CN116656671A

CN116656671A - 一种rna提取方法

Info

Publication number: CN116656671A
Application number: CN202310929960.5A
Authority: CN
Inventors: 王丹凤; 吴尹; 瞿志鹏; 曹林; 聂俊伟; 韩锦雄
Original assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-07-27
Filing date: 2023-07-27
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2043-07-27
Also published as: CN116656671B

Abstract

本申请提供一种RNA提取的方法，属于生物技术领域。本申请优化了传统酸性酚沉淀提取RNA的方法，有利于提高RNA提取产物的浓度和纯度，并且对于不同种类的生物样本具有较好的兼容性。

Description

一种RNA提取方法

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种RNA提取方法。

背景技术

纯化完整的RNA是分子生物学、临床和生物技术应用中基因表达分析的关键步骤。为了实现这一目标，人们开发了RNA分离方法。目前国内外已有的提取RNA的方法多种多样，例如美国科学家Chomzynskin P所发明的酸酚-异硫氰酸胍-氯仿法(Chomczynski P,Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate–phenol–chloroform extraction: twenty-something years on[J].Nature protocols, 2006, 1(2): 581-585)。国内外认为酸酚-异硫氰酸胍-氯仿法是最标准的方法，其基本原理是应用酚和异硫氰酸胍裂解细胞，异硫氰酸胍同时还有保护RNA不被降解的功能，然后加入氯仿进行相分离，离心后所得混合物分为含RNA的上层水相、中间相和含有DNA和蛋白质的下层有机相，收集所有水相进行醇沉淀并洗涤RNA。此方法耗时三小时，操作步骤繁琐，使用的有机溶剂氯仿具有强毒性，而且最重要的不足之处是此方法提取出的RNA中常有DNA污染(参见美国专利US7794932B)。目前市面上使用最多的Trizol法商业试剂盒，即应用了与酸酚-异硫氰酸胍-氯仿法相同的提取原理，其优势在于如样本裂解能力强，基因组DNA(gDNA)残留低，以及样本兼容性高等(Chomczynski P, Wilfinger W, etal. RNAzol® RT: a new single-step method for isolation of RNA[J]. NatureMethods, 2010, 7(12): 4-5)。

专利CN101979539 B和CN1997740B公开了一种不产生相分离即可分离基本纯的RNA的方法：一定浓度的酸性酚选择性沉淀DNA、蛋白质以及其他细胞组分，而RNA仍然保持溶解形式。利用这一现象，设计出了无需分离水相和有机相以及相的界面的用于分离RNA的试剂和方法，这种酸性酚沉淀方法简化了RNA分离步骤，在相分离过程中不需使用毒性有机溶液和常温离心。

发明内容

本申请的发明人发现，酸性酚沉淀提取RNA的方法在生物样本的兼容性和RNA产量方面均存在明显的劣势，特别是一些复杂样本，包括动物组织脑、肾、脾、肠、腺体等均无法提取到完整的RNA。针对这些问题，本申请提供一种RNA提取方法，在保留原有优势的基础上（相分离不需要毒性有机试剂和常温离心）可以极大程度的提高酸性酚沉淀法提取得到的RNA的产量和质量，达到与主流Trizol法试剂盒相当的生物学样本兼容性。此外本方法在保持Trizol法提取优势的基础上，DNA和蛋白质残留更低，分离得到的RNA纯度高，获得的Total RNA可以直接用于RT-PCR、qRT-PCR、Northern Blot、Dot Bolt、体外翻译和高通量测序等各种分子生物学实验。

本申请旨在针对现有技术的不足，提供一种RNA提取方法，该方法优化了传统的酸性酚沉淀法，通过在样本裂解后加入包含还原剂的稀释液，有利于提高RNA提取产物的浓度和纯度，并且对于不同种类的生物样本具有较好的兼容性。

本申请的第一方面提供一种从生物样本中提取RNA的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）获得生物样本；

（2）加入裂解液，震荡混匀，室温静置，所述裂解液包含苯酚，蛋白变性剂和缓冲盐；

（3）任选地，离心，吸取上清液；

（4）向离心后的或上清液或未离心的裂解产物中加入稀释液，震荡混匀，所述稀释液包含还原剂；

（5）离心，吸取上清液；

（6）向上清液中加入乙醇或异丙醇溶剂沉淀RNA。

在一些实施方案中，所述稀释液包含还原剂和pH调节剂。在一些实施方案中，所述还原剂是二硫键还原剂。

在一些实施方案中，所述二硫键还原剂通过还原蛋白质中的二硫键使蛋白质变性，所述蛋白质是例如RNase。

在一些实施方案中，所述二硫键还原剂是例如二硫苏糖醇（DTT）、三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP-HCl）、β-巯基乙醇（β-ME）、二硫赤藓糖醇（DTE）、还原性谷胱甘肽（GSH）和氧钒核糖核苷复合物（RVC）中的一种或多种，例如一种、两种、三种、四种、五种或六种。

