WO1999009945A1 - Utilisations d'extraits de la plante rhoeo discolor dans le domaine de la cosmetique et de la pharmacie, notamment de la dermatologie - Google Patents

Utilisations d'extraits de la plante rhoeo discolor dans le domaine de la cosmetique et de la pharmacie, notamment de la dermatologie Download PDF

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Frédéric Bonte
Alain Meybeck
Pierre Potier
Françoise PICOT
Jean-Pierre Cosson
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    • C12N2500/70—Undefined extracts
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Definitions

  • the invention relates to new uses of extracts of the plant Rhoeo discolor in the field of cosmetics and pharmacy, in particular dermatology. It also relates to the use of the same extracts for the preparation of culture media for skin cells.
  • Rhoeo discolor plant is a plant of the Commeliaceae family also known under the names Rhoeo discolor Hance or Rhoeo spathacea Stearn or Tradescantia spathacea. This plant is known to be native to Central America and cultivated in Brazil. It is also present in New Caledonia.
  • the plant is also cited as a potential source of acylated anthocyanins, in particular for the preparation of food, pharmaceutical or cosmetic dyes in US patent 4,999,423.
  • An insecticidal activity of an aqueous extract of leaves and stems is also cited in Lloydia, 1950, 13, 89-162).
  • extracts of this plant exhibited a certain number of activities making it possible to envisage their use both in the field of cosmetics and in pharmacy, in particular in dermatology.
  • This differentiation is reflected in particular, at the epidemic level, by greater cell cohesion, by regulation of the transformation of keratinocytes into corneocytes by loss of the nucleus and increase in cellular corneification, by an increase in the number of layers of corneocytes forming the stratum corneum, all of these phenomena contributing to the strengthening of the protective function of the skin vis-à-vis the external environment and to the strengthening of the water barrier preventing excessive loss of water by the epidemic. Furthermore, it is also reflected in the hair follicle by regulating the processes of synthesis of keratins by keratinocytes, these proteins being the main constituent of the hair shaft, the quality of which is essential for a hair in good condition. In addition, the inventors have observed that these extracts make it possible to promote, accelerate and improve the differentiation of skin cells, in particular keratinocytes, during their culture in a culture medium.
  • Rhoeo discolor extracts as free radical scavengers and have demonstrated the advantage of using such extracts for the preparation of cosmetic products or dermatological with anti-radical activity, in particular for the preparation of products intended to combat skin aging and oxidative phenomena leading to the production of reactive free radicals.
  • these products make it possible to effectively fight against toxic OH radicals.
  • the inventors have also demonstrated that the extracts of the Rhoeo discolor plant are of valuable interest in cosmetics and in pharmacy, in particular in dermatology because of their property of stimulating the production of GAG by fibroblasts of half, in particular of the human half. .
  • proteoglycans which are partly made up of GAG, are complex macromolecules formed of a protein part onto which are grafted by covalent bonds polymers of disaccharides called glycosaminoglycans (GAG).
  • GAG glycosaminoglycans
  • GAGs are present at the dermal level and participate in the composition of the extracellular matrix. They have been found linked to certain sites of collagen fibers, as described by J. E. SCOTT in Int. J. Biol. Macromol., 1991, J_3, pages 157-161. They have also been identified between keratinocytes at the epidemic level as described by J. G. HAGGERTY et al. in the journal J. Invest. Dcrmatol., 1992, 99, pages 374-380, 99 pages 374-380. GAGs have also been found in the extracellular matrix of the dermal papilla of the hair follicle. Their quantity varies depending on the hair cycle.
  • proteoglycans and GAGs of the hair follicles reference may be made in particular to the publication by JR COUCHMAN cited above, and to that of M. TAYLOR et al., "Glycosaminoglycan synthesis by cultured human hair follicle dc ⁇ nal papilla cclls: comparison with non-follicular dcrmal fibroblasts ", Brit. J. Dcrmatol. 1992 (May) 126 (5) 479-84.
  • GAGs the disaccharide unit of GAGs is formed from a hexosamine (D-glucosamine or D-galactosamine) which is quite often sulfated alternating with a uronic acid (D-glucuronic or L-iduronic).
  • the GAG chains most frequently encountered in the skin are hyaluronic acid, chondroitins-4 and -6 sulfate, dermatan sulfate and, in small quantities, heparin and heparan sulfate.
  • Hyaluronic acid in particular, is known to be an essential element for healthy and undamaged skin. Only this acid is not synthesized in association with a central protein.
  • GAGs by their primary property of associating strongly with water molecules and of forming gels, ensure the hydration of the half and the epidermis.
  • Well-hydrated skin guarantees good appearance, a satisfactory physiological and functional state, with in particular good mechanical properties.
  • the decrease in GAGs during skin aging has been shown by many authors (such as: SMITH et al. in J. Invest. De ⁇ natol., 1962, 39, pages 347-350; or FLEISCHMAJER et al. in Biochim Biophys. Acta, 1972, 279, pages 265-275 ; or by LONG AS et al. in Carbohydr. Rcs., 1987, 159, pages 127-136).
  • the stimulation of the synthesis of GAGs therefore makes it possible in particular to restore to a skin having a deficiency in terms of its mechanical properties or of its water barrier, such as dehydrated or aged skin, the qualities and properties of normal skin and young, or to prevent or treat hair growth disorders, or to restore or strengthen the shine and suppleness of a hair.
  • the main object of the present invention is to solve the new technical problem consisting in the supply of a new formulation of cosmetic or pharmaceutical compositions, in particular dermatological compositions, having the property of promoting the differentiation of keratinocytes and intended in particular for treating skin disorders.
  • '' accompanying an insufficiency or a disturbance in the differentiation of keratinocytes, such as psoriasis, to restore, preserve and / or strengthen the protective function of the skin, in particular the water barrier function, thus leading to a hydrating effect , in particular by preventing excessive loss of water by the epidc ⁇ nc.
  • An advantageous application of this latter phenomenon is the treatment of ichthyotic skin, as well as the treatment of psoriatic skin.
  • Another main object of the present invention is to solve the new technical problem consisting in providing a solution making it possible to promote, accelerate and improve the differentiation of skin cells, in particular keratinocytes, in culture.
  • Another main object of the present invention is also to provide cosmetic or pharmaceutical, in particular dermatological, compositions having anti-free radical activity.
  • Another main object of the invention is also to solve the new technical problem consisting in the supply of cosmetic or pharmaceutical compositions, in particular dermatological compositions, making it possible to stimulate the synthesis of GAGs. Therefore, the invention also relates to the use of extracts of Rhoeo discolor to prepare cosmetic or pharmaceutical compositions, in particular dermatological compositions, making it possible to stimulate the synthesis of GAGs. These compositions make it possible to improve the firmness and suppleness of the skin, to fight against the formation of wrinkles or to attenuate their depth or to obtain a smoothing of the surface of the skin thanks, in particular, to a tightening effect. physiological or to improve the hydration of the skin. The present invention also aims to solve the new technical problem consisting in the supply of a solution making it possible to treat cells, in particular fibroblasts, in culture, in order to obtain stimulation of the synthesis of GAGs.
  • the invention relates to the use of an extract of the Rhoeo discolor plant as an active ingredient in a cosmetic composition.
  • the extract of the plant Rhoeo discolor is used as a cosmetic agent intended to hydrate or improve the hydration of the skin, to fight against the effects of aging of the skin, to prevent or treat wrinkles, improve the firmness and suppleness of the skin.
  • the inventors of the present invention have been able to link these different activities to the activity of the extracts of the plant Rhoeo discolor on the differentiation of keratinocytes, the trapping of free radicals as well as on the synthesis of GAGs.
