CN107653243B - 一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法。本发明提供了一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法，包括如下步骤：1)将动物肠道内容物或粪便经过差速离心；2)将所述微生物细胞结合使用液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法进行细胞破碎，得到破碎后细胞；3)先提取所述破碎后细胞的基因组DNA，再纯化所述基因组DNA。本发明添加了微生物细胞的洗涤和富集步骤，降低了宿主和食物DNA的污染；组合多种微生物细胞裂解破碎的方法，降低宏基因组DNA的物种偏好性；增加纯化的步骤，保证DNA的纯度，可以满足构建第二代高通量测序文库的DNA要求。
Description
技术领域
本发明涉及宏基因组学领域，具体地说是一种从肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法，所获得的宏基因组DNA满足构建第二代高通量测序文库的要求。
背景技术
宏基因组是生物环境中全部微生物的遗传物质的总和，即微生物群体的基因组，目前主要指细菌、古细菌和真菌的基因组总和。宏基因组学以微生物群体基因组为研究对象，研究微生物的遗传物质组成及微生物群落功能。近年来，随着高通量测序技术的发展和测序成本的降低，宏基因组测序技术已经逐渐渗透到诸多领域，人们对微生物菌群获得了全新认识，这些认识是依靠传统微生物培养方法无法获取的。微生物菌群宏基因组学的研究为医疗健康、环境能源和畜牧业等领域提供了重要的研究资源。
人和动物的体表和体内存在数量巨大且种类繁多的微生物，与健康关系密切。目前已知不同部位的微生物数量相差很大，据估算人体皮肤表面的微生物约为<107/cm2,唾液约为109/mL，胃和小肠上段(十二指肠和空肠)的微生物约为103-104/mL,小肠下段(回肠)约为108/mL，大肠(结肠)约为1011/mL。人体大部分的微生物是肠道微生物，甚至约90％的微生物都集中在结肠内。人体肠道排出的每克粪便含有约1千亿个细菌，粪便干重约三分之一为细菌。肠道微生物如今已成为人类和动物健康的研究热点，研究表明，肠道微生物能影响宿主的营养吸收和免疫功能等，与多种疾病密切相关，例如肥胖、糖尿病、炎症性肠病等。
由于取样和DNA提取的方便性，新鲜的粪便样品是目前肠道微生物宏基因组研究的主要样品。然而排出的粪便样品与体内肠道微生物有差异，尤其与胃和小肠部分(十二指肠、空肠、回肠)的微生物在数量和种类上都存在较大差异，因此，以粪便为对象的肠道微生物宏基因组学研究所能得到的结论具有局限性，不能真实体现体内肠道微生物的组成和功能，尤其不能反映胃和小肠内的微生物的真实情况。考虑到肠道是动物消化吸收的主要场所并且含有重要的免疫系统，随着肠道微生物宏基因组学研究的发展，人体的肠道内容物样品(例如胃肠道疾病手术时获取的样品)或者养殖动物的肠道内容物样品等，必定将越来越多地作为肠道微生物宏基因组学的研究对象，从而更深入地揭示微生物与宿主健康的关系。
动物的肠道环境及其所含微生物具有复杂性，导致在微生物基因组DNA提取和纯化时面临着问题，需要开发适合肠道内容物的宏基因组DNA提取的完整流程方法，确保DNA能够成功提取并且真实准确地反应肠道微生物的种类和丰度。目前商用的相关提取试剂盒均仅针对粪便样品而设计。相比于粪便样品，小肠内容物的样品有如下特点：(1)微生物含量少，相同体积样品的微生物数量仅为粪便样品的0.1％-1％甚至更少；(2)小肠内容物中包含大量未消化的食物颗粒和碎片，这将影响微生物DNA的提取，导致食物DNA污染；(3)小肠上皮细胞更新速度快，成熟的上皮细胞最终在绒毛顶端凋亡和脱落，采集样品时机械外力也容易导致小肠绒毛损伤和细胞脱落，肠道内容物样品中存在宿主细胞和宿主DNA碎片，导致宿主DNA污染；(4)肠道内容物中有小肠消化液和多种杂质，容易引起DNA的降解或者容易抑制后续分子实验酶的反应活性。综上所述，直接使用粪便样品试剂盒的方法处理肠道内容物样品，尤其是小肠段的内容物样品，难以成功获得高质量的宏基因组的DNA。
商用粪便样品DNA提取试剂盒已经针对粪便样品的特点进行了优化和改进，然而对于一些特殊的样品，杂质仍然残留并且影响下游的分子实验。在较早的研究中，提取的微生物群落的总DNA往往仅用于PCR实验，而PCR反应中所需的DNA仅作为扩增模板使用量很少，因此即使DNA的提取量很少或者残留部分杂质，还是能满足实验要求。但是对于高通量测序实验，宏基因组DNA的总量、纯度和完整性都必须满足更高的要求。另外，从成本上考虑，试剂盒的购买成本较高，显著增加了大量样本的宏基因组学研究的实验成本。
