DE10037506A1

DE10037506A1 - Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mittels Hybridisierung, Verwendung dieses Verfahrens und entsprechender Analysekit sowie Nukleinsäure-Oligomere und deren Verwendung

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Publication number: DE10037506A1
Application number: DE10037506A
Authority: DE
Inventors: Hans-Joerg Grill; Andreas Schuetz; Lothar Prix
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-08-01
Filing date: 2000-08-01
Publication date: 2002-02-14
Also published as: DE10193057D2; WO2002010447A3; WO2002010447A2; AU2001282053A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis wenigstens einer Nukleinsäure (Target) mit bestimmter Basenabfolge (Targetsequenz) in einer Probe durch Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonde, die Verwendung dieses Verfahrens und Analysekits zur Durchführung dieses Verfahrens. Wesentlich ist die Verwendung eines Nukleinsäure-Oligomers als Kompetitor bei der Hybridisierung zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis wenigstens einer Nuklein säure (Target) mit bestimmter Basenabfolge (Targetsequenz) in einer Probe durch Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonde, die Verwendung dieses Verfah rens, Analysekits zur Durchführung dieses Verfahrens sowie Nukleinsäure-Oligomere und deren Verwendung zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch.

Ein zentrales Problem bei der Hybridisierung von Nukleinsäuren an immobilisierten Sonden ist die Diskriminierung von Sequenzen, die eine sehr ähnliche Sequenz (Basen abfolge) besitzen. Derartige Sequenzkonstellationen treten bei vielen diagnostischen Fragestellungen auf, z. B. beim Nachweis einzelner Punktmutationen und vor allem in Fällen, in denen Permutationen an ein und derselben Base vorliegen können.

Im Bereich der RNA-Viren begegnet man diesem Problem beispielsweise bei der Geno- und Subtypdifferenzierung des Hepatitis C-Virus für die Interferonbehandlung, vor allem in der Hypervariable Region E1. Mutationen im UL97-Gen des DNA-Virus HCMV führen zur Resistenz gegenüber dem Virostatikum Gancyclovir. Als Beispiel sei Codon 595 genannt, bei dem folgendes Permutationsspektrum auftreten kann: TTG (Leu, Wildtyp (wt)) mutiert zu TCG (Ser) oder TGG (Trp). Auch bei der Differenzierung von Enterovirusstämmen, wie Polio-Viren, Coxackie-Viren und Echoviren, zwischen kanzerogenen und nichtkanzeroge nen Papillomavirusstämmen und zwischen dem Mycobakterium tuberkulosis-Komplex und atypischen Mykobakterien trifft man auf diese Problematik. Ein weiteres Beispiel sind Mutationen in Codon 184 des Retrovirus HIV, die zu einer Resistenz gegenüber dem Reverse-Transkriptase-Inhibitor Lamivudine führen: ATG (Met, wt) mutiert zu GTA (Val) oder GTG (Val) oder GTC (Val). Im humanen Bereich können beispielsweise Hämophilie A (Faktor VIII) und Hämophilie B (Faktor IX) angeführt werden: GAT (Codon 542; Asp, wt) mutiert zu CAT (His) oder TAT (Tyr) bzw. CCA (Codon 55; Pro, wt) mutiert zu CGA (Arg), CAA (Gln) oder CTA (Leu).

Auch der Nachweis von K-ras-Mutationen, die in humanen Tumoren sehr häufig nachzu weisen sind, gehört zu diesem Problemkreis. Bei den Mutationen handelt es sich um Mutationen in den Codons 12, 13 (Exon 1) und 61 (Exon 2).

K-ras kodiert wie die beiden anderen ras-Gene (H-ras, N-ras) ein Protein mit 189 Ami nosäuren, das allgemein als p21^RAS bezeichnet wird. Es ist ein monomeres guaninnukleo tidbindendes Protein, das in Verbindung mit GTP aktiv und in Verbindung mit GDP inaktiv ist und eine eigene GTPase-Aktivität besitzt. Durch Mutationen in den Codonen 12, 13 und 61 kann p21 konstitutiv aktiviert werden, wobei es seine GTPase-Aktivität verliert und dadurch permanent aktiviert bleibt.

K-ras-Mutationen stellen exzellente Targets für diagnostische und therapeutische Frage stellungen dar. In Primärtumoren werden K-ras-Mutationen beispielsweise mittels direkter DNA-Sequenzierung, allelspezifischer Oligonukleotid-Hybridisierung oder Restriktionsver dau-Techniken nachgewiesen. Gewebeproben von Tumoren und Metastasen (nativ, gefroren, Paraffinblöcke), Zellen aus Körperflüssigkeiten (Blut, Sputum, Lavagen, Urin) mit und ohne vorhergehende Anreicherung sowie Stuhlproben werden mit hochsensitiven Techniken, wie Phagenklonierung, allelspezifischer PCR oder wiederholtem Restriktions verdau auf K-ras-Mutationen als Frühindikatoren von Krebserkrankungen oder Mikrometa stasen gescreent.

Allerdings ist die Anwendung dieser Techniken in Fällen wie dem Nachweis von K-ras- Mutationen begrenzt. So mangelt es an Sensitivität (DNA-Sequenzierung) oder die Techniken sind nicht in der Lage, das gesamte Spektrum an möglichen Mutationen, beispielsweise Permutationen, nachzuweisen. Darüber hinaus neigen allelspezifische Amplifikationstechniken zu falschpositiven Signalen.

So schlagen Khanna et al. in Onkogene (1999) 18, 27-38 vor, eine erste genspezifische PCR mit einem Multiplex-LDR-Assay zu koppeln. Auf diese Art sollen sich sämtliche Punktmutationen in den K-ras-Codons 12, 13 oder 61 selbst in Gegenwart eines Über schusses an Wildtyp-Allel nachweisen lassen. Die Vielzahl der verwendeten Primer und deren mögliche Wechselwirkungen miteinander stellen erhebliche Nachteile dieses Verfahrens dar.

Einen anderen Weg beschreitet die sogenannte mutationsanreichernde PCR, deren Design eine Amplifikation der Wildtypsequenz unterdrückt. Das grundlegende Prinzip ist in Orum et al., Nucleic Acids Research (1993) 21, 5332-5336 beschrieben. Über die erfolg reiche Anwendung dieser auch als PNA-vermitteltes PCR-Clamping bezeichneten Methode auf den Nachweis aller 12 möglichen K-ras-Mutationen in den Codons 12 und 13 berichten Thiede et al., Nucleic Acids Research (1996) 24, 983-984. Hier wird ein die Codons 12 und 13 überspannendes zum Wildtyp komplementäres 15mer PNA- Oligonukleotid verwendet, das drei Basen in die Bindungsstelle des Antisense-PCR- Primers hineinragt.

