KR101753324B1 - 내열성 dna 중합효소를 이용한 유전자 변이 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 내열성 DNA 중합효소를 이용한 유전자 변이 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 비교적 간단하게 유전자 변이를 검출할 수 있으며, 다양한 형광이나 매스 태그 시퀀스를 도입하여 다중 검출에 사용할 수 있다.

Description

내열성 DNA 중합효소를 이용한 유전자 변이 검출 방법{A method for detecting genetic mutation using thermostable DNA polymerase}

본 발명은 내열성 DNA 중합효소를 이용한 유전자 변이 검출 방법에 관한 것이다.

유전자 분석을 위한 유전자 시료를 수득하기 위하여 가장 보편적으로 사용하는 방법으로 DNA 중합효소를 이용한 중합효소연쇄반응 방법이 있다. 상기 방법은 주형 DNA와 결합할 수 있는 프라이머의 길이와 염기서열을 임의로 조절해서 설계함으로써 목적하는 유전자의 원하는 부위만을 정확하게 증폭시킬 수 있다는 장점이 있는 반면, 한 번의 반응으로 하나의 관심유전자만을 증폭시킬 수 있어 증폭하고자 하는 관심유전자의 개수가 많을 경우엔 동일한 작업을 반복해서 수행하여야 하는 번거러움이 있다.

다수의 유전자 영역을 동시에 분석하기 위해서 여러 개의 중합효소연쇄반응을 한 튜브에서 수행하는 멀티플렉스 중합효소연쇄반응 방법이 널리 이용되고 있으나, 많은 프라이머를 한 튜브에서 동시에 사용함에 따라 프라이머들 간의 교차반응이 발생하게 되기 때문에 한 번에 증폭할 수 있는 유전자 영역의 수에는 한계가 있으며, 반응조건을 찾기 위한 많은 노력과 시간을 필요로 하고 민감도 및 특이도에서 좋은 결과를 얻을 수 없다는 단점이 있다 (Hardenbol et al., Nat. Biotechnol., 21:673, 2003).

최근, 멀티플렉스 중합효소연쇄반응을 사용하지 않고 공통 프라이머를 사용하여 다수의 유전자 영역을 동시에 증폭하여 대량 분석을 가능하게 하는 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 대표적인 기술로는 동시에 여러 유전자 영역의 단일염기다형성(SNP)을 분석할 수 있는 SNPlex, Goldengate assay, molecular inversion probes(MIP)가 있다.

SNPlex는 oligonucleotide ligation assay(OLA) 이후에 exonuclease를 이용한 정제 과정을 수행하고 탐침의 양쪽 끝에 있는 공통 프라이머 염기서열로 중합효소연쇄반응 증폭을 한 다음, 마지막으로 탐침에 포함되어있는 ZipCode 염기서열을 이용해 DNA 칩에서 분석하는 방법이며(Tobler et al., J. Biomol. Tech., 16:398, 2005),Goldengate assay는 고체 표면에 고정화된 genomic DNA에 upstream 탐침으로 대립유전자 특이적 프라이머 연장반응을 수행한 후에 downstream 탐침과 DNA연결 반응을 수행하고, 세척 과정을 거쳐 DNA 연결 반응이 되지 않은 탐침들을 제거한다. 그리고 SNPlex와 같이 탐침에 포함되어 있는 공통 프라이머 염기서열로 증폭시키고, 증폭된 중합효소연쇄반응 결과물을 Illumina BeadChip에서 분석하는 방법이다 (Shen et al., Mutat. Res., 573:70,2005).

Molecular inversion probes(MIP)는 Padlock 탐침을 사용하여 Gap-ligation을 한 이후에 DNA 연결이 되지 않은 탐침들과 genomic DNA를 exonucelase를 이용하여 제거하고 uracil-N-glycosylase를 이용해 Padlock 탐침을 선형화시킨 이후에 탐침에 포함된 공통 프라이머 염기서열을 이용해서 중합효소연쇄반응을 수행하고 GenFlex Tag Array(Affymetrix)에 혼성화시켜 단일염기다형성을 분석하는 방법이다 (Hardenbol et al., Nat. Biotechnol.,21:673, 2003).