除上述问题外，商用的粪便样品试剂盒还存在细胞裂解破碎效率的问题，各种商用试剂盒所采取的微生物细胞的裂解破碎方法不同，难以保证相同的裂解效率，裂解破碎步骤的偏好性会导致最终获得的微生物种类和丰度信息有很大差异。试剂盒普遍采用的裂解原理包括表面活性剂在高温下进行的化学法裂解，在溶菌酶等生物酶的作用下进行的生物法裂解，以及玻璃珠剧烈震荡下的物理法裂解。比微生物纯菌种的基因组DNA提取要求更高的是，宏基因组提取要求尽量完整地破碎所有种类的微生物，即是说要尽量避免不同微生物物种的裂解破碎效率的偏好性，尤其对于难以破壁的微生物依然要有高效率，最终才能真实地反映环境微生物的组成。试剂盒往往采用的方法往往都存在裂解的偏好性，不能得到真实的物种丰度问题。
发明内容
本发明一个目的是提供一种从动物肠道内容物或粪便中提取微生物宏基因组DNA的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将动物肠道内容物或粪便经过差速离心，实现洗涤和富集微生物细胞；
2)将所述微生物细胞结合使用液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法进行细胞破碎，得到破碎后细胞；
3)先提取所述破碎后细胞的基因组DNA，再纯化所述基因组DNA，实现从动物肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA。
上述方法中，所述差速离心包括如下步骤：
1)-1、将动物肠道内容物或粪便与含有Tween80的生理盐水混匀，低速离心，收集上清液，即得到含有微生物细胞的上清液；
1)-2、将所述含有微生物细胞的上清液高速离心，收集沉淀，即得到微生物细胞。
以上步骤中，在食糜沉淀多次加入生理盐水(含0.1％Tween80)震荡混合并且低速离心，能够将样品中全部的微生物细胞回收更完全，尤其是附着在食糜颗粒表面的微生物细胞；多次加入生理盐水(含0.1％Tween80)重悬洗涤微生物细胞再高速离心富集，能够将细胞样品洗涤更干净，尤其是附着在细胞表面或周围的杂质等。
上述方法中，所述1)-1为如下：先将动物肠道内容物或粪便与含有Tween80的生理盐水混匀，低速离心，收集上清液和沉淀；再将所述沉淀与所述含有Tween80的生理盐水混匀，多次低速离心，且每次低速离心的样品为向上一次低速离心沉淀添加所述含有Tween80的生理盐水得到的混合物；合并所有低速离心获得的上清液，得到含有微生物细胞的上清液；
所述1)-2为如下：将所述含有微生物细胞的上清液高速离心，收集沉淀；再将所述沉淀与所述含有Tween80的生理盐水混匀，多次高速离心，且每次高速离心的样品为向上一次高速离心沉淀添加所述含有Tween80的生理盐水得到的混合物；收集最后一次高速离心沉淀，得到微生物细胞。
上述方法中，所述含有Tween80的生理盐水中Tween80的质量体积百分含量为0.1％；
或，所述多次低速离心的次数为2-4次；
或，所述低速离心的条件为0-4℃、200-300g离心10-20min；
或，所述多次高速离心的次数为2-3次；
或，所述高速离心的条件为0-4℃、17000-21000g离心10-20min。
上述方法中，所述结合使用液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法为将所述微生物细胞依次经液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法进行破碎。
上述方法中，所述液氮反复冻融裂解法为将所述微生物细胞在液氮中5-15min和50-65℃水浴5-15min中反复冻融3-6次，得到物理破碎后细胞；
或，所述玻璃珠研磨法为先将所述物理破碎后细胞加入0.5mm玻璃珠、0.1mm的玻璃珠和细胞裂解液震荡，再将震荡产物在90-95℃裂解10-20min，再离心收集玻璃珠研磨上清液和玻璃珠研磨沉淀；
或，所述裂解液高温裂解法为将所述玻璃珠研磨沉淀加入所述细胞裂解液，震荡，再将震荡产物在90-95℃裂解10-20min，再离心收集裂解液高温裂解上清液；再将所述玻璃珠研磨上清液和所述裂解液高温裂解上清液合并，得到含有宏基因组DNA的上清液；
和/或，所述玻璃珠研磨法和所述裂解液高温裂解法的次数为1-2次。
上述方法中，所述纯化采用磁珠纯化。
上述方法中，所述动物为禽类动物或软体动物。
上述方法中，所述肠道十二指肠、空肠、回肠、盲肠和/或结直肠。
