CN105021438A - 用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法，步骤如下：一、制备细胞组织裂解液；二、收集细胞，然后将细胞重悬在细胞组织裂解液中，得到混合液A；三、用玻璃珠震荡破碎混合液A中的细胞：用玻璃珠震荡振荡若干秒，在冰上放置若干秒，反复操作若干次；四、收集组织；五、配制翻译延伸核糖体去除剂；六、去除翻译延伸核糖体；七、将混合液B去除未结合核糖体的mRNA；八、收集翻译起始核糖体。本发明特点是效率高，能够捕获细胞/组织中翻译起始核糖体。<!-- 2 -->
Description
技术领域
本发明涉及用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法。
背景技术
细胞内生物大分子由DNA、RNA以及蛋白质组成。其中DNA是遗传信息的储存者，RNA是遗传信息的传递者，蛋白质是功能执行者。遗传信息由DNA经转录成为传递给RNA，然后RNA经翻译过程将遗传信息转化为蛋白质。
目前新一代测序技术即二代测序技术广泛应用在DNA、RNA序列测定上，因此人们对于DNA、RNA及转录过程都有了深入了解，然而对于蛋白质翻译过程缺乏系统有效的研究方法。近来，美国科学院院士Jonathan S.Weissman建立了基于二代测序的系统检测蛋白质翻译的方法，命名为核糖体展示技术(ribosomeprofiling)，著名测序公司Illumina公司也基于核糖体展示技术开发了研究蛋白质合成的测序试剂盒，这使人们对于蛋白质翻译的认识大大提高。然而核糖体展示技术只能检测蛋白质翻译效率，并不能准确检测蛋白质翻译的质(即翻译成什么蛋白质)。为解决这一问题，我们需要建立蛋白质翻译起始位点的检测方法。
为系统检测蛋白质翻译起始位点，科学家建立了针对体外培养细胞的3种富集翻译起始核糖体及翻译起始位点的方法：第一种是利用harringtonine(三尖杉酯碱)固定翻译起始核糖体大亚基；第一种是利用puromycin(嘌呤霉素)去除延伸核糖体从而相对富集起始核糖体；第三种是细胞培养液中加入Lactimidomycin孵育以固定起始核糖体。数据分析发现，第一种方法和第二种方法能够相对富集体外培养的细胞中的翻译起始核糖体，但数据比较乱，第三种方法能有效固定捕获体外培养的细胞中翻译起始核糖体。但是这三种方法都不能捕获组织中翻译起始核糖体。
发明内容
本发明的目的是克服现有产品中不足，提供一种效率高、能够捕获细胞/组织中翻译起始核糖体的用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法。
为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法，步骤如下：
一、制备细胞组织裂解液：配制浓度为20mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、100mM氯化钾、5mM氯化镁，5μM Lactimidomycin的混合溶液，溶液pH值为7.4；
二、收集细胞，然后将细胞重悬在细胞组织裂解液中，得到混合液A；
三、用玻璃珠震荡破碎混合液A中的细胞：用玻璃珠震荡振荡若干秒，在冰上放置若干秒，反复操作若干次；
四、收集组织，将组织重悬在混合液A中，用研钵研磨组织至破碎，然后在转速为12000转每分钟，温度为4摄氏度条件下离心10分钟，收集上清D；
五、配制翻译延伸核糖体去除剂：翻译延伸核糖体去除剂由Creatine phosphate(肌酸磷酸)、Spermidine(亚精胺)、Creatine phosphokinase(肌酸激酶)、ATP(三磷酸腺甙)、GTP(三磷酸鸟苷)、Puromycin(嘌呤霉素)混合而成；
六、去除翻译延伸核糖体：按体积份，提取上清D49份、翻译延伸核糖体去除剂1份混合均匀后，在温度为37摄氏度条件下孵化若干分钟后得到混合液B；
七、将混合液B去除未结合核糖体的mRNA：在混合液B中加入RNAse I，在温度为4摄氏度条件下旋转消化若干小时得到混合液C；RNAse I即核糖核酸酶I，RNAse I的浓度为每100微升混合液B溶液中加入100单位RNAse I；
