JP2008283981A - 上皮細胞の分離方法、細胞を前条件付けする方法、およびバイオ人工皮膚もしくは真皮を上皮細胞または条件付けされた細胞を用いて調製する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトの皮膚組織または内臓組織を磁気撹拌しながらトリプシン/EDTA処理して、上皮細胞を分離する方法、生物細胞に物理的な刺激(すなわち伸張力)を共することによって前条件付けする方法、およびフィブロネクチンもしくはグリコスアミノグリカンを単独で、又は共に添加することによって前条件付けする方法。
【選択図】なし
Description
BickenbachおよびChism、1998、ECR 244:184-195 JonesおよびWattら、1993、Cell 73:713-724 Germainら、1993、Burns 19:99-104 SimonおよびGreen、1985、Cell 40:677-683 Burkeetal、1981、Ann Surg 194:413-428 TagileおよびAspenberg、1999、J. Orthop Res 17:200-4 Aspenbergら、2000、Acta Orthop Scand 71:558-62 Banesら、1995、J.Biomechanics 28:1505-1513 ButtおよびBishop、1997、J.Mol.Cell Cardiol 29:1141-1151 YamadaおよびClark、1996、Molecular and cellular biology of woundrepair、Provosional Matrix p51-93 Yuら、1998、72kDa Gelatinase(Gelatinase A):Structure、Activation、Regulation、and Substrate Specificity、from Matrix Metalloproteinases:85-113 VuおよびWerb、1998、Gelatinase B:Structure、Regulation、and Function、Matrix Metalloproteinases:115-147
本発明の第1の目的は、従来の細胞分離方法の問題点を克服するためのものであって、細胞収率、CFEおよびコロニーサイズ(幹細胞の比率)が増加した、上皮細胞の新しい分離方法を提供することである。
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。この実施例は、本発明の理解をさらに容易にするためのものであって、本発明の範囲がこの実施例に限定されることではない。
一次ケラチノサイトを成人の包皮から分離した。細胞が分離するまで、切られた包皮を1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび250 ng/mlのファンギゾン(Fungizone:Gibco、Cat.No.15240-062)を含有する表皮最小培地(以下E-培地)に4℃で放置した。一次ケラチノサイトは環状切除後24時間以内に分離した。
組織片を、10mlの0.00125%トリプシンおよび0.01%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)中で、30分間100rpmで磁気撹拌させた。分離された細胞を20%牛胎血清を含有する10mlのE-培地で洗浄してトリプシンを不活化し、遠心分離した。細胞ペレットをケラチノサイト成長培地(KGM)(カタログ番号.CC-3111、Clonetics BioWhittaker、Walkersville)に再懸濁し、5X103/cm2の密度で接種した。この工程は3回実施した。
組織片を10mlの0.025%トリプシン溶液中で、細胞を分離するために5分おきに一回ボルテックスしつつ、37℃で30分間培養した。分離された細胞を20%牛胎血清を含有する10mlのE-培地で洗浄してトリプシンを不活化し、遠心分離した。細胞ペレットをKGM(カタログ番号.CC-3111、Clonetics BioWhittaker、Walkersville)に再懸濁し、培養プレートに5X103/cm2の密度で接種した。この工程は3回実施した。
組織片を37℃で4時間、サーモリシン溶液(250μg/ml、カタログ番号.P1512、Sigma-Aldrich Korea)で処理した。表皮層を分離し、洗浄した後、得られた細胞を10mlの0.05%トリプシンおよびEDTA中で、37℃で30分間振とうさせながらさらに培養した。分離された細胞を20%牛胎血清を含有する10mlのE-培地で洗浄してトリプシンを不活化し、遠心分離した。細胞ペレットをKGM(カタログ番号.CC-3111、Clonetics BioWhittaker、Walkersville)に再懸濁させ、培養プレートに5X103/cm2に接種した。
組織片を、37℃で4時間ディスペースII溶液(2.4U/ml、カタログ番号.165859、Roche、Mannheim)で処理した。表皮層を分離し、洗浄した後、得られた細胞懸濁液を10mlの0.05%トリプシンおよびEDTAの中で37℃で30分間振とうさせながらさらに培養した。分離された細胞を、20%牛胎血清を含有する10mlのE-培地で洗浄してトリプシンを不活化し、遠心分離した。細胞ペレットをKGM(カタログ番号.CC-3111、Clonetics BioWhittaker、Walkersville)に再懸濁させ、培養プレートに5X103/cm2の密度で接種した。
実施例1から得られた細胞のうち、幹細胞のマーカーとして知られるβ1インテグリンを多く発現するβ1インテグリンブライトセルの比率を測定するために、4つの方法で分離した細胞におけるβ1インテグリンの発現レベルをFACSにを用いて比較した。4つの方法によって各々分離された細胞を、β1インテグリン抗体(Chemicon)と共にインキュベートした後、フルオレセイン・イソチアネート(FITC)結合された山羊抗マウス抗体と共に45分間氷上でインキュベートした。各段階間に、細胞を5%ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するリン酸緩衝液(PBS)で洗浄した。染色手順の最後に、細胞を1X106 cells/mlに再懸濁し、FACStarPlus(Beckton Dickinson)を使用して分類した。実験当り少なくとも10,000細胞を流動細胞測定法で分析した。実験ごとに自然蛍光抗体およびイソタイプ対照抗体を使用して結果を補正した(発明の効果4および図6参照)。