  • the cosmetic compositions of the invention make it possible to improve the differentiation of keratinocytes, which contributes to strengthening the cutaneous barrier at the level of the stratum corneum, thus making it possible to reduce the loss of water in the skin, to maintain its hydration , improve its appearance and radiance, strengthen the skin barrier against the penetration of irritants or toxic external agents, protect the skin and, more generally, the body.
  • compositions according to the invention are manifested by the effectiveness of these compositions in the fight against aging of the skin.
  • the effect of the cosmetic compositions of the invention for stimulating the synthesis of GAGs results in the effect of these compositions for improving the hydration of the dermis and the epidermis, combating the formation of wrinkles or attenuating their depth, and improve the firmness and suppleness of the skin.
  • This last effect makes it possible to obtain a smoothing of the surface of the skin thanks to a physiological tensor effect.
  • the invention also relates to the uses of extracts of the Rhoeo discolor plant for preparing compositions for pharmaceutical use, especially dermatological.
  • the invention relates to the use of an extract from the Rhoeo discolor plant, for the preparation of a pharmaceutical composition, in particular a dermatological composition, intended:
  • the pharmaceutical compositions, in particular dermatological compositions of the invention prove to be particularly advantageous because, by their effects on the differentiation of keratinocytes, the pharmaceutical compositions, in particular dermatological compositions of the invention, make it possible to improve the effect barrier of the skin and consequently of limiting water losses but also this activity makes it possible to combat the phenomena of irregular or exaggerated scaling.
  • the invention therefore makes it possible to provide compositions which make it possible to restore the normal physiological state of the skin.
  • compositions in particular those of the invention on free radicals, makes it possible to provide a solution to all the phenomena of aging of the skin, in particular to oxidative phenomena.
  • compositions, in particular dermatological logic, of the invention on the synthesis of GAGs proves to be particularly advantageous in all skin treatments where it is sought in particular to obtain a smoothing of the surface of the skin, in particular thanks to a tightening effect or to improve the hydration of the skin.
  • cosmetic and pharmaceutical, in particular dermatological, extracts from the whole plant may be used.
  • the extract of the Rhoeo discolor plant is an extract obtained by extraction using a solvent or a mixture of solvents whose polarity parameter p 'is between 4 and 8.
  • polarity parameter p ' is between 4 and 8.
  • the extract will advantageously be obtained by maceration of the plant or part of a plant in a solvent or a mixture of solvents as defined above, followed by filtration and, if necessary, by evaporation of said solvent or mixture of solvents .
  • - C 1 to C 4 alcohols in particular ethanol, ethanol, isopropanol or hydroalcoholic mixtures of these alcohols, - esters, in particular ethyl acetate or isopropyl acetate,
  • compositions can be produced.
  • the preferred forms are the topical forms suitable for application to the skin tissue, including the skin and mucous membranes.
  • Suitable topical formulations include, without limitation, emulsions, creams, milks, balms, gels, lotions, ova as well as treating makeup compositions, these different types of formulations being well known to those skilled in the art. art.
  • the cosmetic or pharmaceutical, in particular dermatological, compositions of the invention advantageously contain concentrations of extracts of the Rhoeo discolor plant of between 0.001 and 5% by weight, preferably between 0.01 and 2% expressed as dry extract relative to the weight of said composition.
  • the two aspects of the cosmetic or pharmaceutical invention the compositions also contain at least one product chosen from the family consisting of:
  • alpha hydroxy acids such as lactic acid, malic acid, glycolic acid, citric acid, tartaric acid, salicylic acid, and natural extracts containing them ,
  • - hydrating agents such as glycerol, glycerol lactate, urea, trehalose, dextran,
  • vitamins A, B, C, D, E and F in particular their esters or their phosphates
  • ceramides in particular ceramides of plant or synthetic origin, - effectors of the natural synthesis of ceramides,
  • micro-algae such as Euglcna or Chlorclla
  • - anti-free radical agents such as curcuminoids, vitamin E and vitamin C derivatives, nordihydrogariaretic acid.
  • the present invention also relates to a cell or tissue culture medium, in particular for the culture of skin cells, in particular of keratinocytes, making it possible to promote, accelerate and improve their differentiation, characterized in that it comprises an effective amount of an extract from the plant Rhoeo discolor, to obtain such differentiation.
  • This culture medium advantageously comprises from 0.0001 to 1% by weight of Rhoeo discolor extract relative to the total weight of said culture medium.
  • the invention also relates to a method for the mass culture of skin cells, in particular keratinocytes and / or fibroblasts, for the production of artificial skin or for the preparation of reconstituted skin models, characterized in that it uses a culture medium as defined above.
  • the invention also relates to a method which makes it possible to promote, accelerate or improve the differentiation of skin cells, in particular keratinocytes and / or to stimulate the synthesis of GAGs, in particular from keratinocytes and / or fibroblasts, in particular within the framework of a mass culture of skin cells and thus allows the production of artificial skin or the preparation of reconstituted skin models, comprising a dermis and an epidermis, this process being characterized in that it uses a culture medium as defined above.
  • the ground material of the plant, prior to its maceration in methanol, is treated with hexane, according to a method well known to those skilled in the art, to degrease it.
  • a second methanolic extraction test according to the method described in the first paragraph above, is carried out with another batch of the whole ground plant.
  • a dry extract called MD 82/95 is obtained.
  • An extract is prepared by a hydroglycolic mixture of 1, 3-butylene glycol and water in the ratio 1/1 using a weight ratio of 1/20 of the plant relative to the solvent. This extract is prepared by heating hot for 20 min at 80 ° C. of the mixture. A yellow extract is recovered. This extract has the advantage of being easily incorporated into cosmetic formulations.
  • this culture medium can be constituted by an M 199 medium supplemented with 2 mM of L-glutaminc, 10% of fetal calf serum, cholera toxin, hydrocortisonc, as well as the epidermal growth factor EGF .
  • the culture medium is renewed by an identical medium in 6 of the 12 wells which constitute untreated control wells, and, in the 6 remaining wells constituting the treated wells, the medium is renewed with an identical medium, but in which 2.5 ⁇ g / ml of Rhoeo discolor extract as obtained in Example 1 has been dissolved, and on which sterilizing filtration has been carried out beforehand on a filter at 0.22 ⁇ m.
  • Sections of each of the resin blocks thus obtained are produced in the form of ultrafine sections, for example using a device known under the name of microtome.
  • the sections of the six control cultures, on the one hand, and the sections of the six cultures treated with the extract of Rhoeo discolor, on the other hand, are then observed under a transmission electron microscope.
  • the upper layers show good comerification of keratinocytes, while it is known that the final stage of differentiation is never completely reached in the case of submerged cultures.
  • a microemulsion is prepared by dissolving linoleic acid in a zwitterionic detergent, CHAPS (Sigma), and gradually adding a 0.06 M phosphate buffer, pH 7.4.
  • CHAPS zwitterionic detergent
  • the micro-emulsion of linoleic acid prepared as described above
  • PDGF Platinum Derived
  • BB Sigma, ref. 43066
  • BB Sigma, ref. 4306
  • FHN Normal human fibroblast cultures are initiated in three weeks from explants of healthy skin obtained in plastic surgery.
  • the cells are cultured in the presence of El 99 medium, supplemented with 2mM L-glutaminc (noted El 99c) and containing 10% v / v of fetal calf serum (S VF, Gibco).
  • El 99c 2mM L-glutaminc
  • S VF fetal calf serum
  • the culture dishes are placed in an incubator at 37 ° C under an atmosphere enriched in CO2 (5%).
