WO2002010447A2 - Verfahren zum nachweis von nukleinsäuren mittels hybridisierung, verwendung dieses verfahrens und entsprechender analysekit sowie nukleinsäure-oligomere und deren verwendung - Google Patents

Verfahren zum nachweis von nukleinsäuren mittels hybridisierung, verwendung dieses verfahrens und entsprechender analysekit sowie nukleinsäure-oligomere und deren verwendung Download PDF

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WO2002010447A2 PCT/EP2001/008895 EP0108895W WO0210447A2 WO 2002010447 A2 WO2002010447 A2 WO 2002010447A2 EP 0108895 W EP0108895 W EP 0108895W WO 0210447 A2 WO0210447 A2 WO 0210447A2
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nucleic acid
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Hans-Jörg Grill
Andreas SCHÜTZ
Lothar Prix
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Giesing, Michael
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting at least one nucleic acid (target) with a specific base sequence (target sequence) in a sample by hybridization to at least one immobilized probe, the use of this method, analysis kits for carrying out this method and nucleic acid oligomers and their use for discrimination by Perfect Match and Mismatch.
  • US Pat. No. 5,869,237 describes a method with which the chromosomal identity of mammalian-specific genomic DNA is to be determined.
  • This DNA is initially amplified using primers which are complementary to repetitive sequences of the DNA.
  • the amplificate is then hybridized against comparison DNA with a known identity, a competitor being added as much as possible in molar excess, which is complementary to said repetitive sequences and thus suppressing a possible hybridization between amplificate and comparison DNA via the repetitive sequences.
  • Such suppression of hybridization signals of ubiquitous repetitive DNA sequences was already known from the area of chromosomal in-situ suppression hybridization (cf. WO 90/05789).
  • competitive DNA is, for example, competitive PCR and similar methods in which the competitor DNA suppresses primer accumulation (cf. also US Pat. No. 5,627,054).
  • a central problem in the hybridization of nucleic acids on immobilized probes is the discrimination of sequences which have a very similar sequence (base sequence). Such sequence constellations occur in many diagnostic questions, for example in the detection of individual point mutations and especially in cases in which permutations can be present on one and the same base.
  • this problem is encountered, for example, in the genotype and subtype differentiation of the hepatitis C virus for interferon treatment, especially in the hypervariable region E1. Mutations in the UL97 gene of the DNA virus HCMV lead to resistance to the virostatic gancyclovir.
  • codon 595 in which the following permutation spectrum can occur: TTG (Leu, wild type (wt)) mutates to TCG (Ser) or TGG (Trp).
  • enterovirus strains such as polio viruses, coxackie viruses and echoviruses, between carcinogenic and non-carcinogenic papilloma virus strains and between the mycobacterium tuberculosis complex and atypical mycobacteria.
  • ATG (Met, wt) mutates to GTA (Val) or GTG (Val) or GTC (Val).
  • haemophilia A (factor VIII) and haemophilia B (factor IX) can be mentioned: GAT (codon 542; Asp, wt) mutates to CAT (His) or TAT (Tyr) or CCA (codon 55; Pro, wt) mutates to CGA (Arg), CAA (Gin) or CTA (Leu).
  • the detection of K-tas mutations which are very common in human tumors, also belongs to this problem area.
  • the mutations are, in particular, mutations in codons 12, 13 (exon 1) and 61 (exon 2).
  • K-ras encodes a protein with 189 amino acids, which is generally referred to as p21 R ⁇ S . It is a monomeric guanine nucleotide binding protein that is active in connection with GTP and inactive in connection with GDP and has its own GTPase activity. By mutations in codons 12, 13 and 61, p21 can be constitutively activated, whereby it loses its GTPase activity and thus remains permanently activated.
  • K-ras mutations represent excellent targets for diagnostic and therapeutic questions.
  • K-ras mutations are detected, for example, by means of direct DNA sequencing, allele-specific oligonucleotide hybridization or restriction digestion techniques.
  • Tissue samples from tumors and metastases tissue samples from tumors and metastases (native, frozen, paraffin blocks), cells from body fluids (blood, sputum, lavage, urine) with and without previous enrichment as well as stool samples are analyzed using highly sensitive techniques such as phage cloning, allele-specific PCR or repeated restriction digestion on K-ras mutations as early indicators of cancer or micro metastases.
  • Khanna et al. in Onkogene (1999) 18, 27-38 propose to couple a first gene-specific PCR with a multiplex LDR assay. In this way, all point mutations in the K-tas codons 12, 13 or 61 should be detectable even in the presence of an excess of wild-type allel.
  • the large number of primers used and their possible interactions with each other represent considerable disadvantages of this method.
  • the mutation-enriching PCR described above allows a preferential amplification of mutant alleles even from a gene pool consisting predominantly of wild-type alleles.
  • an amplification of the wild-type sequence is not completely suppressed, so that an amplificate is obtained even if the sample contains only wild-type alleles.
  • the mere fact that an amplificate is obtained or not is therefore not sufficient to differentiate between wild type and mutant.
  • different mutations are co-amplified. An effective way This technique therefore does not offer to distinguish between very similar base sequences, for example in the case of permutation on one and the same base.
  • the task was therefore to provide a powerful method for discriminating sequences with a very similar base sequence.
  • the present invention therefore relates to a method for detecting at least one nucleic acid with a certain base sequence in a sample by hybridization to at least one immobilized probe, which is characterized in that the hybridization is carried out in the presence of at least one nucleic acid oligomer with a base sequence which is similar is to the base sequence of the nucleic acid to be detected.
  • This process preferably includes the following process steps:
  • Step a) is expediently carried out under conditions under which intermolecular hybridization can take place.
  • the presence of the nucleic acid oligomer reduces the hybrid formation between the probe and nucleic acids with a base sequence that is similar to the specific base sequence (mismatch), as a result of which preferential hybrid formation between the probe and nucleic acids with a base sequence that corresponds to the specific one Base sequence corresponds, is achieved (Perfect Match).
  • nucleic acid denotes a sequence of naturally occurring nucleic acid bases, base analogs, base derivatives or mixed forms thereof. A distinction must be made between the actual bases on the one hand and the backbone that connects the bases and defines the sequence on the other.
  • the nucleic acids include above all DNA and RNA as well as nucleic acids derived from them, such as cDNA, second strand cDNA, RNA (cDNA). With regard to the sample, particular mention should be made of dsDNA, cDNA and mRNA.
  • the nucleic acids also include nucleic acid analogs, such as PNA (peptide nucleic acid), LNA (locked nucleic acid), PSNA (phosphothioate nucleic acid). In principle, these nucleic acid analogs can have the naturally occurring nucleic acid bases, which, however, are linked to one another in a different way than, for example, in DNA or RNA.
  • the nucleic acids also include nucleic acids which have nucleic acid derivatives, such as hypoxanthines, 2,6-diaminopurine and / or methylcytosine, and modified, in particular labeled, nucleic acids.
  • nucleic acid derivatives such as hypoxanthines, 2,6-diaminopurine and / or methylcytosine
  • modified, in particular labeled, nucleic acids can in principle also have the naturally occurring nucleic acid bases. Markers can be introduced on bases and / or backbones.
  • the linkages can correspond to DNA or RNA or the nucleic acid analogs.
  • the nucleic acids can be double-stranded (ds) or single-stranded (ss), linear, branched or circular.
  • the nucleic acid oligomer to be used according to the invention in the hybridization step competes with the nucleic acids present in the sample for binding to the immobilized probes.
  • usable oligomers have a base sequence which is similar to a base sequence of a nucleic acid to be detected, but which does not correspond to this.
  • base sequences are similar to one another if the base sequences differ in at least one base.
  • one base sequence can have a base A, T, G or C, while the other base sequence has a base which deviates therefrom at the corresponding position.
  • RNA bases A, U, G, C
  • base sequences can also be similar to one another in the sense of the invention if one base sequence is to be assigned to the nucleic acids, for example DNA or RNA, and the other base sequence is to be assigned to nucleic acid analogs, for example PNA, LNA or PSNA.
  • the bases are less important for the concept of similarity according to the invention than the backbone linking them.
  • nucleic acid derivatives provided that corresponding bases such as base and base derivative, for example hypoxanthine and adenine, 2,6-diaminopurine and guanine or methylcytosine and cytosine, behave with regard to their hybridization to a jointly complementary base, in the present case Example thymine and uracil, cytosine or guanine, competitive.
  • bases such as base and base derivative, for example hypoxanthine and adenine, 2,6-diaminopurine and guanine or methylcytosine and cytosine, behave with regard to their hybridization to a jointly complementary base, in the present case Example thymine and uracil, cytosine or guanine, competitive.
  • nucleic acids with base sequences which are similar to one another in the sense of the invention hybridize with a nucleic acid which comprises a base sequence which is complementary to one of the base sequences, on the one hand completely (perfect match) and on the other hand incompletely in the case of at least one mismatch.
  • the full hybridization corresponds to the specific hybridization in another aspect.
  • a base sequence hybridizes with a complementary base sequence, e.g. Target sequence with a corresponding probe, but not with a different (non-complementary) base sequence.
  • Base sequences of about 9 to 18, preferably consecutive, bases are considered to be similar in particular if they differ in 1, 2, or 3 bases and preferably in 1 base.
  • Base sequences with approximately 19 to 28, 29 to 40 and 41 to 50 bases are considered to be similar in particular if they are in 1 to 5 and preferably 1 or 2, 1 to 6 and preferably 2 to 4 or 1 to 10 and preferably Distinguish 3 to 6 bases.
  • similar base sequences comprise at least 9, preferably at least 12 and in particular at least 18 consecutive bases which differ in at most 3, in particular at most 2 and above all in a single base.
  • Special cases of similar base sequences therefore concern point mutations and in particular permutations. If, for example, one starts from a certain base sequence, similar base sequences result from the fact that one base of this base sequence is replaced by another replaced. For example, a DNA with a certain base sequence can result in three further DNAs with a similar base sequence. If another base of this base sequence is replaced, a further set of three DNAs with a similar base sequence can result for the same DNA.
  • a pool of three base sequences similar to the reference base sequence wild type
  • the nucleic acids to be detected and - regardless of this - the nucleic acid oligomers to be used as competitor can comprise similar base sequences as part (s) of an overall sequence.
  • a similar base sequence can be interrupted by a further base sequence, at least parts of this further base sequence being complementary to one another and, with appropriate duplex formation, the parts of the similar base sequence separated from one another in an arrangement which hybridize the entire similar base sequence allowed with a complementary consecutive base sequence.
  • This embodiment can e.g. when using the principle prescribed by "molecular beacons”.
  • the entire base sequence of a nucleic acid oligomer to be used as a competitor is similar to the base sequence of a nucleic acid to be detected. Accordingly, the base sequence of the competitor differs, in particular in a base, from a base sequence of the nucleic acid to be detected.
  • the nucleic acid oligomer to be used as a competitor and one or more immobilized probes have base sequences which are similar to one another.
  • this similarity relates to those probes which have a base sequence which is complementary to a base sequence of a nucleic acid to be detected (target probes).
  • single-stranded nucleic acids with a length of 2 to 500 bases can be used as competitors. It goes without saying that the single-stranded nucleic acids also include denatured double-stranded nucleic acids.
  • DNA, RNA and nucleic acid analogs and derivatives, such as - possibly modified - PNA, LNA and PSNA as well as modified DNA or RNA can be used.
  • preferred nucleic acid oligomers with immobilized probes according to the invention form hybrids, the thermal stability of which is comparatively greater in the case of complementarity (perfect match) and comparatively less in the case of non-complementarity (mismatch). The T m difference between match and mismatch is therefore more pronounced than with DNA / DNA or DNA / RNA hybrids, which leads to better base mismatch discrimination.
  • the nucleic acid oligomer is a PNA, LNA or PSNA oligomer.
  • the length of suitable nucleic acid oligomers can vary. It depends primarily on the length of the nucleic acids to be detected and the immobilized probes. 6-40mers and in particular 15-25mers are preferred.
  • the polarity of the nucleic acid oligomer can be in the sense or antisense direction in relation to the polarity of the immobilized probes.
  • the nucleic acid oligomer comprises a base sequence which corresponds to that from which the base sequence to be detected is to be distinguished (discriminated). For the area of mutation detection, this is preferably the base sequence of the wild type.
