CN108261332A - 一种血液rna保存管 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种血液RNA保存管,包括管体、管盖、RNA保存液，所述血液RNA保存管里有负压，所述负压和所述RNA保存液的体积为1:1～10:1，所述RNA保存液包括变性剂。用所述血液RNA保存管保存血液包括以下步骤：(1)用抗凝采血管采集血液；(2)血液转移，所述抗凝采血管与所述血液RNA保存管连通，所述血液RNA保存管里的负压迫使血液进入所述血液RNA保存管内；(3)预处理，将所述血液RNA保存管高速离心1min，接着室温静置10min，然后放置在所需温度下进行保存。采用本发明提供的血液RNA保存管保存的血液，可以明显抑制RNA的降解，从而提高血液RNA保存的稳定性和提取率。
Description
技术领域
本发明涉及一种血液保存管，具体涉及一种血液RNA保存管。
背景技术
全血作为较易获取的人体标本，特别适用于实验室和临床检测。RNA提取是进行诸如定量RT-PCR、微矩阵、RNA定位、cDNA文库的建立、基因表达和其他种类的下游应用研究的基础。但由于RNA自身结构为单链状态，极不稳定，同时广泛存在的RNaseA时刻发挥着降解RNA的功能，其活性难以被抑制，因此使得从全血中提取RNA以及对RNA的保存相对困难。
目前对于血液样本的RNA的储存主要有三种方式：第一种为抗凝全血不加任何保护剂，直接冻存-80℃。然而，血液中的RNA基本都存在于白细胞当中，少数存在于循环肿瘤细胞等稀有细胞及血浆中，当环境温度急速下降时，血液由液相转变为固相，体积变大，冰晶形成，会有部分的血细胞涨破或被冰晶破坏，原本在细胞中可以稳定的细内容物外流丧失活性，导致RNA产量降低。第二种为分离白膜层，加入RNAlater保护剂冻存-80℃。但此种方法的弊端在于，首先分离白膜层的过程较为繁琐，需要多次离心，在临床医院或临时的采血点往往难以实施，其次高盐脱水后的细胞复性困难，提取RNA的难度增加，且高盐组分不易去除，提取的RNA纯度不高，最后血液在分离白膜层过程中，会有部分白细胞及RNA组分缺失。第三种为专用的静脉真空采血管，此采血管一次可采集全血2.5ml，提取RNA需用偶联的下游专用试剂盒，其得率较低，仅为每2.5ml全血3ug总RNA。
发明内容
本发明提供一种血液RNA保存管，以解决现有技术存在的血液长期存放时 RNA容易被降解且提取率低的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供一种血液RNA保存管,包括管体、管盖、 RNA保存液，所述血液RNA保存管里有负压，所述负压和所述RNA保存液的体积为1:1～10:1，所述RNA保存液包括变性剂。
可选的，所述管体的材质可为普通玻璃、中性玻璃、医用硼硅玻璃、聚酯材料、PET、PET-聚对苯二甲酸乙二醇酯。
可选的，所述管体的体积为3-20mL。
可选的，所述变性剂至少包括盐酸胍、异硫氰酸胍、苯酚中的一种。
可选的，所述变性剂的浓度为10％-100％。
可选的，所述血液RNA保存管可以用于保存全血、白膜层、去除血浆的血细胞。
用所述血液RNA保存管保存血液包括以下步骤：
(1)用抗凝采血管采集血液；
(2)血液转移，所述抗凝采血管与所述血液RNA保存管连通，所述血液 RNA保存管里的负压迫使血液进入所述血液RNA保存管内；
(3)预处理，将所述血液RNA保存管高速离心1min，接着室温静置10min，然后放置在所需温度下进行保存。
本发明带来的有益效果：采用本发明提供的血液RNA保存管保存的血液，可以明显抑制RNA的降解，从而提高血液RNA保存的稳定性和提取率，同时简化预处理步骤，且适用于无离心机和低温环境下使用
附图说明
表1为采用BioTeke、Qiagen、Ambion三种RNAlater保存液保存后的DNA 的提取浓度。
表2为采用PBS保存的白膜层的DNA提取浓度。
表3为BioTeke离心柱法提取RNAlater保存的白膜层RNA的提取浓度。
表4为沉淀法提取RNAlater保存的白膜层RNA的提取浓度。
表5为Tiangen离心柱法提取RNAlater保存的白膜层RNA的提取浓度。
表6为血液RNA保存管保存3天的血液RNA的提取浓度。
表7为血液RNA保存管保存7天的血液RNA的提取浓度。
图1为采用BioTeke、Qiagen、Ambion三种RNAlater保存液保存后的DNA 的电泳结果。