  • Sub-cultures (passages) are carried out by trypsinization and the FHN are used after one to six passages, denoted P I to P6.
  • the product coded MD82 / 95 is a methanolic extract of Rhoeo discolor obtained according to Example 2.
  • a stock solution was prepared in DMSO, from the dry extract, at the concentration of 25 mg / ml. The product being partially soluble at this concentration, a dry product was produced on the preparation after filtration through 0.22 ⁇ m filters, ie 17.4 mg / ml. Two dilutions of this stock solution were prepared at 6.9 mg / ml and 1.74 mg / ml.
  • FHN 10,000 FHN are seeded in a microplate (96 Falcon wells in 100 ⁇ l of El 99c medium + 10% S VF). A microplate is provided for each assay (GAG, protein and viability). They are incubated 24 h at 37 ° C, 5% CO2.
  • DMSO or the same amount of DMSO in the case of "control" cultures and 4 ⁇ Ci of 3H-glucosamine (ref. TRK 398 Amersham). It is incubated for 48 h at 37 ° C. Then, remove the supernatants, combine them in pairs and transfer them to Eppcndorf screw tubes. 200 ⁇ l of a 0.2 mg / ml pronase solution (Sigma P5147) in a PBS buffer solution containing 0.02% sodium azide are added to each of the tubes. It is left to act overnight at 37 ° C. The pronase is then inactivated by immersing the tubes 5 min in boiling water.
  • the radiolabelled GAGs are coprecipitated with an aqueous solution of a mixture of hyaluronic acid, dermatan sulfate, chondroitin sulfate 1/1/1, 8 mg / ml per 40 ⁇ l of a 100% solution.
  • mg / ml of CPC (Sigma C 9002). Stir and incubate for 30 min at room temperature. The precipitate is centrifuged, the supernatant is aspirated and the pellet is recovered with 400 ⁇ l of a 10 mg / ml CPC solution. Agitation is carried out for 5 min and the residue is taken up in 500 ⁇ l of methanol. The mixture is stirred and transferred to scintillation vials, then 10 ml of scintillation liquid are added and the radioactivity is counted.
  • cytotoxicity of the product to be tested is evaluated by an XTT test (tetrazolium salt) as described by Roehm N.W. et al. in Journal of Immunological Methods 1991, 142, 257-265. This test measures cell viability.
  • the activity A of the product is expressed in% according to the following formula:
  • the amounts of GAG synthesized are expressed in cpm relative to the amount of cellular proteins expressed in ⁇ g.
  • Tables 2 and 3 give the results obtained with the extract of Example 2 on the one hand and with PDGF as a positive control on the other hand,
  • the MD82 / 95 significantly stimulates, in the two experiments carried out, the synthesis of GAGs from 1.7 ⁇ g / ml (+ 23% and + 16%), the maximum effect being obtained at 17.3 ⁇ g / ml (+ 53% and + 42%), this concentration also exhibiting no cytotoxicity.
  • the methanolic extract of Rhoeo discolor tested is an activator of the synthesis of glycosaminoglycans by normal human dermal fibroblasts, in particular in the concentration range of 1.7 to 17.4 ⁇ g / ml with a maximum stimulating effect. observed at the concentration of
  • Vitamin A palmitate 0.05 g
  • Plant ceramides 0.2 g Perfumed excipient qs 100 g
  • This cream hydrates the skin, refines the grain and brightens the complexion from the 3rd imc day of applications.
  • Centella asiatica extract 0.5 g
  • Vitamin E acetate 0.1 g Turmeric longa extract 0.2 g
  • This foundation helps fight the signs of aging while strengthening the radiance of the skin.

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Abstract

L'invention concerne des utilisations d'extraits de Rhoeo discolor dans le domaine de la cosmétique et de la pharmacie, notamment de la dermatologie. Elle concerne plus particulièrement dans ces deux domaines les utilisations où l'on cherche à améliorer la différenciation des kératinocytes et/ou à lutter contre les méfaits des radicaux libres et/ou à améliorer la synthèse des glycosaminoglycanes. Dans ce cadre, les extraits de Rhoeo discolor sont généralement incorporés dans des compositions destinées en particulier à améliorer l'hydratation de la peau, sa souplesse et sa fermeté, à lutter contre les effets du vieillissement cutané ou à traiter les peaux sèches, ichtyosiques ou psoriasiques. L'invention concerne également les utilisations de ces mêmes extraits pour préparer des milieux de culture de cellules, en particulier de kératinocytes pour accélérer et améliorer leurs différenciations.

Description

UTILISATIONS D'EXTRAITS DE LA PLANTE RHOEO DISCOLOR DANS LE DOMAINE DE LA COSMETIQUE ET DE LA PHARMACIE, NOTAMMENT DE LA DERMATOLOGIE.
L'invention concerne de nouvelles utilisations d'extraits de la plante Rhoeo discolor dans le domaine de la cosmétique et de la pharmacie, notamment de la dermatologie. Elle concerne également l'utilisation des mêmes extraits pour la préparation de milieux de culture de cellules de peau.
La plante Rhoeo discolor est une plante de la famille des Commeliaceae connue également sous les noms Rhoeo discolor Hance ou Rhoeo spathacea Stearn ou Tradescantia spathacea. Cette plante est connue pour être native d'Amérique Centrale et cultivée au Brésil. Elle est également présente en Nouvelle Calédonie.
Des usages traditionnels de cette plante sont mentionnés dans Atlas of médicinal plants of middle America, Julia F. Morton, Charles C. Thomas, éditeur,
1981, pp. 71-72, pour le traitement des saignements de la bouche, pour la toux, les problèmes pulmonaires et les hémorragies utérines. Cette plante est également connue pour permettre la cicatrisation des blessures.
Des usages voisins sont également rapportés dans Chinese médicinal herbs of Hongkong, Hong kong, 1985, pp. 188.
D'après B. Weniger, J. Ethnopharmacol, 1982, 6, 67-84, les extraits de la plante Rhoeo, proposés comme abortifs en Haïti, ne présenteraient aucune activité anti-oestrogénique et auraient un effet stimulant sur l'utérus de rat.
La plante est également citée comme source potentielle d'anthocyanines acylées, en particulier pour la préparation de colorants alimentaires, pharmaceutiques ou cosmétiques dans le brevet US 4,999,423. Une activité insecticide d'un extrait aqueux de feuilles et de tiges est également citée dans Lloydia, 1950, 13, 89-162).
Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert de façon tout à fait surprenante que des extraits de cette plante présentaient un certain nombre d'activités permettant d'envisager leur utilisation aussi bien dans le domaine de la cosmétique que de la pharmacie, notamment de la dermatologie.
Les activités de ces extraits de plante, mises en évidence par les inventeurs de la présente invention, sont plus particulièrement une activité sur la différenciation des keratinocytes, une activité en tant qu'inhibiteur de radicaux libres ainsi qu'une activité très nette sur la synthèse des glycosaminoglycanes, désignés ci-après par "GAG ". Ainsi, l'invention résulte de ce qu'on a pu observer que les extraits de Rhoeo discolor sont particulièrement actifs pour favoriser la différenciation des keratinocytes et peuvent être ainsi utilisés pour traiter les desordres cutanés s'accompagnant de dérèglement de la différenciation des keratinocytes. Cette différenciation se traduit en particulier, au niveau de l'épidémie, par une plus grande cohésion cellulaire, par une régulation de la transformation des keratinocytes en cornéocytes par perte du noyau et augmentation de la cornéification cellulaire, par une augmentation du nombre de couches de cornéocytes formant la couche cornée, l'ensemble de ces phénomènes contribuant au renforcement de la fonction protectrice de la peau vis-à-vis du milieu extérieur et au renforcement de la barrière hydrique empêchant la perte excessive d'eau par l'épidémie. Par ailleurs, elle se traduit également au niveau du follicule pileux par une régulation des processus de synthèse des kératines par les keratinocytes, ces protéines étant le constituant principal de la tige pilaire du cheveu dont la qualité est essentielle pour un cheveu en bon état. En outre, les inventeurs ont pu observer que ces extraits permettaient de favoriser, d'accélérer et d'améliorer la différenciation des cellules de peau, en particulier des keratinocytes, lors de leur culture dans un milieu de culture.