在一些实施方案中，所述DTT的浓度是1-200mM，优选5-200mM，更优选10-200mM，包括所述范围内的10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM和200mM。

在一些实施方案中，所述TCEP-HCl的浓度是1-200mM，优选5-200mM，更优选10-200mM，包括所述范围内的10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM和200mM。

在一些实施方案中，所述β-巯基乙醇的浓度是1-200mM，优选5-200mM，更优选10-200mM，包括所述范围内的10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM，145mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM和200mM。

在一些实施方案中，所述二硫赤藓糖醇的浓度是1-200mM，优选5-200mM，更优选10-200mM，包括所述范围内的10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM和200mM。

在一些实施方案中，所述还原性谷胱甘肽的浓度是1-200mM，优选5-200mM，更优选10-200mM，包括所述范围内的10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM和200mM。

在一些实施方案中，所述氧钒核糖核苷复合物的浓度是1-200mM，优选5-200mM，更优选10-200mM，包括所述范围内的5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、105mM、110mM、115mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM和200mM。

在一些实施方案中，所述稀释液的pH是3-7，优选3-6，包括所述范围内的3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.3、5.5、5.6、5.8和6。

在一些实施方案中，所述pH调节剂是例如酸、碱、弱酸盐、弱碱盐中的一种或多种，所述酸是例如柠檬酸或乙酸，所述碱是例如NaOH，所述弱酸盐是例如乙酸盐、碳酸盐或磷酸盐，所述弱碱盐是例如铵盐。

在一些实施方案中，所述乙酸盐是例如乙酸钠，所述乙酸钠的浓度是0.01-5mM，优选0.05-3mM，包括所述范围内的0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.2mM、1.5mM、1.8mM、2mM、2.2mM、2.5mM、2.8mM和3mM。

在一些实施方案中，所述稀释液包含二硫键还原剂和pH调节剂，所述稀释液的pH是3-6。

在一些实施方案中，所述稀释液包含二硫键还原剂和pH调节剂，所述二硫键还原剂是二硫苏糖醇（DTT）、三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP-HCl）、β-巯基乙醇（β-ME）、二硫赤藓糖醇（DTE）、还原性谷胱甘肽（GSH）和氧钒核糖核苷复合物中的一种或多种，所述稀释液的pH是3-6；优选地，所述二硫键还原剂是5-200 mM 二硫苏糖醇、5-200 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐、5-200 mM β-巯基乙醇、5-200 mM 二硫赤藓糖醇、5-200 mM 还原性谷胱甘肽和5-200 mM氧钒核糖核苷复合物中的一种或多种；优选地，所述二硫键还原剂是10-200 mM 二硫苏糖醇、10-200 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐、10-200 mM β-巯基乙醇、10-200 mM 二硫赤藓糖醇、10-200 mM 还原性谷胱甘肽和10-200 mM 氧钒核糖核苷复合物中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述稀释液包含10-200 mM 二硫苏糖醇和0.05-5mM乙酸钠，所述稀释液的pH是3-6。在一些实施方案中，所述稀释液包含10-200 mM 二硫苏糖醇、10-200 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐和0.05-5 mM乙酸钠，所述稀释液的pH是3-6。在一些实施方案中，所述稀释液包含10-200 mM 还原性谷胱甘肽和5-50 mM 盐酸，所述稀释液的pH是3-6。在一些实施方案中，所述稀释液包含10-200 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐和1-100 mM 氢氧化钠，所述稀释液的pH是3-6。

在一些实施方案中，所述稀释液还包括表面活性剂。

在一些实施方案中，所述表面活性剂是例如阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂中的一种或多种，优选阴离子表面活性剂。

在一些实施方案中，所述阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸钠（SDS）、十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、脂肪酸钠、椰油酰单乙醇酰胺、月桂酰肌氨酸钠、月桂酰谷氨酸钠、椰油酰甲基牛磺酸钠、硬酯酰谷氨酸钠、月桂酰甘氨酸钠、月桂酰丙氨酸钠、椰油酰谷氨酸钠、肉豆蔻酰肌氨酸钠、棕榈酰甘氨酸钠、月桂酰谷氨酸钾和椰油酰氨基丙酸钠中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述阴离子表面活性剂是十二烷基硫酸钠（SDS），所述SDS的浓度是例如1-300mM，优选1-200mM，更优选1-100mM，包括所述范围内的1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM和100mM。

在一些实施方案中，所述稀释液还可以包括金属盐，所述金属盐是例如Na⁺盐、K⁺盐、Mg²⁺盐、Mn²⁺盐、Cs⁺盐中的一种或多种，优选Na⁺盐，更优选氯化钠（NaCl）。