그러나, 이러한 방법들은 첫 번째 튜브에서 반응시킨 생성물의 일부를 두 번째 튜브로 옮겨 반응을 수행해야 하거나, 여러 종류의 효소를 이용하여야 하기 때문에 서로 다른 샘플들 간의 오염이 발생할 수 있으며 실험방법이 복잡하다는 문제점이 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 내열성 DNA 중합효소를 이용한 신규한 유전자 변이 다중 검출 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 돌연변이 염기서열에 특이적으로 상보적으로 결합하는 올리고 DNA를 제작하고 이의 5'말단에 형광물질을 접합시켜 형광 프로브 DNA를 제작하는 단계;b) 돌연변이 염기서열을 포함하는 주형 DNA에 상기 형광 프로브와 프라이머 및 내열성 DNA 중합효소를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 이 과정에서 상기 형광프로브 DNA가 해당 유전자의 돌연변이 염기서열과 결합할 경우 이중가닥으로 존재하고 이 경우에 상기 DNA중합효소에 의하여 형광프로브 DNA는 절단되게 되는 단계;및 c) 상기 결과물에 산화그래핀 (Graphene Oxide, GO)을 첨가하며, 이 경우에 돌연변이 염기서열이 없는 야생형 cDNA만 존재하는 정상인 경우에는 형광프로브 DNA가 산화그래핀에 결합하게 되어 형광 신호는 소멸하게 되며, 돌연변이 염기서열에 결합한 형광프로브 DNA는 반응 후 형광물질만 남게 되고 이는 산화그래핀에 결합하지 못하므로 형광신호는 검출되는 단계를 포함하는 내열성 DNA 중합효소를 이용한 유전자 변이 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형광물질은 파시픽 블루(Pacific Blue), 보디피(Bodipy) FL, 프루오르프라임(FluorePrime),프루오르다이트(Fluoredite),FAM™, 사아닌(Cyanine) 3, 사아닌(Cyanine) 5, 및 TAMRA(tetramethylrhodamine)로 구성된 군으로부터 선택된 형광물질인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

상기 형광 색소로서는, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있다. 이들 형광 색소의 시판품으로서는, 예를 들면 Pacific Blue, Bodipy FL, FluorePrime,Fluoredite, FAM, Cy3 및 Cy5, TAMRA 등을 들 수 있다.

형광 표지 올리고뉴클레오티드의 검출 조건은 특히 제한되지 않고, 사용하는 형광 색소에 따라 적절히 결정할 수 있다. 예를 들면 Pacific Blue는, 검출 파장 445nm-480nm, TAMRA는, 검출 파장 585nm-700nm, Bodipy FL은,검출 파장 520nm-555nm에서 검출할 수 있다.

이러한 형광 색소를 갖는 프로브를 사용하면, 각각의 형광 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 형광 색소의 올리고뉴클레오티드에의 결합은, 통상의 방법, 예를 들면 일본국 공개특허공보 특개 2002-119291호 공보 등에 기재된 방법을 따라서 행할 수 있다.

또 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면 3' 말단에 인산기가 부가되어도 된다. 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 인산기를 부가시켜 둠으로써, 프로브 자체가 유전자 증폭 반응에 의해 신장하는 것을 충분하게 억제할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 변이의 유무를 검출하는 DNA(표적 DNA)는, PCR 등의 유전자 증폭법에 의해 조제할 수 있다. 그때, 3' 말단에 인산기가 부가된 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, 이것을 증폭 반응의 반응액 중에 공존시킬 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소 중 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 2의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 돌연변이 염기서열을 포함하는 주형 DNA는 만성 백혈병 유래인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 a)돌연변이 염기서열에 특이적으로 상보적으로 결합하는 올리고 DNA를 제작하고, 그 올리고 DNA의 5'말단에 말레이미드(maleimide) 그룹을 연결하여 말레이미드 변형된 DNA 올리고머를 합성하는 단계;b) 매스 태그 펩타이드의 C말단에 시스테아민(cysteamine)을 처리하여 시스테아민 변형된 매스 태크 펩타이드를 제조하는 단계; 및 c) 상기 말레이미드 변형된 DNA 올리고머 및 시스테아민 변형된 매스 태크 펩타이드를 반응시켜 제조된 매스 태그가 부착된 DNA 올리고머 프로브를 제공한다.