So gestattet die vorstehend beschriebene mutationsanreichernde PCR eine präferentielle Amplifikation mutanter Allele selbst aus einem zum überwiegenden Teil aus Wildtyp-Allelen bestehenden Genpool. Allerdings wird in vielen Fällen eine Amplifikation der Wildtyp- Sequenz nicht vollständig unterdrückt, so daß man auch dann ein Amplifikat erhält, wenn die Probe an sich nur Wildtyp-Allele enthält. Allein die Feststellung, daß ein Amplifikat erhalten wird oder nicht, reicht daher zur sicheren Differenzierung von Wildtyp und Mutante nicht aus. Darüber hinaus werden, wie im oben beschriebenen Fall der K-ras-Sequenz, unterschiedliche Mutationen co-amplifiziert. Eine effektive Möglichkeit, zwischen sehr ähnlichen Basenabfolgen z. B. bei Permutation an ein und derselben Base, unterscheiden zu können, bietet diese Technik daher nicht.

Aufgabe war es daher, ein leistungsstarkes Verfahren zur Diskriminierung von Sequenzen mit einer sehr ähnlichen Basenabfolge bereitzustellen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch Hybridisierung an immobilisierten Sonden unter Zugabe eines Kompetitors.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis wenigstens einer Nukleinsäure mit bestimmter Basenabfolge in einer Probe durch Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonde, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Hybridisie rung durchgeführt wird in Gegenwart wenigstens eines Nukleinsäure-Oligomers mit einer Basenabfolge, die ähnlich ist zu der Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinsäure.

Der Begriff Nukleinsäure bezeichnet erfindungsgemäß eine Abfolge von natürlich vorkom menden Nukleinsäurebasen, Basenanaloga, Basenderivaten oder Mischformen davon. Es ist zu unterscheiden zwischen den eigentlichen Basen einerseits und dem die Basen miteinander verknüpfenden und die Abfolge festlegenden Rückgrat andererseits. Zu den Nukleinsäuren gehören vor allem DNA und RNA sowie davon abgeleitete Nukleinsäuren, wie cDNA, second strand cDNA, RNA(cDNA). In Bezug auf die Probe sind insbesondere zu nennen dsDNA, cDNA und mRNA. Zu den Nukleinsäuren gehören auch Nukleinsäure- Analoga, wie PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PSNA (Phos phothioate Nucleic Acid). Diese Nukleinsäure-Analoga können prinzipiell die natürlich vorkommenden Nukleinsäurebasen aufweisen, die allerdings in anderer Art und Weise miteinander verknüpft sind als beispielsweise in DNA oder RNA. Zu den Nukleinsäuren gehören auch Nukleinsäure-Derivate, wie Hypoxanthine, 2,6-Diaminopurin und/oder Methylcytosin aufweisende Nukleinsäuren, modifizierte, insbesondere markierte Nuklein säuren. Diese Nukleinsäure-Derivate können neben Basenderivaten prinzipiell auch die natürlich vorkommenden Nukleinsäurebasen aufweisen. Markierungen können an Basen und/oder Rückgrat eingeführt sein. Die Verknüpfungen können DNA bzw. RNA oder den Nukleinsäure-Analoga entsprechen. Die Nukleinsäuren können doppelstängig (ds) oder einzelstängig (ss), linear, verzweigt oder circulär sein.

Das erfindungsgemäß im Hybridisierungsschritt zu verwendende Nukleinsäure-Oligomer kompetitiert mit den in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren um die Bindung an die immobilisierten Sonden. Dazu weisen brauchbare Oligomere (Nukleinsäure-Kompetitoren) eine Basenabfolge auf, die ähnlich ist zu einer Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure, dieser jedoch nicht entspricht. Basenabfolgen sind im Sinne der Erfindung zueinander ähnlich, wenn sich die Basenabfolgen in wenigstens einer Base unterscheiden. Insbesondere kann die eine Basenabfolge eine Base A, T, G oder C aufweisen, während die andere Basenabfolge an entsprechender Position eine davon abweichende Base aufweist. Entsprechendes gilt je nach Art der nachzuweisenden Nukleinsäure bzw. des zu verwendenden Nukleinsäure-Oligomers für RNA-Basen (A, U, G, C) und Basenderivate.

Demnach können Basenabfolgen auch dann im Sinne der Erfindung zueinander ähnlich sein, wenn die eine Basenabfolge den Nukleinsäuren, z. B. DNA oder RNA, und die andere Basenabfolge Nukleinsäure-Analoga, z. B. PNA, LNA oder PSNA, zuzuordnen ist. Wesent lich für den erfindungsgemäßen Begriff der Ähnlichkeit sind die Basen, weniger das sie verknüpfende Rückgrat. Entsprechendes gilt auch für Nukleinsäure-Derivate, vorausge setzt sich entsprechende Basen wie Base und Basenderivat, z. B. Hypoxanthin und Adenin, 2,6-Diaminopurin und Guanin bzw. Methylcytosin und Cytosin, verhalten sich im Hinblick auf ihre Hybridisierung an eine gemeinsam komplementäre Base, im vorliegenden Beispiel Thymin und Uracil,. Cytosin bzw. Guanin kompetitiv.

Gemäß einem weiteren Aspekt hybridisieren Nukleinsäuren mit Basenabfolgen, die im Sinne der Erfindung zueinander ähnlich sind, mit einer Nukleinsäure, die eine zu einer der Basenabfolgen komplementäre Basenabfolge umfaßt, einerseits vollständig (Perfect match), andererseits unvollständig bei wenigstens einer Fehlpaarung (Mismatch).

Der vollständigen Hybridisierung entspricht unter einem anderen Aspekt die spezifische Hybridisierung. Hierunter versteht man Hybridisierung unter stringenten Bedingungen. Unter stringenten Bedingungen hybridisiert eine Basenabfolge mit einer dazu komple mentären Basenabfolge, z. B. Targetsequenz mit entsprechender Sonde, nicht aber mit einer anderen Basenabfolge.

Einem weiteren Aspekt zufolge umfassen im Sinne der Erfindung ähnliche Basenabfolgen wenigstens 9, vorzugsweise wenigstens 12 und insbesondere wenigstens 18 konsekutive Basen, die sich in höchstens 3, insbesondere höchstens 2 und vor allem in einer einzigen Base unterscheiden. Besondere Fälle ähnlicher Basenabfolgen betreffen daher Punktmu tationen und insbesondere Permutationen. Geht man beispielsweise von einer bestimmten Basenabfolge aus, so ergeben sich dazu ähnliche Basenabfolgen insbesondere dadurch, daß man eine Base dieser Basenabfolge durch eine andere ersetzt. So können sich z. B. zu einer DNA mit bestimmter Basenabfolge drei weitere DNAs mit ähnlicher Basenabfolge ergeben. Ersetzt man eine andere Base dieser Basenabfolge, so kann sich zu derselben DNA ein weiterer Satz von drei DNAs mit ähnlicher Basenabfolge ergeben. Entsprechend läßt sich beispielsweise für den Fall einer jeden Permutation jeweils ein Pool aus drei zur Bezugsbasenabfolge (Wildtyp) ähnlichen Basenabfolgen angeben.