由上述方法制备的宏基因组DNA也是本发明保护的范围；
或所述的宏基因组DNA在制备高通量测序文库中的应用也是本发明保护的范围。
或所述的宏基因组DNA在PCR扩增或高通量测序中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的优点好处：普通的粪便微生物宏基因组DNA的提取方法难以直接适用于肠道内容物微生物宏基因组DNA，本发明优化了步骤流程方法：(1)添加了微生物细胞的洗涤和富集步骤，有利于微生物DNA的提取，减少了DNA的降解，降低了宿主和食物DNA的污染；(2)组合多种微生物细胞裂解破碎的方法，降低宏基因组DNA的物种偏好性；(3)增加纯化的步骤，保证DNA的纯度，可以满足构建第二代高通量测序文库的DNA要求；(4)适用于多种动物的粪便和肠道内容物样品。
附图说明
图1为鸡肠道宏基因组的DNA凝胶电泳。
图2为PCR扩增产物凝胶电泳。
图3为鸡肠道内容物洗涤液降解DNA样品的凝胶电泳图。
图4为鸡肠道微生物细胞和洗涤液的DNA凝胶电泳。
图5为中华圆田螺和福寿螺的肠道微生物宏基因组DNA琼脂糖凝胶电泳。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中含有0.1％Tween80的生理盐水为向质量体积百分含量为0.9％的NaCl水溶液中加入Tween80得到的溶液；且Tween80在溶液中的质量体积百分含量为0.1％。
下述实施例中生理盐水为质量体积百分含量为0.9％的NaCl水溶液。
实验例1、鸡肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA
一、鸡肠道十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结直肠肠道内容物的收集
通过解剖获取新鲜的各种鸡肠道内容物，加入鸡肠道内容物2倍体积的4℃预冷的含有0.1％Tween80的生理盐水，充分震荡混匀样品，得到内容物样品。
分别取约5-10g十二指肠内容物样品、约10-20g空肠内容物样品和约10-20g回肠内容物样品至离心管用于后续步骤；取约0.5-1.0g盲肠内容物样品、约0.5-1.0g结直肠内容物样品至离心管用于后续步骤。
二、鸡肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA
1、差速离心洗涤和富集肠道微生物细胞
1)低速离心去除食糜颗粒等杂质
在上述一的各个内容物样品中加入20mL 4℃预冷含0.1％Tween80的生理盐水，充分震荡混匀样品，在4℃、200g条件下低速离心10min，收集上清液(含有微生物细胞)；向沉淀(食糜颗粒沉淀)中加入20mL 4℃预冷含0.1％Tween80的生理盐水在4℃、200g条件下低速离心10min，收集上清液(含有微生物细胞)；再次向第二次离心沉淀中加入在4℃、200g条件下低速离心10min，收集上清液(含有微生物细胞)，共离心3次；混合3次上清液，为含有微生物细胞的上清液。
2)高速离心富集微生物细胞
将上述1)的含有微生物细胞的上清液在4℃、19000g条件下高速离心15min，收集沉淀，弃上清，实现富集微生物细胞；向上述沉淀中加入1.5mL 4℃预冷含0.1％Tween80的生理盐水，重悬微生物细胞后，4℃、19000g条件下高速离心15min，收集沉淀，再向第二次离心沉淀中加入1.5mL 4℃预冷含0.1％Tween80的生理盐水，重悬微生物细胞后，4℃、19000g条件下高速离心15min，收集沉淀，得到肠道微生物细胞。
上述肠道微生物细胞可以直接用于下面步骤的裂解破碎，或者液氮冷冻后暂时保存于-80℃超低温冰箱。
2、肠道微生物细胞的裂解破碎
1)、液氮反复冻融裂解
向约50uL上述1得到的肠道微生物细胞中加入200uL 4℃的生理盐水(加入量能没过细胞即可)，再在液氮(-196℃)5min和65℃水浴5min条件下交替处理并反复冻融5次，得到物理破碎后细胞。
2)、玻璃珠和细胞裂解液破碎
向约250uL上述物理破碎后细胞中加入0.2g 0.5mm和0.5g 0.1mm的玻璃珠以及600uL细胞裂解液(QIAGEN公司ASL缓冲液)，剧烈震荡5min(ScientificIndustries，Inc.公司Vortex-Genie 2旋涡振荡器，Mo Bio Labs-13000-V1-24 24离心管水平震荡头)，每30s停顿数秒再继续震荡；将震荡产物在95℃条件下裂解15min，19000g条件下离心5min，转移上清液至新的离心管，保留沉淀(含有玻璃珠和细胞沉淀)。
3)、细胞裂解液裂解