八、收集翻译起始核糖体：在超速离心管中加入0.9ml的浓度为1M的蔗糖溶液，然后在超速离心管中再加入混合液C，在温度为4摄氏度，转速为每分钟90000转的条件下，离心若干分钟后，进行过滤后得到沉淀物，然后在沉淀物中加入1ml的Trizol溶液将沉淀物溶解，然后提取RNA，然后对提取的RNA进行高通量二代测序。
优选地，用玻璃珠震荡振荡20秒，在冰上放置40秒，反复操作4到6次。
优选地，在温度为37摄氏度条件下孵化15分钟后得到混合液B。
优选地，Creatine phosphate(肌酸磷酸)的浓度为500mM，Spermidine(亚精胺)的浓度为5mM，Creatine phosphokinase(肌酸激酶)的浓度为2mg/mL，ATP(三磷酸腺甙)的浓度为40mM，GTP(三磷酸鸟苷)的浓度为10mM，Puromycin(嘌呤霉素)的浓度为1mM。
优选地，在温度为4摄氏度条件下旋转消化1小时得到混合液C。
优选地，在温度为4摄氏度，转速为90000转每分钟的条件下，离心160分钟。
本发明的有益效果如下：本发明在细胞组织裂解液中加入Lactimidomycin，直接裂解细胞或组织，裂解过程中便可固定翻译起始复合体，然后利用翻译延伸核糖体去除剂去除延伸核糖体。因此，本发明的方法既可用于体外培养细胞，也可用于组织样品；本发明能够捕获组织中翻译起始核糖体，翻译效率更高；本发明在细胞组织裂解液中加入Lactimidomycin，直接裂解细胞或组织，裂解过程中翻译起始核糖体已经固定，因此我们的方法可以达到定量的效果，定量的效果指的是是评价翻译起始核糖体的多少即翻译起始效率，因此本发明可以定量分析。
附图说明
图1为HEK293细胞用Harringtonine的mRNA上信号分析结果图；
图2为HEK293细胞用puromycin的mRNA上信号分析结果图；
图3为HEK293细胞培养液中加入Lactimidomycin的mRNA上信号分析结果图；
图4为HEK293细胞用本发明的方法的mRNA上信号分析结果图；
图5为小鼠肝脏组织用本发明的方法的mRNA上信号分析结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明的技术方案作进一步说明：
本发明用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法，步骤如下：
一、制备细胞组织裂解液：配制浓度为20mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、浓度为100mM的氯化钾、浓度为5mM的氯化镁，浓度为5μM Lactimidomycin的混合溶液，溶液pH值为7.4；
二、收集细胞，然后将细胞重悬在细胞组织裂解液中，得到混合液A；
三、用玻璃珠震荡破碎混合液A中的细胞：用玻璃珠震荡振荡若干秒，在冰上放置若干秒，反复操作若干次；
四、收集组织，将组织重悬在混合液A中，用研钵研磨组织至破碎，然后在转速为12000转每分钟，温度为4摄氏度条件下离心10分钟，收集上清D；
五、配制翻译延伸核糖体去除剂：翻译延伸核糖体去除剂由Creatine phosphate(肌酸磷酸)、Spermidine(亚精胺)、Creatine phosphokinase(肌酸激酶)、ATP(三磷酸腺甙)、GTP(三磷酸鸟苷)、Puromycin(嘌呤霉素)混合而成；
六、去除翻译延伸核糖体：按体积份，提取上清D49份、翻译延伸核糖体去除剂1份混合均匀后，在温度为37摄氏度条件下孵化若干分钟后得到混合液B；
七、将混合液B去除未结合核糖体的mRNA：在混合液B中加入RNAse I，在温度为4摄氏度条件下旋转消化若干小时得到混合液C；RNAse I即核糖核酸酶I，RNAse I的浓度为每100微升混合液B溶液中加入100单位RNAse I；
八、收集翻译起始核糖体：在超速离心管中加入0.9ml的浓度为1M的蔗糖溶液，然后在超速离心管中再加入混合液C，在温度为4摄氏度，转速为每分钟90000转的条件下，离心若干分钟后，进行过滤后得到沉淀物，然后在沉淀物中加入1ml的Trizol溶液将沉淀物溶解，然后提取RNA，然后对提取的RNA进行高通量二代测序。
优选地，用玻璃珠震荡振荡20秒，在冰上放置40秒，反复操作4到6次。
优选地，在温度为37摄氏度条件下孵化15分钟后得到混合液B。