在一些实施方案中，所述NaCl的浓度是10-300mM，优选20-250mM，更优选50-200mM，包括所述范围内的50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM和200mM。

在一些实施方案中，所述生物样本是组织样本或细胞样本。

在一些实施方案中，所述组织样本是动物组织或植物组织，所述动物组织来自例如脊椎动物和无脊椎动物，所述脊椎动物是例如人、小鼠、大鼠、鱼类、食蟹猴、兔、犬、猫、牛、马、羊和猪，所述无脊椎动物是例如海参、水母、螺、虾、蟹、蜘蛛和昆虫。

在一些实施方案中，所述动物组织包括但不限于脑组织、肝脏组织、脾脏组织、心脏组织、肺组织、皮肤组织、脂肪组织、肾脏组织、肠组织、腺体、胸腺组织、胰腺组织、肿瘤组织、骨组织、血液组织和鱼类鳃组织等。所述植物组织来自例如种子植物或孢子植物，又例如来自水稻、拟南芥、番茄和小麦等，所述植物组织包括但不限于叶片、种子、根、花、果实和茎等。

在一些实施方案中，所述细胞样本是真核细胞或原核细胞，所述真核细胞是例如293细胞，Vero细胞，Hela细胞，CHO细胞，酵母菌细胞等，所述原核细胞是例如大肠杆菌细胞、乳酸杆菌细胞等。

在一些实施方案中，所述组织样本的使用量和稀释液的使用量的比例为每1mg组织加入包含0.05-1μmol还原剂的稀释液，例如0.05μmol、0.06μmol、0.07μmol、0.08μmol、0.09μmol、0.1μmol、0.2μmol、0.3μmol、0.4μmol、0.5μmol、0.6μmol、0.7μmol、0.8μmol、0.9μmol和1μmol。

在一些实施方案中，所述细胞样本的使用量和稀释液的使用量的比例为，当所述细胞是悬浮细胞，每10⁶个细胞加入包含2-50μmol还原剂的稀释液，例如2μmol、3μmol、4μmol、5μmol、6μmol、7μmol、8μmol、9μmol、10μmol、15μmol、20μmol、25μmol、30μmol、35μmol、40μmol、45μmol和50μmol；当所述细胞是贴壁细胞时，每π cm²面积的细胞培养皿加入包含0.5-10μmol还原剂的稀释液，例如0.5μmol、0.6μmol、0.7μmol、0.8μmol、0.9μmol、1μmol、2μmol、3μmol、4μmol、5μmol、7μmol、8μmol、9μmol和10μmol。

在一些实施方案中，所述稀释液的使用量和裂解液的使用量的比值为0.1-1，包括所述范围内的0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5，0.55，0.6，0.65，0.7，0.75，0.8，0.85，0.9，0.95和1；所述比例是例如体积比或质量比，优选体积比。

在一些实施方案中，所述裂解液的pH是3-6，优选3.5-5.5，包括所述范围内的3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4和5.5。

在一些实施方案中，所述苯酚的浓度（体积分数）是10%-80%，更优选20%-60%，包括所述范围内的20%，22%，25%，28%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，40%，42%，45%，48%，50%，52%，55%，58%和60%。

在一些实施方案中，所述蛋白变性剂是例如胍盐，又例如盐酸胍和/或异硫氰酸胍。

在一些实施方案中，所述异硫氰酸胍的浓度是1-10M，更优选1-5M，包括所述范围内的1M，1.5M，2M，2.5M，3M，3.5M，4M，4.5M和5M。

在一些实施方案中，所述缓冲盐是弱酸盐，例如醋酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、磷酸盐、邻苯二甲酸盐、硼酸盐、酒石酸盐和乳酸盐中的一种或多种；优选地，所述缓冲盐是醋酸盐和柠檬酸盐，更优选地，所述缓冲盐是10-50mM柠檬酸盐和50-200mM醋酸盐，最优选地，所述缓冲盐是10-50mM柠檬酸钠和50-200mM醋酸钠。

在一些实施方案中，所述裂解液还包含去污剂，例如肌氨酸，N-十二烷基肌氨酸钠、十二烷基硫酸钠和N-月桂酰肌氨酸中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述裂解液还包括亲脂性染料，所述亲脂性染料是例如溶剂蓝、尼罗红、荧光黄、苏丹III、苏丹橙G、溶剂绿或尼罗蓝氯化物，优选溶剂蓝。所述亲脂性染料染色细胞内脂质、细胞膜、疏水蛋白表面和其他脂溶性细胞结构。当包含亲脂性染料的裂解液与稀释液混合后，所述染料专有地进入下部有机相，使上部水相澄清无色。

