CN101591650A - 一种用于从生物组织/细胞/血液样品中分离rna的试剂 - Google Patents

Abstract

一种从生物组织/细胞/血液样品中分离RNA的试剂，它是由盐酸胍76.424％、二硫苏糖醇0.4627％、硫代硫酸钠0.2723％、碳酸氢钠42％、水饱和酚4.7％、水加至100％重量配比的原料制成。本发明试剂能够在室温环境下长期稳定保存。发明人将本发明试剂与进口TRIzol试剂进行了对比实验，实验结果表明两种产品稳定性相近，提取得到的总RNA电泳带型一致，OD260/OD280比值无显著性差异，以提取的RNA为模板进行反转录－聚合酶链反应等下游实验均获得满意效果，降低了产品成本。用本发明试剂可以从动物的肝脏组织、脑组织、血液、胆汁中分离提取RNA，也可从植物的组织中分离提取RNA。

Description

一种用于从生物组织/细胞/血液样品中分离RNA的试剂

技术领域

本发明属于含有两个或多个的单核苷酸单元的化合物，具有以核苷基的糖化合物基团连接的单独的磷酸酯基或多磷酸酯基技术领域，具体涉及到以核糖基作为糖化物基团。

背景技术

在真核生物中，RNA是遗传信息中间载体，参与蛋白质合成以及基因表达调控等过程，而对一部分病毒(RNA病毒)而言，RNA是其唯一的遗传信息载体。随着分子生物学研究技术的不断发展，在RNA水平对生命事件进行深入研究逐渐成为生命科学领域的研究重点。RNA提取技术不仅是分子生物学技术的重要组成部分，也是功能基因组学研究技术的重要基础。从RNA水平研究生物体内基因的调控机制，已成为分子生物学研究的一个重要手段。在此类研究中，分离和提取生物样品中RNA是基础及关键步骤，分离提取的RNA的丰度、含量、质量和完整性都直接决定着后续研究工作的成功与否。由于RNA酶广泛存在且极难灭活，对实验中所提取的RNA质量和数量均时刻造成严重威胁，也对开展进一步的深入研究造成巨大影响。在实际工作中如何能够高效快捷地分离提取多种类生物样品中RNA也是相关科研工作的“热点”。

目前，有关RNA提取的方法已有众多报道，其中涉及到真核生物组织或细胞样品以及病毒RNA的提取。细胞总RNA制备的方法有多种，包括异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法、盐酸胍-有机溶剂法、氯化锂-尿素法、热酚法、异硫氰酸胍法-酚-氯仿-步法(acid guanidinium phenol chloroform，AGPC)以及TRIzol试剂提取法等。在这些方法中，多以强变性剂如盐酸胍或异硫氰酸胍等裂解细胞，以便快速从细胞中分离完整的RNA，同时也将内源性RNA酶溶解和变性，抑制RNA的降解。但早期硫氰酸胍-氯化锂法等方法由于耗时长且步骤繁琐(需超速离心)，之后几乎被Chomczynski和Sacchi(1987)研发的AGPC法完全替代，目前AGPC法也是实验室提取总RNA的最常用方法之一。异硫氰酸胍法制备真核细胞总RNA，是将已知最强的RNase酶抑制剂异硫氰酸胍、还原剂β-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，使核蛋白充分变性并与RNA有效解离，同时抑制RNA的降解。在酸性酚和氯仿的作用下，异硫氰酸胍被抽提，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相，进一步在异丙醇的作用下，RNA浓缩沉淀。与之前的传统方法相比，AGPC法成本较低，操作简单，分离效率高，无需特殊的设备，抽提时间可缩短至4小时，并可同时对多个样本进行抽提。目前已有众多成熟的商品化试剂(TRIzol)及试剂盒供选择，但价格仍然相对较高。但是对于富含甘油三酯的脂肪组织或提取RNA的胍基盐被细胞内多糖和蛋白多糖不同程度的污染的情况下，AGPC法可能也无法获得高质量RNA。在这些方法的基础上，新的改良技术不断出现。如SDS-酚改良法也常用于生物样品RNA的分离提取，该方法操作简单、高效快速，也无需超速离心和多次酚-氯仿抽提。但以上方法仍然无法较好地解决分离产物中杂质较多、酚类物质去除不彻底等问题，并可能对下游实验造成一定的不利影响。