图2为采用PBS保存的白膜层的DNA电泳结果。
图3为血液RNA保存管保存3天的血液RNA的电泳结果。
图4为血液RNA保存管保存3天的血液RNA的电泳结果。
图5为血液RNA保存管保存血液的流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合附图及具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。
表1为采用BioTeke、Qiagen、Ambion三种RNAlater保存液保存后的DNA 的提取浓度，表2为采用PBS保存的白膜层的DNA提取浓度，表3为BioTeke 离心柱法提取RNAlater保存的白膜层RNA的提取浓度，表4为沉淀法提取 RNAlater保存的白膜层RNA的提取浓度，表5为Tiangen离心柱法提取RNAlater 保存的白膜层RNA的提取浓度，表6为血液RNA保存管保存3天的血液RNA 的提取浓度，表7为血液RNA保存管保存7天的血液RNA的提取浓度。图1 为采用BioTeke、Qiagen、Ambion三种RNAlater保存液保存后的DNA的电泳结果，图2为采用PBS保存的白膜层的DNA电泳结果，图3为血液RNA保存管保存3天的血液RNA的电泳结果，图4为血液RNA保存管保存3天的血液 RNA的电泳结果，图5为血液RNA保存管保存血液的流程图。
本发明提供的血液RNA保存管,包括管体、管盖、RNA保存液，所述血液 RNA保存管里有负压，所述负压和所述RNA保存液的体积为1:1～10:1，所述 RNA保存液包括变性剂。
进一步来说，所述管体的材质可为普通玻璃、中性玻璃、医用硼硅玻璃、聚酯材料、PET、PET-聚对苯二甲酸乙二醇酯。所述管体的体积为3-20mL，可以根据需要选择不同容积的保存管。所述变性剂至少包括盐酸胍、异硫氰酸胍、苯酚中的一种，且所述变性剂的浓度为10％-100％。异硫氰酸胍及盐酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。所述血液RNA保存管可以用于保存全血、白膜层、去除血浆的血细胞。
如图5所示，用所述血液RNA保存管保存血液包括以下步骤：
在步骤S110中，用抗凝采血管采集血液；
在步骤S111中，血液转移，所述抗凝采血管与所述血液RNA保存管连通，所述血液RNA保存管里的负压迫使血液进入所述血液RNA保存管内；
在步骤S112中，预处理，将所述血液RNA保存管高速离心1min，接着室温静置10min，以确保血液中的核酸酶彻底灭活，然后放置在所需温度下进行保存。
进一步来说，所述抗凝采血管至少包括以下一种成分：肝素锂、肝素钠、柠檬酸肝素、氨肝素、柠檬酸钠、双嘧达莫、茶碱、腺嘌呤、腺苷、华法令阻凝剂、苊香豆醇、苯茚二酮、低分子肝素，艾卓肝素、肝磺达肝癸钠、阿加曲班、重组水蛭素、比伐卢定、达比加群、枸橼酸钠、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾。
在本实施例中，为了检测采用血液RNA保存管保存的血液的性能，需要提取保存后的血液的RNA进行实验分析，整个具体的操作过程如下：
(1)用抗凝采血管采集血液：利用采血器和持针器，采用标准静脉穿刺技术收集5ml静脉血至EDTA-Na2抗凝采血管，并颠倒混匀；
(2)血液转移：将抗凝采血管与血液RNA保存管连通，血液RNA保存管里的负压迫使血液进入血液RNA保存管内，进入的血液量约为2.3ml；
(3)预处理：血液转移完毕后，立即上下颠倒混匀8-10次，高速离心1min，室温(25℃)静置10min，而后将血液RNA保存管分别保存于25℃、4℃、-20℃、 -80℃等温度下，以便对不同温度下保存的血液进行RNA的提取；
(4)提取RNA：
①将冻存管恢复至室温，高速离心10s，室温静置5min，将1.6ml液体转移至2ml离心管，加入200ul氯仿，高速离心10s，室温静置5min；
②离心10min，吸取水相，加入等体积70％乙醇，混匀，将混合液加入吸附柱RA中，离心1min(4℃，12000rpm)，弃滤液；
③加入500ul去蛋白液RE，离心1min(4℃，12000rpm)，弃滤液；
④加入700ul漂洗液RW，离心1min(4℃，12000rpm)，弃滤液；
⑤加入500ul漂洗液RW，离心1min(4℃，12000rpm)，弃滤液；