  • the method according to the invention is suitable for examining any samples of biological origin that can contain nucleic acids.
  • One embodiment relates to body samples of human and animal origin. If necessary, the nucleic acids present in the sample are prepared. This work-up generally corresponds to normal practice. Samples such as blood and blood components or isolates thereof, tissue, native, frozen, fixed, with and without dissection, cells from body fluids, eg sputum, lavage, punctate, exudate and urine, or stool, can advantageously be examined using the method according to the invention. Accordingly, it is an in vitro method, for example the method described in WO 99/10528. This method is part of the present disclosure by reference. Amplified or non-amplified nucleic acids can be used for the hybridization step.
  • amplification refers to the amplification of nucleic acids, i.e. the generation of many copies of certain nucleic acids.
  • the amplification is at least linear and preferably exponential.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LCR ligase chain reaction
  • NASBA nucleic acid sequence-based amplification
  • TMA Transcription-mediated amplification
  • an amplification is carried out before the hybridization in the presence of at least one nucleic acid oligomer with a base sequence which is similar to a specific base sequence of the nucleic acid to be detected.
  • This embodiment is based on the known principle of mutation-enriching PCR, namely a comparatively lower amplification of nucleic acids with a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid oligomer than of nucleic acids with a base sequence similar to the base sequence of the nucleic acid oligomer.
  • suitable nucleic acid oligomers and primers have common sequence segments which expediently cover the 3 'end of the primer.
  • nucleic acids with a base sequence similar to the base sequence of the nucleic acid oligomer can be enriched in favor of nucleic acids with a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid oligomer.
  • the amplification of nucleic acids with a base sequence complementary to the base sequence of the nucleic acid oligomer - depending on the concentration of the nucleic acids in the sample and the amplification conditions used - can essentially be completely suppressed, it can but also sufficient amplificates are generated, which can then be detected in the subsequent hybridization step.
  • nucleic acid oligomer to be used in the mutation-enriching PCR the above statements apply correspondingly to the nucleic acid oligomer used in the hybridization step.
  • the nucleic acid oligomer is therefore also used for the discriminatory amplification of at least one nucleic acid to be detected in the presence of a nucleic acid with a similar base sequence by PCR or similar methods, and the amplification product is then hybridized in the presence of the same nucleic acid oligomer on immobilized probes.
  • This is particularly advantageous if, despite mutation-enriching PCR, an amplificate with wild-type sequences is obtained, because in this case the hybrid hybridization according to the invention can be used to discriminate between mutated sequences and wild-type sequences which may be present in the amplificate.
  • the amplification is not preceded by the hybridization. This applies in particular to the detection of mRNA or nucleic acids derived therefrom.
  • the co-amplification of at least one control sequence is suitable as a general and / or specific PCR control, e.g. to rule out non-specific inhibition for cases in which no amplificate is obtained.
  • the HLA-DRA1 sequence locus: HLA00663
  • HKS human-specific control sequence
  • the probes are usually single-stranded oligomers. DNA, RNA and nucleic acid analogs and derivatives, such as - possibly modified - PNA, LNA and PSNA as well as modified DNA or RNA can be used.
  • the minimum length of the probes depends on the complexity of the sample, in particular the number of bases of nucleic acids to be detected, but also on the type of nucleic acid used as the probe and the thermodynamic stability that can be achieved between the sample and the probe.
  • probes usually have a length of 8 to 60, preferably 13 to 25 and in particular 13 bases for DNA, 8 to 60, preferably 13 to 25 and in particular 13 bases for DNA-LNA hybrids, 8 to 60, preferably from 13 to 25 and in particular from 13 bases for PSNA, from 6 to 30, preferably from 8 to 18 and in particular from 9 bases for LNA, and from 6 to 18, preferably from 8 to 18 and in particular from 9 bases for PNA on.
  • nucleic acids to be detected e.g. Amplificates, in particular PCR amplificates, viruses, plasmids and microorganisms
  • Amplificates in particular PCR amplificates, viruses, plasmids and microorganisms
  • With relatively high complexity of the nucleic acids to be detected e.g. Non-amplified RNA, total amplified RNA via cDNA, non-amplified total genomic DNA and amplified total genomic DNA, are longer probes, for synthetic probes in the range of 16-60 meres, are appropriate or the probes consist of PCR products, cDNA, plasmids or DNA, e.g. from lysed bacteria, which can also have an additional number of bases.
  • a target probe generally has a base sequence which is essentially complementary to a region of a nucleic acid to be detected or, according to another aspect, can hybridize specifically with the region. Such a region corresponds at least in part to a specific target sequence.
  • a control probe can in particular have the function of a normalization, mismatch, housekeeping, sample preparation, hybridization or amplification control and accordingly have a base sequence that is complementary to a base sequence of a reference nucleic acid, a nucleic acid to be detected with a similar base sequence, a constitutive expressed nucleic acid, for example a from ß 2 - microglobulin, beta-actin, GAPDH or transferrin receptor gene derived nucleic acid, a species-specific nucleic acid or an amplicon.
  • the method according to the invention is suitable for the specific detection of a nucleic acid sequence with a certain base sequence and thus for the detection of nucleic acids which have one or possibly several such base sequences.
  • a plurality of nucleic acid sequences with specific base sequences that may be similar to one another can also be specific at the same time be detected. Specifically, in this context means in particular sufficient discrimination against nucleic acids with a similar base sequence.
  • the efficiency of the method is particularly evident when, in addition to the nucleic acids to be detected, the sample also contains at least one further nucleic acid whose base sequence and the base sequence (s) to be detected are similar. Accordingly, the present method is particularly advantageous when the sample can contain at least two nucleic acids with similar base sequences.
  • a point mutation can be specifically detected by providing at least one test probe with a base sequence that is complementary to a base sequence comprising the point mutation, and another test probe with a base sequence that is complementary to the corresponding base sequence of the wild type.
  • further test probes with a base sequence that is complementary to a base sequence comprising the respective point mutation can be provided.
  • the nucleic acid competitor advantageously has a base sequence that is complementary to a base sequence of one of the probes, preferably a reference base sequence that can be selected for the similarity, in particular a base sequence of the wild type. It can also be expedient to carry out the method several times with different competitors using the same probes on several sample aliquots. Another possibility is to use several different competitors at the same time.
  • the probes are coupled to a carrier, for example via covalent, adsorptive or via physical / chemical interactions between the probe and the surface. Suitable methods for achieving a suitable coupling are known to the person skilled in the art.
  • the following materials can be used as carrier material: glass (standard glass, pyrex glass, quartz glass), plastics, preferably of high purity or less Inherent fluorescence (such as polyolefins, e.g. PE (polyethylene), PP (polypropylene), polymethylpentene, polystyrene, PMMA (poly (methyl methacrylate)), polycarbonate, Teflon), metals (such as gold, chromium, copper, titanium, silicon), oxidic materials or Coatings (ceramics, aluminum-doped zinc oxide (TCO), silica, aluminum oxide).
  • Inherent fluorescence such as polyolefins, e.g. PE (polyethylene), PP (polypropylene), polymethylpentene, polystyrene, PMMA (poly (methyl methacrylate)), polycarbonate, Teflon
  • metals such as gold, chromium, copper, titanium, silicon
  • oxidic materials or Coatings cer
  • the carrier materials can be in the form of membranes (such as polysaccharides, polycarbonate, Nafion, Langmuir-Blodget membranes), three-dimensional structures (such as gels, for example polyacrylamide, agarose, ceramics) or molded parts made of the above materials, such as foils and dipsticks.
  • membranes such as polysaccharides, polycarbonate, Nafion, Langmuir-Blodget membranes
  • three-dimensional structures such as gels, for example polyacrylamide, agarose, ceramics
  • molded parts made of the above materials, such as foils and dipsticks.
  • the probes are applied to the surface by pipetting, dispensing, printing, stamping or photolithographic techniques, in particular in the case of the likewise possible in-situ synthesis of the probes on the surface. Different probes are preferably applied to the surface in a two-dimensional pattern. Each probe can then be assigned a unique position on the surface.
  • the hybridization components are allowed to act on one another under conditions which permit duplex formation between the nucleic acid to be detected and the probe complementary thereto.
  • the immobilized probe is brought into contact with a hybridization mixture which comprises the sample or a part derived therefrom, at least one nucleic acid oligomer and, if appropriate, other customary additives.
  • parts of the mixture can initially be brought into contact with the probe separately from one another.
  • the hybridization conditions are expediently chosen so that the probe and the complementary target can form stable hybrids.
  • the appropriate single strands can be generated if necessary by denaturing double strands.
  • conditions of relatively low stringency are initially selected, for example temperatures of approximately 20-50 ° C.
  • the proof in the sense of the invention includes the determination of whether a specific target, i.e. a particular sequence of nucleic acid bases present or not in a sample (presence or absence). The determination can be made qualitatively or quantitatively.
  • the detection requires a quantification of those nucleic acids that hybridize to an immobilized probe.
  • the quantification can be absolute or relative.
  • Suitable detection systems are well known to the person skilled in the art.
  • a widely used possibility is the introduction of markings, e.g. radioactive, colorimetric, fluorescent or luminescent type. These are generally introduced into the nucleic acids present in the sample and in particular into the nucleic acids to be detected with a certain base sequence or nucleic acids with a similar base sequence, e.g. in the course of an amplification preceding the hybridization or in another manner known per se.
  • nucleic acids to be detected are labeled with a certain base sequence or nucleic acids with a similar base sequence, it is expedient not to label the nucleic acid oligomer to be used as a competitor or at least not to use any label which interferes with it.
  • the discrimination between perfect match and mismatch of similar base sequences after hybridization on immobilized probes is generally more than 3: 1.
  • the sensitivity of the method according to the invention when using a mutation-enriching amplification and subsequent competitive hybridization on immobilized probes is generally more than 1:10, preferably more than 1: 100.
  • sample contains double-stranded nucleic acids.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid oligomer as a competitor in hybridization to at least one immobilized probe to discriminate between perfect match and mismatch. This enables the specific detection of a nucleic acid with a certain base sequence forming the perfect match.
  • Use in hybridization to at least two immobilized probes is preferred, one probe being able to form the perfect match and the other the mismatch.
  • the two probes have base sequences that are similar to one another.
  • the present invention furthermore relates to nucleic acid competitors for discriminating perfect match and mismatch in the hybridization of nucleic acids to at least one immobilized probe. Specific configurations of these competitors can be found in the explanations of the method and use.
  • the method according to the invention is suitable for the detection of certain genetic information of any organism or of parts thereof.
  • the method offers advantages in differentiating between similar information.
  • the information can be genomic. However, you can also express genes, e.g. at the mRNA level.
  • the method focuses on the detection of mutations in cells from body fluids or tissues of animal or human origin. For this purpose cells can be obtained in a manner known per se, e.g. are taken from the individual to be examined in the form of a cell-containing sample, enriched if necessary and examined using the method according to the invention.
  • a special method for isolating disseminated cancer cells is described in WO 00/06702. This method is part of the present disclosure by reference.
  • Another particular object of the present invention is therefore the use of a method described above for the identification and characterization of mutations, especially in cells, especially in cancer cells.
  • This application ranges from cancer diagnosis and monitoring to the choice of therapy through targeted drug targeting after the detection of certain genetic characteristics.
  • Another application relates to the detection of viruses or bacteria, for example the organisms mentioned at the beginning, in particular with differentiation of different genotypes, e.g. different strains of one species.
  • a particular application of the method according to the invention relates to the detection of mutations in codons 12, 13 and 61 of the human K-ras gene. This affects everyone any of the theoretically possible mutations in these codons. Accordingly, this embodiment is directed to the detection of at least one nucleic acid with a base sequence that is similar to a base sequence of the human K-ras gene.
  • such base sequences include as codon 12 GAT, GTT, GCT, TGT, AGT, CGT, CTT or ATT instead of GGT and / or as codon 13 TGC or GAC instead of GGC and / or as codon 61 CAT, CAC, CTA, CGA or GAA instead of CAA, the remaining bases of these base sequences corresponding to those of the human K-ras gene.
  • At least one nucleic acid oligomer is used which has a base sequence comprising codons 12 and 13.