专利申请号为971083665的中国专利，公布了一种总RNA分离试剂以及提取总RNA的方法。该试剂以异硫氰酸胍、盐酸胍两种RNA酶的高效抑制剂为主要原料，以SDS和SLS为去垢剂，使用柠檬酸三钠、乙酸钠、冰醋酸提供离子并调节pH值，以巯基乙醇作为抗氧化剂，使用消毒双蒸水和苯酚作为溶剂。在此溶液中，各组份的浓度(重量百分浓度)分别为抑制剂16～65％、去垢剂0.2～0.7％、pH调节剂0.005～0.02％、抗氧化剂0.2～0.5％、消毒双蒸水10～35％、苯酚12～46％。该专利还涉及一种使用该试剂分离提取总RNA的方法，其基本步骤如下：(1)使用该试剂预处理生物样品；(2)用萃取剂氯仿和异戊醇萃取；(3)离心，取上层水相加入异丙醇再次萃取；(4)离心，得白色沉淀即为总RNA；(5)使用乙醇漂洗RNA沉淀并干燥；(6)加入20μL的RNA保护剂溶解RNA沉淀，低温储藏。苯酚暴露于日光和空气中极易发生氧化和降解，只有保存于-20℃以下环境或加入保护剂(8-羟基喹啉)才能保持其稳定性，这限制了苯酚用于RNA提取实验。

专利申请号为200710035694的中国专利，公开了一种RNA分离试剂以及使用该试剂分离提取生物样品总RNA的方法。该试剂主要由RNA异硫氰酸胍抑制剂、SDS和SLS去垢剂、pH调节剂(柠檬酸三钠、乙酸钠和冰醋酸)构成，还包括聚乙烯吡咯烷酮，以酸性水饱和苯酚作为溶剂。在加入溶剂前，各组份浓度分别为RNA抑制剂4M，SDS和SLS分别为2％和0.1％(重量百分浓度)，聚乙烯吡咯烷为1％-3％，加入等体积酸性水饱和酚以及1/5体积的2M酸钠混匀，该溶液pH值为3.2～3.8。该专利还涉及一种使用该试剂分离提取总RNA的方法，其基本步骤如下：(1)使用该试剂预处理动物或植物组织样品，并加入变性剂β-巯基乙醇；(2)用萃取剂氯仿和异戊醇萃取；(3)离心取上层水相，加入异丙醇和高盐(柠檬酸钠和氯化钠)混合液萃取；(4)离心得白色沉淀即为RNA沉淀；(5)使用乙醇漂洗RNA沉淀并干燥；(6)加入20μL焦磷酸乙二酯处理水溶解RNA沉淀，低温储藏。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述分离RNA的试剂的缺点，提供一种分离速度快、分离效率高、产品成本低的用于从生物组织/细胞/血液样品中分离RNA的试剂。

解决上述技术问题所采用的技术方案它是由下述重量配比的原料制成：

盐酸胍                                76.424％

二硫苏糖醇                            0.4627％

硫代硫酸钠                            0.2723％

碳酸氢钠                              42％

水饱和酚                              4.7％

水                                    加至100％。

上述配比中的盐酸胍是一种中强的变性剂及核酸酶的强抑制剂，它可以使核蛋白充分变性后与核酸彻底分离，同时，细胞破裂释放的内源性RNA酶活性也被盐酸胍有效抑制，可从富含RNase的组织中提取出完整的RNA。二硫苏糖醇和硫代硫酸钠为还原剂，可以有效地打断多酚氧化酶的二硫键而使其失活，保护多酚不被氧化，有利于彻底清除多酚类杂质，硫代硫酸钠为pH调节剂，能维持缓冲体系中pH值为3.0～3.8。

上述用于从生物组织/细胞/血液样品中分离RNA的试剂的制备方法如下：

取盐酸胍、二硫苏糖醇、硫代硫酸钠、碳酸氢钠加入到烧瓶中，加入去离子水，搅拌至彻底溶解，加入水饱和酚，去离子水加至100％，搅拌混匀，制备成用于从生物组织/细胞/血液样品中分离RNA的试剂，4℃下或室温保存备用，4℃下保存有效期为一年，室温保存有效期为3个月。