向上述2)得到的沉淀(主要是玻璃珠，细胞沉淀<50uL)中加入400uL细胞裂解液，剧烈震荡5min(Scientific Industries，Inc.公司Vortex-Genie 2旋涡振荡器，Mo BioLabs-13000-V1-24 24离心管水平震荡头)，每30s停顿数秒再继续震荡，95℃条件下裂解15min,19000g条件下离心5min,转移上清液与2)得到的上清液合并，得到含有宏基因组DNA的上清液。
3、宏基因组DNA的提取
在上述2得到的含有宏基因组DNA的上清液中加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1，pH 8.0)，轻柔颠倒混合20次，在13000g离心10min；将离心后的上层清液转移到新的2mL离心管中，注意不要吸到沉淀；在转管的清液中加入等体积的氯仿：异戊醇溶液(24：1)，轻柔颠倒混合20次，在13000g离心10min将离心后的上层清液转移到新的1.5mL离心管中，注意不要吸到沉淀；在转管的清液中加入2/3体积的异丙醇，轻柔颠倒混合，在-20℃冰箱中沉淀2h；在13000g离心10min；用1mL的70％的乙醇洗涤沉淀，13000g离心5min；用移液器移除上清液，用1mL 70％的乙醇再洗涤一次，13000g离心5min，用移液器移除上清，放置5-10min晾干；加入50uL TE溶液(预先加入1％TE体积的10mg/mL RNase A)溶解DNA，37℃条件下孵育30min，消化残留的RNA，得到宏基因组DNA。
4、DNA纯化
对3获得的宏基因组DNA再进行一遍纯化，进一步去除抑制测序文库制备试剂盒酶活的杂质，具体如下：
在上述3得到的50uL宏基因组DNA中加入温度与室温平衡的80uL的磁珠
(Beckman Coulter公司AgencourtAMPure XP)，按照磁珠的说明书进行DNA的纯化，最后用50uL 1：10稀释的TE缓冲液回收纯化后的DNA，得到纯化后宏基因组DNA。
缺少纯化步骤的宏基因组DNA样品可能由于杂质影响，导致无法完成正常的测序文库的构建。
采用上述方法分别得到十二指肠内容物纯化宏基因组DNA、空肠内容物纯化宏基因组DNA、回肠内容物纯化宏基因组DNA、盲肠内容物纯化宏基因组DNA和结直肠内容物纯化宏基因组DNA。
三、检测
1、DNA的浓度
用1％的琼脂糖凝胶，GelRed作为核酸荧光染料，120v电压条件，电泳30min，检测上述二的4得到的各个纯化宏基因组DNA；用超微量分光光度计(Thermo FisherScientific公司，NanoDrop)，检测DNA的230nm，260nm和280nm的吸光值A260，A280和A280，并计算A260/280,A260/230；用荧光定量仪(Thermo Fisher Scientific公司，Qubit)检测DNA的浓度，结果如表1所示。
表1.宏基因组DNA检测
2、宏基因组DNA电泳检测
上述二的4得到的各个纯化宏基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳检测。以按照粪便试剂盒(QIAGEN公司，QIAamp DNA Stool Mini Kit)的Isolation of DNA from Stool forPathogen Detection的操作流程分别提取十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结直肠内容物宏基因组DNA为对照。
结果如图1所示，实验组b1、b2、b3、b4和b5分别为按照上述二的方法得到的十二指肠内容物纯化宏基因组DNA、空肠内容物纯化宏基因组DNA、回肠内容物纯化宏基因组DNA、盲肠内容物纯化宏基因组DNA和结直肠内容物纯化宏基因组DNA，对照组a1、a2、a3、a4、a5是按照粪便试剂盒(QIAGEN公司，QIAamp DNA Stool Mini Kit)的Isolation of DNA fromStool for Pathogen Detection的操作流程分别提取十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结直肠内容物宏基因组DNA，可以看出，实验组b1、b2、b3、b4和b5均检测到宏基因组DNA，而对照组检测较为合格的盲肠和结直肠的宏基因组DNA，但无法检测到合格的十二指肠、空肠、回肠的宏基因组DNA。
上述结果表明，本发明的宏基因组DNA提取效果好。
四、宏基因组DNA用于PCR扩增