优选地，Creatine phosphate(肌酸磷酸)的浓度为500mM，Spermidine(亚精胺)的浓度为5mM，Creatine phosphokinase(肌酸激酶)的浓度为2mg/mL，ATP(三磷酸腺甙)的浓度为40mM，GTP(三磷酸鸟苷)的浓度为10mM，Puromycin(嘌呤霉素)的浓度为1mM。
优选地，在温度为4摄氏度条件下旋转消化1小时得到混合液C。
优选地，在温度为4摄氏度，转速为90000转每分钟的条件下，离心160分钟。
目前有三种方法可富集翻译起始核糖体：1)利用harringtonine(三尖杉酯碱)固定翻译起始核糖体大亚基；2)利用puromycin(嘌呤霉素)去除延伸核糖体从而相对富集起始核糖体；3)细胞培养液中加入Lactimidomycin孵育以固定起始核糖体。
与以上三种方法相比，我们的方法的优点：
1)本发明可用于组织样品检测：以上三种方法只能将药物加入体外培养细胞的培养基中，然后对细胞进行孵育，因此只能用于体外培养的细胞，不能应用于组织样品；我们的方法是在细胞组织裂解液中加入Lactimidomycin，直接裂解细胞或组织，裂解过程中便可固定翻译起始复合体，然后利用翻译延伸核糖体去除剂去除延伸核糖体去除延伸核糖体。因此，我们的方法既可用于体外培养细胞，也可用于组织样品。
2)效率更高：第一种、第二种方法能够相对富集体外培养的细胞中的翻译起始核糖体，但效率不高，第三中方法可以有效固定捕获体外培养的细胞中翻译起始核糖体，但是效率低，本发明的效率更高，能够捕获组织中翻译起始核糖体。
3)定量分析：以上三种方法只能将药物加入体外培养细胞的培养基中，然后对细胞进行孵育，孵育过程中蛋白质翻译仍然会进行，因此最后获得的翻译起始核糖体信号是这段时间内累积的总和，因此以上三种方法并不能达到定量的效果。我们的方法是在细胞组织裂解液中加入Lactimidomycin，直接裂解细胞或组织，裂解过程中翻译起始核糖体已经固定，因此我们的方法可以达到定量的效果，就是说，评价翻译起始核糖体的多少(翻译起始效率)。
本发明是利用Lactimidomycin固定翻译起始核糖体，然后体外去除翻译延伸核糖体，从而实现对翻译起始核糖体的捕获，随后利用二代测序技术可以实现全基因组层面鉴定蛋白质翻译起始位点，从而获得蛋白质合成起始的信息，包括起始位点序列(蛋白质的序列)及起始效率(蛋白质的量)。本发明将有助于人们全面深入理解细胞蛋白质合成过程，并可广泛应用在疾病基础研究及诊断上。该发明可明确细胞内翻译的所有蛋白质的序列(蛋白质的质)；该发明可在全基因层面评价蛋白质翻译的效率(蛋白质的量)；该发明可用于蛋白质翻译调节机制研究；该发明可用于疾病基础研究及诊断。
实验数据：
实施例1：对于培养的HEK293细胞按四种不同的方法制备样品，随后进行高通量二代测序从而得到mRNA上信号分析结果，如图1、图2所示，对结果分析发现，harringtonine(三尖杉酯碱)和puromycin(嘌呤霉素)处理组不能有效富集翻译起始核糖体，波形较杂乱(a点为翻译起始位点，没有显著升高的信号)，harringtonine(三尖杉酯碱)信号强度约为7.7，puromycin(嘌呤霉素)信号强度约为9.5；如图3所示，细胞培养液中加入Lactimidomycin孵育以固定起始核糖体，信号强度约60。如图4所示，本发明以富集翻译起始核糖体并有效鉴定翻译起始位点(a点为翻译起始位点，有显著信号，信号强度约80，起始位点后的信号几乎为0，波形不杂乱。
实施例2：对于小鼠肝脏组织按四种不同方法的进行高通量二代测序从而得到mRNA上信号分析结果，发现第一种方法、第二种方法、第三种方法都无法有效捕获翻译起始复合体，如图5所示，本发明可以有效捕获翻译起始复合体，b点为翻译起始位点，有显著信号，信号强度约50。
本发明在细胞组织裂解液中加入Lactimidomycin，直接裂解细胞或组织，裂解过程中便可固定翻译起始复合体，然后利用翻译延伸核糖体去除剂去除延伸核糖体。因此，本发明的方法既可用于体外培养细胞，也可用于组织样品；本发明能够捕获组织中翻译起始核糖体，翻译效率更高；本发明在细胞组织裂解液中加入Lactimidomycin，直接裂解细胞或组织，裂解过程中翻译起始核糖体已经固定，因此我们的方法可以达到定量的效果，定量的效果指的是是评价翻译起始核糖体的多少即翻译起始效率，因此本发明可以定量分析。
