CN107574225A - 一种血液cfDNA保存剂、真空采血管及其制备方法 - Google Patents

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王爱玲
田春城
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Abstract

本发明公开了一种血液cfDNA保存剂及其构成的真空采血管，其保存剂包括如下按重量份计的组分：1～200份EDTA、1～500份咪唑、1～200份甘油醛、1～1000份氯化钠、1～500份盐酸胍、1～1000份SDS和纯净水5000～7000份。血液cfDNA真空采血管为含有如上保存剂的真空采血管。本发明提供的血液cfDNA保存剂，能有效抑制RNase酶活，保护血液中游离DNA。提供的血液cfDNA真空采血管具有抑制RNase酶活，保护血液中游离DNA，还能有效的固定白细胞，防止白细胞破裂，从而不能污染游离DNA；有效延长血液样本在室温下的存储时间，对血浆样本长距离运输具有极大的帮助，从而为肿瘤早期筛查样本或胎儿的产前筛查和诊断样本的收集，存储和运输提供了有效的保藏方法。

Description

一种血液cfDNA保存剂、真空采血管及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种血液cfDNA保存剂、真空采血管及其制备方法。
背景技术
癌症已成为我国死亡第一大原因，死亡人数占全球癌症死亡人数的四分之一。与美国相比，虽然其肿瘤发病率为中国的1.6倍(高出65％)，但5年生存率为中国的1.8倍(高出81％)。造成该差异的主要原因之一在于美国肿瘤早期筛查诊断的普及率更高，肿瘤早期筛查主要采取内镜、血液、影像学等检查方法，而对血液中的cfDNA(cell free DNA)，即游离DNA进行早期筛查是很重要且方便的一项检测方法。当孕妇怀孕的时候，胎儿的DNA也会同时释放到母亲的血液里头去，通过抽取母亲的外周血测序分析其中的游离DNA就可以判断胎儿是否存在整个染色体或者大片段DNA的变异，比起以前的方式是要安全得多，也更准确，所以对于肿瘤的早期筛查或胎儿的产前筛查和诊断，血液样本的运输和存储显得尤为重要。
目前市场上已有众多品牌的血液样本保存管，其主要成分是EDTA或肝素锂或肝素钠，其主要作用是收集全血，进行血浆的分离。但是其不能有效抑制RNase酶的活性，从而不能保护血浆中游离DNA的稳定性，导致肿瘤早期筛查或胎儿的产前筛查和诊断的结果不准确。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的问题，本发明的一个目的是提供一种血液cfDNA保存剂，该保存剂可有效抑制RNase酶活，保护血液中游离DNA；本发明的另一目是提供一种血液cfDNA真空采血管，延长血液样本中cfDNA在室温下的存储时间，便于血液样本的长途运输。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一种血液cfDNA保存剂，其包括如下按重量份计的组分：1～200份EDTA、1～500份咪唑、1～200份甘油醛、1～1000份氯化钠、1～500份盐酸胍、1～1000份SDS和纯净水5000～7000份。
如上所述的保存剂，优选地，所述EDTA为1～20份，所述咪唑为10～50份，所述甘油醛为50～100份，所述氯化钠为1～100份，所述盐酸胍为1～200份，所述SDS为1～50份。
一种血液cfDNA真空采血管，该采血管中含有如上所述的血液cfDNA保存剂。
一种血液cfDNA真空采血管的制备方法，包括如下步骤：
(1)准备1～200份的EDTA，1～500份的咪唑，1～200份的甘油醛以及氯化钠、盐酸胍或SDS中一种或两种及以上的混合，其中所述氯化钠为1～1000份，所述盐酸胍为1～500份和所述SDS为1～1000份；
(2)将步骤(1)中的每种原料单独用纯净水溶解，过滤，将过滤后的溶液混合获得混合液；(3)将所述步骤(2)的混合液灌装入无添加剂的采血管中，抽成真空，获得血液cfDNA真空采血管。
如上所述的制备方法，优选地，所述EDTA为1～20份，所述咪唑为10～50份，所述甘油醛为50～100份，所述氯化钠为1～100份，所述盐酸胍为1～200份，所述SDS为1～50份。
如上所述的制备方法，优选地，所述纯净水无RNase酶活，所述过滤采用0.22μm膜过滤。
如上所述的制备方法，优选地，在步骤(3)中，所述采血管为5ml时，注入所述步骤(2)的混合液100μl。
如上所述的制备方法，优选地，在步骤(3)中，所述真空负压为大于16kg/cm2，最大真空误差±10％。
本发明的有益效果为：
本发明提供的血液cfDNA保存剂，可以有效制RNase酶活，保护血液中游离DNA。提供的血液cfDNA真空采血管具有抑制RNase酶活，保护血液中游离DNA，还能有效的固定白细胞，防止白细胞破裂，从而不能污染游离DNA；有效延长血液样本在室温下的存储时间，对血浆样本长距离运输具有极大的帮助，从而为肿瘤早期筛查样本或胎儿的产前筛查和诊断样本的收集，存储和运输提供了有效的保藏方法。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来说明本发明内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售试剂。
本发明提供的血液cfDNA保护剂，其中，EDTA是作为抗凝剂，咪唑作为核酸酶抑制剂，有效抑制溶液及其血液中核酸酶，甘油醛与SDS是作为缓冲剂，氯化钠作为稳定剂，盐酸胍作为变性剂，将血液中的蛋白变性。这些化学组合物能有效的固定白细胞，防止白细胞破裂，从而不能污染游离DNA；且化学组合物还能抑制核酸酶，从而使血浆中游离DNA长时间内不会降解。因此在化学组合物的多重作用下，血浆中游离DNA能够长时间的保存稳定。
实施例1
一种血液cfDNA真空采血管的制备，采用如下步骤：
(1)EDTA10mg，咪唑20mg，甘油醛50mg，氯化钠1mg，盐酸胍50mg和SDS 1mg；
(2)将上述的每种原料均用1000mg的无RNase酶活的纯净水溶解，溶解后的每种组分均采用0.22μm膜过滤，备用；
(3)将上述配制好的原料进行混合；
(4)将上述混合液灌装入无添加剂的采血管中，抽成真空负压，真空负压为大于16kg/cm2，最大真空误差±10％。
即成血液cfDNA真空采血管，其中，无添加剂的采血管为江苏康捷医疗器械有限公司提供。
实施例2-6
实施例2-6为血液cfDNA真空采血管的制备，与实施例1不同的是所用组分的用量不同，具体见表1。
表1各组分的配比
实施例7
采用上述实施例制备的血液cfDNA真空采血管与现有的含有EDTA普通采血管和含有肝素锂普通采血管(江苏康捷医疗器械有限公司)进行试验，考察采血管对血液中游离DNA的影响。
取普通采血管和本发明的血液cfDNA真空采血管各100支，招募志愿者进行抽血，分别同时用上述2组普通采血管与实施例1-6中的真空采血管进行收集，每支5ml，放室温(25-30℃)保存，分别放置0天，2天，4天，6天，8天，10天，12天，14天和16天共9个时间段，每个时间段分别抽提上述采血管中的血液游离DNA，提取得到DNA，采用荧光定量PCR的方法进行检测，检测基因为β-actin，根据β-actin基因的CT值换算出血浆中总游离DNA的含量。通过检测β-actin基因的CT变化体现游离总DNA含量的变化。各组分的配比具体设置以及检测结果如下表所示。
表2不同保存时间检测游离总DNA含量
由上表可见，普通采血管与本发明真空采血管相比，普通采血管保存2天后血浆中游离DNA急剧升高，这说明普通采血管保存的血液白细胞已经严重破裂，向血浆中释放出大量DNA，从而污染游离DNA导致后续检测结果不准确。而本发明的存储管在保存血浆14天后仍能得到稳定的游离DNA含量，说明本发明保存剂中的化学组合物能极大的抑制核酸酶活，且能有效固定白细胞，防止细胞内基因组DNA释放到血浆中，稳定血液中游离总DNA，显著地延长血液样本的存储时间。