用1uL的b1、b2、b3、b4和b5纯化宏基因组DNA作为模板，使用正向引物5’-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3’和反向引物5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’进行细菌的16S rRNA基因V4可变区的循环数为25次的PCR扩增，用2％的琼脂糖凝胶，GelRed作为核酸荧光染料，120v电压条件电泳30min，检测PCR扩增产物。
结果如图2所示，c1、c2、c3、c4、c5分别为以十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结直肠内容的纯化宏基因组DNA为模板扩增的16S rRNA基因V4可变区，目标条带清晰，条带大小约为300bp。
表明，本发明的方法提取的宏基因组DNA可用于目的基因的PCR检测，PCR产物可用于扩增子的高通量测序。
五、鸡肠道微生物宏基因组DNA用于高通量测序
1、宏基因组DNA的提取
按照上述一的方法收集42只成年鸡的十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结直肠内容物，总共210个样品，再按照上述二的方法进行各个样品的宏基因组DNA的提取，得到各个样品纯化宏基因组DNA。
2、建立测序文库并测序
1)将上述每个样品纯化宏基因组DNA转移至打断专用管，使用超声波DNA破碎仪(Thermo Fisher Scientific公司，Covaris S220)，调整参数打断DNA，打断的目标DNA片段主要集中在300-500bp区域；
2)用高通量测序文库制备试剂盒(NEB公司，NextUltraTM II DNA Library PrepKit for Illumina)制备测序文库，按照说明书进行操作，用磁珠筛选300-500bp的文库大小；普通样品选择5-7个循环进行PCR扩增，个别样品DNA总量低至50ng可选择10个循环，210个样品最终都满足测序文库制备要求。测序文库进行常规质检后，在高通量测序仪(Illumina Hiseq 2500)上进行测序，每个样品获得约6Gb的原始测序数据。
3)获得宏基因组的原始测序数据后，利用计算机对数据进行宿主和食物DNA分析。首先，过滤去除其中的测序接头和低质量序列部分，保留高质量的序列(每条序列的平均错误率低于0.001)，平均每个样品的高质量数据量约为5GB；然后进行后续序列比对分析，使用比对软件BWA-MEM对宿主(鸡)和食物(大豆、玉米、小麦)的基因组序列进行比对，统计宏基因组中能比对上宿主和食物DNA的总比例，结果如表2所示。
表2.宏基因组DNA中宿主和食物DNA的总比例
本发明方法提取的宏基因组DNA可以获得预期的数据量和数据质量，而且数据中宿主和食物的污染DNA所占比例较小，即宏基因组数据的有效数据量高。有效数据中70％以上的序列在GenBank的NT核酸数据库中具有同源序列可以进行微生物分类，可分类的序列中有90％以上的序列来自于4个微生物门类：厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门，符合文献报道的鸡肠道微生物的主要门类，该测序数据可用于后续宏基因组学的深度分析。
实施例2、不同裂解破碎法和其得到宏基因组DNA所属微生物分析
本实施例以鸡的新鲜粪便样品为样本。
一、提取宏基因组DNA
1、差速离心洗涤和富集微生物细胞
取鸡的新鲜粪便样品2g，按照实验例1二的1的差速离心洗涤和富集微生物细胞，得到微生物细胞。
2、微生物细胞的裂解破碎
将上述1得到的微生物细胞分为4组按照如下4种方法裂解破碎，具体是分装于4个2mL离心管：
方法1：用800uL细胞裂解液(QIAGEN公司ASL缓冲液)，在70℃条件下裂解15min，19000g条件下离心5min，收集上清液；
方法2：用800uL细胞裂解液(QIAGEN公司ASL缓冲液)，在95℃条件下裂解15min，19000g条件下离心5min，收集上清液；
方法3：加入0.2g 0.5mm和0.5g 0.1mm的玻璃珠以及800uL细胞裂解液(QIAGEN公司ASL缓冲液)，剧烈震荡5min(Scientific Industries，Inc.公司Vortex-Genie2旋涡振荡器，Mo Bio Labs-13000-V1-24 24离心管水平震荡头)，每震荡30s停顿数秒，然后在95度条件下裂解15min，19000g条件下离心5min，收集上清液；