需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。
总之，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法，其特征在于，步骤如下：
一、制备细胞组织裂解液：配制浓度为20mM的羟乙基哌嗪乙硫磺酸、100mM氯化钾、5mM氯化镁，5μM Lactimidomycin的混合溶液，溶液pH值为7.4；
二、收集细胞，然后将细胞重悬在细胞组织裂解液中，得到混合液A；
三、用玻璃珠震荡破碎混合液A中的细胞：用玻璃珠震荡振荡若干秒，在冰上放置若干秒，反复操作若干次；
四、收集组织，将组织重悬在混合液A中，用研钵研磨组织至破碎，然后在转速为12000转每分钟，温度为4摄氏度条件下离心10分钟，收集上清D；
五、配制翻译延伸核糖体去除剂：所述翻译延伸核糖体去除剂由Creatinephosphate(肌酸磷酸)、Spermidine(亚精胺)、Creatine phosphokinase(肌酸激酶)、ATP(三磷酸腺甙)、GTP(三磷酸鸟苷)、Puromycin(嘌呤霉素)混合而成；
六、去除翻译延伸核糖体：按体积份，提取上清D49份、翻译延伸核糖体去除剂1份混合均匀后，在温度为37摄氏度条件下孵化若干分钟后得到混合液B；
七、将混合液B去除未结合核糖体的mRNA：在混合液B中加入RNAse I，在温度为4摄氏度条件下旋转消化若干小时得到混合液C；所述RNAse I即核糖核酸酶I，RNAse I的浓度为每100微升混合液B溶液中加入100单位RNAseI；
八、收集翻译起始核糖体：在超速离心管中加入0.9ml的浓度为1M的蔗糖溶液，然后在超速离心管中再加入混合液C，在温度为4摄氏度，转速为每分钟90000转的条件下，离心若干分钟后，进行过滤后得到沉淀物，然后在沉淀物中加入1ml的Trizol溶液将沉淀物溶解，然后提取RNA，然后对提取的RNA进行高通量二代测序。
2.根据权利要求1所述用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法，其特征在于，所述用玻璃珠震荡振荡20秒，在冰上放置40秒，反复操作4到6次。
3.根据权利要求1所述用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法，其特征在于，所述在温度为37摄氏度条件下孵化15分钟后得到混合液B。
4.根据权利要求1所述用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法，其特征在于，所述Creatine phosphate(肌酸磷酸)的浓度为500mM，所述Spermidine(亚精胺)的浓度为5mM，所述Creatine phosphokinase(肌酸激酶)的浓度为2mg/mL，所述ATP(三磷酸腺甙)的浓度为40mM，所述GTP(三磷酸鸟苷)的浓度为10mM，所述Puromycin(嘌呤霉素)的浓度为1mM。
5.根据权利要求1所述用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法，其特征在于，所述在温度为4摄氏度条件下旋转消化1小时得到混合液C。
6.根据权利要求1所述用于蛋白质翻译起始位点系统检测的样品制备方法，其特征在于，所述在温度为4摄氏度，转速为90000转每分钟的条件下，离心160分钟。
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| WO1999058718A1 (en) * | 1998-05-11 | 1999-11-18 | Quark Biotech Inc. | Method for identifying genes |
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| CN104032026A (zh) * | 2014-06-27 | 2014-09-10 | 武汉大学 | 一种提取线粒体中多聚核糖体的方法及其应用 |
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