应用本发明提供的分离提取RNA的方法可以快速、简捷、高效的提取多种类生物样品RNA，而且降低了研究成本。

采用本发明试剂从生物组织/细胞/血液样品中分离提取RNA的方法如下：

1、用本发明试剂预处理生物组织、细胞或血液样品。

2、加入100μL氯仿振荡混匀10秒，室温静置5分钟，4℃，12,000转离心10分钟。

3、取上层水相至新的离心管，加入等体积异丙醇并颠倒混匀10秒，室温静置5分钟，4℃下，12,000转离心10分钟。

4、弃上清液得白色沉淀，即为RNA沉淀。加入1mL质量浓度为75％的乙醇洗涤沉淀，4℃下，12,000转离心5分钟，弃乙醇。

5、加入1mL无水乙醇洗涤沉淀，4℃下，12,000转离心5分钟，弃乙醇，超净台中气流干燥或真空干燥15分钟。

6、加入20μL经过1％焦磷酸乙二酯处理的去离子水溶解RNA，-80℃储藏备用。

如上所述，该方法通过加入氯仿萃取组织匀浆，使其成为两相(水相和有机相)。在pH值为3.0-3.8、氯仿浓度为20％的情况下，分离RNA效果最佳。酸性溶液在破坏细胞膜的同时可以维持RNA稳定性，有助于DNA溶于有机相内。pH值和有机溶剂的浓度过高或过低都将造成杂质残留，产物需反复多次分离进行纯化，导致RNA产量和质量降低，显著影响RNA分离效果。在酸性环境中，二硫苏糖醇和硫代硫酸钠可以有效抑制多酚类物质的氧化反应，当加入有机溶剂后，通过离心将RNA浓缩在上层水相中。

该方法包括进一接使用异丙醇萃取前一步骤生成的水相，从而有效析出RNA沉淀。由于RNA不溶于有机溶剂，通过使用75％乙醇和无水乙醇洗涤RNA沉淀进一步去除多糖类等杂质。

本发明试剂能够在室温环境下长期稳定保存。发明人将本发明试剂与进口TRIzol试剂进行了对比实验，实验结果表明两种产品稳定性相近，提取得到的总RNA电泳带型一致，OD260/OD280比值无显著性差异，以提取的RNA为模板进行反转录-聚合酶链反应等下游实验均获得满意效果，降低了产品成本。用本发明试剂可以从动物的肝脏组织、脑组织、血液、胆汁中分离提取RNA，也可从植物的组织中分离提取RNA。

附图说明

图1是鼠肝RNA反转录-聚合酶链反应检测电泳照片。

图2鼠脑组织总RNA电泳照片。

图3鼠血RNA反转录-聚合酶链反应检测电泳照片。

图4猪HEV RNA反转录-聚合酶链反应检测电泳照片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

以制备本发明用于从生物组织/细胞/血液样品中分离RNA的试剂1000mL为例，所用的原料及其重量配比为：

盐酸胍                    764.24g

二硫苏糖醇                4.627g

硫代硫酸钠                2.723g

碳酸氢钠                  420g

水饱和酚                  47g

去离子水                  加至1000mL。

其制备方法如下：

取盐酸胍、二硫苏糖醇、硫代硫酸钠、碳酸氢钠加入到烧瓶中，加入去离子水，搅拌至彻底溶解，加入水饱和酚，去离子水加至1000mL，搅拌混匀，制备成用于从生物组织/细胞/血液样品中分离RNA的试剂，4℃下或室温保存备用，4℃下保存有效期为一年，室温保存有效期为3个月。

为了确定本发明(实验中简称RNA分离提取试剂)的最佳配比，发明人进行了L9(3⁴)正交实验，正交实验情况如下：

采用L9(3⁴)正交实验设计方案，如表1配方配制9种混合溶液，加入等体积水饱和酚混匀，制成RNA分离提取试剂，依据以下实验步骤完成RNA提取：

1、取豚鼠新鲜肝脏组织50mg置于匀浆器中，加入0.5mL RNA分离试剂，匀浆30秒，吸取细胞悬浮液于离心管中，室温静置5分钟。

2、加入100μL氯仿，振荡混匀10秒，静置5分钟，4℃，12,000转离心10分钟。

3、取上层水相至新的离心管，加入等体积异丙醇并颠倒混匀10秒，室温静置5分钟，4℃，12,000转离心10分钟。

4、弃上清液得白色沉淀，即为RNA沉淀。加入1mL质量浓度为75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，12,000转离心5分钟，弃乙醇。

5、加入1mL无水乙醇洗涤沉淀，4℃，12,000转离心5分钟，弃乙醇，超净台中气流干燥或真空干燥15分钟。

6、加入20μL经过1％焦磷酸乙二酯处理的去离子水溶解RNA，-80℃储藏备用。取20μLRNA溶液稀释后，使用紫外分光光度计，于波长260nm和280nm下检测吸光度OD值。实验结果见表1。

表1试剂浓度与RNA分离效果正交实验结果

由表1可见，盐酸胍为8mol/L(95.53)、NaHCO₃为5mol/L时(84)，组织蛋白质变性彻底，萃取时蛋白质层稳定，易于分离，RNA提取效率最佳。交互作用分析结果显示，二硫苏糖醇为0.03mol/L×154.25、NaSSO₄为0.02mol/L时RNA分离纯度最高。