方法4：在离心管中加入200uL 4℃的生理盐水，将离心管中的细胞在液氮5min和65℃水浴5min条件下交替处理并反复冻融5次，通过多次冻融的方法进行细胞的物理破碎；再加入800uL细胞裂解液(QIAGEN公司ASL缓冲液)，在95度条件下裂解15min；19000g条件下离心5min，收集上清液。
3、DNA提取：按照实验例1二的3进行；
4、DNA纯化：按照实验例1二的4进行；
二、构建测序文库并测序分析
1、将各个方法得到的纯化宏基因组DNA转移至打断专用管，使用超声波DNA破碎仪(Thermo Fisher Scientific公司，Covaris S220)，调整参数打断DNA，打断的目标DNA片段主要集中在300-500bp区域；用高通量测序文库制备试剂盒(NEB公司，Next UltraTMII DNALibrary Prep Kit for Illumina)制备测序文库，按照说明书进行操作，用磁珠筛选300-500bp的文库大小，PCR循环数控制在6个循环完成测序文库的构建。测序文库进行常规质检后，在高通量测序仪(Illumina Hiseq 2500)上进行测序。
2、获得宏基因组的原始测序数据后，利用计算机对数据进行宿主和食物DNA分析。过滤去除其中的测序接头和低质量序列部分，保留高质量的序列(每条序列的平均错误率低于0.001)。随机抽取每个样品的10000条序列，用比对软件BLASTN与GenBank的NT核酸数据库进行比对，去掉无匹配结果的序列后，统计剩余的每条序列的匹配结果(e-value<1e-5)中最佳匹配序列所属的微生物的门类，各样品中最主要的3个微生物门类所占比例的百分含量(该方法的技术三平行测试的标准差小于0.4)，本实验的4个方法结果如表3所示。
表3.微生物细胞裂解破碎方法的影响
可以看出，方法1和方法2的对比，表明相同的细胞裂解液在不同裂解温度(70℃和95℃)下有较大的裂解差异，尤其在拟杆菌门和厚壁菌门的丰度差别较大。70℃和95℃均为细胞裂解液(QIAGEN公司ASL缓冲液)的推荐工作温度，在粪便试剂盒(QIAGEN公司，QIAampDNA Stool Mini Kit)的Isolation of DNA from Stool for Pathogen Detection的标准流程中使用ASL缓冲液在70℃裂解5min，对于难以裂解的细菌推荐在95℃裂解5min。方法3在ASL缓冲液在95℃裂解15min的基础上，增加了玻璃珠研磨法对样品进行破碎。方法4在ASL缓冲液在95℃裂解15min的基础上，增加了液氮反复冻融5次的物理破碎步骤。液氮和玻璃珠研磨法是较为常见的物理破碎方法。玻璃珠研磨法是土壤微生物提取试剂盒(例如MPbio公司的FastDNA spin kit for soil)普遍采用的方法，可以增加难以破碎的细胞的破碎效率，也广泛应用于粪便微生物宏基因组的提取。对比方法2、方法3和方法4，表明使用单一的细胞裂解方法容易产生的较大的偏好性。多方法结合以及重复裂解步骤的方式提高微生物细胞裂解破碎的完全性，有助于获得更真实的微生物丰度信息。
实验例3、摸索差速离心洗涤步骤重要性
一、提取宏基因组DNA
1、收集未差速离心洗涤的回肠内容物的洗涤液
取0.5g鸡肠道回肠内容物样品，加入1mL的4℃预冷的生理盐水(含0.1％Tween80)，充分震荡混匀样品，在4℃和19000g的条件下高速离心15min，沉淀食糜和微生物细胞，收集回肠内容物的洗涤液。
2、实验例1获得的盲肠内容物纯化宏基因组DNA样品，将浓度稀释为50ng/uL，成为DNA样品d1。
浓度为50ng/uL的DNA分子量标准品(天根生化科技有限公司，D15000)为DNA样品e1。取5uL DNA样品d1和e1，分别与5uL生理盐水(含0.1％Tween80)混合，在室温反应30min，得到样品d2和e2。
取5uL DNA样品d1和e1，分别与1得到的5uL回肠内容物的洗涤液混合，在室温反应30min，得到样品d3和e3。
用1％的琼脂糖凝胶，GelRed作为核酸荧光染料，120v电压条件电泳30min检测。
结果如图3所示，可以看出，本发明方法获得的纯化宏基因组样品d1和DNA分子量标准品e1与生理盐水(含0.1％Tween80)在室温反应30min后，凝胶电泳检测没有出现明显的变化，而宏基因组DNA样品d1和DNA分子量标准品e1与回肠内容物的洗涤液室温反应30min后，几乎全部降解。取5uL DNA样品d1和e1，分别与5uL回肠内容物的洗涤液混合，在4℃反应10min和30min进行测试，均发现DNA部分降解的现象。
上述结果表明，小肠内容物的物质容易导致DNA的降解，通过洗涤微生物细胞的方法，可以减少这些物质的对宏基因组DNA提取的影响，提高微生物细胞裂解后的DNA的稳定性，因此，本发明方法采用的差速离心效果更好。