  • nucleic acid oligomers with a base sequence that corresponds to that of the wild type represents a further special aspect.
  • the mutation-enriching PCR is preceded by the hybridization.
  • a 15mer PNA oligomer (wt sequence, polarity antisense) can be designed so that it overlaps codons 12 and 13 and 3 bases protrude into the binding site of the antisense PCR primer.
  • the PNA oligomer is complementary to the wild-type sequence (polarity: antisense). By binding to the sense wild-type sequence, it reduces the amplification of the wild-type during the PCR. Mutated sequences are preferentially amplified - even in the presence of an excess of wild-type sequence.
  • a co-amplification of HLA-DRA1 can advantageously be carried out in a multiplex approach.
  • This serves as proof of the function of the PCR, since in the absence of a mutation there is no or only a small amount of PCR product, and is particularly advantageous for the detection of K-ras mutations in stool samples, since a high concentration of animal nucleic acids may also be extracted here the sequence of the HLA-DRA1 of human DNA selected for co-amplification does not occur in the DNA of animal origin.
  • both the amplification and the hybridization can be carried out in the presence of the same nucleic acid oligomer. In this case, this nucleic acid oligomer can remain in the amplification mixture.
  • a nucleic acid oligomer preferably used according to the invention has the sequence SEQ ID NO: 1.
  • a preferred probe arrangement is that i1) at least one probe has a base sequence that is complementary to a base sequence that is similar to that of the human K-ras gene; i2) at least one further probe has a base sequence which is complementary to a base sequence comprising codons 12 and 13 which corresponds to the base sequence of the human K-ras gene; and i3) optionally further base sequences which serve for the amplification and / or species control.
  • the probes addressed under i1) are preferably selected from the oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 8-17.
  • a probe addressed under i2) is preferably an oligonucleotide with the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the probes addressed under i3) are preferably selected from the oligonucleotides with the sequences SEQ ID NO: 18-20.
  • the probes are preferably immobilized on the surface of a planar support.
  • biochips on which the probes are arranged.
  • a special biochip has the probes with the sequences SEQ ID NO: 7-20, preferably two field elements on the chip each being equipped with a probe type.
  • Carcinomas thyroid carcinomas, Ph-negative CML, colorectal carcinomas, multiple myelomas, myelodysplastic syndrome (MDS), myeloproliferative syndrome (MPS), acute myeloid leukemia and lung adenocarcinoma. If necessary, fixed and / or dissected tissues can be examined, or cells from body fluids with and without previous enrichment and especially stool can be screened for colorectal cancer.
  • K-ras mutations can also be used for drug targeting for therapeutic applications, for example the administration of monoclonal antibodies against mutated p21, for gene therapy or antisense therapy.
  • kits with means for performing a method described above.
  • Such kits preferably contain i) at least one immobilized probe with a base sequence which is complementary to a specific base sequence of a nucleic acid to be detected; ii) at least one nucleic acid oligomer with a base sequence which is similar to the determined base sequence of a nucleic acid to be detected; and iii) if necessary, further means for carrying out the method, e.g. to be selected from amplifiers, buffers, internal standards and controls.
  • kits according to the invention result from the explanations of the method itself.
  • FIG. 2 shows a partial sequence of the human K-ras gene (wild type) comprising codon 12/13 as well as the primers RasUSI and RasDS135 used for the mutation-enriching PCR and the nucleic acid oligomer (competitor) PNA-KRas 123. Primers underlined, the oligomer sequence is in italics and codons 12 and 13 are in bold. The length of the PCR product is 157 bp;
  • FIG. 3 shows the selective amplification of the mutated K-ras sequence (GTT, Val 12) (A) and the influence of the number of cycles on the amount of amplified wild-type sequence (B) when PNA-KRAS123 is added to the PCR (M: marker; WT: Wild type; courage: mutant);
  • Figure 4 shows the sequencing of the PCR product after mutation-rich PCR with the addition of PNA-KRAS123 (A) and the sequencing of a wild-type control in (B);
  • FIG. 5 shows the co-amplification of the HLA-DRA1 locus in wild type and mutant cell lines (M: marker; WT: wild type; mut: mutant)
  • FIG. 6 discrimination rates in the hybridization of a synthetic 24-mer sample (KRST-Ile12) comprising the Ile 12 mutation to different probes (with information on the complementarity) (A) without and (B) when the competitor was added to the hybridization buffer;
  • FIG. 8 normalized discrimination in the case of hybridization of defined PCR products (complementarity according to the information) on immobilized probes (complementarity according to the information) with the addition of a competitor.
  • PCR conditions per batch 100 ng DNA, 1.5 mM MgCl 2 ; 100 ⁇ M dNTPs; 250 nM primer; 1 U Taq polymerase (Qiagen; HotStar); 7.5% glycerol; possibly 2.8 ⁇ M PNA; in 50 ul 1 x PCR buffer.
  • Thermocycling 1 x 95 ° C 15 min; 35-45 x (94 ° C 60 s, 70 ° C 50 s, 58 ° C 50 s, 72 ° C 60 s); 1 x 72 ° C 7 min.
  • the mutation-enriching effect is shown in FIG. 3A. If 2.8 ⁇ M PNA oligomer is added to a PCR approach which contains only the K-ras wild-type sequence (DNA from the Colo320 cell line), the amplification of the wild-type sequence is suppressed. DNA with a mutated K-ras sequence (from the cell line SW480, codon 12 GGT; valine 12) is also amplified in the presence of the PNA oligo. By increasing the number of cycles from 35 to 45, a ratio of mutated DNA to wild-type DNA of 1: 1000 and more can be amplified, which could be demonstrated by sequencing the amplificate (FIG. 4). However, the amount of amplified wild-type sequence increases under these conditions (FIG. 3B).
  • HLA-DRA1 a fragment of HLA-DRA1 is co-amplified as a human-specific control sequence (HSKS).
  • the primers DRA20Uo and DRA200Lo used for this are shown in Table 1.
  • the polarities of the PCR primers are sense and antisense, the antisense primer being labeled at 5 'with Cy5.
  • the polarity of the PNA oligomer is antisense.
  • the result of the co-amplification is shown in FIG. 5.
  • the probes consist of a photoactive group (anthraquinone), a hexaethylene glycol spacer and a single-stranded 13-mer DNA oligonucleotide coupled via 5 ' to the spacer.
  • a photoactive group anthraquinone
  • a hexaethylene glycol spacer 1.5 nL of the dissolved probes (concentration 10 ⁇ M) were spotted in duplicates on a plastic surface (support). After the spots had dried on, the supports were irradiated with UV light for 1 min, as a result of which the photoreactive anthraquinone group of the probes covalently bonds with the plastic material. The slides were washed to remove excess probes. d) Competitive hybridization
  • Two K-ras biochips from Example c) were hybridized with a synthetic, Cy5-labeled 24mer nucleic acid as a sample (polarity antisense; base sequence see Table 1) with and without the addition of 2.4 ⁇ M PNA oligomer (PNA-KRAS123) ,
  • the sample (SEQ ID NO: 6) has a base sequence which is complementary to the base sequence of the immobilized probe SEQ ID NO: 15 (Ile12 mutation).
  • the sample concentration was adjusted to 5 nM in 6 x SSPE. 20 ⁇ l of sample with and without PNA were hybridized at 37 ° C. for 1 h, then the excess sample was rinsed briefly with 6 ⁇ SSPE and the fluorescence was measured. The results are shown in FIG. 6: A: No PNA in the hybridization buffer. B: Additional 2.4 ⁇ M PNA in the hybridization buffer. The addition of PNA with a base sequence complementary to the wild type significantly improves the specificity of the hybridization. The discrimination rates achieved are summarized in Table 3.
  • K-ras amplificates of DNA samples with known mutations were produced under the mutation-enriching PCR conditions mentioned in Example 1.
  • the amplificates with the individual mutations were hybridized in the presence of 2.4 ⁇ M PNA oligomer (PNA-KRAS123).
  • a match / mismatch discrimination of> 10: 1 could be achieved for all amplificates with respect to the respective mutation.
  • the exception is the mutation Leu 12, in which a quotient of 5.2 for the mutation III was found.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis wenigstens einer Nukleinsäure (Target) mit bestimmter Basenabfolge (Targetsequenz) in einer Probe durch Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonde, die Verwendung dieses Verfahrens und Analysekits zur Durchführung dieses Verfahrens. Wesentlich ist die Verwendung eines Nukleinsäure-Oligomers als Kompetitor bei der Hybridisierung zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch.

Description

Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren mittels Hybridisierung, Verwendung dieses Verfahrens und entsprechender Analysekit sowie Nukleinsäure-Oligomere und deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis wenigstens einer Nukleinsäure (Target) mit bestimmter Basenabfolge (Targetsequenz) in einer Probe durch Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonde, die Verwendung dieses Verfahrens, Analysekits zur Durchführung dieses Verfahrens sowie Nukleinsäure- Oligomere und deren Verwendung zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch.
Der Nachweis bestimmter Nukleinsäuren mit spezifischen Hybridisierungssonden ist hinlänglich bekannt. Neben dem klassischen Southem-Blot haben sich zahlreiche Techniken herausgebildet, die eine Vielfalt von Hybridisierungsformaten verwenden.
In US-A-5,869,237 wird ein Verfahren beschrieben, mit dem die chromosomale Identität von Säuger-spezifischer, genomischer DNA bestimmt werden soll. Die Amplifikation dieser DNA gelingt zunächst mit Primern, die zu repetitiven Sequenzen der DNA komplementär sind. Das Amplifikat wird dann gegen Vergleichs-DNA mit bekannter Identität hybridisiert, wobei ein Kompetitor möglichst in molarem Überschuss zugesetzt wird, der zu besagten repetitiven Sequenzen komplementär ist und damit eine mögliche Hybridisierung zwischen Amplifikat und Vergleichs-DNA über die repetitiven Sequenzen unterdrückt. Eine derartige Suppression von Hybridisierungssignalen ubiquitärer repetitiver DNA-Sequenzen war im übrigen bereits aus dem Bereich der chromosomalen in-situ Suppressionshybridisierung bekannt gewesen (vgl. WO 90/05789).
Weitere Anwendungsmöglichkeiten kompetitierender DNA sind beispielsweise die kompetitive PCR und ähnliche Verfahren, bei denen die Kompetitor-DNA die Primerlanlagerung unterdrückt (vgl. auch US-A-5,627,054).
Ein zentrales Problem bei der Hybridisierung von Nukleinsäuren an immobilisierten Sonden ist die Diskriminierung von Sequenzen, die eine sehr ähnliche Sequenz (Basenabfolge) besitzen. Derartige Sequenzkonstellationen treten bei vielen diagnostischen Fragestellungen auf, z.B. beim Nachweis einzelner Punktmutationen und vor allem in Fällen, in denen Permutationen an ein und derselben Base vorliegen können. Im Bereich der RNA-Viren begegnet man diesem Problem beispielsweise bei der Geno- und Subtypdifferenzierung des Hepatitis C- Virus für die Interferonbehandlung, vor allem in der Hypervariablen Region E1. Mutationen im UL97-Gen des DNA-Virus HCMV führen zur Resistenz gegenüber dem Virostatikum Gancyclovir. Als Beispiel sei Codon 595 genannt, bei dem folgendes Permutationsspektrum auftreten kann: TTG (Leu, Wildtyp (wt)) mutiert zu TCG (Ser) oder TGG (Trp). Auch bei der Differenzierung zwischen verschiedenen Enterovirusstämmen, wie Polio-Viren, Coxackie-Viren und Echoviren, zwischen kanzerogenen und nichtkanzerogenen Papillomavirusstämmen und zwischen dem Mycobakterium tuberkulosis-Komplex und atypischen Mykobakterien trifft man auf diese Problematik. Ein weiteres Beispiel sind Mutationen in Codon 184 des Retrovirus HIV, die zu einer Resistenz gegenüber dem Reverse-Transkriptase-Inhibitor Lamivudine führen: ATG (Met, wt) mutiert zu GTA (Val) oder GTG (Val) oder GTC (Val). Im humanen Bereich können beispielsweise Hämophilie A (Faktor VIII) und Hämophilie B (Faktor IX) angeführt werden: GAT (Codon 542; Asp, wt) mutiert zu CAT (His) oder TAT (Tyr) bzw. CCA (Codon 55; Pro, wt) mutiert zu CGA (Arg), CAA (Gin) oder CTA (Leu).