또한 본 발명은 돌연변이 염기서열을 포함하는 주형 DNA에 상기 프라이머, 내열성 DNA 중합효소 및 상기 본 발명의 매스 태그가 부착된 DNA 올리고머 프로브를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 이 과정에서 상기 프로브 DNA가 해당 유전자의 돌연변이 염기서열과 결합할 경우 이중가닥으로 존재하고 이 경우에 상기 DNA중합효소에 의하여 상기 매스 태그 프로브 DNA는 절단되게 되고, 상기 절단된 매스 태그 신호를 측정하는 단계를 포함하는 내열성 DNA 중합효소를 이용한 유전자 변이 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소 중 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 4 내지 13의 염기서열로 이루어진 프라이머 중 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

내열성 DNA 중합효소를 이용한 형광프로브 DNA 절단

핵산증폭을 위한 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 널리 쓰이는 Taq DNA 중합효소는 내열성 특징과 5'에서 3'으로의 단일가닥 DNA를 절단하는 핵산 가수분해 활성 (exonuclease)이 있다.

돌연변이 염기서열에 특이적으로 결합하는 올리고DNA를 제작하고 이의 5'말단에 형광물질을 접합시켜 형광프로브 DNA를 제작하고, 돌연변이 염기서열에 상보적으로 결합하게 설계된 형광프로브 DNA는 단일가닥 DNA로서 돌연변이 염기서열과 상보적으로 결합하지 못할 경우 용액 상에서 단일가닥으로 존재한다.하지만 형광프로브 DNA가 해당 돌연변이 염기서열과 결합할 경우 이중가닥으로 존재하고 상기 Taq DNA중합효소에 의하여 형광프로브 DNA는 절단되게 된다.

산화그래핀 (Graphene Oxide, GO)는 단일가닥 DNA에 매우강한 결합력을 가지고 있으나, 이중가닥 DNA는 결합하지 못하는 특징이 있다. 산화그래핀은 형광물질이 가까이 붙은 경우 형광신호를 소멸 (quenching)시키는 특징이 있으므로, 돌연변이 염기서열이 없는 야생형 cDNA만 존재하는 경우 (정상일 때) 형광프로브 DNA가 GO에 결합하게 되어 GO가까이 위치한 형광 신호는 소멸하게 된다. 하지만 돌연변이 염기서열에 결합한 형광프로브 DNA는 Taq중합효소 반응 후 형광물질만 남게 되고 이는 산화그래핀에 결합하지 못하므로 형광신호는 검출된다.형광 신호의 검출 세기에 따라 정상 (야생형)과 환자 (돌연변이)유래의 cDNA의 혼합비를 산출할 수 있는 정량성을 지닌다.

Mass tag conjugated 프로브를 이용한 유전자 변이 동시 검출

Mass tag conjugated probe를 이용한 유전자 변이 동시 검출은 BCR-ABL fusion 타입별로 서로 다른 mass tag이 결합된 probe 만든 후, PCR 과정에서 떨어져 나온 mass tag을 MALDI-TOF을 이용하여 측정한 후 fusion 타입을 분석하는 방법으로, mass tag 디자인에 관한 모식도는 도 2에 나타내었다.

펩타이드의 시퀀스는 AAR, AAAR, AGR 등 R이나 K를 포함한 3~5개의 아미노산으로 이루어진 다양한 시퀀스를 도입하여 다중 검출에 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면 비교적 간단하게 유전자 변이를 검출할 수 있으며, 다양한 형광이나 매스 태그 시퀀스를 도입하여 다중 검출에 사용할 수 있다.