Die nachzuweisenden Nukleinsäuren und - unabhängig davon - die als Kompetitor zu verwendenden Nukleinsäure-Oligomere können ähnliche Basenabfolgen als Teil(e) einer Gesamt-Sequenz umfassen. In speziellen Fällen kann eine ähnliche Basenabfolge durch eine weitere Basenabfolge unterbrochen sein, wobei zumindest Teile dieser weiteren Basenabfolge zueinander komplementär sind und bei entsprechender Duplex-Bildung die durch sie voneinander getrennten Teile der ähnlichen Basenabfolge in eine Anordnung bringen, welche die Hybridisierung der gesamten ähnlichen Basenabfolge mit einer dazu komplementären konsekutiven Basenabfolge erlaubt. Diese Ausführungsform kann sich z. B. bei der Verwendung des durch "Molecular Beacons" vorgegebenen Prinzips ergeben.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die gesamte Basenabfolge eines als Kompetitor zu verwendenden Nukleinsäure-Oligomers ähnlich zur Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure. Demnach unterscheidet sich die Basenabfolge des Kompetitors insbesondere in einer Base von einer Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinsäure.

Einem weiteren Aspekt zufolge weisen das als Kompetitor zu verwendende Nukleinsäure- Oligomer und eine oder mehrere immobilisierte Sonden Basenabfolgen auf, die zueinander ähnlich sind. Insbesondere betrifft diese Ähnlichkeit diejenigen Sonden, die eine Basen abfolge aufweisen, die komplementär ist zu einer Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure.

Prinzipiell als Kompetitor brauchbar sind einzelsträngige Nukleinsäuren mit einer Länge von 2 bis 500 Basen (Oligomere). Es versteht sich, daß zu den einzelsträngigen Nuklein säuren auch denaturierte doppelsträngige Nukleinsäuren gehören. DNA, RNA sowie Nukleinsäure-Analoga und -Derivate, wie gegebenenfalls modifizierte PNA, LNA und PSNA sowie modifizierte DNA oder RNA kann verwendet werden.

Verglichen mit den in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren bilden erfindungsgemäß bevorzugte Nukleinsäure-Oligomere mit immobilisierten Sonden Hybride, deren thermische Stabilität bei Komplementarität (Perfect Match) vergleichsweise größer, bei Nichtkomple mentarität (Mismatch) vergleichsweise geringer ist. Der T_m-Unterschied zwischen Match und Mismatch ist daher ausgeprägter als bei DNA/DNA- oder DNA/RNA-Hybriden, was zu einer besseren Basenfehlpaarungs-Diskriminierung führt.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäu re-Oligomer ein PNA-, LNA- oder PSNA-Oligomer.

Die Länge geeigneter Nukleinsäure-Oligomere kann unterschiedlich sein. Sie richtet sich vor allem nach der Länge der nachzuweisenden Nukleinsäuren sowie der immobilisierten Sonden. Bevorzugt sind 6-40mere und insbesondere 15-25mere.

Die Polarität des Nukleinsäure-Oligomers kann in Relation zur Polarität der immobilisierten Sonden in sense oder antisense Richtung liegen.

Einem besonderen Aspekt zufolge umfaßt das Nukleinsäure-Oligomer eine Basenabfolge, die derjenigen des Wildtyps entspricht.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Untersuchung beliebiger Proben biologischen Ursprungs, die Nukleinsäuren enthalten können. Eine Ausführungsform betrifft Körperproben humanen und tierischen Ursprungs. Erforderlichenfalls erfolgt eine vorbereitende Aufarbeitung der in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren. Diese Aufarbei tung enspricht in der Regel üblicher Praxis. Proben wie Blut und Blutbestandteilen bzw. Isolate davon, Gewebe, nativ, gefroren, fixiert, mit und ohne Dissektion, Zellen aus Körperflüssigkeiten, z. B. Sputum, Lavagen, Punktate, Exsudate und Urin, oder Stuhl, können vorteilhaft mit dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden. Demnach handelt es sich um ein in vitro Verfahren.

Für den Hybridisierungsschritt können amplifizierte oder nicht amplifizierte Nukleinsäuren eingesetzt werden.

Der Begriff Amplifikation betrifft die Vervielfältigung von Nukleinsäuren, d. h. die Erzeugung vieler Kopien bestimmter Nukleinsäuren. In der Regel verläuft die Amplifikation wenigstens linear und vorzugsweise exponentiell.

Brauchbar sind die bekannten Amplifikationsverfahren, zu denen die Polymerase- Kettenreaktion (PCR), auch als Nested-PCR, Asymmetrische PCR oder Multiplex-PCR durchgeführt, oder alternative Verfahren, wie die Ligase-Kettenreaktion (LCR), Nukleinsäu resequenz-basierende Amplifikation (NASBA), Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA) und ähnliche, gehören. Bestimmte Versionen dieser Techniken, wie die mutations anreichernde PCR, und/oder Kombinationen mit anderen molelularbiologischen Methoden, wie mit der Reversen Transkription (RT), können zweckmäßig sein.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird vor der Hybridisierung eine Amplifikation durchführt in Gegenwart wenigstens eines Nukleinsäure-Oligomers mit einer Basenabfolge, die ähnlich ist zu einer bestimmten Basenabfolge der nachzuweisen den Nukleinsäure.

Dieser Ausführungsform liegt das bekannte Prinzip der mutationsanreichernden PCR zugrunde, nämlich einer vergleichsweise geringeren Amplifikation von Nukleinsäuren mit einer zur Basenabfolge des Nukleinsäure-Oligomers komplementären Basenabfolge als von Nukleinsäuren mit einer zur Basenabfolge des Nukleinsäure-Oligomers ähnlichen Basenabfolge. Dazu ist es zweckmäßig, das Nukleinsäure-Oligomer so zu gestalten, daß dessen Bindung an das Templat die Anlagerung wenigstens eines PCR-Primers und/oder dessen Elongation verhindert. In der Regel weisen geeignete Nukleinsäure-Oligomere und Primer gemeinsame Sequenzabschnitte auf, die zweckmäßigerweise das 3'-Ende des Primers überdecken. So gelingt eine Anreicherung von Nukleinsäuren mit einer zur Basenabfolge des Nukleinsäure-Oligomers ähnlichen Basenabfolge zugunsten von Nukleinsäuren mit einer zur Basenabfolge des Nukleinsäure-Oligomere komplementären Basenabfolge. Dabei kann die Amplifikation von Nukleinsäuren mit einer zur Basenabfolge des Nukleinsäure-Oligomers komplementären Basenabfolge - je nach Konzentration der Nukleinsäuren in der Probe und den verwendeten Amplifikationsbedingungen - im wesent lich vollständig unterdrückt werden, es können aber auch ausreichend Amplifikate erzeugt werden, die dann im anschließenden Hybridisierungsschritt nachgewiesen werden können.