Par ailleurs, les inventeurs de la présente invention ont clairement mis en évidence l'activité des extraits de Rhoeo discolor en tant que piégeurs de radicaux libres et ont mis en évidence l'intérêt d'utiliser de tels extraits pour la préparation de produits cosmétiques ou dermatologiques à activité anti-radicalairc, en particulier pour la préparation de produits destinés à lutter contre le vieillissement cutané et les phénomènes oxydatifs conduisant à la production d'espcces radicalaires réactives. En particulier, ces produits permettent de lutter efficacement contre les radicaux toxiques OH.
Les inventeurs ont également mis en évidence que les extraits de la plante Rhoeo discolor présentent un intérêt précieux en cosmétique et en pharmacie, notamment en dermatologie du fait de leur propriété de stimulation de la production de GAG par les fibroblastes du demie, notamment du demie humain.
Or, l'homme de l'art sait que les protéoglycancs, constitues pour partie de GAG, sont des macromoléculcs complexes formées d'une partie protéique sur laquelle sont greffées par des liaisons covalcntcs des polymères de disaccharides dénommés glycosaminoglycanes (GAG). Ceci est en particulier décrit dans l'ouvrage de E.D. HAY ayant pour titre "Cell Biology of Extracellular Matrix", pa chez Plénum Press, New York en 1991 et dans la publication de J. E. SILBERT, ayant pour titre "Structure and Metabolism of Proteoglycans and Glycosaminoglycans", parue dans J. Invest. Dcrmatol.,1982, 79, pages 31s-37s.
Ainsi, les GAG sont présents au niveau dermique et participent à la composition de la matrice extracellulaire. Ils ont été trouvés liés à certains sites des fibres de collagènc, comme décrit par J. E. SCOTT dans Int. J. Biol. Macromol., 1991, J_3, pages 157-161. Ils ont également été identifiés entre les keratinocytes au niveau de l'épidémie comme décrit par J. G. HAGGERTY et al. dans la revue J. Invest. Dcrmatol., 1992, 99, pages 374-380, 99 pages 374-380. Des GAG ont été trouvés également dans la matrice extracellulaire de la papille dermique du follicule pileux. Leur quantité varie en fonction du cycle pilaire. Elle atteint un maximum durant la phase anagène correspondant à la croissance du cheveu. En ce qui concerne les protéoglycanes et les GAG des follicules pileux, on pourra se reporter en particulier à la publication de J.R. COUCHMAN citée plus haut, et à celle de M. TAYLOR et al., "Glycosaminoglycan synthesis by cultured human hair follicle dcπnal papilla cclls : comparison with non-follicular dcrmal fibroblasts", Brit. J. Dcrmatol. 1992 (May) 126 (5) 479-84. On notera qu'il a été démontre que le minoxidil, substance bien connue présentant une certaine activité sur la croissance et la repousse des cheveux, stimulait la biosynthèse des glycosaminoglycanes (Y. MORI et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1991 (Dec. 26) 642 473-5). Les observations des auteurs précédemment cités, combinées à d'autres preuves cliniques, suggèrent que les glycosaminoglycanes participent à la régulation de la croissance des cheveux.
On sait également que l'unité disaccharidique des GAG est foπnée d'une hexosamine (D-glucosamine ou D-galactosamine) assez souvent sulfatée alternant avec un acide uronique (D-glucuronique ou L-iduronique). Les chaînes de GAG les plus fréquemment rencontrées au niveau de la peau sont l'acide hyaluronique, les chondroïtines-4 et -6 sulfate, le dermatane sulfate et, en faible quantité, l'héparine et l'héparane sulfate. L'acide hyaluronique, en particulier, est connu comme étant un élément indispensable pour une peau en bonne santé et en bon état. Seul cet acide n'est pas synthétisé en liaison à une protéine centrale.
Les GAG, par leur propriété première de s'associer fortement à des molécules d'eau et de former des gels, assurent l'hydratation du demie et de l'épiderme. Une peau bien hydratée est gage d'une bonne apparence, d'un état physiologique et fonctionnel satisfaisant, avec notamment de bonnes propriétés mécaniques. La diminution des GAG au cours du vieillissement cutané a été montrée par de nombreux auteurs (comme par exemple : SMITH et al. dans J. Invest. Deπnatol., 1962, 39, pages 347-350 ; ou FLEISCHMAJER et al. dans Biochim Biophys. Acta, 1972, 279, pages 265-275 ; ou encore par LONG AS et al. dans Carbohydr. Rcs., 1987, 159, pages 127-136). La stimulation de la synthèse des GAG permet donc notamment de rendre à une peau présentant une déficience au niveau de ses propriétés mécaniques ou de sa barrière hydrique, telle qu'une peau déshydratée ou âgée, les qualités et les propriétés d'une peau normale et jeune, ou de prévenir ou traiter les troubles de la croissance des cheveux, ou encore de restaurer ou renforcer l'éclat et la souplesse d'une chevelure.
La présente invention a pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une nouvelle formulation de compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques, ayant la propriété de favoriser la différenciation des keratinocytes et destinée en particulier à traiter les désordres cutanés s'accompagnant d'une insuffisance ou d'un dérèglement de la différenciation des keratinocytes, tel que le psoriasis, à restaurer, préserver et/ou renforcer la fonction protectrice de la peau, notamment la fonction de barrière hydrique, conduisant ainsi à un effet hydratant, en particulier en empêchant la perte excessive d'eau par l'épidcπnc. Une application avantageuse de ce dernier phénomène est le traitement des peaux ichtyosiques, ainsi que le traitement des peaux psoriasiques. Ces compositions permettent également d'améliorer la qualité des cheveux, embellissant ainsi l'aspect de la chevelure.
La présente invention a encore pour autre but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solution permettant de favoriser, d'accélérer et d'améliorer la différenciation de cellules de peau, notamment de keratinocytes, en culture.
La présente invention a également pour autre but principal de fournir des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques, présentant une activité antiradicalaire.
L'invention a également pour autre but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture de compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques, permettant de stimuler la synthèse des GAG. De ce fait, l'invention concerne également l'utilisation des extraits de Rhoeo discolor pour préparer des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques, permettant de stimuler la synthèse des GAG. Ces compositions permettent d'améliorer la fermeté et la souplesse de la peau, de lutter contre la formation des rides ou d'en atténuer la profondeur ou d'obtenir un lissage de la surface de la peau grâce, en particulier, à un effet tenseur physiologique ou pour améliorer l'hydratation de la peau. La présente invention a encore pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une solution permettant de traiter des cellules, en particulier des fibroblastes, en culture, pour obtenir une stimulation de la synthèse des GAG.
Plus précisément, selon l'une de ses caractéristiques essentielles, l'invention concerne l'utilisation d'un extrait de la plante Rhoeo discolor comme principe actif d'une composition cosmétique.