在一些实施方案中，所述裂解液包含苯酚、胍盐、缓冲盐和去污剂；优选地，所述裂解液包含20%-60%苯酚、1-5M胍盐、缓冲盐和去污剂；优选地，所述裂解液包含20%-60%苯酚、1-5M胍盐、缓冲盐、去污剂和亲脂性染料；优选地，所述裂解液包含20%-60%苯酚、1-5M异硫氰酸胍、缓冲盐、肌氨酸和溶剂蓝；优选地，所述裂解液包含20%-60%苯酚、1-5M异硫氰酸胍、10-50mM柠檬酸盐、50-200mM醋酸盐、10-50mM肌氨酸和1-10μg/ml溶剂蓝；优选地，所述裂解液包含20%-60%苯酚、1-5M异硫氰酸胍、10-50mM柠檬酸钠、50-200mM醋酸钠、10-50mM肌氨酸和1-10μg/ml溶剂蓝；优选地，所述裂解液包含30%-50%苯酚、1-3M异硫氰酸胍、10-30mM柠檬酸钠、100-200mM醋酸钠、10-30mM肌氨酸和2-5μg/ml溶剂蓝。

在一些实施方案中，当所述生物样本是组织样本时，所述步骤（2）还包括在加入裂解液之前先研磨的步骤，所述研磨为例如使用研钵研磨或使用研磨仪（磨样机）研磨，优选加入液氮研磨。

在一些实施方案中，所述步骤（3）中的离心条件为10000-18000 rpm离心5-20min，优选10000-15000 rpm离心5-10min，最优选11200rpm离心5min，最优选11200rpm常温离心5min。

在一些实施方案中，所述步骤（4）包括旋涡震荡混匀，室温静置。

在一些实施方案中，所述步骤（5）中的离心条件为10000-18000 rpm离心10-25min，优选10000-15000 rpm离心10-20min，最优选11200rpm离心15min，最优选11200rpm常温离心15min。

在一些实施方案中，所述步骤（6）包括在上清中加入异丙醇后震荡混匀，离心，弃去上清，然后加入75％的乙醇，室温离心，弃去上清，得到RNA。

本申请的第二方面提供一种试剂盒，其包含独立包装的裂解液和独立包装的稀释液，所述裂解液包含苯酚，蛋白变性剂和缓冲盐，所述稀释液包含二硫键还原剂。

在一些实施方案中，所述稀释液包含二硫键还原剂和pH调节剂。

在一些实施方案中，所述稀释液还包括表面活性剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含其他辅助检测试剂，例如纯水、异丙醇和乙醇中的一种或多种。

术语解释：

酸性酚沉淀法：一定浓度的酸性酚选择性沉淀DNA(单链DNA(ss DNA)和双链DNA(ds DNA))、蛋白质以及其它细胞组分，而RNA仍然保持溶解形式。根据这一原理得到的无需分离水相和有机相以及相的界面的用于分离RNA的方法称为酸性酚沉淀法。

附图说明

图1A：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液1）提取得到水稻叶RNA和拟南芥叶RNA的纯度；

图1B：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液1）提取得到水稻叶RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图2：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液2）提取得到大鼠肝脏组织RNA、大鼠肺脏组织RNA和斑马鱼肉RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图3：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液3）提取得到大鼠白色脂肪组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图4：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液4）提取得到大鼠脾脏组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图5：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液4）提取得到大鼠肾脏组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图6：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液4）提取得到大鼠胸腺组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图7：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液4）提取得到大鼠腿骨组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图8：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液4）提取得到小鼠胰腺组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图9：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液4）提取得到白鲢肌肉组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图10：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液4）提取得到白鲢腮组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图11：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液4）提取得到白鲢皮肤组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图12：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液4）提取得到海参肉组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图13：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液5）提取得到293细胞RNA和Vero细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图14：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液6-11）提取得到大鼠肾脏组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图15：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液12-17）提取得到大鼠小肠组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图16：三种方法（Trizol法、酸性酚沉淀法、稀释液18-22）提取得到大鼠小肠组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图17：不同pH的裂解液提取得到的大鼠脾脏组织RNA和293 T细胞RNA的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案，但下述的实例仅仅是本申请的简易例子，并不代表或限制本申请的权利保护范围，本申请的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。

实施例1

以纯水为溶剂，配制如下裂解液和稀释液（其中各试剂均来自本领域常规试剂厂商）：

裂解液1：35%（体积分数）苯酚、1.5M异硫氰酸胍、20mM柠檬酸钠、100mM醋酸钠、20mM肌氨酸、3μg/ml溶剂蓝43、pH 4.0；

稀释液1：使用20mL 10mM的乙酸钠溶液（pH=5.2）溶解3.09g二硫苏糖醇，获得1M的二硫苏糖醇母液（pH=5.2）。

取1mL二硫苏糖醇母液稀释100倍获得含有10mM二硫苏糖醇的稀释液1，pH 5.2。

注：水对pH的影响很小，默认稀释后的pH不变，下同。

以拟南芥叶片和汕优63水稻叶片为实验样本进行RNA提取，其中对照组使用传统Trizol法RNA提取试剂盒(Thermo(Life)，货号：15596018)，酸性酚沉淀组和实验组按照如下步骤进行（三种方法的样本投入量相同）：