実施例1から得られたケラチノサイトをカバースリップで培養した後、4℃で10分間、エタノール/メタノール(1:1)混合物中で固定した。分離、培養された細胞がケラチノサイトだけからなるかどうかを確認するために、固定された細胞を上皮細胞のマーカーであるパン・サイトケラチン抗体で染色した(図8、発明の効果2参照)。また、分離、培養された細胞が基底細胞の特徴を表すか否かを確認するために、固定した細胞をα2インテグリン抗体で染色し(図8、発明の効果4参照)、分化する細胞数を確認するためにインボルクリン抗体で染色した(図8、発明の効果5参照)。インテグリンα2(chemicon)、β1(chemicon)の抗体はマウスモノクローナル抗体を使用し、パン・サイトケラチン(Novocastra)、インボルクリン(BiomedicalTechnologies、ケラチノサイトの分化マーカー)の抗体はウサギポリクローナル抗体を使用した。一次抗体存在下で培養した後に、標準ABCキット(Vector Laboratories)を利用して染色した。
分離されたケラチノサイトが皮膚への分化に成功するかどうかを生体内で(インビボ)評価するために、分離したヒトケラチノサイトをヌードマウスに移植した(図9、発明の効果6参照)。直径1cmの全層性の切り込みをヌードマウスの背に付け、その切り込みにプラスチックチャンバを設置する。実施例1で培養したケラチノサイト(5×105 cells/cm2)および真皮繊維芽細胞(1×105 cells/cm2)をKGMに混合した細胞懸濁液を、ヌードマウスの背に先に移植したプラスチックチャンバ内それぞれ接種した。1週間後にプラスチックチャンバを除去して表皮の分化を誘導した。再生された皮膚組織を分離して、3.7%ホルマリン/PBSに固定し、ヘマトキシリン&エオジンを含む適切な試薬で組織染色を実施して、接種した細胞の皮膚組織への分化(proliferation)を確認した(図10参照)。
ケラチノサイトおよび繊維芽細胞が皮膚組織への分化に成功するかどうかをインビトロで評価するために、人体死体から得た脱表皮真皮(DED)に、ケラチノサイトおよび繊維芽細胞を接種して3週間培養した(図11、発明の効果7参照)。特に1×105細胞/cm2の密度で繊維芽細胞を下部皮膚網上部(bottom dermal reticulus)に、一日後に5×105 cells/cm2の密度でケラチノサイトを上方皮膚乳頭部に接種した。得られるDEDを水に浸った条件で1週間、そして空気-液体界面で2週間培養した。得られる培養物の一部を取り除き、3.7%ホルマリン/PBSに固定し、ヘマトキシリン&エオジンを含む適切な試薬で組織染色を実施して、接種された細胞の皮膚組織への分化(proliferation)を確認した。
バイオ人工皮膚は、繊維芽細胞を含むか、または含まないで調製されてもよい。本態様において、繊維芽細胞を含むバイオ人工皮膚はインビボおよびインビトロにおいて構築された。繊維芽細胞を分離して培養し、インビボ接種に供して真皮層を形成させた(図9、10、発明の効果6)。インビトロの調製のため、皮膚繊維細胞を人工真皮に接種してバイオ人工真皮を得た後(図11、12、13、14、発明の効果7)、インビボ移植をおこなった(図15、発明の効果8)。
実施例1の方法、すなわち滅菌鋏を用いて(磁気撹拌法、グリーン法)、またはサーモリシン(サーモリシン法)もしくはディスペース(ディスペース法)での処理により、成人ヒト包皮から分離した。分離した真皮層を0.07%コラゲナーゼ溶液10mlに浸して摂氏37度で2時間培養した。その後ピペッティングして培養物から繊維芽細胞を分離した。このように分離された繊維芽細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン・ストレプトマイシンを含むF-培地(ダルベッコ最小基本培地(DMEM):F-12=3:1)で培養した後、直ちに人工皮膚構築物に接種した。または保存液(DMEM50%、牛胎児血清40%、DMSO10%を含む)中で凍結させ、皮膚構築物に接種する前に解凍した。人工皮膚構築物は無菌フード中で、直径8〜10mmのサイズに穿孔して、それぞれが10mmの直径を有する24ウェルの培養プレートに置いた。直径8mmのバイオ人工真皮を調製するため、1X105個の生存細胞(トリパンブルー溶液で判定)を最小体積のDMEM培養液で希釈して、穿穴皮膚構築物に安定に結合させるために均一に接種した。用いた人工皮膚構築物は(Bioartificial skin(BAS(商標)、図12、発明の効果8参照)、Integra(登録商標)、Alloderm(Life Cell)、Terudermis(図14、発明の効果8参照)(Terumo Co.日本)、Beschitin W(Unitika Ltd.日本)、および脱表皮真皮(DED)(図13、発明の効果8参照)であった。繊維芽細胞を接種した皮膚構築物は5%CO2下において37℃で3〜5時間放置した後に、50μlのDMEM培養液を培養プレートのそれぞれ別のウェルに加え、24時間後に1mlの培養液を各々のウェルに添加した。人工皮膚構築物は3〜4週間同じ条件下で培養し、培地交換を一週間に3回おこなって、バイオ人工真皮を得た。
実施例6のような方法でバイオ人工真皮をヌードマウスの背に移植し、組織の拡張についての効果を確認した(図15、16、発明の効果9参照)。使用されたバイオ人工真皮は真皮繊維芽細胞を人工真皮構築物(Integra(登録商標)およびTerudermis)および純粋人工真皮構築物(Integra(登録商標)およびTerudermis)に接種することによって調製された。ヌードマウスは無菌室で飼育する。ヌードマウスの背に1cm幅の切り込みを入れた。ピンセットを利用して直径8mmのバイオ人工真皮または人工真皮をそれぞれのマウスの筋膜上に移植し、縫合糸で縫った後、消毒されたガーゼで覆った。感染を防止するために抗生物質(アンピシリンおよびストレプトマイシン)を含む水をマウスに与えた。実験マウスの移植部位の高さを毎日測定し、28日後に屠殺した。組織学的分析のために、そのマウスから無処置皮膚および移植部位を含む組織部位を分離した。組織試料は3.7%ホルマリン/PBSに固定した後、パラフィンで包埋し、切片化して、ヘマトキシリン&エオジン溶液で染色する。