도 1은 내열성 DNA 중합효소 Taq를 이용한 돌연변이 염기서열 결합 형광프로브 DNA 절단과 이의 산화그래핀을 이용한 검출을 설명한 그림.
도 2는 BCR-ABL 타입별 Mass tag binded Probe 디자인,
도 3은 mass tag conjugated probe 디자인. 펩타이드의 C-말단에 cysteamine을 결합시켜 mass tag을 만든 후, maleimide modified DNA oligomer와 컨쥬게이션함.
도 4는 산화그래핀의 단일 층 분자영상화. (a) AFM 사진 및 (b) 단일 층 두께 범위.
도 5는 산화그래핀(GO)에 의한 형광핵산 probe의 소광과 DNaseI에 의한 핵산 분해에 따른 소광 현상 소실.
도 6은 KG1 cell과 K562 cell의 BCR-ABL 융합단백질 발현 확인
도 7은 BCR-ABl 융합유전자 특이적 형광 probe의 염기서열과 BCR-ABL 융합유전자를 PCR 증폭할 primer 염기서열.
도 8은 Real-time PCR을 이용하여 K562 cell 유래의 BCR-ABL cDNA PCR증폭을 확인함.
도 9는 최적의 산화그래핀의 농도값 관찰 (a) 산화그래핀 농도 증가에 따른 세포 주 유래의 RT-PCR product 형광변화 관찰 (b) 상대 형광값 비율에 따른 최적의 산화그래핀 농도값 선택
도 10은 PCR cycle 증가에 따른 KG1 cell과 K562 cell 유래의 cDNA 증폭산물의 형광 값 관찰
도 11은 K562 cell과 KG1 cell을 섞은 후 K562 cell수가 증가함에 따라 형광값 변화 관찰
도 12는 두 종류의 세포를 혼합한 후 상기 에세이 방법의 검출한계 산출
도 13은 e1, b2, a3 primer를 이용한 type 별 BCR-ABL PCR product에 대한 유전자 모식도
도 14는 K562와 KG1 세포의 PCR 결과
도 15는 e1, b2, a3, GAPDH primer를 이용한 mixed PCR 결과,
도 16은 bcr-abl b3-a2 type의 fusion 부분 서열

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: BCR - ABL 융합유전자 돌연변이 분석

돌연변이 분석 염기서열로서는 질병 진단을 위하여 만성 골수성백혈병(CML)의 원인인 BCR-ABL 융합유전자를 설정하였다.

CML은 필라델피아(Philadelphia, Ph)라는 염색체에 의해 발생하는 질병으로, 필라델피아 염색체는 9번 염색체에 있던 Abl(Abelsom oncogene)과 22번 염색체에 있는 Bcr(Breakpoint cluster region)이라는 유전자들이 교차를 일으켜 자리바꿈을 하면서 형성된 결과이다.

형성된 Bcr-Abl에 의해 만들어지는 돌연변이 타이로신 인산화 효소(tyrosine kinase)가 계속 활성을 가지면서 세포 내 세포분열과 관련한 신호전달 체계를 활성화 시켜 백혈구의 과도 증식을 초래하고, 세포자살 유도작용 (apoptosis)과 관련한 신호전달을 억제하여 백혈병에 결정적인 작용을 한다는 것이 병리원인으로 알려졌다.

1) 내열성 DNA 중합효소 Taq를 이용한 형광프로브 DNA 절단

a. 산화그래핀의 단층 및 소광 능력 검증

원자간력현미경(Atomic force microscopy)를 이용한 산화그래핀의 단층 (single layer) 특성을 검증하였다. 그래핀(graphene)은 그래파이트(graphite)의 단층을 말하며 연구에 사용할 산화그래핀(graphene oxide)은 핵산 흡착을 위하여 단일 층(monolayer)으로 존재해야 함. 따라서 발명에 사용할 산화그래핀이 단일 층 구조를 이루고 있는지를 Atomic Force Microscopy를 통해 알아보고자 함이다.

산화그래핀 시료와 탐침간에 움직이는 원자간력을 검출하여 검출시료의 표면을 3차원 형상으로 나타낸다[도4 (a)]. 측정 결과 산화그래핀의 두께는 0.714 nm로써 단층범위인 1 nm 이하 범위에 들기 때문에 단층구조임을 알 수 있다[도 4(b)].