Für das im Rahmen der mutationsanreichernden PCR zu verwendende Nukleinsäure- Oligomer gelten obige Ausführungen zu dem im Rahmen des Hybridisierungsschrittes verwendeten Nukleinsäure-Oligomer entsprechend.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet man demnach das Nukleinsäure-Oligomer auch zur diskriminierenden Amplifikation wenigstens einer nachzuweisenden Nukleinsäure in Gegenwart einer Nukleinsäure mit ähnlicher Basenabfolge durch PCR oder ähnliche Verfahren und hybridisiert anschließend das Amplifikationsprodukt in Gegenwart desselben Nukleinsäure-Oligomers an immobilisierten Sonden. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn trotz mutationsanreichernder PCR ein Amplifikat mit Wildtyp-Sequenzen erhalten wird, weil in diesem Fall mittels der erfindungs gemäßen kompetitiven Hybridisierung diskriminiert werden kann zwischen möglicherweise im Amplifikat vorhandenen mutierten Sequenzen und Wild-Sequenzen.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Hybridisie rung keine Amplifikation vorgeschaltet. Dies gilt insbesondere für den Nachweis von mRNA bzw. davon abgeleiteten Nukleinsäuren.

Für die Fälle, in denen eine Amplifikation durchgeführt wird, bietet sich die Co-Amplifikation wenigstens einer Kontrollsequenz als allgemeine und/oder spezifische PCR-Kontrolle an, z. B. um eine unspezifische Inhibition für die Fälle ausschließen, in denen kein Amplifikat erhalten wird. Beispielsweise kann die HLA-DRA1-Sequenz (Locus: HLA00663) als allgemeine PCR- und als humanspezifische Kontrollsequenz (HSKS) gewählt werden, da sie bei Tieren nicht vorhanden ist.

Die Sonden sind in der Regel einzelsträngige Oligomere. DNA, RNA sowie Nukleinsäure- Analoga und -Derivate, wie gegebenenfalls modifizierte PNA, LNA und PSNA sowie modifizierte DNA oder RNA kann verwendet werden. Die Mindestlänge der Sonden hängt ab von der Komplexität der Probe, insbesondere der Anzahl der Basen nachzuweisender Nukleinsäuren, aber auch von der Art des als Sonde verwendeten Nukleinsäuretyps und der erreichbaren thermodynamische Stabilität zwischen Probe und Sonde.

In Abhängigkeit vom Nukleinsäuretyp weisen Sonden üblicherweise ein Länge von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für DNA, von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für DNA-LNA Hybride, von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für PSNA, von 6 bis 30, vorzugsweise von 8 bis 18 und insbesondere von 9 Basen für LNA, und von 6 bis 18, vorzugsweise von 8 bis 18 und insbesondere von 9 Basen für PNA auf.

Bei relativ geringer Komplexität der nachzuweisenden Nukleinsäuren, z. B. Amplifikaten, insbesondere PCR-Amplifikaten, Viren, Plasmiden und Mikroorganismen, sind relativ kurze Sonden, etwa im Bereich von 8-25meren und insbesondere 8-15meren, zweckmäßig. Bei relativ hoher Komplexität der nachzuweisenden Nukleinsäuren, z. B. nichtamplifizierter RNA; über cDNA gesamtamplifizierter RNA, nichtamplifizierter gesamtgenomischer DNA und amplifizierter gesamtgenomischer DNA, sind längere Sonden, etwa im Bereich von 16-60meren für synthetische Sonden, zweckmäßig oder die Sonden bestehen aus PCR- Produkten, cDNA, Plasmiden oder DNA aus lysierten Bakterien, die auch eine darüber hinaus gehende Basenanzahl aufweisen können.

Die Basenabfolge der Sonden richtet sich vornehmlich nach ihrer Funktion. Eine Testson de weist in der Regel eine Basenabfolge auf, die zu einer bestimmten Targetsequenz einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist oder einem anderen Aspekt zufolge mit der Targetsequenz spezifisch hybridisieren kann. Eine Kontrollsonde kann insbesondere die Funktion einer Normalisierungs-, Mismatch-, Housekeeping-, Probenzubereitungs-, Hybridisierungs- oder Amplifikationskontrolle haben und dementsprechend eine Basenab folge aufweisen, die komplementär ist zu einer Basenabfolge einer Referenz-Nukleinsäure, einer nachzuweisenden Nukleinsäure mit ähnlicher Basenabfolge, einer konstitutiv exprimierten Nukleinsäure, z. B. einer vom β₂-Mikroglobulin, β-Aktin-, GAPDH- oder Transferrin-Rezeptor-Gen abgeleiteten Nukleinsäure, einer speziesspezifischen Nuklein säure bzw. eines Amplifikats.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zum spezifischen Nachweis einer Nuklein säure mit bestimmter Basenabfolge. Es können auch gleichzeitig mehrere Nukleinsäuren mit bestimmten, gegebenenfalls zueinander ähnlichen Basenabfolgen jeweils spezifisch nachgewiesen werden. Spezifisch meint in diesem Zusammenhang insbesondere eine ausreichende Diskriminierung gegenüber Nukleinsäuren mit einer ähnlicher Basenabfolge. Demnach ist das vorliegende Verfahren insbesondere dann von Vorteil, wenn die Probe wenigstens zwei Nukleinsäuren mit zueinander ähnlichen Basenabfolgen enthalten kann. Beispielsweise kann eine Punktmutation spezifisch nachgewiesen werden, indem man wenigstens eine Testsonde mit einer Basenabfolge, die komplementär zu einer die Punktmutation umfassenden Basenabfolge ist, und eine weitere Testsonde mit einer Basenabfolge, die komplementär zur entsprechenden Basenabfolge des Wildtyps, vorsieht. Zum spezifischen Nachweis weiterer Punktmutationen, z. B. im Rahmen einer Permutation, können weitere Testsonden mit einer Basenabfolge, die komplementär zu einer die jeweilige Punktmutation umfassenden Basenabfolge ist, vorgesehen werden. Für diese Fälle ist es zweckmäßig, die Sonden in einem parallelisierten System anzuordnen. Der Nukleinsäure-Kompetitor weist in diesen Fällen vorteilhafterweise eine Basenabfolge auf, die komplementär ist zu einer Basenabfolge einer der Sonden, vorzugsweise einer für die Ähnlichkeit wählbaren Bezugsbasenabfolge, insbesondere einer Basenabfolge des Wildtyps. Es kann auch zweckmäßig sein, das Verfahren mit denselben Sonden an mehreren Probenaliquots mehrmals mit unterschiedlichen Kompetitoren durchzuführen. Eine weitere Möglichkeit besteht in dem gleichzeitigen Einsatz mehrerer unterschiedlicher Kompetitoren.