为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的用于从生物组织/细胞/血液样品中分离RNA的试剂(实验中简称本发明试剂)进行了从生物组织中分离提取RNA实验，各种实验情况如下：

1、用本发明试剂与进口TRIzol试剂从动物肝脏组织中分离提取RNA对比实验

取豚鼠新鲜肝脏组织50mg两份置于两个匀浆器中，分别加入0.5ml本发明试剂和进口TRIzol试剂仅进行对比实验，分别采用实验1方法分离提取RNA以及TRIzol试剂说明书分离提取总RNA，加入80μL经过质量浓度为1％的焦磷酸乙二酯处理的去离子水溶解RNA，-80℃储藏备用。

取20μL RNA试剂稀释后，使用紫外分光光度计，于波长260nm和280nm下检测吸光度OD值。取2μL总RNA溶液，使用反转录-聚合酶链反应试剂盒扩增β-actin片段(300bp)，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。实验结果见表2和图1。

表2豚鼠肝组织RNA提取结果比较

由表2可见，本发明试剂从豚鼠肝脏组织中分离提取RNA效果与进口TRIzol试剂相当，所分离提取的RNA纯度高，可供下游反转录-聚合酶链反应实验。

2、用本发明试剂从动物脑组织中分离提取RNA

取豚鼠新鲜脑组织50mg于离心管中，加入0.5ml本发明试剂，振荡混匀，采用实验1方法提取总RNA，加入80μL经过1％焦磷酸乙二酯处理的去离子水溶解RNA，-80℃储藏备用。

取20μL RNA溶液稀释后，使用紫外分光光度计，于波长260nm和280nm下检测吸光度(OD)值。实验结果见表3和图2。

表3鼠脑组织RNA提取结果

由表3图2可见，脑组织富含脂肪，使用TRIzol试剂往往得不到较好效果，本发明试剂能够有效地从脑物质中提取脑RNA，且提取的RNA纯度高。

3、用本发明试剂从动物抗凝血中分离提取RNA

取豚鼠新鲜抗凝血200μL于离心管中，加入0.5ml本发明剂，采用实验1方法提取总RNA，加入80μL经过1％焦磷酸乙二酯处理的去离子水溶解RNA，-80℃储藏备用。

取5μL总RNA溶液，使用反转录-聚合酶链反应试剂盒扩增β-actin片段(300bp)，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。由图3可见目的片段大小与预期一致。

4、用本发明试剂从戊型肝炎病毒抗原阳性的猪胆汁中分离提取RNA

取戊型肝炎病毒抗原阳性的猪胆汁200μL于离心管中，加入0.5ml本发明试剂，采用实验1方法从戊型肝炎病毒抗原阳性的猪胆汁提取总RNA，加入80μL经过1％焦磷酸乙二酯处理的去离子水溶解RNA，-80℃储藏备用。

取5μL总RNA溶液，使用反转录-聚合酶链反应试剂盒扩增HEV结构区ORF2片段(150bp)，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。实验结果见图4。由图4可见目的片段大小与预期一致。

5、用本发明试剂从植物中分离提取RNA

取新鲜橘叶200mg置于研钵中，加入2倍体积液氮后立刻研磨成粉状，加入0.5ml本发明试剂，吸取悬浮液置于预冷的离心管中，采用实验1方法提取总RNA，加入80μL经过1％焦磷酸乙二酯处理的去离子水溶解RNA，-80℃储藏备用。取10μLRNA后，使用紫外分光光度计，于波长260nm和280nm下检测吸光度(OD)值。实验结果见表4。

表4橘叶RNA提取结果

由表4可见，本试剂提取的RNA含量均大于10μg。

实验结论：用本发明试剂可以从动物的肝脏组织、脑组织、血液、胆汁中分离提取RNA，也可从植物的组织中分离提取RNA，所分离提取得RNA在波长260nm的吸光度OD值、波长260nm吸光度OD值与波长280nm吸光度OD值的比达到了进口TRIzol试剂的分离效果，降低了生产成本。本发明试剂还可用于富含脂肪组织、血液以及RNA病毒RNA的提取。

Claims (1)

1、一种从生物组织/细胞/血液样品中分离RNA的试剂，其特征在于它是由下述重量配比的原料制成：

盐酸胍        76.424％

二硫苏糖醇    0.4627％

硫代硫酸钠    0.2723％

碳酸氢钠      42％

水饱和酚      4.7％

水            加至100％。

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