1、裂解

(1)将新鲜拟南芥叶片/水稻叶片组织用液氮速冻，迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状(无明显可见颗粒)。

(2)将研磨成粉的样品转移至离心管中，取50 mg组织加入500 μl裂解液，涡旋振荡至充分裂解，室温静置5 min。

(3)11,200 rpm(12,000 × g)室温离心5 min。小心吸取上清至新的1.5 ml离心管，切勿吸取沉淀。

2、向上述上清中加入2/5体积的稀释液（其中酸性酚沉淀组使用等体积的水替代稀释液）(每500 μl上清加入200 μl稀释液)。盖紧离心管盖，充分涡旋振荡至溶液为均一乳浊状。室温静置5 min。

3、11,200 rpm(12,000 × g)室温离心15 min。

4、小心取出离心管。此时溶液分成上层溶液(含RNA)和深色的下层有机相(含蛋白质、DNA、多糖等杂质)，小心吸取上清溶液(约550 µl)至一个新的离心管中。

5、在得到的上清溶液中加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温静置10min。

6、11,200 rpm(12,000 × g)室温离心10 min，离心后在管侧和管底可以看见白色凝胶状沉淀，小心弃去上清，勿丢失沉淀。

7、加入1 ml 75%乙醇(RNase-free ddH₂O配制)。轻弹管底，让沉淀悬浮起来，并上下颠倒数次。

8、9,100 rpm(8,000 × g)室温离心3 min，弃去上清，勿丢失沉淀。

9、重复步骤6和7一遍，弃尽上清。

10、室温放置晾干，加入100 μl RNase-free ddH₂O溶解沉淀，室温涡旋3 min(或使用移液器反复吹打)，使RNA沉淀充分溶解。提取的RNA产物可以分装后在-85~-65℃长期保存，在-30~-15℃短期保存。

分离出的RNA进行OneDrop检测纯度，琼脂糖凝胶电泳检测产量和完整度，具体实验步骤如下，结果如图1A和图1B所示。

1、OneDrop(超微量紫外可见分光光度计，Od1000+)检测分离RNA浓度和纯度：

（1）OneDrop测定前，需先将RNA产物振荡混匀、瞬离后再测以保证数据真实。

（2）使用本次质控实验中洗脱RNA产物所用的RNase-free ddH₂O进行Blank。

（3）Blank后需先测RNase-free ddH₂O，且数值-0.1~0.1之间，再进行RNA产物测值。

（4）每次取2 μl RNA产物进行测值。

2、琼脂糖凝胶电泳检测分离RNA的完整度：

设备：凝胶电泳仪(PP-1152)；

取2.5μl水稻叶片RNA提取产物和7.5μl RNase-free ddH₂O混合，共计10μl，再加入1μl 10x loading Buffer混匀，然后在PCR仪72℃孵育2min，16℃ Hold。跑1.2%的琼脂糖胶，在220V下电泳10 min。

结果分析：如图1A所示，使用稀释液1提取的水稻叶片和拟南芥叶片的RNA纯度优于酸性酚沉淀法和Trizol法，具体地，使用稀释液1对水稻叶片提取得到的RNA纯度优于Trizol法10%左右，优于酸性酚沉淀法20%左右。这一结果说明使用稀释液1以后，产物残留的杂质（蛋白质、盐类、有机溶剂等）更少。如图1B所示，使用稀释液1提取的水稻叶片的RNA产量是高于酸性酚沉淀法的，与Trizol法相当，且完整度高（条带清楚且无拖尾情况）。

实施例2

裂解液2：35%（体积分数）苯酚、2M异硫氰酸胍、20mM柠檬酸钠、100mM醋酸钠、20mM肌氨酸、3μg/ml溶剂蓝43、pH 4.0；

稀释液2：1M的二硫苏糖醇母液（pH=5.2）配制方法同实施例1。

取1mL二硫苏糖醇母液稀释20倍获得含有50mM二硫苏糖醇的稀释液2，pH 5.2。

以采集的常见动物组织样本-大鼠肝脏组织、大鼠肺脏组织和斑马鱼肉组织为实验样本进行RNA提取，以传统Trizol法RNA提取试剂盒(Thermo(Life)，货号：15596018)作为对照，酸性酚沉淀组和实验组RNA提取过程同实施例1（三种方法的样本投入量相同）。其中分别取1μl大鼠肝脏组织RNA提取产物、2 μl大鼠肺脏组织RNA提取产物和1μl 斑马鱼组织RNA提取产物和相应体积的RNase-free ddH₂O混合，分别得到3份10μl的待电泳的样本，后续琼脂糖凝胶电泳实验步骤同实施例1，结果如图2所示。