분광 형광광도계(spectrofluorophotometer)를 이용한 단일가닥 형광 핵산 probe의 산화그래핀에 의한 소광 능력을 확인하였다. 형광광도계를 이용하여 형광단이 달린 올리고 핵산probe만 있을 때와 형광 핵산probe에 산화그래핀을 넣어주었을 때 형광 값을 스캔하였다.또한 Taq polymerase의 5‘→3’ exonuclease활성에 의하여 핵산 probe가 분해되는 것을 구현하기 위해 DNA를 분해하는 DNaseⅠ에 반응시킨 probe를 산화그래핀에 반응시켰을 때와 control로써 BSA (Bovine serum albumin)에 반응시킨 probe를 산화그래핀에 반응시킨 후 형광 값을 스캔하였다.Probe만 있을 때는 형광 값이 크지만 산화그래핀을 넣어주면 형광 소광이 일어나 형광 값이 떨어진다. Probe를 DNaseⅠ에 반응시켜 oligonucleotide digestion이 일어나면 짧은 길이의 형광은 산화그래핀을 넣어주어도 형광소광이 일어나지 않고 형광 값이 그대로 살아 있다. 반면 BSA에 반응시킨 probe 형광 값은 핵산 probe의 분해가 일어나지 않고 산화그래핀에 흡착되어 소광에 의해 형광 값이 떨어진다[도 5].

b. 세포주 배양 및 발현유전자 확인 후 cDNA 합성

본 발명에서 사용할 백혈병 세포주로서 BCR-ABL 융합유전자를 가지고 있지 않은 leukemic cell인 KG1 cell과 BCR-ABL을 가지고 있는 leukemic cell인 K562 cell을 사용함. 10% fetal bovine serum이 함유된 RPMI1640 medium을 써서 5% CO₂ 대기 하에서 37 ^oC에서 배양하였다.

Western Blot방법을 통한 Cell 수준에서의 BCR-ABL fusion protein 발현 여부 확인: KG1 cell에서는 BCR-ABL 단백질 발현이 없고 대신 c-ABL 발현만 보이며, K562 cell 에서는 cABL과 BCR-ABL 융합단백질 발현이 확인되었다[도 6].

배양된 세포주(KG1 cell, K562cell)로부터 Total RNA를 추출한 후 cDNA합성을 위해 개시자로써 Oligo dT를 사용하여 역전사(RT, Reverse transcription)을 시행하였다.

c. 중합효소 연쇄 반응( PCR )조건 확립 및 형광 핵산 프로브 ( probe ) 설계

BCR-ABL 융합유전자를 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 증폭할 primer 설계 및 PCR 조건 확립 및 BCR-ABL 융합유전자에 특이적으로 결합하는 형광 핵산 probe를 설계하였다. BCR-ABL 융합유전자를 PCR 증폭 시키기 위한 primer로써 ABL gene에 결합하는 21mer의 Forward primer와 BCR gene에 결합하는 21mer의 Reverse primer를 제작하였다[도 7].

BCR-ABL 융합유전자 연결지점과 가까운 ABL gene에 결합하는 probe 제작함. 5‘말단에는 FAM형광을 달고 3’말단에는 더 이상 probe가 신장되지 않게 하기 위해 phosphorylation시켰다.

Real-time PCR (SYBR green방법)을 통한 mRNA 수준에서의 BCR-ABL 융합유전자 증폭발현 여부와 primer의 특이성 확인은 KG1 cell과 K562 cell로부터 total RNA를 추출한 후 Reverse Transcription을 통해 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA에 β-actin(Housekeeping gene) primer와 BCR-ABL primer, SYBR green을 넣고 Real-time PCR을 진행하였다. KG1 cell과 K562 cell 모두 β-actin primer에 의해 증폭된 곡선을 보이며 K562 cell의 경우 BCR-ABL primer에 의해 product가 증폭된 반면, KG1 cell의 경우 K562 cell에 비해 뒤늦은 cycle에서 증폭된 곡선을 보인다[도 8].

d. 산화그래핀의 최적 농도 조건 확인 및 PCR 진행에 따른 형광변화 관찰

BCR-ABL 융합유전자 보유 여부에 따른 세포주 유래의 cDNA에 기반한 최적의 형광 신호 차를 보이는 산화그래핀 농도 확인은 산화그래핀의 농도를 증가시킴에 따라 핵산 프로브의 형광이 점점 소광되는데, KG1 cell의 경우보다 K562 cell에서 유래한 cDNA를 주형으로 PCR을 수행한 경우 PCR product의 형광 값이 더 완만하게 떨어지는 것 볼 수 있다[도 9(a)].