Auch der Nachweis von K-tas-Mutationen, die in humanen Tumoren sehr häufig nachzuweisen sind, gehört zu diesem Problemkreis. Bei den Mutationen handelt es sich insbesondere um Mutationen in den Codons 12, 13 (Exon 1) und 61 (Exon 2).
K-ras kodiert wie die beiden anderen ras-Gene (H-ras, N-ras) ein Protein mit 189 Aminosäuren, das allgemein als p21RΛS bezeichnet wird. Es ist ein monomeres guaninnukleotidbindendes Protein, das in Verbindung mit GTP aktiv und in Verbindung mit GDP inaktiv ist und eine eigene GTPase-Aktivität besitzt. Durch Mutationen in den Codonen 12, 13 und 61 kann p21 konstitutiv aktiviert werden, wobei es seine GTPase- Aktivität verliert und dadurch permanent aktiviert bleibt.
K-ras-Mutationen stellen exzellente Targets für diagnostische und therapeutische Fragestellungen dar. In Primärtumoren werden K-ras-Mutationen beispielsweise mittels direkter DNA-Sequenzierung, allelspezifischer Oligonukleotid-Hybridisierung oder Restriktionsverdau-Techniken nachgewiesen. Gewebeproben von Tumoren und Metastasen (nativ, gefroren, Paraffinblöcke), Zellen aus Körperflüssigkeiten (Blut, Sputum, Lavagen, Urin) mit und ohne vorhergehende Anreicherung sowie Stuhlproben werden mit hochsensitiven Techniken, wie Phagenklonierung, allelspezifischer PCR oder wiederholtem Restriktionsverdau auf K-ras-Mutationen als Frühindikatoren von Krebserkrankungen oder Mikrometastasen gescreent.
Allerdings ist die Leistungsfähigkeit und damit die Anwendung dieser Techniken in Fällen wie dem Nachweis von K-tas-Mutationen begrenzt. So mangelt es an Sensitivität (DNA- Sequenzierung) oder die Techniken sind nicht in der Lage, das gesamte Spektrum an möglichen Mutationen, beispielsweise Permutationen, nachzuweisen. Darüber hinaus neigen allelspezifische Amplifikationstechniken zu falschpositiven Signalen.
Khanna et al. in Onkogene (1999) 18, 27-38 schlagen vor, eine erste genspezifische PCR mit einem Multiplex-LDR-Assay zu koppeln. Auf diese Art sollen sich sämtliche Punktmutationen in den K-tas-Codons 12, 13 oder 61 selbst in Gegenwart eines Überschusses an Wildtyp-AIIel nachweisen lassen. Die Vielzahl der verwendeten Primer und deren mögliche Wechselwirkungen miteinander stellen erhebliche Nachteile dieses Verfahrens dar.
Einen anderen Weg beschreitet die sogenannte mutationsanreichernde PCR, deren Design eine Amplifikation der Wildtypsequenz unterdrückt. Das grundlegende Prinzip ist in Orum et al., Nucleic Acids Research (1993) 21, 5332-5336 beschrieben. Ober die erfolgreiche Anwendung dieser auch als PNA-ver itteltes PCR-Clamping bezeichneten Methode auf den Nachweis aller 12 möglichen K-ras-Mutationen in den Codons 12 und 13 berichten Thiede et al., Nucleic Acids Research (1996) 24, 983-984. Hier wird ein die Codons 12 und 13 überspannendes, zum Wildtyp komplementäres 15mer PNA- Oligonukleotid verwendet, das drei Basen in die Bindungsstelle des Antisense-PCR- Primers hineinragt.
So gestattet die vorstehend beschriebene mutationsanreichernde PCR eine präferentielle Amplifikation mutanter Allele selbst aus einem zum überwiegenden Teil aus Wildtyp- Allelen bestehenden Genpool. Allerdings wird in vielen Fällen eine Amplifikation der Wildtyp-Sequenz nicht vollständig unterdrückt, so daß man auch dann ein Amplifikat erhält, wenn die Probe an sich nur Wildtyp-Allele enthält. Allein die Feststellung, daß ein Amplifikat erhalten wird oder nicht, reicht daher zur sicheren Differenzierung von Wildtyp und Mutante nicht aus. Darüber hinaus werden, wie im oben beschriebenen Fall der K- ras-Sequenz, unterschiedliche Mutationen co-amplifiziert. Eine effektive Möglichkeit, zwischen sehr ähnlichen Basenabfolgen z.B. bei Permutation an ein und derselben Base, unterscheiden zu können, bietet diese Technik daher nicht.
Aufgabe war es daher, ein leistungsstarkes Verfahren zur Diskriminierung von Sequenzen mit einer sehr ähnlichen Basenabfolge bereitzustellen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch Hybridisierung an immobilisierten Sonden unter Zugabe eines Kompetitors.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis wenigstens einer Nukleinsäure mit bestimmter Basenabfolge in einer Probe durch Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonde, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Hybridisierung durchgeführt wird in Gegenwart wenigstens eines Nukleinsäure- Oligomers mit einer Basenabfolge, die ähnlich ist zu der Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinsäure.
Dieses Verfahren beinhaltet vorzugsweise folgende Verfahrensschritte:
a) man lässt aufeinander einwirken: i) eine Nυkleinsäure-haltige Probe oder einen davon abgeleiteten Teil, ii) wenigstens eine immobilisierte Sonde mit einer Basenabfolge, die spezifisch mit der i bestimmten Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinäsure zu hybridisieren vermag; und iii) wenigstens ein Nukleinsäure-Oligomer mit einer Basenabfolge, die ähnlich ist zu der bestimmten Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinsäure, b) man detektiert Hybridisierungssignale und stellt damit die An- oder Abwesenheit von Nukleinsäuren mit der bestimmten Basenabfolge fest.
Schritt a) wird zweckmäßigerweise unter Bedingungen durchgeführt, unter denen eine intermolekulare Hybridisierung stattfinden kann. Erfindungsgemäß ist dabei durch die Anwesenheit des Nukleinsäure-Oligomers die Hybridbildung zwischen der Sonde und Nukleinsäuren mit einer Basenabfolge, die zu der bestimmten Basenabfolge ähnlich ist, verringert (Mismatch), wodurch eine präferentielle Hybridbildung zwischen der Sonde und Nukleinsäuren mit einer Basenabfolge, die der bestimmten Basenabfolge entspricht, erreicht wird (Perfect Match). Der Begriff Nukleinsäure bezeichnet erfindungsgemäß eine Abfolge von natürlich vorkommenden Nukleinsäurebasen, Basenanaloga, Basenderivaten oder Mischformen davon. Es ist zu unterscheiden zwischen den eigentlichen Basen einerseits und dem die Basen miteinander verknüpfenden und die Abfolge festlegenden Rückgrat andererseits. Zu den Nukleinsäuren gehören vor allem DNA und RNA sowie davon abgeleitete Nukleinsäuren, wie cDNA, second Strand cDNA, RNA(cDNA). In Bezug auf die Probe sind insbesondere zu nennen dsDNA, cDNA und mRNA. Zu den Nukleinsäuren gehören auch Nukleinsäure-Analoga, wie PNA (Peptide Nucleic Acid), LNA (Locked Nucleic Acid), PSNA (Phosphothioate Nucleic Acid). Diese Nukleinsäure-Analoga können prinzipiell die natürlich vorkommenden Nukleinsäurebasen aufweisen, die allerdings in anderer Art und Weise miteinander verknüpft sind als beispielsweise in DNA oder RNA. Zu den Nukleinsäuren gehören auch Nukleinsäuren, die Nukleinsäure-Derivate, wie Hypoxanthine, 2,6-Diaminopurin und/oder Methylcytosin, aufweisen, und modifizierte, insbesondere markierte Nukleinsäuren. Diese Nukleinsäure-Derivate können neben Basenderivaten prinzipiell auch die natürlich vorkommenden Nukleinsäurebasen aufweisen. Markierungen können an Basen und/oder Rückgrat eingeführt sein. Die Verknüpfungen können DNA bzw. RNA oder den Nukleinsäure-Analoga entsprechen. Die Nukleinsäuren können doppelstängig (ds) oder einzelstängig (ss), linear, verzweigt oder circulär sein.
Das erfindungsgemäß im Hybridisierungsschritt zu verwendende Nukleinsäure-Oligomer kompetitiert mit den in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren um die Bindung an die immobilisierten Sonden. Dazu weisen brauchbare Oligomere (Nukleinsäure-Kompetitoren) eine Basenabfolge auf, die zu einer Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure ähnlich ist, dieser jedoch nicht entspricht. Basenabfolgen sind im Sinne der Erfindung zueinander ähnlich, wenn sich die Basenabfolgen in wenigstens einer Base unterscheiden. Insbesondere kann die eine Basenabfolge eine Base A, T, G oder C aufweisen, während die andere Basenabfolge an entsprechender Position eine davon abweichende Base aufweist. Entsprechendes gilt je nach Art der nachzuweisenden Nukleinsäure bzw. des zu verwendenden Nukleinsäure-Oligomers für RNA-Basen (A, U, G, C) und Basenderivate.
Demnach können Basenabfolgen auch dann im Sinne der Erfindung zueinander ähnlich sein, wenn die eine Basenabfolge den Nukleinsäuren, z.B. DNA oder RNA, und die andere Basenabfolge Nukleinsäure-Analoga, z.B. PNA, LNA oder PSNA, zuzuordnen ist. Wesentlich für den erfindungsgemäßen Begriff der Ähnlichkeit sind die Basen, weniger das sie verknüpfnende Rückgrat. Entsprechendes gilt auch für Nukleinsäure-Derivate, vorausgesetzt sich entsprechende Basen wie Base und Basenderivat, z.B. Hypoxanthin und Adenin, 2,6-Diaminopurin und Guanin bzw. Methylcytosin und Cytosin, verhalten sich im Hinblick auf ihre Hybridisierung an eine gemeinsam komplementäre Base, im vorliegenden Beispiel Thymin und Uracil, Cytosin bzw. Guanin, kompetitiv.
Gemäß einem weiteren Aspekt hybridisieren Nukleinsäuren mit Basenabfolgen, die im Sinne der Erfindung zueinander ähnlich sind, mit einer Nukleinsäure, die eine zu einer der Basenabfolgen komplementäre Basenabfolge umfaßt, einerseits vollständig (Perfect match), andererseits unvollständig bei wenigstens einer Fehlpaarung (Mismatch).
Der vollständigen Hybridisierung entspricht unter einem anderen Aspekt die spezifische Hybridisierung. Hierunter versteht man Hybridisierung unter stringenten Bedingungen. Unter stringenten Bedingungen hybridisiert eine Basenabfolge mit einer dazu komplementären Basenabfolge, z.B. Targetsequenz mit entsprechender Sonde, nicht aber mit einer anderen (nicht komplementären) Basenabfolge.
Mit zunehmender Länge der Basenabfolge erhöht sich die mögliche Anzahl an Basen, in denen sich im Sinne der Erfindung ähnliche Basenabfolgen unterscheiden können. Z.B. gelten Basenabfolgen von etwa 9 bis 18, vorzugsweise konsekutiven, Basen insbesondere dann als ähnlich, wenn sie sich in 1, 2, oder 3 Basen und vorzugsweise in 1 Base unterscheiden. Basenabfolgen mit etwa 19 bis 28, 29 bis 40 und 41 bis 50 Basen gelten insbesondere dann als ähnlich, wenn sie sich in 1 bis 5 und vorzugsweise 1 oder 2, 1 bis 6 und vorzugsweise 2 bis 4, bzw. 1 bis 10 und vorzugsweise 3 bis 6 Basen unterscheiden. Für Basenabfolgen mit mehr als 50, vorzugsweise konsekutiven, Basen ergibt sich eine Ähnlichkeit insbesondere dann, wenn die Anzahl unterschiedlicher Basen in einem Bereich von etwa 10 bis 25%, bezogen auf die Gesamtzahl der Basen, liegt.