结果分析：从图2结果来看，使用稀释液2提取的大鼠肝脏组织、大鼠肺脏组织和斑马鱼肉组织的RNA产量是高于酸性酚沉淀法的，与Trizol法相当；且完整度明显优于酸性酚沉淀法和Trizol法。

实施例3

裂解液3：30%（体积分数）苯酚、2.5M异硫氰酸胍、20mM柠檬酸钠、100mM醋酸钠、20mM肌氨酸、3μg/ml溶剂蓝43、pH 4.0；

稀释液3：使用20mL 10mM的乙酸钠溶液（pH=5.2）溶解3.09g 二硫苏糖醇，充分溶解，获得1M的二硫苏糖醇母液（pH=5.2）。

取3mL 1M 二硫苏糖醇母液，定容到100mL，加入十二烷基硫酸钠至终浓度为10 mM，获得含有30mM二硫苏糖醇和10 mM 十二烷基硫酸钠的稀释液3，pH 5.2。

以采集的脂肪含量高动物组织样本-大鼠白色脂肪组织为实验样本进行RNA提取，以传统Trizol法RNA提取试剂盒(Thermo(Life)，货号：15596018)作为对照，酸性酚沉淀组和实验组RNA提取过程同实施例1（三种方法的样本投入量相同）。其中取6μl大鼠脂肪组织RNA提取产物和4μl RNase-free ddH₂O混合得到10μl的待电泳的样本，后续琼脂糖凝胶电泳实验步骤同实施例1，结果如图3所示。

结果分析：如图3所示，使用稀释液3提取的大鼠白色脂肪组织的RNA产量和完整度与Trizol法相当，且显著优于酸性酚沉淀法（没有明显条带）。

实施例4

裂解液4：35%（体积分数）苯酚、1.5M异硫氰酸胍、10mM柠檬酸钠、200mM醋酸钠、20mM肌氨酸、3μg/ml溶剂蓝43、pH 4.0；

稀释液4：使用20mL 10mM的乙酸钠溶液（pH=5.2）溶解3.09g 二硫苏糖醇，充分溶解，获得1M的二硫苏糖醇母液（pH=5.2）。

取1mL 1M 二硫苏糖醇母液，定容到100mL，加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐至终浓度为50 mM，获得含有10mM 二硫苏糖醇和50 mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐的稀释液4，pH 4.5。

以采集的RNase含量高的9种动物组织样本：大鼠脾脏组织、大鼠肾脏组织、大鼠胸腺组织、大鼠腿骨组织、小鼠胰腺组织、白鲢肌肉组织、白鲢腮组织、白鲢皮肤组织和海参肉组织分别为实验样本进行RNA提取，以传统Trizol法RNA提取试剂盒(Thermo(Life)，货号：15596018)作为对照，酸性酚沉淀组和实验组RNA提取过程同实施例1（三种方法的样本投入量相同）。其中分别取1μl前述组织RNA提取产物和9μl RNase-free ddH₂O混合分别得到9份10μl的待电泳的样本，后续琼脂糖凝胶电泳实验步骤同实施例1，结果如图4-图12所示。

结果分析：如图4-图12，稀释液4对动物组织样本表现出了优秀的RNA提取能力，其中9种不同样本提取获得的RNA产量均显著高于酸性酚沉淀法的，与Trizol法相当，且完整度明显优于酸性酚沉淀法。

实施例5

裂解液5：45%（体积分数）苯酚、1.5M异硫氰酸胍、20mM柠檬酸钠、100mM醋酸钠、20mM肌氨酸、3μg/ml溶剂蓝43、pH 4.0；

稀释液5：使用20mL 10mM的乙酸钠溶液（pH=5.2）溶解3.09g 二硫苏糖醇，充分溶解，获得1M的二硫苏糖醇母液（pH=5.2）。

取1mL 1M 二硫苏糖醇母液，定容到100mL，加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐至终浓度为20 mM，获得包含10mM二硫苏糖醇和20 mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐的稀释液5，pH 4.7。

以采集的细胞样本-293细胞和Vero细胞为实验样本进行RNA提取，以传统Trizol法RNA提取试剂盒(Thermo(Life)，货号：15596018)作为对照，酸性酚沉淀组和实验组按如下步骤进行（三种方法的样本投入量相同）：