包皮切除した新生児包皮または成人皮膚組織を、包皮切除直後にペニシリンおよびストレプトマイシンを含んだPBSに10回以上洗浄し、組織を2mm単位に分画した。その組織画分を2.4 U/mlディスパーゼを4℃で一夜処理してケラチノサイトを分離し、0.35%コラゲナーゼで、37℃、2時間処理して単一繊維芽細胞に分離した。その単離した単一繊維芽細胞をF-培地(DMEM/F-12=3:1に10%牛胎児血清または10%牛新生児血清を含んだ培地)で培養して、約80%の密集度に至った時に継代培養した。4継代の繊維芽細胞を3×104cells/ウェルの密度で接種して、2日に一回ずつ培地を交換しながら、F-培地で8日間した後に前条件付けを実施した。細胞前条件付けのために、無血清培地(2ml)に交換した。無血清培地は、何の成長因子を添加しない培地か、または50ng/ml 血小板-誘導成長因子(PDGF)-BB、10ng/mlインシュリン成長因子(IGF-I)、または50ng/ml PDGF-BBと10ng/ml IGF-Iを添加した培地だった。伸張力は前条件付けのために、真皮繊維芽細胞に、FX-4000T(商標)を用いて、37℃2日間、最大伸張力10%、周波数1.0Hzで適用された。対照試料は同じ条件で培養し、伸張力を加えなかった。
4継代由来のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を2×105cells/ウェルの密度で接種し、細胞接着のために一日間静置した。FX-4000T(商標)を用いて周波数1.0Hz、最大伸張力15%を加えながら、HUVECを2日間上皮成長培地(EGM)-MV(Clonetics Inc.)で培養した。対照試料は同じ条件下で伸張力を加えずに培養した。
3継代の皮膚ケラチノサイトを5×105cells/ウェルの密度で接種してKGM培地で培養した。培地交換後、FX-4000T(商標)を利用して最大伸張力20%、周波数0.5Hzを加えつつ、皮膚ケラチノサイトを2日間培養した。対照試料は同じ条件下で伸張力を加えずに培養した。
成人の繊維芽細胞を包皮試料から分離させた後、MACS抗繊維芽細胞マイクロビーズ(Miltenyi Biotec.)で室温で1時間反応させ、カラムに供与して純粋な繊維芽細胞を確保した。分離した繊維芽細胞を100mm培養皿一枚当たり1×105cell接種して、80〜90%密集度に到達する度に継代培養した。培地はF-培地を使用し、2日に一回ずつ培地を交換した。一次継代由来の繊維芽細胞をFACSを供して、HLA-ABC(Deko)およびHLA-DR(Neomarker)の発現レベルを測定した。その結果、HLA-DRは発現されていなかった。そのため、以後の継代からはHLA-DRを分析しなかった。FACS分析のために、分離した繊維芽細胞をトリプシンで処理し、FACS試薬で洗浄した後、HLA-ABC抗体(Dako)およびHLA-DR抗体(Neomarkers)と反応させ、FITC標識2次抗体に反応させた。細胞濃度はFACS分析のために5×105〜1×106cellsに調整した(発明の効果16参照)。
細胞内の総タンパク質量の定量分析のために、細胞プレート(BioFlex)をPBSで洗浄し、タンパク質分解酵素阻害剤として作用する2mMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を添加した、細胞溶解緩衝液(20mM Tris-HCl pH7.4、150mM NaCl、1mM Na2EDTA、1mM EGTA、1% Triton X-100、2.5mM ナトリウムピロリン酸塩、1mM Na3VO4、1mM β-グリセロリン酸塩、1μg/ml ロイぺプチン)中で4℃20分間、細胞を溶解させた。細胞スクレーパを利用して細胞溶解物を掻き集め、12,000rpm、4℃で20分間遠心分離した。遠心分離物から得た上澄み液は細胞内のタンパク質の分析のために回収され、分析はビシンコニン酸(BCA)で実施された。上澄み液10μlをBCA:4% CuSO4=49:1に混合された溶液2mlに添加して37℃で30分間反応させた後、562nmの波長で吸光度を測定した。タンパク質の濃度はウシ血清アルブミン(BSA)で算出された標準曲線と比較して換算した。
FX-4000T(商標)による前条件付けの後、細胞培養液は細胞が分泌した成分の分析のために保管した。細胞培養液中の関心対象のタンパク質を細胞培養プレートの単位面積当りの細胞数を基準に定量した。
蛍光染色のために、細胞が接種されたカバースリップを100%メタノールで固定させ、PBSで希釈された0.2% TritonX-100をもちいて浸透化させた。PBSで希釈された20% 正常ヤギ血清(NGS)で1時間反応させ、非特異的な抗原をブロックした。この後、ヒトフィブロネクチンハイブリドーマ培養上澄み液(Hybridoma)またはα平滑筋アクチン抗体(Dako)で、4℃で一夜反応させ、蛍光標識2次抗体で1時間室温で反応させた。細胞をDAPIで室温で5分間染色し、細胞核の形態を観察し、細胞数を数えた。
免疫染色のために、細胞が接種されたカバースリップを有する培養プレートを100%メタノールで固定させ、PBSに希釈された0.2% TritonX-100に浸透化させた。次に培養プレートの底を取り除いた。PBSで希釈された20% 正常ヤギ血清(NGS)で1時間反応させ、抗原の非特異的反応をブロックした。この後、細胞を一次コラーゲンIV抗体(Dako)で室温で45分間反応させ、標準ABCキットで染色し、Vectashield(Vector Laboratories)に搭載した。
