기 (e) 단계는 90℃ 내지 100℃에서 3분 내지 10분간 가열하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 (f) 단계는 50℃ 내지 60℃에서 한 시간 이상 반응시켜 수행되는 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 (g) 단계는 프라이머에 표지된 형광을 측정하는 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 (g) 단계는 프라이머에 표지된 비오틴과 형광 또는 발색 가능한 효소가 연결된 스트렙트타비딘(streptavidin)을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 검출 방법.
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