BCR-ABL 유무에 따른 서로 간의 형광 값 차이가 가장 많이 나는 최적의 산화그래핀 농도 값을 찾기 위해 K562 cell의 형광값에서 KG1 cell의 형광값으로 나눈 비율을 관찰하였다. 그 결과 산화그래핀 농도 15μg/ml에서 가장 높은 값을 보이며 추후 실험에 고정된 값을 적용하고자 하였다[도 9(b)]

PCR 진행에 따라 증폭된 PCR product의 형광 변화 관찰은 PCR 반응이 0 cycle에서 35 cycle까지 진행됨에 따라 K562 cell유래의 cDNA가 증폭된다. 증폭된 PCR product에 산화그래핀을 넣어준 후 형광 값을 관찰한 결과, KG1 cell유래의 cDNA 증폭산물의 경우 PCR cycle증가에 따라 비교적 형광 값 변화가 적은 반면 K562 cell 유래의 cDNA 증폭산물의 경우 형광 값이 기하급수적으로 증가하는 것을 볼 수 있다.[도 10]

e. 두 종류의 세포 혼합에 따른 형광 값 관찰과 융합유전자 검출한계( LOD , limit of detection ) 파악

실제 환자 샘플의 경우 정상세포와 융합 유전자를 가진 세포가 섞여 있기 때문에 이것을 구현하고자 세포 수준에서 정상세포와 융합 유전자를 가진 세포를 혼합함. 여기에서 유래된 각각의 cDNA를 PCR하여 산화그래핀과 반응 시킨 후 probe의 형광 값 변화를 살펴보고자 한다.

KG1 cell의 수 1 X 10⁶ 개를 준비한 후 K562 cell을 0, 1 X 10¹, 1 X 10², 1 X 10³, 1 X 10⁴, 1 X 10⁵, 1 X 10⁶ 개를 각각 혼합 후 각각의 경우에서 유래된 cDNA를 PCR한다. PCR product에 산화그래핀을 넣은 후 probe의 형광 값 변화를 살펴 본 결과 K562 cell의 개수가 증가할수록 형광 값이 증가하는 것을 알 수 있으며 KG1 cell은 형광 값에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있다[도 11].

상기 실험에서 두 종류의 세포를 혼합하여 실험을 수행하였을 때 K562 cell 0, 1 X 10¹, 1 X 10², 1 X 10³개일 경우 직선성을 나타나는 지 검증함. 또한 이때 검출한계는 아래 식을 대입하여 구할 수 있다. 즉, 돌연변이 융합유전자를 가진 cell을 1240개까지도 검출이 가능함을 알 수 있다[도 12].

LOD= 3.3*(SD/S) (SD=y절편의 표준편차, S=기울기)

Slope=0.11 / SD=41.33

LOD= 3.3 * (41.33/0.11)=1239.9

2) Mass tag conjugated probe를 이용한 유전자 변이 동시 검출

a. BCR - ABL fusion gene 에 대한 primer 디자인 및 template 제작 ( PCR )

DNA 조각 패턴 분석, PNA-DNA hybridization, 및 mass-tag probe을 이용한 BCR-ABL 진단 시스템 개발을 위한 DNA template 제작을 위해 PCR primer를 디자인 하였다.

PCR primer는 최적의 실험 조건을 만들기 위해 여러 가지 primer를 디자인 하였으며 실험을 통해 최적의 primer를 선정하였다. 디자인 된 primer는 표 1에 나타내었으며, Primer에 대한 PCR 산물에 대한 모식도는 도 13에 나타내었다.