实验例4、摸索洗涤微生物细胞步骤重要性
一、样本制备
本发明方法获得样本：按照实施例1的一的方法采集5只1日龄小鸡的十二指肠内容物样品后混合，按照实施例1的二的方法，获得纯化宏基因组样品j1。
洗涤液样本：按照实施例1的一的方法采集5只1日龄小鸡的十二指肠内容物样品后混合，按照按照实施例1的二的1差速离心洗涤和富集肠道微生物细胞，收集第三次高速离心后上清液；再按照实施例1的二的3和4提取高速离心后上清液的DNA，并纯化得到样品j2。
二、电泳检测
用1％的琼脂糖凝胶，GelRed作为核酸荧光染料，120v电压条件电泳30min，检测提取的DNA。
琼脂糖凝胶电泳的结果如图4所示，十二指肠微生物细胞经过洗涤和富集步骤，所提取的DNA样品j1有大于15kb的基因组条带；十二指肠微生物洗涤液提取的DNA样品j2中含有DNA碎片。
三、高通量测序
对于DNA样品j1，使用超声波DNA破碎仪(Thermo Fisher Scientific公司，Covaris S220)，调整参数打断DNA，打断的目标DNA片段主要集中在300-500bp区域，然后用于测序文库的构建。对于DNA样品j2，直接用于测序文库的构建。
用高通量测序文库制备试剂盒(NEB公司，NextUltraTM II DNA Library PrepKiAfor Illumina)制备测序文库，按照说明书进行操作，用磁珠筛选300-500bp的文库大小；测序文库进行常规质检后，在高通量测序仪(Illumina Hiseq 2500)上进行测序。
获得宏基因组的原始测序数据，过滤去除其中的测序接头和低质量序列部分，保留高质量的序列(每条序列的平均错误率低于0.001)；然后进行后续序列比对分析，使用比对软件BWA-MEM对宿主(鸡)和食物(大豆、玉米、小麦)的基因组序列进行比对，统计获得的数据中能比对上宿主和食物DNA的总比例。
结果如下：j1样本宏基因组中宿主和食物DNA的总比例80.75％，可获得约19.25％的微生物DNA数据量；而j2样本宏基因组中宿主和食物DNA的总比例为99.10％，微生物DNA数据量少于1％。根据所提取的微生物DNA的比例以及所提取的DNA总量计算，本肠道内容物样品中可提取的微生物细胞DNA的总量不及微生物细胞外的宿主和食物DNA的1.5％，本发明的方法可以使微生物DNA的有效数据量提高10倍以上。
本实验例的样品非常特殊，1日龄的鸡肠道细小内容物少，采集过程中的肠道也容易损伤，提取的DNA碎片化且宿主DNA污染严重，如未经过有效的实验流程处理，测序数据几乎全为无效数据。由于普通的粪便试剂盒提取标准方法中没有进行微生物细胞的洗涤和富集的步骤，原始内容物样品中残留较多宿主和一些食物DNA碎片被提取，而微生物细胞较少，因此难以获得合格的肠道微生物宏基因组DNA，如图1的a1、a2、a3所示。本实验例所示，通过微生物细胞离心洗涤的方法，可以减少提取的宿主和食物DNA的比例，提高微生物宏基因组的有效数据量。
实施例5、软体动物的肠道内容物宏基因组DNA的提取
一、肠道内容物的收集
通过解剖获取的新鲜的中华圆田螺和福寿螺的肠道内容物各2g，加入样品2倍体积的4℃预冷的生理盐水(含0.1％Tween80)，充分震荡混匀样品，分别得到混匀后的肠道内容物。
二、宏基因组DNA的提取
采用实施例1的二的方法对混匀后肠道内容物提取，得到纯化宏基因组DNA。
三、检测
1、电泳检测
宏基因组DNA的琼脂糖糖凝胶电泳图如图5所示，h1为中华圆田螺的肠道内容物宏基因组DNA样品，h2为福寿螺的肠道肠道内容物宏基因组DNA样品，可以看出，本发明的方法可用于提取软体动物的肠道内容物的宏基因组DNA。
2、浓度检测
检测h1的浓度为15.20ng/uL，总量为760ng，A260/280和A260/280分别为2.09和1.60；检测h2的浓度为8.02ng/uL，总量为401ng，A260/280和A260/280分别为2.04和1.53。
3、构建测序文库并测序分析
将2个DNA样品h1和h2分别转移至2个打断专用管，使用超声波DNA破碎仪(ThermoFisher Scientific公司，Covaris S220)，调整参数打断DNA，打断的目标DNA片段主要集中在300-500bp区域；用高通量测序文库制备试剂盒(NEB公司，NextUltraTM II DNA LibraryPrep Kit for Illumina)制备测序文库，按照说明书进行操作，用磁珠筛选300-500bp的文库大小；PCR循环数控制在7个循环成功完成测序文库的构建。测序文库进行常规质检后，在高通量测序仪(Illumina Hiseq 2500)上可完成测序。