1、裂解

悬浮细胞（293细胞）：

(1)离心收集细胞，弃尽上清。每1×10⁶个细胞加入500 μl裂解液。

(2)涡旋振荡或用移液器反复吹打直至充分裂解，室温静置5 min。

贴壁细胞（Vero细胞）：

(1)弃去细胞培养液，用1 × PBS清洗一次。

(2)每10 cm直径的细胞培养皿(10 cm cell culture dish)培养的细胞加入2 ml裂解液，使之充分覆盖到细胞表面，然后用移液器将细胞吹打下来。

(3)将裂解液转移至1.5 ml离心管中，涡旋振荡或用移液器反复吹打直至充分裂解，室温静置5 min。

2、分别加入裂解液2/5体积的稀释液，酸性酚沉淀组使用相同体积的水替代，后续实验步骤同实施例1。

其中分别取2μl 293细胞RNA提取产物、4 μl Vero细胞RNA提取产物和相应体积的RNase-free ddH₂O混合，分别得到2份10μl的待电泳的样本，后续琼脂糖凝胶电泳实验步骤同实施例1，结果如图13所示。

结果分析：如图13，使用稀释液5提取的293细胞和Vero细胞的RNA产量是高于酸性酚沉淀法的，与Trizol法相当；且完整度明显优于酸性酚沉淀法。

实施例6

裂解液1同实施例1中的裂解液1；

使用20mL 10mM的乙酸钠溶液（pH=5.2）溶解3.09g 二硫苏糖醇，获得1M的二硫苏糖醇母液（pH=5.2）。

取1mL二硫苏糖醇母液稀释200倍获得含有5mM二硫苏糖醇的稀释液6，pH 5.2。

取1mL二硫苏糖醇母液稀释100倍获得含有10mM二硫苏糖醇的稀释液7，pH 5.2。

取1mL二硫苏糖醇母液稀释20倍获得含有50mM二硫苏糖醇的稀释液8，pH 5.2。

取1mL二硫苏糖醇母液稀释10倍获得含有100mM二硫苏糖醇的稀释液9，pH 5.2。

取3mL二硫苏糖醇母液加水定容至20mL获得含有150mM二硫苏糖醇的稀释液10，pH5.2。

取1mL二硫苏糖醇母液稀释5倍获得含有200mM二硫苏糖醇的稀释液11，pH 5.2。

以大鼠肾脏组织为实验样本进行RNA提取，以传统Trizol法RNA提取试剂盒(Thermo(Life)，货号：15596018)作为对照，酸性酚沉淀组和实验组RNA提取过程同实施例1（三种方法的样本投入量相同）。其中取1μl大鼠肾脏组织RNA提取产物和9μl RNase-freeddH₂O混合得到10μl的待电泳的样本，后续琼脂糖凝胶电泳实验步骤同实施例1，结果如图14所示。

结果分析：如图14所示，使用稀释液6-11提取的大鼠肾脏组织的RNA产量和完整度明显优于酸性酚沉淀法，其中不同浓度的二硫苏糖醇对RNA分离的效果不一样，随着二硫苏糖醇的浓度逐渐提升，RNA得率逐渐上升。

实施例7

裂解液1同实施例1中的裂解液1；

稀释液12：50mM二硫苏糖醇；pH 5.2；（取1mL二硫苏糖醇母液稀释20倍获得即可获得含有50mM二硫苏糖醇的稀释液12，pH 5.2。）

稀释液13：50mM还原性谷胱甘肽；加入盐酸调节pH至 5.0；

稀释液14：50mM二硫赤藓糖醇；pH 7.0；

稀释液15：50mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)；加入氢氧化钠调节pH至4.6；

稀释液16：50mM氧钒核糖核苷复合物；pH 7.0；

稀释液17：50mM β-巯基乙醇；pH 7.0。

以大鼠小肠组织为实验样本进行RNA提取，以传统Trizol法RNA提取试剂盒(Thermo(Life)，货号：15596018)作为对照，酸性酚沉淀组和实验组RNA提取过程同实施例1（三种方法的样本投入量相同）。其中取4μl大鼠小肠组织RNA提取产物和6μl RNase-freeddH₂O混合得到10μl的待电泳的样本，后续琼脂糖凝胶电泳实验步骤同实施例1，结果如图15所示。

结果分析：如图15，在稀释液中分别加入不同的还原剂均可提升RNA的提取效果，其中含有二硫苏糖醇和氧钒核糖核苷复合物的稀释液效果最好，RNA得率最高。

实施例8

裂解液6：35%（体积分数）苯酚、2M异硫氰酸胍、20mM柠檬酸钠、100mM醋酸钠、20mM肌氨酸、3 μg/ml溶剂蓝43、pH=4；

稀释液18：100mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)；加入氢氧化钠调节pH至3.0；

稀释液19：100mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)；加入氢氧化钠调节pH至4.0；

稀释液20：100mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)；加入氢氧化钠调节pH至5.0；

稀释液21：100mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)；加入氢氧化钠调节pH至6.0；

稀释液22：100mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)；加入氢氧化钠调节pH至7.0；

以大鼠小肠组织为实验样本进行RNA提取，以传统Trizol法RNA提取试剂盒(Thermo(Life)，货号：15596018)作为对照，酸性酚沉淀组和实验组RNA提取过程同实施例1（三种方法的样本投入量相同）。其中取4μl大鼠小肠组织RNA提取产物和6μl RNase-freeddH₂O混合得到10μl的待电泳的样本，后续琼脂糖凝胶电泳实验步骤同实施例1，结果如图16所示。