⑥离心2min(4℃，12000rpm)，将吸附柱RA插入新的1.5ml离心管，加入30ul 30ulRNase-free H2O，室温静置3min；
⑦离心1min(12000rpm)，所得液体即为提取的血液总RNA；
在本实施列中，浓度检测采用超微量紫外分光光度计ND 5000进行测试。电泳检测时取5ul核酸，采用ultrapower染料点染，2％琼脂糖凝胶，150V、15min 拍照，曝光。
如图1、图2、表1和表2所示，全血经GE Ficoll-paqueTM PLUS lymphocyteisolation sterile solution分离白膜层后，采用BioTeke、Qiagen、Ambion三种 RNAlater保存液保存后，DNA的提取率分别约为13ug/ml、10ug/ml、7.76ug/ml，而对照组PBS保存的白膜层的DNA提取率为16.19ug/ml，这说明RNAlater保存的白膜层细胞失水皱缩，细胞膜结构未被破坏，可用于提取RNA。
表1
表2
从表3～5中可以看出，经RNAlater保存的白膜层，所试验的3种常用的RNA 提取方法，实验数据表明OD260/230的比值均严重偏低，这说明提取出来的RNA 中残留有大量盐分。这三种方法的RNA的平均提取率依次为0.82ug/ml、1.02 ug/ml、0.72ug/ml，可以看出RNA的提取率极低。
表3
表4
表5
如表6和图3所示，血液样品在血液RNA保存管保存3天后，在25℃、4℃、 -20℃和-80℃温度下保存的血液，RNA的提取率无明显的差异，平均为8.75 ug/ml。
表6
如表7和图4所示，血液样品在血液RNA保存管保存3天后，RNA的平 均提取率为9.82ug/ml。
表7
大量的实验数据表明，在血液RNA保存管中的血液采用离心柱方法提取总 RNA时，血液样品可在18-25℃温度下稳定保存至少3天，4℃温度下稳定保 存至少14天，-20℃温度下稳定保存至少1年，-80℃温度下稳定保存至少50个 月。
综上所述，采用本发明提供的血液RNA保存管保存的血液，可以明显抑制 RNA的降解，从而提高血液RNA保存的稳定性和提取率，同时简化预处理步 骤，且适用于无离心机和低温环境下使用。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的 技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。
Claims (8)
1.一种血液RNA保存管,其特征在于，所述血液RNA保存管包括管体、管盖、RNA保存液，所述血液RNA保存管里有负压，所述负压和所述RNA保存液的体积为1:1～10:1，所述RNA保存液包括变性剂。
2.如权利要求1所述的血液RNA保存管，其特征在于，所述管体的材质可为普通玻璃、中性玻璃、医用硼硅玻璃、聚酯材料、PET、PET-聚对苯二甲酸乙二醇酯。
3.如权利要求1所述的血液RNA保存管，其特征在于，所述管体的体积为3-20mL。
4.如权利要求1所述的血液RNA保存管，其特征在于，所述变性剂至少包括盐酸胍、异硫氰酸胍、苯酚中的一种。
5.如权利要求1或4所述的血液RNA保存管，其特征在于，所述变性剂的浓度为10％-100％。
6.如权利要求1所述的血液RNA保存管，其特征在于，所述血液RNA保存管可以用于保存全血、白膜层、去除血浆的血细胞。
7.如权利要求1～6任一所述的血液RNA保存管，其特征在于，用所述血液RNA保存管保存血液包括以下步骤：
(1)用抗凝采血管采集血液；
(2)血液转移，所述抗凝采血管与所述血液RNA保存管连通，所述血液RNA保存管里的负压迫使血液进入所述血液RNA保存管内；
(3)预处理，将所述血液RNA保存管高速离心1min，接着室温静置10min，然后放置在所需温度下进行保存。
8.如权利要求7所述的血液RNA保存管，其特征在于，所述抗凝采血管至少包括以下一种成分：肝素锂、肝素钠、柠檬酸肝素、氨肝素、柠檬酸钠、双嘧达莫、茶碱、腺嘌呤、腺苷、华法令阻凝剂、苊香豆醇、苯茚二酮、低分子肝素，艾卓肝素、肝磺达肝癸钠、阿加曲班、重组水蛭素、比伐卢定、达比加群、枸橼酸钠、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾。
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