结果样品h1和h2分别获得17.6Gb和17.4Gb的原始数据量。利用计算机对原始数据进行过滤，其中过滤的测序接头约为0.2％，测序低质量序列约为25％，宿主和食物DNA小于2％，最终保留高质量的微生物宏基因组序列(每条序列的平均错误率低于0.001)数据量的比例约为73.8％。从保留的高质量数据中随机抽取10000条序列，用比对软件BLASTN与GenBank的NT核酸数据库进行比对，去掉无匹配结果的序列后，统计剩余的每条序列的匹配结果(e-value<1e-5)中最佳匹配序列所属的微生物的门类，计算样品中最主要的3个微生物门类序列所占的百分含量。h1样品的最主要的3个微生物门类为变形菌门(36.1％)、拟杆菌门(34.0％)、放线菌门(13.6％)。h2样品最主要的3个微生物门类为变形菌门(84.4％)、放线菌门(2.7％)、螺旋体门(2.4％)。测序得到数据量和数据质量等各方面满足预期需求，数据可用于宏基因组学的深入分析。
Claims (7)
1.一种从动物肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA的方法，包括如下步骤：
1）将动物肠道内容物经过差速离心，实现洗涤和富集微生物细胞；
2）将所述微生物细胞结合使用液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法进行细胞破碎，得到破碎后细胞；
3）先提取所述破碎后细胞的基因组DNA，再纯化所述基因组DNA，实现从动物肠道内容物中提取微生物宏基因组DNA；
所述差速离心包括如下步骤：
1）-1为如下：先将所述动物肠道内容物与含有Tween80的生理盐水混匀，低速离心，收集上清液和沉淀；再将所述沉淀与所述含有Tween80的生理盐水混匀，多次低速离心，且每次低速离心的样品为向上一次低速离心沉淀添加所述含有Tween80的生理盐水得到的混合物；合并所有低速离心获得的上清液，得到含有微生物细胞的上清液；
1）-2为如下：将所述含有微生物细胞的上清液高速离心，收集沉淀；再将所述沉淀与所述含有Tween80的生理盐水混匀，多次高速离心，且每次高速离心的样品为向上一次高速离心沉淀添加所述含有Tween80的生理盐水得到的混合物；收集最后一次高速离心沉淀，得到微生物细胞；
所述含有Tween80的生理盐水中Tween80的质量体积百分含量为0.1%；
所述多次低速离心的次数为2-4次；
所述低速离心的条件为0-4℃、200-300g离心10-20 min；
所述多次高速离心的次数为2-3次；
所述高速离心的条件为0-4℃、17000-21000g离心10-20 min；
所述结合使用液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法为将所述微生物细胞依次经液氮反复冻融裂解法、玻璃珠研磨法和裂解液高温裂解法进行破碎；
所述液氮反复冻融裂解法为将所述微生物细胞在液氮中5-15 min和50-65 ℃水浴5-15 min中反复冻融3-6次，得到物理破碎后细胞；
所述玻璃珠研磨法为先将所述物理破碎后细胞加入0.5 mm玻璃珠、0.1 mm的玻璃珠和细胞裂解液震荡，再将震荡产物在90-95℃裂解10-20 min，再离心收集玻璃珠研磨上清液和玻璃珠研磨沉淀；
所述裂解液高温裂解法为将所述玻璃珠研磨沉淀加入所述细胞裂解液，震荡，再将震荡产物在90-95℃裂解10-20 min，再离心收集裂解液高温裂解上清液；再将所述玻璃珠研磨上清液和所述裂解液高温裂解上清液合并，得到含有宏基因组DNA的上清液；
所述玻璃珠研磨法和所述裂解液高温裂解法的次数为1-2次。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 所述纯化采用磁珠纯化。
3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于： 所述动物为禽类动物或软体动物。
4.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于： 所述肠道为十二指肠、空肠、回肠、盲肠和/或结直肠。
5.由权利要求1-4任一所述方法制备的宏基因组DNA。
6.权利要求5所述的宏基因组DNA在制备高通量测序文库中的应用。
7.权利要求5所述的宏基因组DNA在PCR扩增或高通量测序中的应用。
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