Zur Immobilisierung sind die Sonden an einen Träger gekoppelt, beispielsweise über kovalente, adsorptive oder über physikalisch/chemische Wechselwirkungen von Sonde und Oberfläche. Geeignete Methoden zur Erzielung einer zweckmäßigen Kopplung sind dem Fachmann bekannt. Dabei kann die zuvor bereitgestellte Sonde an die Oberfläche gekoppelt werden oder es kann die Sonde in-situ an der Oberfläche synthetisiert werden, z. B. mittels photolitographischer Verfahren. Die Kopplung über photoaktive Gruppen, beispielsweise bestimmte Anthrachinone, und erforderlichenfalls einen Spacer geeigneter Länge und Konstitution, beispielsweise Polyethylenglykol mit n = 2-10 und vorzugsweise von etwa 6 bei 8-15meren, an eine reaktive Oberfläche, stellt eine bevorzugte Ausfüh rungsform dar.

Als Trägermaterial können folgende Stoffe verwendet werden: Glas (Standardglas, Pyrexglas, Quarzglas), Kunststoffe, bevorzugt von hoher Reinheit bzw. geringer Eigenfluoreszenz (wie Polyolefine, z. B. PE (Polyethylen), PP (Polypropylen), Polymethylpenten, Polystyrol, PMMA (Poly(methylmethacrylat)), Polycarbonat, Teflon), Metalle (wie Gold, Chrom, Kupfer, Titan, Silizium), oxidische Materialien bzw. Beschichtungen (Keramiken, aluminiumdotiertes Zinkoxid (TCO), Silica, Aluminiumoxid). Die Trägermaterialien können als Membranen (wie Polysaccharide, Polycarbonat, Nation, Langmuir-Blodget-Membrane), dreidimensionale Strukturen (etwa Gele z. B. Polyacrylamid, Agarose, Keramiken) oder auch Formteile aus obigen Materialien, wie Folien und Dipsticks, ausgebildet sein. Für eine bessere Haftung, die Reduzierung unspezifischer Bindung oder für eine kovalente Ankopplung der Sonden kann das Aufbringen einer Zwischenschicht oder eine Voraktivierung der Oberfläche notwendig sein, z. B. durch Silane (Alkylsilane, Epoxysilane, Aminosilane, Carboxysilane), Langmuir-Blodget- Membranen, Polymere (Polysaccharide, Polyethylenglycol, Polystyrol, polyfluorierte Kohlenwasserstoffe, Polyolefine, Polypeptide), Alkylthiole, derivatisierte Alkylthiole, Lipide oder Lipid-Doppelschichten. Die Aufbringung der Sonden auf die Oberfläche erfolgt durch Pipettieren, Dispensieren, Drucken, Stempeln oder photolithographische Techniken, insbesondere bei der ebenfalls möglichen in-situ-Synthese der Sonden an der Oberfläche. Es werden bevorzugt verschiedene Sonden in einem zweidimensionalen Muster auf die Oberfläche aufgebracht. Jeder Sonde kann dann eine eindeutige Position auf der Oberfläche zugeordnet werden.

Zur Hybridisierung bringt man die immobilisierte Sonde in Kontakt mit einem Hybridisie rungsgemisch, das einen von der Probe abgeleiteten Teil, wenigstens ein Nukleinsäure- Oligomer und gegebenenfalls weitere übliche Zusätze umfaßt. Es versteht sich, daß Teile des Gemisches zunächst getrennt voneinander mit der Sonde in Kontakt gebracht werden können. Die Hybridisierungsbedingungen werden zweckmäßigerweise so gewählt, daß Sonde und dazu komplementäres Target stabile Hybride bilden können. Dazu werden in der Regel zunächst Bedingungen relativ niedriger Stringenz gewählt, z. B. Temperaturen von etwa 20-50°C und insbesondere von etwa 30-40°C sowie Ionenstärken von etwa 6 × SSPE oder niedriger. Anschließend kann dann bei ähnlicher oder höherer Stringenz, z. B. etwa 1 × SSPE bei etwa 30-40°C bis etwa 0,25 × SSPE bei etwa 30-50°C gewaschen werden. Ferner kann auf bekannte Agenzien, z. B. Detergenzien, Blockreagenzien, denaturierende Agenzien, die Renaturierung beschleunigende Agenzien und T_m- egalisierende Reagenzien zurückgegriffen werden. Die Optimierung des Hybridisierungs protokolls ist Sache des Fachmanns.

Der Nachweis im erfindungsgemäßen Sinn beinhaltet die Feststellung, ob ein bestimmtes Target in einer Probe vorhanden ist oder nicht (Anwesenheit oder Abwesenheit). Die Feststellung kann qualitativ oder quantitativ erfolgen.

In der Regel erfordert der Nachweis eine Quantifizierung derjenigen Nukleinsäuren, die an eine immobilisierte Sonde hybridisieren. Die Quantifizierung kann absolut oder relativ erfolgen. Geeignete Detektionssysteme sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Eine vielfach genutzte Möglichkeit besteht in der Einführung von Markierungen, z. B. radioakti ver, colorimetrischer, fluoreszierender oder lumineszierender Art. Diese werden in der Regel in die in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren und insbesondere in die nachzuwei senden Nukleinsäuren mit bestimmter Basenabfolge bzw. Nukleinsäuren mit dazu ähnlicher Basenabfolge eingeführt, z. B. im Zuge einer der Hybridisierung vorgeschalteten Amplifikation oder auf andere an sich bekannte Art und Weise. Sind die nachzuweisenden Nukleinsäuren mit bestimmter Basenabfolge bzw. Nukleinsäuren mit dazu ähnlicher Basenabfolge markiert, so ist es zweckmäßig, das als Kompetitor zu verwendende Nukleinsäure-Oligomer nicht zu markieren oder zumindest keine damit interferierende Markierung zu verwenden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beträgt die Diskriminierung zwischen Perfect Match und Mismatch von ähnlichen Basenabfolgen nach der Hybridisierung an immobili sierten Sonden in der Regel mehr als 3 : 1.

Die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Verwendung einer mutationsanrei chernden Amplifikation und anschließender kompetitiver Hybridisierung an immobilisierten Sonden beträgt in der Regel mehr als 1 : 10, vorzugsweise mehr als 1 : 100.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines Nukleinsäure- Oligomers als Kompetitor bei der Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonde zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch. Damit gelingt der spezifische Nachweis einer Nukleinsäure mit bestimmter den Perfect Match bildenden Basenabfolge. Bevorzugt wird die Verwendung bei Hybridisierung an wenigstens zwei immobilisierte Sonden, wobei eine Sonde den Perfect Match und die andere den Mismatch bilden kann. Insbesondere weisen die beiden Sonden zueinander ähnliche Basenabfolgen auf.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäure-Kompetitoren zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch bei der Hybridisierung von Nukleinsäuren an wenigstens eine immobilisierte Sonde. Spezifische Ausgestaltungen dieser Kompetito ren sind den Ausführungen zum Verfahren und zur Verwendung zu entnehmen.