FX-4000T(商標)で細胞を前条件付けした後、細胞培養液に存在するMMPの活性をザイモグラフィで分析した。細胞培養液をメルカプトエタノールが含まれていない試料緩衝液で希釈して、0.1%ゼラチンが含まれた10%ゲルでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を実施した。電気泳動の後、ゲルを2回、2.5% TritonX-100中でそれぞれ30分間復元させた。その後、1×デベロッピング緩衝液(50mM Tris(pH7.4)、5mM CaCl2、1M ZnCl2)に浸かって常温で30分間インキュベートさせ、次に新鮮なデベロッピング緩衝液中、37℃で16時間を超えてインキュベートさせる。予め準備した染色緩衝液(10% 酢酸、10%プロパノール、0.5%クマシーブリリアントブルー)に室温で2時間染色させ、次に脱色緩衝液(10%酢酸、10%プロパノール)にバンドが現れる脱色する。蒸溜水でリンスし、10% グリセロール/12% エタノールを含む溶液中でゲルを脱水する。
HUVECをFX-4000T(商標)で伸張力を加えてながら、培地中で前条件付けした後、培養液中のVEGF分泌量のレベルの変化をR&D Qunatikineキットを利用してELISA方法で分析した。
1.細胞収率
細胞を4つの方法によって組織から分離した後、残った組織を固定し、ヘマトキシリン&エオジン染色して組織中に細胞が残っているかどうかを確認した。磁気撹拌法で細胞を分離し組織中には、細胞がほとんど存在しなかった。対照的に、他の分離法で細胞を分離した組織中には多くの幹細胞が存在した(図1)。このような細胞の組織からの完全な分離は、磁気撹拌の適用によって可能であった。磁気攪拌の効果は分離された細胞数を測定することによって支持された(表1、図2、3)。本発明による磁気撹拌法はグリーン法に比べて約700%の細胞収率の改善を表す。
異なる分離方法で分離された細胞の純度を確認するために、ケラチノサイトのケラチノサイトの指標としてパン・サイトケラチン抗体を用いて培養細胞を蛍光染色した。磁気攪拌法に関しては100%のパン・サイトケラチン陽性細胞(ケラチノサイト)が検出された。磁気攪拌法により分離された細胞は繊維芽細胞を含まない純粋なケラチノサイトを含むことは明らかである(図8)。他の細胞分離法に関して、培養細胞中に同じ比率でのパン・サイトケラチン陽性細胞が検出された。したがって、磁気撹拌法は細胞の純度に関して他の分離法と同じ効果を提供する。
幹細胞の存在はコロニー形成効率(CFE)で確認できる。他の分離法と比較して、磁気撹拌法によって分離されたケラチノサイトは最も高いCFEを示した(表2、図4)。特に、大きいコロニー(128個を超える細胞を含む)のCFEは顕著に増加した(表2)。これらの結果は、磁気撹拌法によって分離されたケラチノサイトの培養細胞中における幹細胞の比率が著しく改善することを表す。
免疫染色法の結果により、磁気攪拌法により分離された全てのケラチノサイトにおいて、基底膜にある細胞(基底細胞)に特異的なα2インテグリンが発現していた(図8)。これはインビトロの細胞増殖が基底ケラチノサイトの分裂によって生じることを示す。
ケラチノサイトの分化マーカーであるインボルクリンは、低いレベルで培養ケラチノサイト中に発現され、磁気撹拌法で7%、グリーン法で7%、サーモリシン法で17%、およびディスペース法で23%であった(表3、図7)。インボルクリンを発現する細胞は、連続的に分化・老化してすぐに死滅する。
マウスの背に移植された皮膚ケラチノサイトおよび真皮繊維芽細胞の培養物は表皮、基底膜および真皮からなる完全な皮膚に分化した(図10)。ケラチノサイトはヒト特異的パン・サイトケラチン発現において陽性を表し、真皮繊維芽細胞はヒト特異的ビメンチン発現において陽性であった。この上皮細胞および真皮繊維芽細胞がヒトから由来したことを示す。また、ヌードマウスの創傷部位付近で生存していたケラチノサイトおよび繊維芽細胞は共に移動し、各々表皮および真皮に分化したことが明らかでる。加えて、基底膜はヒト表皮とヒト真皮の間に首尾良く再生された。
自然状態でケラチノサイトは階層化した多重層表皮に分化する。本発明の磁気撹拌法で分離したケラチノサイトの多重層表皮への分化能を調べるために、分離したケラチノサイトの培養細胞を脱表皮真皮(DED)に直接接種して、固定し、H&E染色した。その結果、パン・サイトケラチン発現について陽性であるケラチノサイトが多重層に成長していることが観察された(図11)。
繊維芽細胞を動的条件下で伸張力を適用することによって接種および培養を行う場合、静的条件で接種および培養を実施した時に比べて、人工皮膚構築物BAS(商標)に付着された皮膚繊維芽細胞の数が増加した(図16)。BAS(商標)に接種された皮膚繊維芽細胞の走査電子顕微鏡(SEM)写真は付着された細胞が細胞外基質を豊富に分泌していることを確認させる(図12)。したがって、バイオ人工真皮の細胞が機能においても生体内でと同じであることが分かる。一方、DEDに接種された皮膚繊維芽細胞はBAS(商標)に接種された皮膚繊維芽細胞が構造表面に付着されたことに比べて、構造の深い部分まで見られ、そして、比較的均等に分布して実際に真皮層で発見されるものとほぼ同程度の細胞密集度を示した(図13)。人工真皮構築物であるIntegra(登録商標)およびTerudermisに接種された皮膚繊維芽細胞もDEDと同程度の密集度および均等な細胞の分布を示す。
Integra(登録商標)およびTerudermisに繊維芽細胞を接種してから14日後にバイオ人工真皮(図14)を得た。および市販のIntegra(登録商標)およびTerudermisをヌードマウスに移植(図15)した。これらをヘマトキシリン&エオジン染色で調べた(図15、16)。移植部位または周辺組織で炎症反応の徴候は見られなかった。移植部位は周辺組織とよく融合されており、元サイズの相当部分がそのまま維持された(図16)。繊維芽細胞および血管の流入が移植部位の全般にわたって発見され、移植部位の繊維芽細胞の密集度は無傷のマウス真皮と類似した(図16)。移植部位の高さの変化を径(calibre)を利用して測定しようとしたが、移植物の高さが低いため、組織染色写真に基づいて移植物の高さを測定した(図17)。Integra(登録商標)およびTerudermisは全て移植部位に体積減少が起きたが、これはコラーゲンの収縮および移植物の分解によると思われる。生細胞を接種したバイオ人工真皮が人工真皮構築物より移植物の体積減少幅がせまく、特にIntegra(登録商標)がTerudermisより移植物の体積減少幅が狭かった(図17)。