结果分析：如图16，pH在3-6之间的稀释液均可提升RNA的提取效果，其中又以pH为4和5的稀释液效果最好，RNA得率最高，凝胶电泳条带最清晰。

实施例9

裂解液7：35%（体积分数）苯酚、1.5M异硫氰酸胍、20mM柠檬酸钠、100mM醋酸钠、20mM肌氨酸、3μg/ml溶剂蓝43；调节pH分别为4.0、4.2、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8和6.0。

稀释液1同实施例1中的稀释液1。

以大鼠脾脏组织为实验样本进行RNA提取，样本投入量以及RNA提取过程同实施例1。以293T细胞为实验样本进行RNA提取，样本投入量以及RNA提取过程同实施例5。其中取4μl大鼠脾脏组织RNA提取产物和6μl RNase-free ddH₂O混合得到10μl的待电泳的样本，取2μl 293T细胞RNA提取产物和8μl RNase-free ddH₂O混合，分别得到2份10μl的待电泳的样本，后续琼脂糖凝胶电泳实验步骤同实施例1，结果如图17所示（孔道有限，分两次跑胶）。

结果分析：如图17，pH在4.0-6.0之间的裂解液配合稀释液均可有效提取RNA。

Claims

1.一种从生物样本中提取RNA的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）获得生物样本；

（3）任选地，离心，吸取上清液；

（4）向离心后的上清液或未离心的裂解产物中加入稀释液，震荡混匀，所述稀释液包含还原剂；

（5）离心，吸取上清液；

（6）向上清液中加入乙醇或异丙醇沉淀RNA。

2.根据权利要求1所述的方法，所述还原剂是二硫键还原剂。

3.根据权利要求2所述的方法，所述稀释液还包含pH调节剂，所述pH调节剂是酸或碱或弱酸盐或弱碱盐中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的方法，所述稀释液的pH是3-7。

5.根据权利要求1所述的方法，所述稀释液还包括表面活性剂。

6.根据权利要求3所述的方法，所述二硫键还原剂是二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、β-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、还原性谷胱甘肽和氧钒核糖核苷复合物中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的方法，所述蛋白变性剂是胍盐，所述裂解液包含苯酚、胍盐、缓冲盐和去污剂。

8.根据权利要求7所述的方法，所述裂解液的pH是3-6。

9.根据权利要求1所述的方法，所述生物样本是组织样本，所述组织样本是动物组织或植物组织。

10.根据权利要求9所述的方法，所述组织样本的使用量和稀释液的使用量的比例为每1mg组织加入包含0.05-1μmol还原剂的稀释液。

11.根据权利要求9所述的方法，所述步骤（2）还包括在加入裂解液之前先研磨的步骤。

12.根据权利要求1所述的方法，所述生物样本是细胞样本，所述细胞样本是贴壁细胞或悬浮细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，所述悬浮细胞样本的使用量和稀释液的使用量的比例为每10⁶个细胞加入包含2-50μmol还原剂的稀释液，所述贴壁细胞样本的使用量和稀释液的使用量的比例为每π cm²面积的细胞培养皿加入包含0.5-10μmol还原剂的稀释液。

14.根据权利要求1所述的方法，所述稀释液的使用量和裂解液的使用量的体积比为0.1-1。

15.根据权利要求1-14任一项所述的方法，所述步骤（6）包括在上清中加入异丙醇后震荡混匀，离心，弃去上清，然后加入75％的乙醇，室温离心，弃去上清，得到RNA。

16.一种用于行使权利要求1-15任一项所述方法的试剂盒，其包含独立包装的裂解液和独立包装的稀释液，所述裂解液包含苯酚，蛋白变性剂和缓冲盐，所述稀释液包含二硫键还原剂。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，所述裂解液的pH是3-7。

18.根据权利要求16所述的试剂盒，所述裂解液包含苯酚、胍盐、缓冲盐和去污剂。

19.根据权利要求16所述的试剂盒，所述稀释液的pH是3-6。

20.根据权利要求19所述的试剂盒，所述二硫键还原剂是二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐、β-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、还原性谷胱甘肽和氧钒核糖核苷复合物中的一种或多种。