Prinzipiell eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis bestimmter genetischer Informationen eines beliebigen Organismus oder von Teilen davon. Vorteile bietet das Verfahren bei der Differenzierung zwischen ähnlichen Informationen. Die Informationen können genomischer Art sein. Sie können aber auch die Expression von Genen, z. B. auf mRNA-Ebene, betreffen. Vor allem richtet sich das Verfahren auf den Nachweis von Mutationen in Zellen aus Körperflüssigkeiten oder Geweben tierischen oder menschlichen Ursprungs. Dazu können Zellen in an sich bekannter Weise gewonnen, z. B. dem zu untersuchenden Individuum in Form einer zellhaltigen Probe entnommen werden, erforderlichenfalls angereichert und mit dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden.

Ein weiterer besonderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung eines vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Identifizierung und Charakte risierung von Mutationen vor allem in Zellen, insbesondere von Krebszellen. Diese Anwendung reicht von der Krebsdiagnose über das Monitoring bis zur Therapiewahl durch gezieltes Drug-Targeting nach Feststellung bestimmter genetischer Eigenarten. Eine weitere Anwendung betrifft den Nachweis von Viren oder Bakterien, beispielsweise den eingangs genannten Organismen, insbesondere unter Differenzierung verschiedener Genotypen, z. B. verschiedener Stämme einer Art.

Eine besondere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft den Nachweis von Mutationen in den Codons 12, 13 und 61 des humanen K-ras-Gens. Dies betrifft jede beliebige der theoretisch möglichen Mutationen in diesen Codons. Demnach richtet sich diese Ausführungsform auf den Nachweis von wenigstens einer Nukleinsäure mit einer Basenabfolge, die ähnlich ist zu einer Basenabfolge des humanen K-ras-Gens.

Insbesondere beinhalten derartige Basenabfolgen als Codon 12 GAT, GTT, GCT, TGT, AGT, CGT, CTT oder ATT anstatt GGT und/oder als Codon 13 TGC oder GAC anstatt GGC und/oder als Codon 61 CAT, CAC, CTA, CGA oder GAA anstatt CAA, wobei die übrigen Basen dieser Basenabfolgen denjenigen des humanen K-ras-Gens entsprechen.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens wird wenigstens ein Nukleinsäure-Oligomer verwendet, das eine Codon 12 und 13 umfassende Basenabfolge aufweist.

Die Verwendung von Nukleinsäure-Oligomeren mit einer Basenabfolge, die derjenigen des Wildtyps entspricht, stellt einen weiteren besonderen Aspekt dar.

In einem speziellen Verfahren wird der Hybridisierung eine mutationsanreichernde PCR vorgeschaltet. Zu diesem Zweck kann beispielsweise ein 15mer PNA-Oligomer (wt- Sequenz, Polarität antisense) so entworfen werden, daß es die Codons 12 und 13 überlappt und 3 Basen in die Bindungsstelle des antisense-PCR-Primers hineinragt. Das PNA-Oligomer ist komplementär zur Wildtypsequenz (Polarität: antisense). Durch Bindung an die sense-Wildtypsequenz verringert es während der PCR die Amplifikation des Wildtyps. Mutierte Sequenzen werden - auch in Gegenwart eines Überschusses an Wildtypsequenz - präferentiell amplifiziert.

Als allgemeine und als humanspezifische Kontrollsequenz kann vorteilhafterweise eine Co- Amplifikation von HLA-DRA1 in einem Multiplexansatz durchgeführt werden. Dies dient als Funktionsnachweis der PCR, da im Fall des Fehlens einer Mutation kein oder nur wenig PCR Produkt entsteht, und ist insbesondere beim Nachweis von K-ras-Mutationen in Stuhlproben von Vorteil, da hier unter Umständen eine hohe Konzentration tierischer Nukleinsäuren mitextrahiert wird und die zur Co-Amplifikation gewählte Sequenz des HLA- DRA1 humaner DNA, nicht aber in der DNA tierischen Ursprungs vorkommt.

Insbesondere kann sowohl die Amplifikation als auch die Hybridisierung in Gegenwart des gleichen Nukleinsäure-Oligomers durchgeführt werden. In diesem Fall kann dieses Nukleinsäure-Oligomer im Amplifikationsansatz verbleiben.

Ein erfindungsgemäß bevorzugt verwendetes Nukleinsäure-Oligomer weist die Sequenz SEQ ID NO: 1 auf.

Eine bevorzugte Sondenanordnung besteht darin, daß

1. wenigstens eine Sonde eine Basenabfolge aufweist, die komplementär ist zu einer Basenabfolge, die derjenigen des humanen K-ras-Gens ähnlich ist;
2. wenigstens eine weitere Sonde eine Basenabfolge aufweist, die komplementär ist zu einer Codon 12 und 13 umfassenden Basenabfolge, die der Basenabfolge des humanen K-ras-Gens entspricht; und
3. gegebenenfalls weitere Sonden Basenabfolgen aufweisen, die zur Amplifikations- und/oder Specieskontrolle dienen.

Die unter i1) angesprochenen Sonden werden vorzugsweise ausgewählt unter den Oligonukleotiden mit den Sequenzen SEQ ID NO: 8-17.

Eine unter i2) angesprochene Sonde ist vorzugsweise ein Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID NO: 7.

Die unter i3) angesprochenen Sonden werden vorzugsweise ausgewählt unter den Oligonukleotiden mit den Sequenzen SEQ ID NO: 18-20.

Die Immobilisierung der Sonden erfolgt vorzugsweise auf der Oberfläche eines planaren Trägers. Insbesondere ergeben sich Biochips, auf denen die Sonden angeordnet sind. Ein besonderer Biochip weist die Sonden mit den Sequenzen SEQ ID NO: 7-20 auf, wobei vorzugsweise jeweils zwei Feldelemente auf dem Chip mit einem Sondentyp bestückt sind.

Für den vorstehend beschriebenen Nachweis von Mutationen des K-ras-Gens ergeben sich vor allem Anwendungen in der Krebserkennung, beispielsweise von Pankreas- Karzinomen, Schilddrüsen-Karzinomen, Ph-negativer CML, kolorektalen Karzinomen Multiplen Myelomen, Myelodysplastischem Syndrom (MDS), Myeloproliferativem Syndrom (MPS), akuten myeloischen Leukämien und Lungen-Adenokarzinomen. Es können gegebenenfalls fixierte und/oder dissektierte Gewebe untersucht werden, oder auch Zellen aus Körperflüssigkeiten mit und ohne vorhergehende Anreicherung und vor allem Stuhl auf Kolorektal-Karzinome gescreent werden.