繊維芽細胞にFX-4000T(商標)で2日間37℃、10%の最大伸張力、1.0Hzの周波数で細胞を前条件付けさせた後、総タンパク質量は対照群に比べて伸張力処理群が約4.8倍、血小板由来成長因子(PDGF)処理群が約2.1倍、インスリン様成長因子(IGF-1)処理群が約1.3倍、PDGF-BB+IGF-1処理群が約1.3倍増加した。
皮膚繊維芽細胞にFX-4000T(商標)で2日間37℃、10%の最大伸張力、1.0Hzの周波数で細胞を前条件付けさせた後、サイクリン-D1の発現量は、対照群と比較して、約8倍増加した。成長因子提供群で伸張力提供によるサイクリン-D1増加値は、伸張力を提供しない成長因子処理群に比べて、26〜29倍増加した(図20、表5)。
FX-4000T(商標)で2日間37℃、10%の最大伸張力、1.0Hzの周波数で伸張力を提供した新生児の皮膚繊維芽細胞を前条件付けした場合、この細胞培養液に分泌されたフィブロネクチンは対照群に比べて約282倍増加した。PDGF-BB(対照群と比べて3倍増加)、またはIGF-1(対照群と比べて22倍)、またはPDGF+IGF-1(対照群と比べて108倍)処理群より最高94倍最低2.8倍増加した値である(図21のA)。フィブロネクチンの分泌量は伸張力提供だけで282倍増加し、伸張力と同時に、IGF-1、およびPDGF-BB処理群で約3.2倍増加した。しかし、伸張力提供がI型コラーゲンの発現には何らの影響も与えなかった(図21のA)。
FX-4000T(商標)を用いて最大伸張力10%、周波数1.0Hzの伸張力を適用しながら37℃、2日間前条件付けをおこなった成人真皮繊維芽細胞を、トリプシン処理し、継代培養した場合、フィブロネクチンの発現量が4日後(図24)、および7日後、増加した。
FX-4000T(商標)を用いて最大伸張力10%、周波数1.0Hzの伸張力を適用しながら37℃、2日間前条件付けをおこなった成人真皮繊維芽細胞を、トリプシン処理し、継代培養した後に免疫蛍光染色した結果、α平滑筋アクチン(筋繊維芽細胞の指標)の陰性発現が示された(図25)。これは伸張力適用後に繊維芽細胞の特性を維持するということを支持する。しかし、成長因子処理群は、α平滑筋アクチン発現が陽性である細胞の顕著な増加を示したが(図25)、このことは成長因子処理後に相当数の細胞が筋肉繊維芽細胞に分化したことを意味する。創傷治癒過程で筋繊維芽細胞が一時的に現れる。しかしながら、創傷過程において、筋繊維芽細胞がしばらく存在する場合、傷跡が形成される可能性が高く、繊維芽細胞が筋繊維芽細胞よりさらに重要に作用する。したがって、伸張力が適用された処理群は成長因子処理群より高い創傷治癒効果を期待できた。
皮膚繊維芽細胞を、FX-4000T(商標)を用いて最大伸張力10%、周波数1.0Hzの伸張力を拍動的に適用しながら37℃、2日間前条件付けをおこなったとき、培養液に存在するマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)-2およびMMP-9の活性は、対照群と比較して増加していた(図26のA)。
真皮繊維芽細胞におけるHLA-ABC発現が1次継代には約56.77%であり、2次継代に85.87%に増加した。3次継代では60.96%に減少し、4次継代は11.17%に著しく減少した。5継代は3.29%とほとんど発現されず、このことは次の継代でもほとんど同じであった。したがって、HLA-ABCの発現は5継代の真皮繊維芽細胞においてほとんどないようである(図27)。このような結果は、生体的に同種の4継代以降の繊維芽細胞は治療用細胞源として利用でき、組織不適合反応がおこらないということが立証する。
血管内皮細胞(VEC)を、FX-4000T(商標)を用いて最大伸張力15%、周波数1.0Hzの伸張力を適用しながら2日間前条件付けをおこなったとき、VEGFの分泌レベルが約30%増加し、VEGF10ng/mlを添加して伸張力を提供した場合では約200%増加した(図28)。ケラチノサイトに伸張力を適用した場合は、VEGFの分泌レベルが約2,400%増加した(図28)。したがって、伸張力を適用することによって、VECおよびケラチノサイトの両方において、VEGF分泌が促進された。
Claims (30)
- 皮膚組織または内臓組織をトリプシン処理またはトリプシン/EDTA処理すると同時に磁気撹拌する上皮細胞の分離方法。
- 皮膚組織を、包皮、脇のした、股関節、乳房、頭皮、角膜、陰毛、腹部、育児嚢から得る、請求項1記載の方法。
- 内臓組織を、口腔粘膜、食道粘膜、胃粘膜、腸粘膜、鼻腔粘膜、咽喉、腎臓、尿道、子宮粘膜、膀胱、または膣から得る、請求項1記載の方法。
- 皮膚組織または内臓組織をトリプシン処理する場合は、トリプシン0.025%〜0.25%の量で添加し、皮膚組織または内臓組織をトリプシン/EDTA処理する場合は、トリプシン0.025〜0.25%およびEDTA0.005%〜0.02%の量で添加する、請求項1記載の方法。
- 磁気撹拌は、10分間〜4時間に60rpm〜700rpmの速度で撹拌する、請求項1記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項記載の方法で分離された上皮細胞を単独または繊維芽細胞と共に、人工真皮構築物または脱表皮真皮(DED)に接種することによってバイオ人工皮膚を調製する方法。
- 人工真皮構築物または脱表皮真皮(DED)に繊維芽細胞を接種して調製されたバイオ人工真皮に上皮細胞を接種する、請求項6記載の方法。
- 上皮細胞をメラニン細胞を共に接種する請求項6または7記載の方法。
- 上皮細胞を毛嚢細胞または真皮鞘を共に接種する請求項6または7記載の方法。
- 上皮細胞を血管内皮細胞を共に接種する請求項6または7記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項記載の方法で分離された上皮細胞を単独または繊維芽細胞と共に損傷した皮膚組織または内臓組織に移植して損傷した皮膚または内臓を治療する方法。
- 請求項6〜10のいずれか一項記載の方法で調製されたバイオ人工皮膚を損傷した皮膚組織または内臓組織に移植して損傷した皮膚または内臓を治療する方法。
- 皮膚組織は、火傷、外傷、もしく潰瘍による皮膚損傷部位、または皮膚成形外科手術、組織伸張および組織増強もしくは角膜移植を必要とする皮膚部位ある、請求項11または12記載の方法。
- 内臓組織は、癌治療、または他の目的のために切開または放射性治療が行われた後に回復または再生を必要とする損傷した組織部位である請求項11または12記載の方法。