	Primer	Sequence (5' → 3')	Gene
1	e1	5'- ACC GCA TGT TCC GGG ACA AAA G -3'(서열번호 4)	BCR
2	b2	5'- ACA GAA TTC CGC TGA CCA TCA ATA AG -3'(서열번호 5)	BCR
3	b2+	5'- TTC AGA AGC TTC TCC CTG ACA T -3'(서열번호 6)	BCR
4	b2-KK	5'- TCC GCT GAC CAT CAA CAA GGA -3'(서열번호 7)	BCR
5	BCR-rev	5'- ATA GGA TCC TTT GCA ACC GGG YCY GAA -3'(서열번호 8)	BCR(Normal)
6	a3	5'- TGT TGA CTG GCG TGA TGT AGT TGC TTG G -3'(서열번호 9)	ABL
7	a2(rev)	5'- CCA TTC CCC ATT GTG ATT ATA GC -3'(서열번호 10)	ABL
8	a2-KK	5'- CAC TCA GAC CCT GAG GCT CAA -3'(서열번호 11)	ABL
9	GAPDH-For	5'- GAA GGT GAA GGT CGG AGT C -3'(서열번호 12)	House keeping gene
10	GAPDH-Rev	5'- GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC -3'(서열번호 13)	House keeping gene

표 1은 BCR-ABL fusion gene을 위한 PCR primer

b. PCR 조건 테스트

표 1의 primer를 이용한 PCR 조건 테스트를 위해 BCR-ABL에 대한 b3a2 fusion gene을 가지고 있는 K562 세포와 양성 대조군인 KG 1 세포를 이용하여 진행하였다. K562 세포와 KG 1 세포를 배양 후, 세포 harvest 하여 Trizol reagent를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 1% 아가로오스 겔에서 확인 후 cDNA를 합성하였으며, 합성된 cDNA를 이용하여 PCR 테스트를 진행하였다.

PCR 조성과 조건은 표 2에 나타내었으며, 실험 결과는 도 14에 나타내었다.

Reagent		Volume (㎕)
10 x buffer		2.0
dNTP		2.0
For-primer		1.0
Rev-primer		1.0
cDNA		1.0
Ex Taq polymerase		0.2
D.W.		12.8
Total		20.0
Cycles	Temperature (℃)		Duration
1	95		5min
35	95		30sec
	60		30sec
	72		30sec
1	72		10min
1	4		∞

표 2는 PCR 조성 및 조건

PCR 결과 BCR-ABL의 b3a2 junctiom 부위를 가지고 있는 K562 세포에서는 예상했던대로 e1a3와 b3a2에 해당되는 band가 관찰되었으며, 음성대조군인 KG 1 세포에서는 BCR normal에 해당되는 band 만 관찰되었다. K562 세포에서도 BCR normal에 해당되는 band가 관찰되는 것으로 보아, 정상적인 유전자가 함께 공존하는 것을 확인할 수 있었다.

최소한의 primer를 이용한 타입별 PCR 조건을 결정하기 위해 여러 종류의 fusion gene을 동시에 확인할 수 있는 e1, b2, a3 primer와 GAPDH primer를 이용하여 mixed PCR을 진행하였다. Mixed PCR 조건 및 결과는 표 3과 도 15에 나타내었다. PCR 조건은 MgCl₂ 농도(2.0mM→1.5mM)와 cDNA(1.0㎕→0.5㎕) 양을 조절하여 진행하였다. PCR 결과, K562 세포에서 b3a2, e1a2, GAPDH를 동시에 확인할 수 있었다.

Reagent	조건 1	조건 2	조건 3
10x buffer	2.0	2.0	2.0
dNTP	2.0	2.0	2.0
e1-For	0.5	0.5	0.5
b2 or b2+-For	0.5	0.5	0.5
a2-Rev	1.0	1.0	1.0
GAPDH-For	0.1	0.25	0.5
GAPDH-Rev	0.1	0.25	0.5
cDNA	1.0	1.0	1.0
Ex Taq polymerase	0.15	0.15	0.15
D.W	12.65	12.35	11.85
Total	20.0	20.0	20.0
Cycles	Temperature (℃)		Duration
1	95		5min
35	95		30sec
	60		30sec
	72		30sec
1	72		10min
1	4		∞