Selon une variante avantageuse de ce premier aspect, l'extrait de la plante Rhoeo discolor est utilisé comme agent cosmétique destiné à hydrater ou à améliorer l'hydratation de la peau, à lutter contre les effets du vieillissement de la peau, à prévenir ou traiter les rides, à améliorer la fermeté et la souplesse de la peau.
Les inventeurs de la présente invention ont pu relier ces différentes activités à l'activité des extraits de la plante Rhoeo discolor sur la différenciation des keratinocytes, le piégeage des radicaux libres ainsi que sur la synthèse des GAG.
Plus précisément, les compositions cosmétiques de l'invention permettent d'améliorer la différenciation des keratinocytes, ce qui contribue à renforcer la barrière cutanée au niveau de la couche cornée, permettant ainsi de diminuer la perte en eau de la peau, de conserver son hydratation, d'améliorer son aspect et son éclat, de renforcer ia barrière cutanée vis-à-vis de la pénétration d'agents extérieurs irritants ou toxiques, de protéger la peau et, plus généralement, l'organisme.
L'activité anti-radicalaire des compositions selon l'invention se manifeste par l'efficacité de ces compositions dans la lutte contre le vieillissement de la peau.
L'effet des compositions cosmétiques de l'invention pour stimuler la synthèse des GAG se traduit par l'effet de ces compositions pour améliorer l'hydratation du derme et de l'épidcrme, lutter contre la formation des rides ou en atténuer la profondeur, et améliorer la fermeté et la souplesse de la peau. Ce dernier effet permet d'obtenir un lissage de la surface de la peau grâce à un effet tenseur physiologique. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne également les utilisations d'extraits de la plante Rhoeo discolor pour préparer des compositions à usage pharmaceutique, notamment dermatologique.
Ainsi selon une autre de ses caractéristiques essentielles, l'invention concerne l'utilisation d'un extrait de la plante Rhoeo discolor, pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment dermatologique, destinée :
- à la prévention ou au traitement des désordres liés à un dysfonctionnement de la différenciation des keratinocytes, afin de lutter notamment contre une desquamation irrégulière ou exagérée, de traiter les peaux sèches ichtyosiques ou psoriasiques, ou d'améliorer la fonction protectrice de l'épideπne, ou de traiter toutes les insuffisances de la fonction barrière de 1'épiderme,
- et/ou au traitement ou à la prévention des effets du vieillissement sur la peau, en particulier du vieillissement lié aux effets néfastes des radicaux libres, - et/ou au traitement des sujets souffrant d'une insuffisance de la synthèse des GAG, pour corriger les effets négatifs de ladite insuffisance, en particulier pour améliorer la fermeté et la souplesse cutanée, pour lutter contre la formation des rides ou pour en atténuer la profondeur.
Ainsi donc, les compositions pharmaceutiques, notamment dermatologiques de l'invention, s'avèrent particulièrement intéressantes du fait que, par leurs effets sur la différenciation des keratinocytes, les compositions pharmaceutiques, notamment dermatologiques de l'invention, permettent d'améliorer l'effet de barrière de la peau et par conséquent de limiter les pertes en eau mais également cette activité permet de lutter contre les phénomènes desquamation irrégulière ou exagérée. L'invention permet donc de fournir des compositions qui permettent de restaurer l'état physiologique normal de la peau.
L'effet des compositions pharmaceutiques, notamment deπnatologiques de l'invention sur les radicaux libres, permet d'apporter une solution à tous les phénomènes de vieillissement de la peau, notamment aux phénomènes oxydatifs.
L'effet des compositions pharmaceutiques, notamment dermato logiques, de l'invention sur la synthèse des GAG s'avère particulièrment intéressant dans tous les traitements de la peau où l'on cherche à obtenir en particulier un lissage de la surface de la peau, en particulier grâce à un effet tenseur ou à améliorer l'hydratation de la peau. Pour ces deux aspects aussi bien cosmétique que pharmaceutique, notamment dermatologique, on pourra utiliser des extraits de la plante entière.
On utilisera également avantageusement des extraits des feuilles de la plante. Selon un mode avantageux de réalisation, l'extrait de la plante Rhoeo discolor est un extrait obtenu par extraction au moyen d'un solvant ou d'un mélange de solvants dont le paramètre de polarité p' est compris entre 4 et 8. Pour la définition de ce paramètre de polarité p' on se reportera à la publication dans Practical High Performance Liquid Chromatography (Véronika R. Meyer) Université de Berne, traduit de l'édition originale allemande par Valérie Cottrell, 1988, John Wiley and Sonc éditeur.
L'extrait sera avantageusement obtenu par macération de la plante ou partie de plante dans un solvant ou un mélange de solvants tel que défini ci- dessus, suivie d'une filtration et, au besoin, d'une évaporation dudit solvant ou mélange de solvants.
A titre d'exemple de solvants ou mélange de solvants particulièrement avantageux pour préparer les extraits utiles selon l'invention, on citera :
- les alcools en Cj à C4, en particulier l'éthanol, le éthanol, l'isopropanol ou les mélanges hydroalcooliqucs de ces alcools, - les esters, en particulier l'acétate d'éthyle ou l'acétate d'isopropylique,
- les ectoncs en C à Cg, en particulier l'acétone ou
- les glycols en C2 à Cg, en particulier l'éthylcncglycol,
- et les mélanges des solvants précités.
Diverses formes de compositions peuvent être réalisées. Les formes préférées sont les formes topiques adaptées pour être appliquées sur le tissu cutané, incluant la peau et les muqueuses. Les formulations topiques appropriées incluent, sans limitation, des émulsions, des crèmes, des laits, des baumes, des gels, des lotions, des ovules ainsi que des compositions de maquillage traitantes, ces différents types de formulations étant bien connus de l'homme de l'art. Les compositions cosmétiques ou pharmaceutiques, notamment dermatologiques, de l'invention contiennent avantageusement des concentrations d'extraits de la plante Rhoeo discolor comprises entre 0,001 et 5 % en poids, de préférence entre 0,01 et 2 % exprimées en extrait sec par rapport au poids de ladite composition. Selon une variante particulièrement avantageuse, les deux aspects de l'invention cosmétique ou pharmaceutique, les compositions contiennent également au moins un produit choisi dans la famille constituée par :
- les acides aminés, en particulier la lysine, la proline, la thréonine, la serine, l'argininc et leurs dérivés,
- les agents kératolytiques, en particulier les acides hydroxylés en alpha tels que l'acide lactique, l'acide malique, l'acide glycolique, l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide salicylique, et les extraits naturels en contenant,
- les agents hydratants tels que le glycérol, le lactate de glycérol, l'urée, la tréhalose, le dextran,
- les vitamines, en particulier les vitamines A, B, C, D, E et F et leurs dérivés en particulier leurs esters ou leurs phosphates,
- les céramides, en particulier les céramides d'origine végétale ou synthétique, - les effecteurs de la synthèse naturelle des céramides,
- les oligomères procyanidoliques ainsi que les tannins catéchiques et galliqucs et leurs dérivés, en particulier leurs esters,
- les substances connues pour stimuler la synthèse du collagènc, en particulier les triterpènes et leurs dérivés, en particulier les dérivés glycosylés de l'acide asiatique ou madécassique, tel que l'asiaticoside, le niadecassoside, et leurs esters ou les extraits de Ccntclla asiatica,
- les extraits d'algues, en particulier de micro-algues telles que Euglcna ou Chlorclla,
- les agents à action antiradicalairc tels que les curcuminoïdes, les dérivés de la vitamine E et de la vitamine C, l'acide nordihydrogariarétique.