- 生体から分離された細胞を培地中で物理的な刺激を加えることによって前条件付けする方法。
- 細胞が繊維芽細胞である請求項15記載の方法。
- 細胞が血管内皮細胞である請求項15記載の方法。
- 細胞がケラチノサイトである請求項15記載の方法。
- 請求項15記載の方法で培養された細胞を人工または天然の真皮構築物に接種してバイオ人工真皮を調製する方法。
- 細胞を人工または天然の真皮構築物に接種した後、物理的な刺激を加えつつバイオ人工真皮を調製する方法。
- 天然の真皮構築物は脱表皮真皮(DED)、コラーゲン溶液、フィブリン溶液、ゲル化コラーゲン、ゲル化フィブリンからなる群より選択される少なくとも1つであり、人工真皮構築物は中和されたキトサンスポンジ、中和されたキトサン/コラーゲン混合スポンジ、Integra(登録商標)、Alloderm、Terudermis、およびBeschitinからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項19または20記載の方法。
- 細胞には繊維芽細胞および/または血管内皮細胞が含まれる、請求項19または20記載の方法。
- 人工または天然の真皮構築物にフィブロネクチンおよび/またはグリコスアミノグリカンを添加する、請求項19または20記載の方法。
- 真皮構築物に請求項18記載の方法で前条件付けされたケラチノサイトを単独で、またはメラニン細胞、真皮鞘もしくは毛嚢細胞と共に接種してバイオ人工皮膚を調製する方法。
- 真皮構築物にケラチノサイトを単独で、またはメラニン細胞と共に接種した後、物理的な刺激を加えることによってバイオ人工皮膚を調製する方法。
- 真皮構築物は、人工真皮構築物、天然真皮構築物、バイオ人工真皮構築物、請求項19または20記載の方法で調製されたバイオ人工真皮を含む、請求項24または25記載の方法。
- 物理的な刺激は周波数0.1Hz〜3.0Hz、最大伸張力0.01%〜40%で適用される拍動的または継続的伸張力を含む、請求項15、20または25のいずれか一項記載の方法。
- 天然の真皮構築物は、脱表皮真皮(DED)、コラーゲン溶液、フィブリン溶液、ゲル化フィブリンからなる群より選択される少なくとも1つであり、人工真皮構築物は中和されたキトサンスポンジ、中和されたキトサン/コラーゲン混合スポンジ、Integra(登録商標)、Alloderm、Terudermis、Beschitinからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項26記載の方法。
- 請求項19もしくは20記載の方法で調製されたバイオ人工真皮または請求項24もしくは25記載の方法で調製されたバイオ人工皮膚を損傷した皮膚組織または内臓組織に移植することによって損傷した組織を治療する方法。
- 請求項16記載の方法で前条件付けされた繊維芽細胞、請求項17記載の方法で前条件付けされた血管内皮細胞、請求項18記載の方法で前条件付けされたケラチノサイトを別々または共に損傷した皮膚組織または内臓組織に直接移植することによって損傷した組織を治療する方法。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013543760A (ja) * | 2010-11-09 | 2013-12-09 | コーネル ユニヴァーシティー | 器官再生方法 |
JP2020070270A (ja) * | 2018-11-01 | 2020-05-07 | 御木本製薬株式会社 | フィブロネクチン遺伝子発現促進剤 |
Families Citing this family (33)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2518569C (en) * | 2003-03-10 | 2011-11-15 | Expression Pathology, Inc. | Liquid tissue preparation from histopathologically processed biological samples, tissues and cells |
US8298824B2 (en) | 2004-04-28 | 2012-10-30 | Sanofi Pasteur Vaxdesign Corporation | Methods of evaluating a test agent in a diseased cell model |
US8071373B2 (en) | 2004-04-28 | 2011-12-06 | Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. | Co-culture lymphoid tissue equivalent (LTE) for an artificial immune system (AIS) |
US20060275270A1 (en) * | 2004-04-28 | 2006-12-07 | Warren William L | In vitro mucosal tissue equivalent |
US7771999B2 (en) * | 2004-04-28 | 2010-08-10 | Vaxdesign Corp. | Disease model incorporation into an artificial immune system (AIS) |
US7855074B2 (en) | 2004-04-28 | 2010-12-21 | Vaxdesign Corp. | Artificial immune system: methods for making and use |
US7785883B2 (en) * | 2004-04-28 | 2010-08-31 | Vax Design Corp. | Automatable artificial immune system (AIS) |
US8030070B2 (en) * | 2004-04-28 | 2011-10-04 | Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. | Artificial lymphoid tissue equivalent |