Claims (8)

1.一种血液cfDNA保存剂，其特征在于，其包括如下按重量份计的组分：1～200份EDTA、1～500份咪唑、1～200份甘油醛、1～1000份氯化钠、1～500份盐酸胍、1～1000份SDS和纯净水5000～7000份。
2.如权利要求1所述的保存剂，其特征在于，所述EDTA为1～20份，所述咪唑为10～50份，所述甘油醛为50～100份，所述氯化钠为1～100份，所述盐酸胍为1～200份，所述SDS为1～50份。
3.一种血液cfDNA真空采血管，其特征在于，该真空管中含有如权利要求1或2所述的血液cfDNA保存剂。
4.一种血液cfDNA真空采血管的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)准备1～200份的EDTA，1～500份的咪唑，1～200份的甘油醛以及氯化钠、盐酸胍或SDS中一种或两种及以上的混合，其中所述氯化钠为1-1000份，所述盐酸胍为1-500份和所述SDS为1-1000份；
(2)将步骤(1)的每种原料单独用无RNase酶活的纯净水溶解，之后过滤，混合获得混合液；
(3)将所述步骤(2)的混合液灌装入无添加剂的采血管中，抽成真空负压，获得血液cfDNA真空采血管。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述EDTA为1～20份，所述咪唑为10～50份，所述甘油醛为50～100份，所述氯化钠为1～100份，所述盐酸胍为1～200份，所述SDS为1～50份。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述纯净水无RNase酶活，用量为1000份，所述过滤采用0.22μm膜过滤。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述采血管为5ml时，注入所述步骤(2)的混合液100μl。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述真空负压为大于16kg/cm2，最大真空误差±10％。
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