Einem weiteren Aspekt zufolge umfassen im Sinne der Erfindung ähnliche Basenabfolgen wenigstens 9, vorzugsweise wenigstens 12 und insbesondere wenigstens 18 konsekutive Basen, die sich in höchstens 3, insbesondere höchstens 2 und vor allem in einer einzigen Base unterscheiden. Besondere Fälle ähnlicher Basenabfolgen betreffen daher Punktmutationen und insbesondere Permutationen. Geht man beispielsweise von einer bestimmten Basenabfolge aus, so ergeben sich dazu ähnliche Basenabfolgen insbesondere dadurch, daß man eine Base dieser Basenabfolge durch eine andere ersetzt. So können sich z.B. zu einer DNA mit bestimmter Basenabfolge drei weitere DNAs mit ähnlicher Basenabfolge ergeben. Ersetzt man eine andere Base dieser Basenabfolge, so kann sich zu derselben DNA ein weiterer Satz von drei DNAs mit ähnlicher Basenabfolge ergeben. Entsprechend läßt sich beispielsweise für den Fall einer jeden Permutation jeweils ein Pool aus drei zur Bezugsbasenabfolge (Wildtyp) ähnlichen Basenabfolgen angeben.
Die nachzuweisenden Nukleinsäuren und - unabhängig davon - die als Kompetitor zu verwendenden Nukleinsäure-Oligomere können ähnliche Basenabfolgen als Teil(e) einer Gesamt-Sequenz umfassen. In speziellen Fällen kann eine ähnliche Basenabfolge durch eine weitere Basenabfolge unterbrochen sein, wobei zumindest Teile dieser weiteren Basenabfolge zueinander komplementär sind und bei entsprechender Duplex-Bildung die durch sie voneinander getrennten Teile der ähnlichen Basenabfolge in eine Anordnung bringen, welche die Hybridisierung der gesamten ähnlichen Basenabfolge mit einer dazu komplementären konsekutiven Basenabfolge erlaubt. Diese Ausführungsform kann sich z.B. bei der Verwendung des durch „Molecular Beacons" vorgegebenen Prinzips ergeben.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die gesamte Basenabfolge eines als Kompetitor zu verwendenden Nukleinsäure-Oligomers ähnlich zur Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure. Demnach unterscheidet sich die Basenabfolge des Kompetitors insbesondere in einer Base von einer Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinsäure.
Einem weiteren Aspekt zufolge weisen das als Kompetitor zu verwendende Nukleinsäure- Oligomer und eine oder mehrere immobilisierte Sonden Basenabfolgen auf, die zueinander ähnlich sind. Insbesondere betrifft diese Ähnlichkeit diejenigen Sonden, die eine Basenabfolge aufweisen, die komplementär ist zu einer Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure (Targetsonden).
Prinzipiell als Kompetitor brauchbar sind einzelsträngige Nukleinsäuren mit einer Länge von 2 bis 500 Basen (Oligomere). Es versteht sich, daß zu den einzelsträngigen Nukleinsäuren auch denaturierte doppelsträngige Nukleinsäuren gehören. DNA, RNA sowie Nukleinsäure-Analoga und -Derivate, wie - gegebenenfalls modifizierte - PNA, LNA und PSNA sowie modifizierte DNA oder RNA können verwendet werden. Verglichen mit den in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren bilden erfindungsgemäß bevorzugte Nukleinsäure-Oligomere mit immobilisierten Sonden Hybride, deren thermische Stabilität bei Komplementarität (Perfect Match) vergleichsweise größer, bei Nichtkomplementarität (Mismatch) vergleichsweise geringer ist. Der Tm-Unterschied zwischen Match und Mismatch ist daher ausgeprägter als bei DNA/DNA- oder DNA/RNA- Hybriden, was zu einer besseren Basenfehlpaarungs-Diskriminierung führt.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Nukleinsäure-Oligomer ein PNA-, LNA- oder PSNA-Oligomer.
Die Länge geeigneter Nukleinsäure-Oligomere kann unterschiedlich sein. Sie richtet sich vor allem nach der Länge der nachzuweisenden Nukleinsäuren sowie der immobilisierten Sonden. Bevorzugt sind 6-40mere und insbesondere 15-25mere.
Die Polarität des Nukleinsäure-Oligomers kann in Relation zur Polarität der immobilisierten Sonden in sense oder antisense Richtung liegen.
Einem besonderen Aspekt zufolge umfaßt das Nukleinsäure-Oligomer eine Basenabfolge, die derjenigen entspricht, von der die nachzuweisende Basenabfolge zu unterscheiden (diskriminieren) ist. Für den Bereich des Mutationsnachweis ist dies vorzugsweise die Basenabfolge des Wildtyps.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Untersuchung beliebiger Proben biologischen Ursprungs, die Nukleinsäuren enthalten können. Eine Ausführungsform betrifft Körperproben humanen und tierischen Ursprungs. Erforderlichenfalls erfolgt eine vorbereitende Aufarbeitung der in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren. Diese Aufarbeitung enspricht in der Regel üblicher Praxis. Proben wie Blut und Blutbestandteilen bzw. Isolate davon, Gewebe, nativ, gefroren, fixiert, mit und ohne Dissektion, Zellen aus Körperflüssigkeiten, z.B. Sputum, Lavagen, Punktate, Exsudate und Urin, oder Stuhl, können vorteilhaft mit dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden. Demnach handelt es sich um ein in vitro Verfahren, z.B. das in WO 99/10528 beschriebene Verfahren. Dieses Verfahren ist durch Bezugnahme Teil der vorliegenden Offenbarung. Für den Hybridisierungsschritt können amplifizierte oder nicht amplifizierte Nukleinsäuren eingestetzt werden.
Der Begriff Amplifikation betrifft die Vervielfältigung von Nukleinsäuren, d.h. die Erzeugung vieler Kopien bestimmter Nukleinsäuren. In der Regel verläuft die Amplifikation wenigstens linear und vorzugsweise exponentiell.
Brauchbar sind die bekannten Amplifikationsverfahren, zu denen die Polymerase- Kettenreaktion (PCR), auch als Nested-PCR, Asymmetrische PCR oder Multiplex-PCR durchgeführt, oder alternative Verfahren, wie die Ligase-Kettenreaktion (LCR), Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA), Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA) und ähnliche, gehören. Bestimmte Versionen dieser Techniken, wie die mutationsanreichernde PCR, und/oder Kombinationen mit anderen molelularbiologischen Methoden, wie mit der Reversen Transkription (RT), können zweckmäßig sein.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird vor der Hybridisierung eine Amplifikation durchführt in Gegenwart wenigstens eines Nukleinsäure-Oligomers mit einer Basenabfolge, die ähnlich ist zu einer bestimmten Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinsäure.
Dieser Ausführungsform liegt das bekannte Prinzip der mutationsanreichemden PCR zugrunde, nämlich einer vergleichsweise geringeren Amplifikation von Nukleinsäuren mit einer zur Basenabfolge des Nukleinsäure-Oligomers komplementären Basenabfolge als von Nukleinsäuren mit einer zur Basenabfolge des Nukleinsäure-Oligomers ähnlichen Basenabfolge. Dazu ist es zweckmäßig, das Nukleinsäure-Oligomer so zu gestalten, daß dessen Bindung an das Templat die Anlagerung wenigstens eines PCR-Primers und/oder dessen Elongation verhindert. In der Regel weisen geeignete Nukleinsäure-Oligomere und Primer gemeinsame Sequenzabschnitte auf, die zweckmäßigerweise das 3'-Ende des Primers überdecken. So gelingt eine Anreicherung von Nukleinsäuren mit einer zur Basenabfolge des Nukleinsäure-Oligomers ähnlichen Basenabfolge zugunsten von Nukleinsäuren mit einer zur Basenabfolge des Nukleinsäure-Oligomers komplementären Basenabfolge. Dabei kann die Amplifikation von Nukleinsäuren mit einer zur Basenabfolge des Nukleinsäure-Oligomers komplementären Basenabfolge - je nach Konzentration der Nukleinsäuren in der Probe und den verwendeten Amplifikationsbedingungen - im wesentlich vollständig unterdrückt werden, es können aber auch ausreichend Amplifikate erzeugt werden, die dann im anschließenden Hybridisierungsschritt nachgewiesen werden können.
Für das im Rahmen der mutationsanreichemden PCR zu verwendende Nukleinsäure- Oligomer gelten obige Ausführungen zu dem im Rahmen des Hybridisierungsschrittes verwendeten Nukleinsäure-Oligomer entsprechend.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet man demnach das Nukleinsäure-Oligomer auch zur diskriminierenden Amplifikation wenigstens einer nachzuweisenden Nukleinsäure in Gegenwart einer Nukleinsäure mit ähnlicher Basenabfolge durch PCR oder ähnliche Verfahren und hybridisiert anschließend das Amplifikationsprodukt in Gegenwart desselben Nukleinsäure-Oligomers an immobilisierten Sonden. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn trotz mutationsanreichnder PCR ein Amplifikat mit Wildtyp-Sequenzen erhalten wird, weil in diesem Fall mittels der erfindungsgemäßen kompetitiven Hybridisierung diskriminiert werden kann zwischen möglicherweise im Amplifikat vorhandenen mutierten Sequenzen und Wildtyp-Sequenzen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Hybridisierung keine Amplifikation vorgeschaltet. Dies gilt insbesondere für den Nachweis von mRNA bzw. davon abgeleiteten Nukleinsäuren.
Für die Fälle, in denen eine Amplifikation durchgeführt wird, bietet sich die Co- Amplifiaktion wenigstens einer Kontrollsequenz als allgemeine und/oder spezifische PCR- Kontrolle an, z.B. um eine unspezifische Inhibition für die Fälle ausschließen, in denen kein Amplifikat erhalten wird. Beispielsweise kann die HLA-DRA1 -Sequenz (Locus: HLA00663) als allgemeine PCR- und als humanspezifische Kontrollsequenz (HSKS) gewählt werden, da sie bei Tieren nicht vorhanden ist.
Die Sonden sind in der Regel einzelsträngige Oligomere. DNA, RNA sowie Nukleinsäure- Analoga und -Derivate, wie - gegebenenfalls modifizierte - PNA, LNA und PSNA sowie modifizierte DNA oder RNA kann verwendet werden. Die Mindestlänge der Sonden hängt ab von der Komplexität der Probe, insbesondere der Anzahl der Basen nachzuweisender Nukleinsäuren, aber auch von der Art des als Sonde verwendeten Nukleinsäuretyps und der erreichbaren thermodynamische Stabilität zwischen Probe und Sonde. In Abhängigkeit vom Nukleinsäuretyp weisen Sonden üblicherweise ein Länge von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für DNA, von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für DNA-LNA Hybride, von 8 bis 60, vorzugsweise von 13 bis 25 und insbesondere von 13 Basen für PSNA, von 6 bis 30, vorzugsweise von 8 bis 18 und insbesondere von 9 Basen für LNA, und von 6 bis 18, vorzugsweise von 8 bis 18 und insbesondere von 9 Basen für PNA auf.
Bei relativ geringer Komplexität der nachzuweisenden Nukleinsäuren, z.B. Amplifikaten, insbesondere PCR-Amplifikaten, Viren, Plasmiden und Mikroorganismen, sind relativ kurze Sonden, etwa im Bereich von 8-25meren und insbesondere 8-15meren, zweckmäßig. Bei relativ hoher Komplexität der nachzuweisenden Nukleinsäuren, z.B. nichtamplifizierter RNA, über cDNA gesamtamplifizierter RNA, nichtamplifizierter gesamtgenomischer DNA und amplifizierter gesamtgenomischer DNA, sind längere Sonden, für synthetische Sonden etwa im Bereich von 16-60meren, zweckmäßig oder die Sonden bestehen aus PCR-Produkten, cDNA, Plasmiden oder DNA, z.B. aus lysierten Bakterien, die auch eine darüber hinaus gehende Basenanzahl aufweisen können.