US7709256B2 (en) * | 2004-04-28 | 2010-05-04 | Vaxdesign Corp. | Disease model incorporation into an artificial immune system (AIS) |
US20070141552A1 (en) * | 2004-04-28 | 2007-06-21 | Warren William L | Automatable artificial immune system (AIS) |
US7785806B2 (en) * | 2004-04-28 | 2010-08-31 | Vaxdesign Corporation | Method for determining the immunogenicity of an antigen |
FR2893328B1 (fr) * | 2005-11-17 | 2014-01-31 | Lvmh Rech | Procede pour depister des marqueurs impliques dans la resistance de keratinocytes a des deformations mecaniques. |
AU2006330951B2 (en) * | 2005-12-21 | 2012-04-05 | Sanofi Pasteur Vaxdesign Corporation | A porous membrane device that promotes the differentiation of monocytes into dendritic cells |
US8003387B2 (en) | 2005-12-21 | 2011-08-23 | Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. | In vitro germinal centers |
CA2655344C (en) * | 2006-06-27 | 2016-09-13 | Vaxdesign Corporation | Models for vaccine assessment |
JP2007313333A (ja) * | 2007-06-08 | 2007-12-06 | Kao Corp | 再構成皮膚の構築方法 |
US8647837B2 (en) * | 2007-07-16 | 2014-02-11 | Sanofi Pasteur Vaxdesign Corp. | Artificial tissue constructs comprising alveolar cells and methods for using the same |
WO2009107266A1 (ja) * | 2008-02-29 | 2009-09-03 | 学校法人昭和大学 | 人工皮膚の製造方法 |
JP5275710B2 (ja) * | 2008-07-23 | 2013-08-28 | 日本メナード化粧品株式会社 | 幹細胞から分化誘導した線維芽細胞及び人工真皮 |
PT2471902T (pt) * | 2009-08-25 | 2018-08-02 | Univ Granada | Produção de tecidos artificiais por meio da engenharia de tecidos utilizando biomateriais de agarose-fibrina |
US9526648B2 (en) | 2010-06-13 | 2016-12-27 | Synerz Medical, Inc. | Intragastric device for treating obesity |
US10420665B2 (en) | 2010-06-13 | 2019-09-24 | W. L. Gore & Associates, Inc. | Intragastric device for treating obesity |
US8628554B2 (en) | 2010-06-13 | 2014-01-14 | Virender K. Sharma | Intragastric device for treating obesity |
US10010439B2 (en) | 2010-06-13 | 2018-07-03 | Synerz Medical, Inc. | Intragastric device for treating obesity |
JP2013143955A (ja) * | 2013-03-19 | 2013-07-25 | Cellseed Inc | 閉鎖系小型細胞培養用培地供給システム |
US9737590B2 (en) | 2013-07-31 | 2017-08-22 | Vivex Biomedical, Inc. | Self-assembly of collagen fibers from dermis, fascia and tendon for tissue augmentation and coverage of wounds and burns |
CN104232475B (zh) * | 2014-09-17 | 2017-01-11 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置及方法 |
US10273549B2 (en) * | 2016-04-21 | 2019-04-30 | Vitrolabs Inc. | Engineered skin equivalent, method of manufacture thereof and products derived therefrom |
US10779980B2 (en) | 2016-04-27 | 2020-09-22 | Synerz Medical, Inc. | Intragastric device for treating obesity |
US20210338568A1 (en) * | 2018-08-31 | 2021-11-04 | Shiseido Company, Ltd. | Cosmetic method |