Enfin, selon un dernier aspect, la présente invention concerne également un milieu de culture de cellules ou de tissus, notamment pour la culture de cellules de peau, en particulier de keratinocytes, permettant de favoriser, d'accélérer et d'améliorer leur différenciation, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'un extrait de la plante Rhoeo discolor, pour obtenir une telle différenciation.
Ce milieu de culture comprend avantageusement de 0,0001 à 1 % en poids d'extrait de Rhoeo discolor par rapport au poids total dudit milieu de culture.
L'invention concerne également un procédé de culture en masse de cellules de peau, en particulier de keratinocytes et/ou de fibroblastes, pour la production de peau artificielle ou pour la préparation de modèles de peau reconstituée, caractérisé en ce qu'il utilise un milieu de culture tel que défini ci-dessus.
Enfin, l'invention concerne également un procédé qui permet de favoriser, d'accélérer ou d'améliorer la différenciation des cellules de peau, en particulier des keratinocytes et/ou de stimuler la synthèse des GAG, en particulier à partir des keratinocytes et/ou des fibroblastes, notamment dans le cadre d'une culture en masse de cellules de peau et permet ainsi la production de peau artificielle ou la préparation de modèles de peau reconstituée, comprenant un derme et un épiderme, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il utilise un milieu de culture tel que défini ci-dessus.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent clairement à l'homme du métier, également à partir de la description explicative qui va suivre en référence à plusieurs exemples de réalisation donnés à titre d'illustration de l'invention. Dans ces exemples, sauf indications contraires, les pourcentages sont donnés en poids.
EXEMPLES
Exemple 1
Préparation d'un extrait méthanolique de la plante entière
On met en contact après broyage pendant 24 h, 1 kg de la plante entière avec 10 1 de méthanol à froid. On réalise ensuite l'extraction pendant 30 min au reflux. On filtre ensuite sur papier, puis on évapore le solvant. On obtient un extrait sec dénommé MD 44/94.
Suivant une variante de ce procédé, le broyât de la plante, préalablement à sa macération dans le méthanol, est traité par de l'hexane, selon une méthode bien connue de l'homme de l'art, pour le dégraisser.
Un deuxième essai d'extraction méthanolique, selon le procédé décrit au premier paragraphe ci-dessus, est réalisé avec un autre lot de la plante entière broyée. On obtient un extrait sec dénommé MD 82/95.
Exemple 2
Préparation d'un extrait hvdroglvcolique de Rhoeo discolor
On prépare un extrait par un mélange hydroglycolique de 1 ,3- butylèneglycol et d'eau dans le rapport 1/1 en utilisant un rapport en poids de 1/20 de la plante par rapport au solvant. Cet extrait est préparé par chauffage à chaud pendant 20 min à 80°C du mélange. On récupère un extrait de couleur jaune. Cet extrait présente l'avantage d'être incorporablc aisément dans des formulations cosmétiques.
Exemple 3 Mise en évidence de l'effet d'un extrait de Rhoeo discolor sur la différenciation des keratinocytes
Pour la présente étude, on utilise un prélèvement de peau effectué lors d'une opération de plastie mammaire d'une femme de vingt deux ans. Le protocole suivi est voisin de celui décrit par Detmar et al., dans la publication Eur. J. Dermatol. 1994 4 558-562.
Au jour J = -2, on ensemence 12 puits d'une plaque de culture multi- puits avec 300 000 cellules par puits de keratinocytes isolés à partir de ce prélèvement dans un milieu de culture classique pour la culture des keratinocytes, bien connu de l'homme de l'art. Avantageusement, ce milieu de culture peut être cons- titué par un milieu M 199 additionné de 2 mM de L-glutaminc, de 10% de sérum de veau foetal, de toxine cholérique, d'hydrocortisonc, ainsi que du facteur de croissance épidermique EGF.
Aux jours J = l , J = 5, J = 8 et J = l l , le milieu de culture est renouvelé par un milieu identique dans 6 des 12 puits qui constituent des puits témoins non traités, et, dans les 6 puits restants constituant les puits traités, on renouvelle avec un milieu identique, mais dans lequel on a dissous 2,5 μg/ml d'extrait de Rhoeo discolor tel qu'obtenu à l'exemple 1 , et sur lesquels on a réalisé préalablement une filtration stérilisante sur filtre à 0,22 μm.
Au jour J = 12, on réalise une numération cellulaire ainsi qu'une inclusion des cellules en résine époxy après fixation des stmctures cellulaires au glutaraldéhyde et tétroxyde d'osmium.
On réalise des coupes de chacun des blocs de résine ainsi obtenus sous forme de coupes ultrafines, par exemple à l'aide d'un dispositif connu sous le nom de microtome. On observe ensuite au microscope électronique à transmission les coupes des six cultures témoin, d'une part, et les coupes des six cultures traitées par l'extrait de Rhoeo discolor, d'autre part.
Les mêmes essais sont réalisés en utilisant une solution d'extrait de la plante Rhoeo discolor à la concentration de 10 μg/ml à la place de la solution à 2,5 μg/ml. On a pu observer que les cellules traitées avec l'extrait de Rhoeo discolor selon l'invention, obtenu à l'exemple 1 , présentent une différenciation cellulaire nettement supérieure au témoin.
Dans le cas du traitement avec 2,5 μl/ml, on observe une épaisseur totale et un nombre plus important de couches de cellules. L'homogénéité d'épaisseur des cellules en cours de différenciation montre une bonne stratification.
Les couches supérieures présentent une bonne coméification des keratinocytes, alors qu'il est connu que le stade final de la différenciation n'est jamais complètement atteint dans le cas de cultures immergées.
On retrouve les caractéristiques essentielles d'une bonne différenciation :
- aplatissement des cellules supérieures
- épaississement de l'enveloppe cornée (couches supérieures) - présence de desmosomes
- présence de grains de kératohyaline (couches moyenne)
- présence de filaments de kératine orientés
- existence de l'cxocytosc lipidique.
Ainsi, les cultures de keratinocytes humains normaux cultivés en présence d'un extrait de Rhoeo discolor à la dose de 2,5 à 10 μg/1 présentent une amélioration très nette de leur différenciation.
Exemple 4
Mise en évidence de l'effet inhibiteur des radicaux libres d'un extrait de Rhoeo discolor a) Principe du test
Une micro-émulsion est préparée en dissolvant de l'acide linoléique dans un détergent zwittérionique, le CHAPS (Sigma), et en additionnant progressivement un tampon phosphate 0,06 M, pH 7,4. La micro-émulsion d'acide linoléique préparée comme décrit ci-dessus
(avec ou sans produit à tester) est exposée au rayonnement γ d'une source de 2Ci de 137 Cs pendant 18 h (soit dans les conditions de l'essai, 20.000 rads). Les radicaux libres OH° sont alors fomiés par radiolyse de l'eau.
Ensuite, la décomposition de l'acide linoléique par les radicaux OI I° conduit à la fomiation de pentane qui s'échappe dans l'atmosphère d'un flacon scellé. Le pentane libéré peut alors être dosé par chromatographie en phase gazeuse.
Ainsi, il est possible de déterminer en comparaison avec les essais réalisés avec la micro-émulsion témoin, le taux d'inhibition de la formation des radicaux libres due à la présence des extraits de la plante Rhoeo discolor.
b) Résultats
Les résultats figurent au tableau I ci-dessous pour différentes concentrations en extraits, obtenus selon l'exemple 1 , dans les micro-émulsions testées.