Die Basenabfolge der Sonden richtet sich vornehmlich nach ihrer Funktion. Eine Targetsonde weist in der Regel eine Basenabfolge auf, die zu einer Region einer nachzuweisenden Nukleinsäure im wesentlichen komplementär ist oder einem anderen Aspekt zufolge mit der Region spezifisch hybridisieren kann. Eine solche Region entspricht einer bestimmten Targetsequenz zumindest in Teilen. Eine Kontrollsonde kann insbesondere die Funktion einer Normalisierungs-, Mismatch-, Housekeeping-, Probenzubereitungs-, Hybridisierungs- oder Amplifikationskontrolle haben und dementsprechend eine Basenabfolge aufweisen, die komplementär ist zu einer Basenabfolge einer Referenz-Nukleinsäure, einer nachzuweisenden Nukleinsäure mit ähnlicher Basenabfolge, einer konstitutiv exprimierten Nukleinsäure, z.B. einer vom ß2- Mikroglobulin, ß-Aktin-, GAPDH- oder Transferrin-Rezeptor-Gen abgeleiteten Nukleinsäure, einer speziesspezifischen Nukleinsäure bzw. eines Amplifikats.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zum spezifischen Nachweis einer Nukleinsäuresequenz mit bestimmter Basenabfolge und damit zum Nachweis von Nukleinsäuren, die eine derartige oder gegebenenfalls auch mehrere derartige Basenabfolgen aufweisen. Es können auch gleichzeitig mehrere Nukleinsäuresequenzen mit bestimmten, gegebenenfalls zueinander ähnlichen Basenabfolgen jeweils spezifisch nachgewiesen werden. Spezifisch meint in diesem Zusammenhang insbesondere eine ausreichende Diskriminierung gegenüber Nukleinsäuren mit einer ähnlicher Basenabfolge. Die Leistungsfähigkeit des Verfahrens zeigt sich insbesondere dann, wenn die Probe neben den nachzuweisenden Nukleinsäuren auch wenigstens eine weitere Nukleinsäure enthält, deren Basenabfolge und die nachzuweisend(n) Basenabfolge(n) ähnlich sind. Demnach ist das vorliegende Verfahren insbesondere dann von Vorteil, wenn die Probe wenigstens zwei Nukleinsäuren mit zueinander ähnlichen Basenabfolgen enthalten kann. Beispielsweise kann eine Punktmutation spezifisch nachgewiesen werden, indem man wenigstens eine Testsonde mit einer Basenabfolge, die komplementär zu einer die Punktmutation umfassenden Basenabfolge ist, und eine weitere Testsonde mit einer Basenabfolge, die komplementär zur entsprechenden Basenabfolge des Wildtyps ist, vorsieht. Zum spezifischen Nachweis weiterer Punktmutationen, z.B. im Rahmen einer Permutation, können weitere Testsonden mit einer Basenabfolge, die komplementär zu einer die jeweilige Punktmutation umfassenden Basenabfolge ist, vorgesehen werden. Für diese Fälle ist es zweckmäßig, die Sonden in einem parallelisierten System anzuordnen. Der Nukleinsäure-Kompetitor weist in diesen Fällen vorteilhafterweise eine Basenabfolge auf, die komplementär ist zu einer Basenabfolge einer der Sonden, vorzugsweise einer für die Ähnlichkeit wählbaren Bezugsbasenabfolge, insbesondere einer Basenabfolge des Wildtyps. Es kann auch zweckmäßig sein, das Verfahren mit denselben Sonden an mehreren Probenaliquots mehrmals mit unterschiedlichen Kompetitoren durchzuführen. Eine weitere Möglichkeit besteht in dem gleichzeitgen Einsatz mehrerer unterschiedlicher Kompetitoren.
Zur Immobilisierung sind die Sonden an einen Träger gekoppelt, beispielsweise über kovalente, adsorptive oder über physikalisch/chemische Wechselwirkungen von Sonde und Oberfläche. Geeignete Methoden zur Erzielung einer zweckmäßigen Kopplung sind dem Fachmann bekannt. Dabei kann die zuvor bereitgestellte Sonde an die Oberfläche gekoppelt werden oder es kann die Sonde in-situ an der Oberfläche synthetisiert werden, z.B. mittels photolitographischer Verfahren. Die Kopplung über photoaktive Gruppen, beispielsweise bestimmte Anthrachinone, und erforderlichenfalls einen Spacer geeigneter Länge und Konstitution, beispielsweise Polyethylenglykol mit n = 2-10 und vorzugsweise von etwa 6 bei 8-15meren, an eine reaktive Oberfläche, stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar.
Als Trägermaterial können folgende Stoffe verwendet werden: Glas (Standardglas, Pyrexglas, Quarzglas), Kunststoffe, bevorzugt von hoher Reinheit bzw. geringer Eigenfluoreszenz (wie Polyolefine, z.B. PE (Polyethylen), PP (Polypropylen), Polymethylpenten, Polystyrol, PMMA (Poly(methylmethacrylat)), Polycarbonat, Teflon), Metalle (wie Gold, Chrom, Kupfer, Titan, Silizium), oxidische Materialien bzw. Beschichtungen (Keramiken, aluminiumdotiertes Zinkoxid (TCO), Silica, Aluminiumoxid). Die Trägermaterialien können als Membranen (wie Polysacharide, Polycarbonat, Nafion, Langmuir-Blodget-Membrane), dreidimensionale Strukturen (etwa Gele z.B. Polyacrylamid, Agarose, Keramiken) oder auch Formteile aus obigen Materialien, wie Folien und Dipsticks, ausgebildet sein. Für eine bessere Haftung, die Reduzierung unspezifischer Bindung oder für eine kovalente Ankopplung der Sonden kann das Aufbringen einer Zwischenschicht oder eine Voraktivierung der Oberfläche notwendig sein, z.B. durch Silane (Alkylsilane, Epoxysilane, Aminosilane, Carboxysilane), Langmuir- Blodget-Membranen, Polymere (Polysaccharide, Polyethylenglycol, Polystyrol, polyfluorierte Kohlenwasserstoffe, Polyolefine, Polypeptide), Alkylthiole, derivatisierte Alkylthiole, Lipide oder Lipid-Doppelschichten. Die Aufbringung der Sonden auf die Oberfläche erfolgt durch Pipettieren, Dispensieren, Drucken, Stempeln oder photolithographische Techniken, insbesondere bei der ebenfalls möglichen in-situ- Synthese der Sonden an der Oberfläche. Es werden bevorzugt verschiedene Sonden in einem zweidimensionalen Muster auf die Oberfläche aufgebracht. Jeder Sonde kann dann eine eindeutige Position auf der Oberfläche zugeordnet werden.
Zur Hybridisierung läßt man die Hybridisierungskomponenten unter Bedingungen, die eine Duplex-Bildung zwischen nachzuweisender Nukleinsäure und dazu komplementärer Sonde zulassen, aufeinander einwirken. Z.B. bringt man die immobilisierte Sonde in Kontakt mit einem Hybridisierungsgemisch, das die Probe oder einen davon abgeleiteten Teil, wenigstens ein Nukleinsäure-Oligomer und gegebenenfalls weitere übliche Zusätze umfaßt. Es versteht sich, daß Teile des Gemisches zunächst getrennt voneinander mit der Sonde in Kontakt gebracht werden können. Die Hybridisierungsbedingungen werden zweckmäßigerweise so gewählt, daß Sonde und dazu komplementäres Target stabile Hybride bilden können. Die dazu zweckmäßigen Einzelstränge können erforderlichenfalls durch Denaturierung von Doppelsträngen erzeugt werden. In der Regel werden zunächst Bedingungen relativ niedriger Stringenz gewählt, z.B. Temperaturen von etwa 20 - 50°C und insbesondere von etwa 30 - 40°C sowie lonenstärken von etwa 6 x SSPE oder niedriger. Anschließend kann dann bei ähnlicher oder höherer Stringenz, z.B. etwa 1 x SSPE bei etwa 30 - 40°C bis etwa 0,25 x SSPE bei etwa 30 - 50°C gewaschen werden. Ferner kann auf bekannte Agenzien, z.B. Detergenzien, Blockreagenzien, denaturierende Agenzien, die Renaturierung beschleunigende Agenzien und Tm-egalisierende Reagenzien zurückgegriffen werden. Die Optimierung des Hybridisierungsprotokolls ist Sache des Fachmanns.
Der Nachweis im erfindungsgemäßen Sinn beinhaltet die Feststellung, ob ein bestimmtes Target, d.h. eine bestimmte Nukleinsäurebasenabfolge, in einer Probe vorhanden ist oder nicht (Anwesenheit oder Abwesenheit). Die Feststellung kann qualitativ oder quantitativ erfolgen.
In der Regel erfordert der Nachweis eine Quantifizierung derjenigen Nukleinsäuren, die an eine immobilisierte Sonde hybridisieren. Die Quantifizierung kann absolut oder relativ erfolgen. Geeignete Detektionssysteme sind dem Fachmann hinlänglich bekannt. Eine vielfach genutzte Möglichkeit besteht in der Einführung von Markierungen, z.B. radioaktiver, colorimetrischer, fluoreszierender oder lumineszierender Art. Diese werden in der Regel in die in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren und insbesondere in die nachzuweisenden Nukleinsäuren mit bestimmter Basenabfolge bzw. Nukleinsäuren mit dazu ähnlicher Basenabfolge eingeführt, z.B. im Zuge einer der Hybridisierung vorgeschalteten Amplifikation oder auf andere an sich bekannte Art und Weise. Sind die nachzuweisenden Nukleinsäuren mit bestimmter Basenabfolge bzw. Nukleinsäuren mit dazu ähnlicher Basenabfolge markiert, so ist es zweckmäßig, das als Kompetitor zu verwendende Nukleinsäure-Oligomer nicht zu markieren oder zumindest keine damit interferierende Markierung zu verwenden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beträgt die Diskriminierung zwischen Perfect Match und Mismatch von ähnlichen Basenabfolgen nach der Hybridisierung an immobilisierten Sonden in der Regel mehr als 3:1.
Die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Verwendung einer mutationsanreichemden Amplifikation und anschließender kompetitiver Hybridisierung an immobilisierten Sonden beträgt in der Regel mehr als 1:10, vorzugsweise mehr als 1 :100.
Besondere Vorteile ergeben sich, wenn die Probe doppelsträngige Nukleinsäuren beinhaltet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines Nukleinsäure- Oligomers als Kompetitor bei der Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonde zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch. Damit gelingt der spezifische Nachweis einer Nukleinsäure mit bestimmter den Perfect Match bildenden Basenabfolge. Bevorzugt wird die Verwendung bei Hybridisierung an wenigstens zwei immobilisierte Sonden, wobei eine Sonde den Perfect Match und die andere den Mismatch bilden kann. Insbesondere weisen die beiden Sonden zueinander ähnliche Basenabfolgen auf.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäure-Kompetitoren zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch bei der Hybridisierung von Nukleinsäuren an wenigstens eine immobilisierte Sonde. Spezifische Ausgestaltungen dieser Kompetitoren sind den Ausführungen zum Verfahren und zur Verwendung zu entnehmen.
Prinzipiell eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis bestimmter genetischer Informationen eines beliebigen Organismus oder von Teilen davon. Vorteile bietet das Verfahren bei der Differenzierung zwischen ähnlichen Informationen. Die Informationen können genomischer Art sein. Sie können aber auch die Expression von Genen, z.B. auf mRNA-Ebene, betreffen. Vor allem richtet sich das Verfahren auf den Nachweis von Mutationen in Zellen aus Körperflüssigkeiten oder Geweben tierischen oder menschlichen Ursprungs. Dazu können Zellen in an sich bekannter Weise gewonnen, z.B. dem zu untersuchenden Individuum in Form einer zellhaltigen Probe entnommen werden, erforderlichenfalls angereichert und mit dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht werden. Ein besonderes Verfahren zur Isolierung disseminierter Krebszellen wird in WO 00/06702 beschreiben. Dieses Verfahren ist durch Bezugnahme Teil der vorliegenden Offenbarung.
Ein weiterer besonderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung eines vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Identifizierung und Charakterisierung von Mutationen vor allem in Zellen, insbesondere in Krebszellen. Diese Anwendung reicht von der Krebsdiagnose über das Monitoring bis zur Therapiewahl durch gezieltes Drug-Targeting nach Feststellung bestimmter genetischer Eigenarten. Eine weitere Anwendung betrifft den Nachweis von Viren oder Bakterien, beispielsweise den eingangs genannten Organismen, insbesondere unter Differenzierung verschiedener Genotypen, z.B. verschiedener Stämme einer Art.