CN109735486B (zh) * | 2019-01-31 | 2022-02-22 | 中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所 | 一种用于研究uvb照射致早衰的原代黑素细胞培养方法 |
EP3985395A1 (en) * | 2020-10-16 | 2022-04-20 | Mukocell GmbH | Method for producing transplantable oral mucosa tissue |
CN112375731A (zh) * | 2020-11-24 | 2021-02-19 | 河北医科大学 | 一种皮肤成纤维细胞分离培养方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10136977A (ja) * | 1996-11-11 | 1998-05-26 | Toyobo Co Ltd | 組織付属器官様構造体を含む人工組織およびその製造方法 |
WO1999009945A1 (fr) * | 1997-08-27 | 1999-03-04 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Utilisations d'extraits de la plante rhoeo discolor dans le domaine de la cosmetique et de la pharmacie, notamment de la dermatologie |
WO2000016817A1 (en) * | 1998-09-24 | 2000-03-30 | Korea Atomic Energy Research Institute | Dermal scaffold using neutralized chitosan sponge or neutralized chitosan/collagen mixed sponge |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5686303A (en) * | 1994-12-30 | 1997-11-11 | Korman; Joshua | Method of growing vertebrate skin in vitro |
US6057150A (en) * | 1997-09-19 | 2000-05-02 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Biaxial strain system for cultured cells |
US6599741B1 (en) * | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Avontec Gmbh | Modulating transcription of genes in vascular cells |
US6942873B2 (en) * | 2000-09-25 | 2005-09-13 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Microfabrication of membranes containing projections and grooves for growing cells |
-
2001
- 2001-11-06 WO PCT/KR2001/001873 patent/WO2002062971A1/en active Application Filing
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10136977A (ja) * | 1996-11-11 | 1998-05-26 | Toyobo Co Ltd | 組織付属器官様構造体を含む人工組織およびその製造方法 |
WO1999009945A1 (fr) * | 1997-08-27 | 1999-03-04 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Utilisations d'extraits de la plante rhoeo discolor dans le domaine de la cosmetique et de la pharmacie, notamment de la dermatologie |
WO2000016817A1 (en) * | 1998-09-24 | 2000-03-30 | Korea Atomic Energy Research Institute | Dermal scaffold using neutralized chitosan sponge or neutralized chitosan/collagen mixed sponge |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013543760A (ja) * | 2010-11-09 | 2013-12-09 | コーネル ユニヴァーシティー | 器官再生方法 |
US10946066B2 (en) | 2010-11-09 | 2021-03-16 | Cornell University | Methods for organ regeneration |
JP2020070270A (ja) * | 2018-11-01 | 2020-05-07 | 御木本製薬株式会社 | フィブロネクチン遺伝子発現促進剤 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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WO2002062971A1 (en) | 2002-08-15 |
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Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
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