Auch kann der Nachweis von K-ras-Mutationen zum Drug-Targeting für therapeutische Anwendungen, beispielsweise der Verabreichung monoklonaler Antikörper gegen mutier tes p21, zur Gentherapie oder Antisense-Therapie dienen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Analysekits mit Mitteln zur Durchführung eines vorstehend beschriebenen Verfahrens. Derartige Kits enthalten vorzugsweise

a) wenigstens eine immobilisierte Sonde mit einer Basenabfolge, die zu einer be stimmten Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist;
b) wenigstens ein Nukleinsäure-Oligomer mit einer Basenabfolge, die zu der be stimmten Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure ähnlich ist; und,
c) gegebenenfalls weitere Mittel zur Durchführung des Verfahrens, die z. B. auszu wählen sind unter Amplifikationsmitteln, Puffer, internen Standards und Kontrollen. Weitere besondere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kits ergeben sich aus den Ausführungen zum Verfahren selbst.

Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen näher erläutert.

In den Zeichnungen zeigt:

Fig. 1 ein Histogramm der Häufigkeit bisher nachgewiesener K-ras-Mutationen in den Codons 12 (schwarz), 13 (schraffiert) und 61 (weiß);

Fig. 2 eine Codon 12/13 umfassende Teilsequenz des humanen K-ras-Gens (Wild typ) sowie die zur mutationsanreichernden PCR verwendeten Primer RasUS1 und RasDS135 und das Nukleinsäure-Oligomer (Kompetitor) PNA-KRas 123. Primer sind unterstrichen, die Oligomersequenz ist in kursiver Schrift und Codon 12 und 13 sind in Fettdruck gehalten. Die Länge des PCR-Produktes beträgt 157 bp;

Fig. 3 die selektive Amplifikation der mutierten K-ras-Sequenz (GTT, Val 12) (A) sowie den Einfluß der Zyklenzahl auf die Menge an amplifizierter Wildtypsequenz (B) bei Zusatz von PNA-KRAS123 zur PCR (M: Marker; WT: Wildtyp; Mut: Mutante);

Fig. 4 die Sequenzierung des PCR-Produktes nach mutationsanreichernder PCR unter Zusatz von PNA-KRAS123 (A) und die Sequenzierung einer Wildtypkontrolle in (B);

Fig. 5 die Co-Amplifikation des HLA-DRA1-Locus in Wildtyp- und Mutantenzelllinie (M: Marker; WT: Wildtyp; Mut: Mutante);

Fig. 6 Diskriminierungsraten bei der Hybridisierung einer synthetischen, die Ile 12- Mutation umfassenden 24mer Probe (KRST-Ile12) an verschiedene Sonden (mit Angaben zur Komplementarität) (A) ohne und (B) bei Kompetitor-Zusatz zum Hybridisierungspuffer;

Fig. 7 die Auswertung eines Biochips mit verschiedenen Sonden (Komplementarität den Angaben entsprechend) nach Hybridisierung eines PCR-Produktes mit einem Verhältnis von Wildtyp-DNA: mutierter DNA (Codon 12 GGT, Val12) von 1000 : 1 bei PNA-Zusatz als gescannte Abbildung (A) und entsprechender Plot (B);

Fig. 8 normalisierte Diskriminierung bei Hybridisierung definierter PCR-Produkte (Komplementarität den Angaben entsprechend) an immobilisierte Sonden (Komplementa rität den Angaben entsprechend) unter Zusatz von Kompetitor;

Fig. 9 eine tabellarische Aufstellung der in Fig. 8 aufgetragenen Werte.

Nachweis bestimmter K-ras-Mutationen in den Codons 12 und 13 a) Mutationsanreichernde Amplifikation

In Fig. 2 ist eine K-ras-Sequenz, welche die Codons 12 und 13 umfaßt, wiedergegeben. Die Sequenzen der verwendeten Primer, Codon 12 und 13 sowie die zum PNA-Oligomer korrespondierende Sequenz sind hervorgehoben. Diese und weitere Sequenzen sind in folgender Tabelle 1 aufgelistet.

Tabelle 1

PCR-Bedingungen pro Ansatz: 100 ng DNA, 1,5 mM MgCl₂; 100 µM dNTPs; 250 nM Primer; 1 U Taq-Polymerase (Qiagen; HotStar); 7,5% Glycerol; ggf. 2,8 µM PNA; in 50 µl 1 × PCR-Puffer. Thermocycling: 1 × 95°C 15 min. 35-45 × (94°C 60 s, 70°C 50 s, 58°C 50 s, 72°C 60 s); 1 × 72°C 7 min.

In Fig. 3A ist der mutationsanreichernde Effekt dargestellt. Wenn zu einem PCR Ansatz, der nur die K-ras-Wildtypsequenz (DNA aus der Zellinie Colo320) enthält, 2,8 µM PNA- Oligomer zugegeben werden, wird die Amplifikation der Wildtypsequenz unterdrückt. DNA mit mutierter K-ras-Sequenz (aus der Zellinie SW480, Codon 12 GGT; Valin 12) wird auch in Gegenwart des PNA-Oligos amplifiziert. Durch Erhöhung der Zyklenzahl von 35 auf 45 kann ein Verhältnis von mutierter DNA zu Wildtyp-DNA von 1 : 1000 und mehr amplifiziert werden, was durch Sequenzierung des Amplifikats nachgewiesen werden konnte (Fig. 4). Allerdings erhöht sich unter diesen Bedingungen die Menge an amplifizierter Wildtypsequenz (Fig. 3B).

b) Aufbau der Multiplex-PCR

Zur Kontrolle der mutationsanreichernden PCR, bei der man im Fall der Abwesenheit einer mutierten Sequenz kein Amplifikat erhält, wird als human-spezifische Kontrollsequenz (HSKS) ein Fragment von HLA-DRA1 co-amplifiziert. Die hierzu verwendeten Primer DRA20Uo und DRA200Lo sind in Tabelle 1 angegeben. Die Polaritäten der PCR-Primer sind sense und antisense, wobei der antisense-Primer an 5' mit Cy5 markiert ist. Die Polarität des PNA-Oligomers ist antisense. Das Ergebnis der Co-Amplifikation ist in Fig. 5 dargestellt.

c) Herstellung der Biochips

Als Sonden wurden einzelsträngige 13mer DNA-Oligomere verwendet (Polarität sense). In nachfolgender Tabelle 2 sind die Sequenzen der auf dem Biochip immobilisierten Sonden (Capture Probes) aufgelistet (K-ras-Codon 12; K-ras-Codon 13; K-ras-PCR-Kontrolle (Control 81); human-spezifisches Kontrollgen (HLA-DRA1)). Die Polarität der immobili sierten Sonden ist sense und an die Sonden hybridisierende Stränge sind antisense und an 5' Cy5-markiert.