Eine besondere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft den Nachweis von Mutationen in den Codons 12, 13 und 61 des humanen K-ras-Gens. Dies betrifft jede beliebige der theoretisch möglichen Mutationen in diesen Codons. Demnach richtet sich diese Ausführungsform auf den Nachweis von wenigstens einer Nukleinsäure mit einer Basenabfolge, die ähnlich ist zu einer Basenabfolge des humanen K-ras-Gens.
Insbesondere beinhalten derartige Basenabfolgen als Codon 12 GAT, GTT, GCT, TGT, AGT, CGT, CTT oder ATT anstatt GGT und/oder als Codon 13 TGC oder GAC anstatt GGC und/oder als Codon 61 CAT, CAC, CTA, CGA oder GAA anstatt CAA, wobei die übrigen Basen dieser Basenabfolgen denjenigen des humanen K-ras-Gens entsprechen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens wird wenigstens ein Nukleinsäure-Oligomer verwendet, das eine Codon 12 und 13 umfassende Basenabfolge aufweist.
Die Verwendung von Nukleinsäure-Oligomeren mit einer Basenabfolge, die derjenigen des Wildtyps entspricht, stellt einen weiteren besonderen Aspekt dar.
In einem speziellen Verfahren wird der Hybridisierung eine mutationsanreichernde PCR vorgeschaltet. Zu diesem Zweck kann beispielsweise ein 15mer PNA-Oligomer (wt- Sequenz, Polarität antisense) so entworfen werden, daß es die Codons 12 und 13 überlappt und 3 Basen in die Bindungsstelle des antisense-PCR-Primers hineinragt. Das PNA-Oligomer ist komplementär zur Wildtypsequenz (Polarität: antisense). Durch Bindung an die sense-Wildtypsequenz verringert es während der PCR die Amplifikation des Wildtyps. Mutierte Sequenzen werden - auch in Gegenwart eines Überschusses an Wildtypsequenz - präferentiell amplifiziert.
Als allgemeine und als humanspezifische Kontrollsequenz kann vorteilhafterweise eine Co-Amplifikation von HLA-DRA1 in einem Multiplexansatz durchgeführt werden. Dies dient als Funktionsnachweis der PCR, da im Fall des Fehlens einer Mutation kein oder nur wenig PCR Produkt entsteht, und ist insbesondere beim Nachweis von K-ras-Mutationen in Stuhlproben von Vorteil, da hier unter Umständen eine hohe Konzentration tierischer Nukleinsäuren mitextrahiert wird und die zur Co-Amplifikation gewählte Sequenz des HLA- DRA1 humaner DNA, nicht aber in der DNA tierischen Ursprungs vorkommt. Insbesondere kann sowohl die Amplifikation als auch die Hybridisierung in Gegenwart des gleichen Nukleinsäure-Oligomers durchgeführt werden. In diesem Fall kann dieses Nukleinsäure-Oligomer im Amplifikationsansatz verbleiben.
Ein erfindungsgemäß bevorzugt verwendetes Nukleinsäure-Oligomer weist die Sequenz SEQ ID NO:1 auf.
Eine bevorzugte Sondenanordnung besteht darin, daß i1) wenigstens eine Sonde eine Basenabfolge aufweist, die komplementär ist zu einer Basenabfolge, die derjenigen des humanen K-ras-Gens ähnlich ist; i2) wenigstens eine weitere Sonde eine Basenabfolge aufweist, die komplementär ist zu einer Codon 12 und 13 umfassenden Basenabfolge, die der Basenabfolge des humanen K-ras-Gens entspricht; und i3) gegebenenfalls weitere Sonden Basenabfolgen aufweisen, die zur Amplifikations- und/oder Specieskontrolle dienen.
Die unter i1) angesprochenen Sonden werden vorzugsweise ausgewählt unter den Oligonukleotiden mit den Sequenzen SEQ ID NO:8-17.
Eine unter i2) angesprochene Sonde ist vorzugsweise ein Oligonukleotid mit der Sequenz SEQ ID NO:7.
Die unter i3) angesprochenen Sonden werden vorzugsweise ausgewählt unter den Oligonukleotiden mit den Sequenzen SEQ ID NO: 18-20.
Die Immobilisierung der Sonden erfolgt vorzugsweise auf der Oberfläche eines planaren Trägers. Insbesondere ergeben sich Biochips, auf denen die Sonden angeordnet sind. Ein besonderer Biochip weist die Sonden mit den Sequenzen SEQ ID NO:7-20 auf, wobei vorzugsweise jeweils zwei Feldelemente auf dem Chip mit einem Sondentyp bestückt sind.
Für den vorstehend beschriebenen Nachweis von Mutationen des K-ras-Gens ergeben sich vor allem Anwendungen in der Krebserkennung, beispielsweise von Pankreas-
Karzinomen, Schilddrüsen-Karzinomen, Ph-negativer CML, kolorektalen Karzinomen Multiplen Myelomen, Myelodysplastischem Syndrom (MDS), Myeloproliferativem Syndrom (MPS), akuten myeloischen Leukämien und Lungen-Adenokarzinomen. Es können gegebenenfalls fixierte und/oder dissektierte Gewebe untersucht werden, oder auch Zellen aus Körperflüssigkeiten mit und ohne vorhergehende Anreicherung und vor allem Stuhl auf Kolorektal-Karzinome gescreent werden.
Auch kann der Nachweis von K-ras-Mutationen zum Drug-Targeting für therapeutische Anwendungen, beispielsweise der Verabreichung monoklonaler Antikörper gegen mutiertes p21, zur Gentherapie oder Antisense-Therapie dienen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Analysekits mit Mitteln zur Durchführung eines vorstehend beschriebenen Verfahrens. Derartige Kits enthalten vorzugsweise i) wenigstens eine immobilisierte Sonde mit einer Basenabfolge, die zu einer bestimmten Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist; ii) wenigstens ein Nukleinsäure-Oligomer mit einer Basenabfolge, die zu der bestimmten Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure ähnlich ist; und iii) gegebenenfalls weitere Mittel zur Durchführung des Verfahrens, die z.B. auszuwählen sind unter Amplifikationsmitteln, Puffer, internen Standards und Kontrollen.
Weitere besondere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kits ergeben sich aus den Ausführungen zum Verfahren selbst.
Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen näher erläutert.
In den Zeichnungen zeigt:
Figur 1 ein Histogramm der Häufigkeit bisher nachgewiesener K-ras-Mutationen in den Codons 12 (schwarz), 13 (schraffiert) und 61 (weiß);
Figur 2 eine Codon 12/13 umfassende Teilsequenz des humanen K-ras-Gens (Wildtyp) sowie die .zur mutationsanreichemden PCR verwendeten Primer RasUSI und RasDS135 und das Nukleinsäure-Oligomer (Kompetitor) PNA-KRas 123. Primer sind unterstrichen, die Oligomersequenz ist in kursiver Schrift und Codon 12 und 13 sind in Fettdruck gehalten. Die Länge des PCR-Produktes beträgt 157 bp;
Figur 3 die selektive Amplifikation der mutierten K-ras-Sequenz (GTT, Val 12) (A) sowie den Einfluß der Zyklenzahl auf die Menge an amplifizierter Wildtypsequenz (B) bei Zusatz von PNA-KRAS123 zur PCR (M: Marker; WT: Wildtyp; Mut: Mutante);
Figur 4 die Sequenzierung des PCR-Produktes nach mutationsanreichemder PCR unter Zusatz von PNA-KRAS123 (A) und die Sequenzierung einer Wildtypkontrolle in (B);
Figur 5 die Co-Amplifikation des HLA-DRA1-Locus in Wildtyp- und Mutantenzelllinie (M: Marker; WT: Wildtyp; Mut: Mutante)
Figur 6 Diskriminierungsraten bei der Hybridisierung einer synthetischen, die lle 12- Mutation umfassenden 24mer Probe (KRST-Ile12) an verschiedene Sonden (mit Angaben zur Komplementarität) (A) ohne und (B) bei Kompetitor-Zusatz zum Hybridisierungspuffer;
Figur 7 die Auswertung eines Biochips mit verschiedenen Sonden (Komplementarität den Angaben entsprechend) nach Hybridisierung eines PCR-Produktes mit einem Verhältnis von Wildtyp-DNA : mutierter DNA (Codon 12 GGT, Val12) von 1000 : 1 bei PNA-Zusatz als gescannte Abbildung (A) und entsprechender Plot (B);
Figur 8 Normalisierte Diskriminierung bei Hybridisierung definierter PCR-Produkte (Komplementarität den Angaben entsprechend) an immobilisierte Sonden (Komplementarität den Angaben entsprechend) unter Zusatz von Kompetitor.
Nachweis bestimmter K-ras-Mutationen in den Codons 12 und 13.
a) Mutationsanreichernde Amplifikation
In Fig. 2 ist eine K-ras-Sequenz, welche die Codons 12 und 13 umfaßt, wiedergegeben. Die Sequenzen der verwendeten Primer, Codon 12 und 13 sowie die zum PNA-Oligomer korrespondierende Sequenz sind hervorgehoben. Diese und weitere Sequenzen sind in folgender Tabelle 1 aufgelistet. Tabelle 1
Figure imgf000021_0001
PCR-Bedingungen pro Ansatz: 100 ng DNA, 1,5 mM MgCI2; 100 μM dNTPs; 250 nM Primer; 1 U Taq-Polymerase (Qiagen; HotStar); 7,5 % Glycerol; ggf. 2,8 μM PNA; in 50 μl 1 x PCR-Puffer. Thermocycling: 1 x 95 °C 15 min; 35 - 45 x (94 °C 60 s, 70°C 50 s, 58 °C 50 s, 72 °C 60 s); 1 x 72 °C 7 min.
In Fig. 3A ist der mutationsanreichernde Effekt dargestellt. Wenn zu einem PCR Ansatz, der nur die K-ras-Wildtypsequenz (DNA aus der Zellinie Colo320) enthält, 2,8 μM PNA- Oligomer zugegeben werden, wird die Amplifikation der Wildtypsequenz unterdrückt. DNA mit mutierter K-ras Sequenz (aus der Zellinie SW480, Codon 12 GGT; Valin 12) wird auch in Gegenwart des PNA-Oligos amplifiziert. Durch Erhöhung der Zyklenzahl von 35 auf 45 kann ein Verhältnis von mutierter DNA zu Wildtyp-DNA von 1 : 1000 und mehr amplifiziert werden, was durch Sequenzierung des Amplifikats nachgewiesen werden konnte (Fig.4). Allerdings erhöht sich unter diesen Bediungen die Menge an amplifizierter Wildtypsequenz (Fig. 3B).
b) Aufbau der Multiplex-PCR
Zur Kontrolle der mutationsanreichernden PCR, bei der man im Fall der Abwesenheit einer mutierten Sequenz kein Amplifikat erhält, wird als human-spezifische Kontrollsequenz (HSKS) ein Fragment von HLA-DRA1 co-amplifiziert. Die hierzu verwendeten Primer DRA20Uo und DRA200Lo sind in Tabelle 1 angegeben. Die Polaritäten der PCR-Primer sind sense und antisense, wobei der antisense-Primer an 5' mit Cy5 markiert ist. Die Polarität des PNA-Oligomers ist antisense. Das Ergebnis der Co- Amplifikation ist in Fig. 5 dargestellt. c) Herstellung der Biochips
Als Sonden wurden einzelsträngige 13mer DNA-Oligomere verwendet (Polarität sense). In nachfolgender Tabelle 2 sind die Sequenzen der auf dem Biochip immobilisierten Sonden (Capture Probes) aufgelistet K-ras-Codon 12; K-ras-Codon 13; K-ras-PCR-Kontrolle (Control 81); human-spezifisches Kontrollgen (HLA-DRA1)). Die Polarität der immobilisierten Sonden ist sense und an die Sonden hybridisierende Stränge sind antisense und an 5' Cy5-markiert.