TABLEAU I
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Ainsi, ces résultats montrent clairement l'action inhibitricc des extraits selon l'invention sur la fomiation des radicaux libres, en particulier des radicaux 011°. Sachant que l'acide linoléique est présent dans la couche cornée de l'épidcπne, ainsi que dans les membranes cellulaires, la présente invention s'avère particulièrement intéressante pour protéger de l'action néfaste des radicaux libres, en particulier des radicaux OH°, les différents éléments biologiques exposés, notamment le ciment lipidique cutané et les membranes cellulaires. La mise en oeuvre de l'invention assure ainsi l'intégrité et la fonctionnalité de ces éléments.
Exemple 5 Mise en évidence de l'effet d'un extrait de Rhoeo discolor sur la stimulation de la synthèse des GAG a) Principe du test
Sur cellules humaines, on étudie l'incorporation de glucosaminc radio- marquée dans la formation et la sécrétion de GAG, avec et sans produit objet de l'invention. On part de cultures de fibroblastes de demie humain que l'on incube avec de la ^il-glucosamine avec ou sans le produit à tester. Puis, sur les surnageants, on sépare par hydrolyse, au moyen de la pronasc, la partie protéiquc des protéoglycanncs formés. On précipite les GAG formes et sécrétés (ayant incorporé plus ou moins la glucosamine radiomarquéc) par du chlorure de cétylpyridinium (CPC). On procède ensuite au comptage de la radioactivité des cultures traitées et témoin, cette radioactivité étant proportionnelle à la quantité des GAG synthétisés.
Afin de contrôler la réponse des cellules utilisées, on a testé en parallèle sur ces cellules du PDGF à 25 ng/ml final. Le PDGF (Platelet Derived
Growth Factor), facteur de croissance dérivé des plaquettes sanguines, (PDGF-
BB, Sigma, réf. 4306) est un agent connu pour stimuler la synthèse des GAG par les fibroblastes cutanés.
b) Protocole du test
Les cultures de fibroblastes humains normaux (FHN) sont initiées en trois semaines à partir d'expiants de peau saine obtenue en chirurgie plastique. Les cellules sont cultivées en présence de milieu El 99, complénienté en L-glutaminc 2mM (noté El 99c) et contenant 10 % v/v de sérum de veau foetal (S VF, Gibco). Les boîtes de culture sont placées dans un incubateur à 37°C sous une atmosphère enrichie en CO2 (5 %). Des sous-cultures (passages) sont effectuées par trypsinisation et les FHN sont utilisés après un à six passages, notés P I à P6.
L'étude a été réalisée sur une souche de fibroblastes notée FHN679 provenant d'un lifting d'une femme de 68 ans. Le produit codé MD82/95 est un extrait méthanolique de Rhoeo discolor obtenu selon l'exemple 2. Une solution mère à été préparée dans le DMSO, à partir de l'extrait sec, à la concentration de 25 mg/ml. Le produit étant partiellement soluble à cette concentration, un produit sec a été réalisé sur la préparation après filtration sur des filtres 0,22 μm soit 17,4 mg/ml. De cette solution mère deux dilutions ont été préparées à 6,9 mg/ml et 1,74 mg/ml.
10 000 FHN sont ensemencés en microplaque (96 puits Falcon dans 100 ul de milieu El 99c + 10 % S VF). Une microplaquc est prévue pour chaque dosage (GAG, protéines et viabilité). Elles sont incubées 24 h à 37°C, 5 % CO2.
Au bout de 24 h, le milieu est retiré et remplacé par 100 microlitres de milieu E199 C sans sérum et contenant le produit à tester solubilisé dans du
DMSO ou la même quantité de DMSO dans le cas des cultures "témoins" et 4μCi de 3H-glucosamine (réf. TRK 398 Amersham). On laisse incuber 48 h à 37°C. Puis, on prélève les surnageants, on les regroupe par 2 et on les transfère dans des tubes Eppcndorf à vis. Dans chacun des tubes, on ajoute 200 μl d'une solution à 0,2 mg/ml de pronase (Sigma P5147) dans une solution tampon de PBS contenant 0,02 % d'azoture de sodium. On laisse agir une nuit à 37°C. La pronase est alors inactivée en plongeant les tubes 5 min dans de l'eau bouillante.
Après refroidissement à température ambiante, on coprécipite les GAG radiomarqués avec une solution aqueuse d'un mélange d'acide hyaluronique, de dermatan sulfate, de chondroïtine sulfate 1/1/1, 8 mg/ml par 40 μl d'une solution à 100 mg/ml de CPC (Sigma C 9002). On agite et on laisse incuber 30 min à température ambiante. On centrifuge le précipité, on aspire le surnageant et on récupère le culot avec 400 μl d'une solution de CPC à 10 mg/ml. On agite 5 min et on reprend le culot dans 500 μl de méthanol. On agite et on transfère dans des fioles à scintillation puis on ajoute 10 ml de liquide scintillant et on compte la radioactivité.
Parallèlement, la cytotoxicité du produit à tester est évaluée par un test au XTT (sel de tétrazolium) tel que décrit par Roehm N.W. et al. dans Journal of Immunological Methods 1991, 142, 257-265. Ce test mesure la viabilité cellulaire.
c- Expression des résultats et test statistique
L'activité A du produit est exprimée en % selon la formule suivante :
(GAG synthétisés par les FHN traites - GAG synthétises par les Fi IN témoins) . «„
GAG synthétisés par les FHN témoin
Les quantités de GAG synthétisées sont exprimées en cpm par rapport à la quantité de protéines cellulaires exprimées en μg.
Les résultats obtenus sur les FHN traités (n=6) et témoins (11=6) sont comparés par le test t de Studcnt non apparié. p=0,05 est fixé comme seuil de significativité. Les essais significatifs (p 0,05) sont notés S, ceux non significatifs NS.
d-Résultats d- H Cytotoxicité
Le test XTT cité ci-dessus a permis de démontrer que les extraits selon l'invention, testés aux concentrations de 1,7 à 17,4 μg/ml, ne sont pas cytoxiques. d-2) Première expérience
Cette étude est réalisée sur la souche de fibroblastes F11N679 (femme, 68 ans, lifting), à la deuxième sous-culture P2.
Les tableaux 2 et 3 donnent les résultants obtenus avec l'extrait de l'exemple 2 d'une part et avec le PDGF comme témoin positif d'autre part,
TABLEAU 2
Figure imgf000017_0001
TABLEAU 3
Figure imgf000017_0002
d- 3) Deuxième expérience
Cette expérience a éé réalisée pour confirmer l'effet stimulant du MD82/95 sur la synthèse des GAG. Comme dans la 1ère expérience, la souche FHN679 a été utilisée (femme, 68 ans, lifting) mais à la 3ème sous-culture (P3).
Les résultats sont rassemblés dans le tableau 4. Ceux obtenus avec le PDGF figurent dans le tableau 5. TABLEAU 4
Figure imgf000018_0001
TABLEAU 5
Figure imgf000018_0002
d-4) Conclusion Le témoin positif de référence, le PDGF (à 25 ng/ml), stimule de manière significative la synthèse des GAG, dans les deux expériences (+99 % et +123 % respectivement).
Le MD82/95 stimule significativement, dans les deux expériences réalisées, la synthèse des GAG et ce dès 1,7 μg/ml (+23 % et +16 %), le maximum d'effet étant obtenu à 17,3 μg/ml (+53 % et +42 %), cette concentration ne présentant par ailleurs aucune cytotoxicité.