표 3은 Mixed PCR에 대한 PCR 조성 및 조건

c. B3a2 돌연변이 검출을 위한 mass tag conjugated probe design

bcr-abl fusion gene 중에서 b3-a3 type의 fusion 부분에 대한 sequence를 타깃으로 probe를 디자인 하였다. probe는 fusion 부분에 결합하는 DNA oligmer 부분과 mass tag 부분으로 구분되어 지고 이 둘을 연결하기 위한 linker 부분이 삽입된 구조를 가지고 있다. linker 부분은 maleimide 그룹이 DNA oligomer 5'위치에 연결되어 있고 mass tag 부분에 포함되어 있는 SH 그룹과 반응하여 mass tag이 conjugation된 probe를 얻게 된다.

실시예 2: 매스 태그 결합된 프로브 제조

Maleimide modified DNA Oligomer 제작

Oligomer 서열은 5'-agttcaaaagcccttcagcg-3'(서열번호 14)을 사용하였으며, Modification: 상기 서열의 5’를 maleimide로 변형하고, 3’을 인산화(Phosphorylation)하였다.

매스 태그 부위 제작

매스 태그 부위는 펩타이드 서열로는 alanine-alanine-arginine (AAR)를 사용하고 그 펩타이드의 C-terminal에 cysteamine을 처리하였다.

매스 태그 결합된 프로브 제조

상기 말레이미드 변형된 DNA 올리고머 및 시스테아민 변형된 매스 태크 펩타이드를 반응시켜 매스 태그가 부착된 DNA 올리고머 프로브를 제조하였다.[도 3]

<110> DIATECH KOREA CO., LTD. Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A method for detecting genetic mutation using thermostable DNA polymerase <130> HY140498 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 cactcagacc ctgaggctca a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tccgctgacc atcaacaagg a 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 cccttcagcg gccagtagca tctga 25 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 accgcatgtt ccgggacaaa ag 22 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acagaattcc gctgaccatc aataag 26 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttcagaagct tctccctgac at 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tccgctgacc atcaacaagg a 21 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ataggatcct ttgcaaccgg gycygaa 27 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgttgactgg cgtgatgtag ttgcttgg 28 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ccattcccca ttgtgattat agc 23 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cactcagacc ctgaggctca a 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gaagatggtg atgggatttc 20

Claims (12)

1. a) 돌연변이 염기서열에 특이적으로 상보적으로 결합하는 올리고 DNA를 제작하고 이의 5'말단에 형광물질을 접합시켜 형광 프로브 DNA를 제작하는 단계;
   b) 돌연변이 염기서열을 포함하는 주형 DNA에 상기 형광 프로브와 프라이머 및 5’→3’엑소뉴클레아제 활성을 지닌 내열성 DNA 중합효소를 첨가하여 중합효소 연쇄반응을 수행하고, 이 과정에서 상기 형광프로브 DNA가 해당 유전자의 돌연변이 염기서열과 결합할 경우 이중가닥으로 존재하고 이 경우에 상기 DNA중합효소에 의하여 형광프로브 DNA는 절단되게 되는 단계;및
   c) 상기 b) 단계의 결과물에 산화그래핀 (Graphene Oxide, GO)을 첨가하며, 이 경우에 돌연변이 염기서열이 없는 야생형 cDNA만 존재하는 정상인 경우에는 형광프로브 DNA가 산화그래핀에 결합하게 되어 형광 신호는 소멸하게 되며, 돌연변이 염기서열에 결합한 형광프로브 DNA는 반응 후 형광물질만 남게 되고 이는 산화그래핀에 결합하지 못하므로 형광신호는 검출되는 단계를 포함하는 내열성 DNA 중합효소를 이용한 유전자 변이 검출 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 형광물질은 파시픽 블루(Pacific Blue), 보디피(Bodipy) FL, 프루오르프라임(FluorePrime),프루오르다이트(Fluoredite),FAM™, 사아닌(Cyanine) 3, 사아닌(Cyanine) 5, 및 TAMRA(tetramethylrhodamine)로 구성된 군으로부터 선택된 형광물질인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 및 Pfu DNA 중합효소 중 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 돌연변이 염기서열을 포함하는 주형 DNA는 만성 백혈병 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
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