Tabelle 2
Figure imgf000022_0001
Die Sonden bestehen aus einer photoaktiven Gruppe (Anthrachinon), einem Hexaethylenglykol-Spacer und einem über 5' an den Spacer gekoppelten einzelsträngigen 13mer DNA-Oligonukleotid. 1,5 nL der gelösten Sonden (Konzentration 10 μM) wurden in Duplikaten auf eine Plastikoberfläche (Träger) gespottet. Nach dem Eintrocknen der Spots wurden die Träger 1 min mit UV-Licht bestrahlt, wodurch die photoreaktive Anthrachinongruppe der Sonden eine kovalente Bindung mit dem Plastikmaterial eingeht. Die Träger wurden gewaschen, um überschüssige Sonden zu entfernen. d) Kompetitive Hybridisierung
Zwei K-ras-Biochips aus Beispiel c) wurden mit einer synthetischen, Cy5-markierten 24mer-Nukleinsäure als Probe (Polarität antisense; Basenabfolge siehe Tabelle 1) mit und ohne Zusatz von 2,4 μM PNA-Oligomer (PNA-KRAS123) hybridisiert. Die Probe (SEQ ID NO:6) weist eine zur Basenabfolge der immobilisierten Sonde SEQ ID NO:15 (Ile12- Mutation) komplementäre Basenabfolge auf.
Die Probenkonzentration wurde auf 5 nM in 6 x SSPE eingestellt. Es wurden 20 μl Probe mit und ohne PNA bei 37°C 1 h hybridisiert, danach die überschüssige Probe kurz mit 6 x SSPE abgespült und die Fluoreszenz gemessen. In Fig. 6 sind die Ergebnisse dargestellt: A: kein PNA im Hybrisierungspuffer. B: Zusätzlich 2,4 μM PNA im Hybrisierungspuffer. Die Zugabe von PNA mit einer zum Wildtyp komplementären Basenabfolge verbessert deutlich die Spezifität der Hybridisierung. Die erreichten Diskriminierungsraten sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
Tabelle 3
Figure imgf000023_0001
In einem weiteren Experiment wurden 12 μl PCR-Produkt (mutationsanreichernde PCR nach Beispiel a), Wildtyp-DNA : mutierter DNA 1000 : 1) gemischt mit 5,1 μl 20 x SSPE- 0,3 % Tween 20 (Endkonzentrationen im Gemisch ~ 6 x SSPE-0.1 % Tween 20). Die kompletten 17,1 μl im Hybridisierungsansatz wurden 3 min auf 90 °C erhitzt, auf Eis abgekühlt und auf den Array pipettiert. Der Chip wurde 1 h bei 37 °C im Hybridisierungsofen inkubiert, danach die überschüssige Sonde kurz mit 6 x SSPE abgespült und gescannt (Fig. 7A). Die Diskriminierung war für alle Match/Mismatch- Verhältnisse > 10:1 (Fig. 7B).
e) Diskriminierung einzelner Mutationen durch Hybridisierung auf dem Biochip
Es wurden unter den in Beispiel 1 genannten mutationsanreichernden PCR-Bedingungen K-ras-Amplifikate von DNA-Proben mit bekannten Mutationen hergestellt (Targets). Die Amplifikate mit den einzelnen Mutationen wurden jeweils in Gegenwart von 2,4 μM PNA- Oligomer (PNA-KRAS123) hybridisiert. Die auf den jeweiligen Perfect Match normalisierten Ergebnisse der einzelnen Hybridisierungen (Perfect Match = 1,0, Mismatches: Signal-Quotient aus Perfect Match / Single Mismatch) sind in Figur 8 tabellarisch zusammengefaßt. Es konnte für alle Amplifikate in Bezug auf die jeweilige Mutation eine Match/Mismatch-Diskriminierung von > 10 : 1 erreicht werden. Ausnahme ist die Mutation Leu 12, bei der ein Quotient von 5,2 zur Mutation lle festgestellt wurde.

Claims

[Patentansprüche]
1. Verfahren zum Nachweis wenigstens einer Nukleinsäure mit bestimmter Basenabfolge in einer Probe durch Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridisierung durchgeführt wird in Gegenwart wenigstens eines Nukleinsäure-Oligomers mit einer Basenabfolge, die ähnlich ist zu der Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinsäure.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäure- Oligomer ein PNA-, LNA- oder PSNA-Oligomer ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Hybridisierung eine Amplifikation durchgeführt wird in Gegenwart wenigstens eines Nukleinsäure-Oligomers mit einer Basenabfolge, die ähnlich ist zu der bestimmten Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinsäure.
4. Verfahren nach einem der Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonde eine Länge von etwa 8 bis 60 Basen aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe wenigstens zwei Nukleinsäuren mit zueinander ähnlichen Basenabfolgen enthalten kann.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Basenabfolge der nachzuweisenden Nukleinsäure wenigstens 9 konsekutive Basen umfaßt und das Nukleinsäure-Oligomer eine Basenabfolge umfaßt, die sich davon in höchstens 3, 2 oder 1 Base unterscheidet.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die bestimmte Basenabfolge einer nachzuweisender Nukleinsäure ähnlich ist zu einer Basenabfolge des humanen K-ras-Gens.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Basenabfolge, die zu derjenigen des humanen K-ras-Gen ähnlich ist, als Codon 12 GAT, GTT, GCT, TGT, AGT, CGT, CTT oder ATT anstatt GGT und/oder als Codon 13 GGC oder GAC anstatt GGC und/oder als Codon 61 CAT, CAC, CTA, CGA oder GAA anstatt CAA umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sowohl die
Amplifikation als auch die Hybridisierung durchgeführt wird in Gegenwart eines
Nukleinsäure-Oligomers mit einer Codon 12 und 13 umfassenden Basenabfolge, die der Basenabfolge des Wildtyps entspricht.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäure- Oligomer die Sequenz SEQ ID NO:1 aufweist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß i1) wenigstens eine Sonde eine Basenabfolge aufweist, die komplementär ist zu einer Basenabfolge, die derjenigen des humanen K-ras-Gens ähnlich ist; i2) eine weitere Sonde eine Basenabfolge aufweist, die komplementär ist zu einer Codon 12 und 13 umfassenden Basenabfolge, die der Basenabfolge des humanen K-ras-Gens entspricht; und i3) gegebenenfalls weitere Sonden Basenabfolgen aufweisen, die zur Amplifikations- und/oder Spezieskontrolle dienen.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden ausgewählt sind unter i1) SEQ ID NO:8-17; i2) SEQ ID NO:7; und i3) SEQ ID NO:18-20.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Sonden als Array auf der Oberfläche eines Trägers immobilisiert sind.
14. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zum Nachweis wenigstens einer genetischen Information oder Eigenart.
15. Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 14 zur Identifizierung und Charakterisierung von Krebszellen.
16. Verwendung eines Nukleinsäure-Oligomers als Kompetitor bei der Hybridisierung an wenigstens eine immobilisierte Sonden zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch.
17. Nukleinsäure-Kompetitor zur Diskriminierung von Perfect Match und Mismatch bei der Hybridisierung von Nukleinsäuren an wenigstens eine immobilisierten Sonde.
18. Analysekit, enthaltend i) wenigstens eine immobilisierte Sonde mit einer Basenabfolge, die zu einer bestimmten Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist; ii) wenigstens ein Nukleinsäure-Oligomer mit einer Basenabfolge, die zu der bestimmten Basenabfolge einer nachzuweisenden Nukleinsäure ähnlich ist; und gegebenenfalls weitere übliche Mittel zur
Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
19. Analysekit nach Anspruch 18, wobei die immobilisierte Sonde Teil eines Biochips ist.
PCT/EP2001/008895 2000-08-01 2001-08-01 Verfahren zum nachweis von nukleinsäuren mittels hybridisierung, verwendung dieses verfahrens und entsprechender analysekit sowie nukleinsäure-oligomere und deren verwendung WO2002010447A2 (de)

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Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0127327A1 (de) * 1983-04-29 1984-12-05 National Research Development Corporation Verfahren zur Bestimmung der Sequenz von Nukleotiden in Zellen und zur Abscheidung von nukleinen Säuren von Zellen
WO1991012343A2 (en) * 1990-02-07 1991-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of point mutations in genes encoding gtp binding proteins
WO1994009156A1 (en) * 1992-10-08 1994-04-28 The Regents Of The University Of California Pcr assays to determine the presence and concentration of a target
EP0664339A1 (de) * 1993-07-09 1995-07-26 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Methode und testsatz zur unterscheidung von dna
US5627054A (en) * 1996-04-05 1997-05-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Competitor primer asymmetric polymerase chain reaction
US5869237A (en) * 1988-11-15 1999-02-09 Yale University Amplification karyotyping
WO1999036564A1 (en) * 1998-01-16 1999-07-22 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
EP0933431A1 (de) * 1996-07-11 1999-08-04 Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd. Verfahren zur untersuchung von nukleinsäuren und reagentiensätze
WO2001085988A1 (en) * 2000-05-09 2001-11-15 Diatech Pty. Ltd. Methods for detecting nucleic acid molecules having particular nucleotide sequences
DE10036457A1 (de) * 2000-07-26 2002-02-14 Giesing Michael Verwendung eines bildgebenden photoelektrischen Flächensensors zur Auswertung von Biochips und Bildgebungsverfahren hierfür

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4642089A (en) * 1988-11-15 1990-06-12 Yale University In situ suppression hybridization and uses therefor
DE19736691A1 (de) * 1997-08-22 1999-02-25 Michael Prof Dr Med Giesing Verfahren zur Charakterisierung und Identifizierung disseminierter und metastasierter Krebszellen

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0127327A1 (de) * 1983-04-29 1984-12-05 National Research Development Corporation Verfahren zur Bestimmung der Sequenz von Nukleotiden in Zellen und zur Abscheidung von nukleinen Säuren von Zellen
US5869237A (en) * 1988-11-15 1999-02-09 Yale University Amplification karyotyping
WO1991012343A2 (en) * 1990-02-07 1991-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Detection of point mutations in genes encoding gtp binding proteins
WO1994009156A1 (en) * 1992-10-08 1994-04-28 The Regents Of The University Of California Pcr assays to determine the presence and concentration of a target
EP0664339A1 (de) * 1993-07-09 1995-07-26 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Methode und testsatz zur unterscheidung von dna
US5627054A (en) * 1996-04-05 1997-05-06 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Competitor primer asymmetric polymerase chain reaction
EP0933431A1 (de) * 1996-07-11 1999-08-04 Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd. Verfahren zur untersuchung von nukleinsäuren und reagentiensätze
WO1999036564A1 (en) * 1998-01-16 1999-07-22 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
WO2001085988A1 (en) * 2000-05-09 2001-11-15 Diatech Pty. Ltd. Methods for detecting nucleic acid molecules having particular nucleotide sequences
DE10036457A1 (de) * 2000-07-26 2002-02-14 Giesing Michael Verwendung eines bildgebenden photoelektrischen Flächensensors zur Auswertung von Biochips und Bildgebungsverfahren hierfür

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERGUSON J A ET AL: "HIGH-DENSITY FIBER-OPTIC DNA RANDOM MICROSPHERE ARRAY" ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. COLUMBUS, US, Bd. 72, Nr. 22, 2000, Seiten 5618-5624, XP001133705 ISSN: 0003-2700 *
KHANNA MARILYN ET AL: "Multiplex PCR/LDR for detection of K-ras mutations in primary colon tumor." ONCOGENE, Bd. 18, Nr. 1, 7. Januar 1999 (1999-01-07), Seiten 27-38, XP009006346 ISSN: 0950-9232 *
THIEDE CHRISTIAN ET AL: "Simple and sensitive detection of mutations in the ras proto-oncogenes using PNA-mediated PCR clamping." NUCLEIC ACIDS RESEARCH, Bd. 24, Nr. 5, 1996, Seiten 983-984, XP002233117 ISSN: 0305-1048 in der Anmeldung erw{hnt *
UGOZZOLI L: "DETECTION OF SPECIFIC ALLELES BY USING ALLELE-SPECIFIC PRIMER EXTENSION FOLLOWED BY CAPTURE ON SOLID SUPPORT" GENETIC ANALYSIS TECHNIQUES AND APPLICATIONS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHING, NEW YORK, US, Bd. 9, Nr. 4, 1. August 1992 (1992-08-01), Seiten 107-112, XP000330552 ISSN: 1050-3862 *

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