Tabelle 2

Die Sonden bestehen aus einer photoaktiven Gruppe (Anthrachinon), einem Hexaethy lenglykol-Spacer und einem über 5' an den Spacer gekoppelten einzelsträngigen 13mer DNA-Oligonukleotid. 1,5 nL der gelösten Sonden (Konzentration 10 µM) wurden in Duplikaten auf eine Plastikoberfläche (Träger) gespottet. Nach dem Eintrocknen der Spots wurden die Träger 1 min mit UV-Licht bestrahlt, wodurch die photoreaktive Anthrachinon gruppe der Sonden eine kovalente Bindung mit dem Plastikmaterial eingeht. Die Träger wurden gewaschen, um überschüssige Sonden zu entfernen.

d) Kompetitive Hybridisierung

Zwei K-ras-Biochips aus Beispiel c) wurden mit einer synthetischen, Cy5-markierten 24mer-Nukleinsäure als Probe (Polarität antisense; Basenabfolge siehe Tabelle 1) mit und ohne Zusatz von 2,4 µM PNA-Oligomer (PNA-KRAS123) hybridisiert. Die Probe (SEQ ID NO: 6) weist eine zur Basenabfolge der immobilisierten Sonde SEQ ID NO: 15 (Ile12- Mutation) komplementäre Basenabfolge auf.

Die Probenkonzentration wurde auf 5 nM in 6 × SSPE eingestellt. Es wurden 20 µl Probe mit und ohne PNA bei 37°C 1 h hybridisiert, danach die überschüssige Probe kurz mit 6 × SSPE abgespült und die Fluoreszenz gemessen. In Fig. 6 sind die Ergebnisse dargestellt: A: kein PNA im Hybrisierungspuffer. B: Zusätzlich 2,4 µM PNA im Hybrisierungspuffer. Die Zugabe von PNA mit einer zum Wildtyp komplementären Basenabfolge verbessert deutlich die Spezifität der Hybridisierung. Die erreichten Diskriminierungsraten sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

In einem weiteren Experiment wurden 12 µl PCR-Produkt (mutationsanreichernde PCR nach Beispiel a), Wildtyp-DNA: mutierter DNA 1000: 1) gemischt mit 5,1 µl 20 × SSPE-0,3% Tween 20 (Endkonzentrationen im Gemisch ~ 6 × SSPE-0.1% Tween 20). Die kom pletten 17,1 µl im Hybridisierungsansatz wurden 3 min auf 90°C erhitzt, auf Eis abgekühlt und auf den Array pipettiert. Der Chip wurde 1 h bei 37°C im Hybridisierungsofen inku biert, danach die überschüssige Sonde kurz mit 6 × SSPE abgespült und gescannt (Fig. 7A). Die Diskriminierung war für alle Match/Mismatch-Verhältnisse < 10 : 1 (Fig. 7B).

e) Diskriminierung einzelner Mutationen durch Hybridisierung auf dem Biochip

Es wurden unter den in Beispiel 1 genannten mutationsanreichernden PCR-Bedingungen K-ras-Amplifikate von DNA-Proben mit bekannten Mutationen hergestellt (Targets). Die Amplifikate mit den einzelnen Mutationen wurden jeweils in Gegenwart von 2,4 µM PNA- Oligomer (PNA-KRAS123) hybridisiert. Die auf den jeweiligen Perfect Match normalisierten Ergebnisse der einzelnen Hybridisierungen (Perfect Match = 1,0, Mismatches: Signal- Quotient aus Perfect Match/Signal Mismatch) sind in Fig. 8 aufgetragen und in Fig. 9 tabellarisch zusammengefaßt. Es konnte für alle Amplifikate in Bezug auf die jeweilige Mutation eine Match/Mismatch-Diskriminierung von < 10 : 1 erreicht werden. Ausnahme ist die Mutation Leu 12, bei der ein Quotient von 5,2 zur Mutation Ile festgestellt wurde.

SEQUEBCE LISTING

Claims

1. Verfahren zum Nachweis wenigstens einer Nukleinsäure mit bestimmter Basenabfol ge in einer Probe durch Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonde, da durch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung durchgeführt wird in Gegenwart we nigstens eines Nukleinsäure-Oligomers mit einer Basenabfolge, die ähnlich ist zu der Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinsäure.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäure- Oligomer ein PNA-, LNA- oder PSNA-Oligomer ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Hybridisierung eine Amplifikation durchgeführt wird in Gegenwart wenigstens eines Nukleinsäure-Oligomers mit einer Basenabfolge, die ähnlich ist zu der bestimmten Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinsäure.

4. Verfahren nach einem der Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde eine Länge von etwa 8 bis 60 Basen aufweist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe wenigstens zwei Nukleinsäuren mit zueinander ähnlichen Basenabfol gen enthalten kann.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die bestimmte Basenabfolge einer nachzuweisender Nukleinsäure ähnlich ist zu einer Basenabfolge des humanen K-ras-Gens.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Basenabfolge, die zu derjenigen des humanen K-ras-Gen ähnlich ist, als Codon 12 GAT, GTT, GCT, TGT, AGT, CGT, CTT oder ATT anstatt GGT und/oder als Codon 13 GGC oder GAC an statt GGC und/oder als Codon 61 CAT, CAC, CTA, CGA oder GAA anstatt CAA umfasst.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die Amplifikation als auch die Hybridisierung durchgeführt wird in Gegenwart eines Nu kleinsäure-Oligomers mit einer Codon 12 und 13 umfassenden Basenabfolge, die der Basenabfolge des Wildtyps entspricht.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäure- Oligomer die Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß i1) wenigstens eine Sonde eine Basenabfolge aufweist, die komplementär ist zu einer Basenabfolge, die derjenigen des humanen K-ras-Gens ähnlich ist; i2) eine weitere Sonde eine Basenabfolge aufweist, die komplementär ist zu einer Codon 12 und 13 umfassenden Basenabfolge, die der Basenabfolge des humanen K-ras-Gens ent spricht; und i3) gegebenenfalls weitere Sonden Basenabfolgen aufweisen, die zur Amplifikations- und/oder Spezieskontrolle dienen.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden ausgewählt sind unter i1) SEQ ID NO: 8-17; i2) SEQ ID NO: 7; und i3) SEQ ID NO: 18-20.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Sonden als Array auf der Oberfläche eines Trägers immobilisiert sind.

13. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zum Nachweis wenigstens einer genetischen Information oder Eigenart.

14. Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 13 zur Identifizierung und Charakteri sierung von Krebszellen.

15. Verwendung eines Nukleinsäure-Oligomers als Kompetitor bei der Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonden zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch.

16. Nukleinsäure-Kompetitor zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch bei der Hybridisierung von Nukleinsäuren an wenigstens eine immobilisierten Sonde.

17. Analysekit, enthaltend i) wenigstens eine immobilisierte Sonde mit einer Basenabfol ge, die zu einer bestimmten Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist; ii) wenigstens ein Nukleinsäure-Oligomer mit einer Basenabfolge, die zu der bestimmten Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure ähnlich ist; und gegebenenfalls weitere übliche Mittel zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12.

18. Analysekit nach Anspruch 17, wobei die immobilisierte Sonde Teil eines Biochips ist.