En conséquence, l'extrait méthanolique de Rhoeo discolor testé est un activateur de la synthèse des glycosaminoglycanes par des fibroblastes humains normaux de derme, en particulier dans la gamme de concentration de 1 ,7 à 17,4 μg/ml avec un effet stimulant maximal observé à la concentration de
17,4 μg/ml. Il apparaît donc que les extraits de Rhoeo discolor, incorporés dans les compositions selon l'invention appliquées sur la peau, auront pour effet de stimuler la synthèse des GAG et ainsi de contribuer à la formation d'une matrice cxtraccllulaire dermique optimale. La peau sera alors réhydratée, raflermie, et les cellules communiqueront mieux entre elles.
Exemple 6 Crème hydratante
Extrait butylèneglycol de Rhoeo discolor selon l'exemple 2 : 2 g
Palmitate de vitamine A : 0,05 g
Glycérol 3 g
Acide lactique : 3 g
Céramides végétaux : 0,2 g Excipient parfumé qsp 100 g
Cette crème hydrate la peau, affine le grain et illumine le teint dès le 3imc jour d'applications.
Exemple 7
Crème raffermissante anti-âize
Extrait méthanolique de Rhoeo discolor MD 82/95 selon l'exemple 1 : 0,2 g
Phosphate d'ascorbyle, sel de Mg 2 g Acide malique 3 g
Extrait de Centella asiatica 0,5 g
Excipient qsp 100 g
En application sur le visage, cette crème raffermit la peau et élimine rides et ridules.
Exemple 8
Fond de teint traitant
Extrait méthanolique de Rhoeo discolor MD 44/94 selon l'exemple 1 0,1 g
Acétate de vitamine E 0,1 g Extrait de curcuma longa 0,2 g
Particules de nylon 2 g
Excipient fluide avec pigments qsp 100 g
Ce fond de teint permet de lutter contre les signes du vieillissement tout en renforçant l'éclat de la peau.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un extrait de la plante Rhoeo discolor, comme principe actif d'une composition cosmétique.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ledit extrait est utilisé comme agent cosmétique destiné à hydrater ou améliorer l'hydratation de la peau, à lutter contre les effets du vieillissement de la peau, à prévenir ou traiter les rides, à améliorer la fermeté et la souplesse de la peau.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit extrait est utilisé comme agent cosmétique destiné à :
- améliorer la différenciation des keratinocytes, ce qui contribue à renforcer la barrière cutanée au niveau de la couche cornée peπnettant ainsi de diminuer la perte en eau de la peau, de conserver son hydratation, d'améliorer son aspect et son éclat, de renforcer la barrière cutanée vis-à-vis de la pénétration d'agents extérieurs irritants ou toxiques, de protéger la peau et, plus généralement, l'organisme,
- et/ou à lutter contre les méfaits des radicaux libres, permettant ainsi de lutter contre le vieillissement de la peau,
- et/ou à améliorer la synthèse des glycoaminoglycancs (GAG), pcπnettant ainsi d'améliorer l'hydratation du demie et de l'epiderme, de lutter contre la fomiation des rides ou d'en atténuer la profondeur, d'améliorer ta fermeté et la souplesse de la peau et d'obtenir un lissage de la peau grâce à un effet tenseur physiologique.
4. Utilisation d'un extrait de la plante Rhoeo discolor, pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment dermatologique, destinée :
- à la prévention ou au traitement des désordres liés à un dysfonctionnement de la différenciation des keratinocytes, afin de lutter notamment contre une desquamation irrégulière ou exagérée, de traiter les peaux sèches, ichtyosiques ou psoriasiques, d'améliorer la fonction protectrice de l'epiderme, ou de traiter les insuffisances de la fonction barrière de l'epiderme,
- et/ou au traitement ou à la prévention des effets du vieillissement sur la peau, en particulier du vieillissement lié aux effets néfastes des radicaux libres,
- et/ou au traitement des sujets souffrant d'une insuffisance de la synthèse des glycosaminoglycanes (GAG), pour corriger les effets négatifs de ladite insuffisance, en particulier pour améliorer la fermeté et la souplesse cutanée, pour lutter contre la formation des rides ou pour en atténuer la profondeur.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit extrait est un extrait de la plante entière.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit extrait est un extrait de feuilles de ladite plante.
7. Utilisation selon l'une des revendications l à 6, caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu par macération de la plante ou partie de plante dans un solvant ou un mélange de solvants dont le paramètre p' de polarité est compris entre 4 et 8, suivie d'une filtration et, au besoin, d'une évaporation dudit solvant ou mélange de solvants.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit solvant ou mélange de solvants est choisi dans le groupe constitué par :
- les alcools en C i à C4, en particulier l'éthanol, le méthanol, l'isopropanol ou les mélanges hydroalcooliques de ces alcools,
- les esters, en particulier l'acétate d'éthyle ou l'acétate d'isopropylique,
- les cétoncs en C7 à Cg, en particulier l'acétone ou
- les glycols en C2 à C j, en particulier l'éthylèneglycol,
- et les mélanges des solvants précités.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit extrait est présent dans la composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, à des concentrations exprimées en extrait sec par rapport au poids de ladite composition. comprise entre 0,001 et 5 % en poids, et de préférence entre 0,01 et 2 %.
10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, comprend en outre au moins un produit choisi dans la famille constituée par :
- les acides aminés, en particulier la lysine, la proline, la thréoninc, la serine, l'argininc et leurs dérivés,
- les agents kératolytiques, en particulier les acides hydroxylés en alpha tels que l'acide lactique, l'acide malique, l'acide glycolique, l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide salicylique et les extraits naturels en contenant,
- les agents hydratants tels que le glycérol, le lactate de glycérol, l'urée, la tréhalose, le dextran, - les vitamines, en particulier les vitamines A, B, C, D, E et F et leurs dérivés en particulier leurs esters ou leurs phosphates,
- les céramides, en particulier les céramides d'origine végétale ou synthétique, - les effecteurs de la synthèse naturelle des céramides,
- les oligomères procyanidoliques ainsi que les tannins catéchiques et galliques et leurs dérivés, en particulier leurs esters,
- les substances connues pour stimuler la synthèse du collagène, en particulier les triterpènes et leurs dérivés, en particulier les dérivés glycosylés de l'acide asiatique ou madécassique, tel que l'asiaticoside, le madecassoside, et leurs esters ou les extraits de Centella asiatica,
- les extraits d'algues, en particulier de micro-algues telles que Euglena ou Chlorella,
- les agents à action antiradicalaire tels que les curcuminoïdes, les dérivés de la vitamine E et de la vitamine C, l'acide nordihydrogariarétique.
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, est formulée pour une application topique.
12. Milieu de culture de cellules ou de tissus, notamment pour la culture de cellules de peau, en particulier de keratinocytes, permettant de favoriser, d'accélérer et d'améliorer leurs différenciations, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'un extrait de la plante Rhoeo discolor, pour obtenir ladite différenciation.
13. Milieu de culture selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend de 0,0001 à 1 % en poids d'extrait de Rhoeo discolor par rapport au poids total dudit milieu de culture.
14. Procédé de culture en masse de cellules de peau, en particulier de keratinocytes et/ou de fibroblastes, pour la production de peau artificielle ou pour la préparation de modèles de peau reconstituée, caractérisé en ce qu'il utilise un milieu de culture selon l'une des revendications 12 ou 13.
15. Procédé pour favoriser, accélérer ou améliorer la différenciation des cellules de peau, en particulier des keratinocytes et/ou pour stimuler la synthèse des GAG en particulier à partir des keratinocytes et/ou des fibroblastes, notamment dans le cadre d'une culture en masse de cellules de peau, pour la production de peau artificielle ou pour la préparation de modèles de peau reconstituée, caractérisé en ce qu'il utilise un milieu de culture tel que défini dans l'une des revendications 12 ou 13.
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