CN114703079A

CN114703079A - 一株副干酪乳杆菌及其在缓解皮肤损伤中的应用

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Publication number: CN114703079A
Application number: CN202111047708.9A
Authority: CN
Inventors: 段治; 吴松洁; 崔洪昌; 张景燕; 郭超群; 李凯玲
Original assignee: QINGDAO VLAND BIOTECH Inc; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: QINGDAO VLAND BIOTECH Inc; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2041-09-08
Also published as: CN114703079B

Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一株新型的副干酪乳杆菌及其应用。所述副干酪乳杆菌分离自健康婴儿的粪便，已于2021年5月24日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021587。该菌株耐酸能力和抗氧化能力很强，且能有效缓解多种因素造成的皮肤损伤，效果显著。

Description

一株副干酪乳杆菌及其在缓解皮肤损伤中的应用

技术领域

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌，特别是一种对皮肤损伤具有保护作用的副干酪乳杆菌及其应用。

背景技术

益生菌通常指的是对人类和动物具有有益作用的微生物。常见的益生菌主要有各类乳杆菌，以及双歧杆菌和某些肠球菌等。这些益生菌可以单独或组合地添加到食物中以发挥功效。益生菌最常见的功效与宿主的肠道有关，包括预防抗生素相关的腹泻，肠易激综合症以及炎症性肠病的治疗。

人类皮肤拥有细菌、真菌、病毒、螨虫和古细菌等多种生态系统。人类皮肤上的微生物大约有10⁴-10⁹个/cm²，根据其定殖时间可以分为常驻菌群与暂驻菌群。暂驻菌群是皮肤与不同日常接触物接触时，由物体表面传递到皮肤表面，其在皮肤表面短暂停留，所造成的影响也相对较小。而常驻菌群也可以视作皮肤的核心菌群，其长期定殖于个体皮肤，已完全适应皮肤环境，并对皮肤环境产生专性依赖，这类菌群对皮肤的影响较为直接。皮肤微生物菌群和表皮细胞之间存在复杂的相互作用网络。这些不同的微生物菌群创造其特定的生态位，并可以帮助预防或导致疾病。例如，一些细菌物种(如金黄色葡萄球菌)通过将皮脂脂质水解成毒性脂肪酸来限制其他细菌的生长，从而导致机会性皮肤感染的症状更为突出。同样，皮肤微生物菌群的大规模改变与特应性皮炎(Atopic dermatitis，AD)、银屑病、牛皮癣、红斑痤疮和痤疮等几种非传染性疾病有关。

皮肤屏障功能异常、抗微生物肽含量降低和异常免疫应答决定了皮肤微生物群的改变，也是影响皮肤健康的主要因素。益生菌正是通过对抗这些变化来维持皮肤正常状态，促进皮肤健康。例如，WANG等将痤疮患者鼻部皮肤微生物与痤疮丙酸杆菌共同培养后发现痤疮丙酸杆菌生长被抑制，通过菌株鉴定后确认是表皮葡萄球菌抑制了痤疮丙酸杆菌。结果表明，表皮葡萄球菌作为一种益生菌，可以通过厌氧发酵甘油来产生琥珀酸，降低细胞内环境的pH，从而控制痤疮丙酸杆菌的过度生长。

另有研究表明，益生菌及其代谢产物可能会从调节皮肤pH、减少自由基的产生方面改善皮肤老化。健康的皮肤pH在4.2-5.6左右，微酸的环境有助于预防病原菌定植，保持皮肤表面常驻菌群稳定状态。然而，随着年龄增长，皮肤的pH显著升高，从而导致皮肤正常菌群被破坏。益生菌代谢能够产生酸性物质，降低周围环境的pH，如乳杆菌在发酵过程中产生的游离脂肪酸(Free fatty acid，FFA)和共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)等。因此，使用益生菌可能会使皮肤恢复正常的pH，从而对抗皮肤老化。人体的正常代谢会产生自由基，但与此同时，许多外界因素如紫外线等会使其产量大大提高。研究表明，自由基的产生与衰老有着密切的联系，其中活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)占主导作用。衰老是由于有氧代谢产生的过量ROS引起的。ROS能够引起脂质，蛋白质和DNA的损伤，并影响细胞的衰老。此外，自由基还会损伤真皮的结缔组织成分，特别是胶原蛋白，并且通过细胞-基质的相互作用来影响细胞生理行为。益生菌如凝结芽孢杆菌已被证明能够产生不同种类的胞外生物活性分子，包括释放胞外多聚物(Extracellular PolymericSubstance，EPS)等，从而产生抗氧化作用。近日研究表明，微生物EPS具有显著的抗氧化和清除自由基的活性。因此，益生菌可通过恢复自由基清除剂与自由基产生之间的平衡来减缓皮肤老化。

随着目前环境污染日益严重，加上人体自身的变化，人体的皮肤健康时常受到威胁。来自外界的损伤，如紫外线、大气污染物、创伤等，以及体内内分泌变化、皮肤菌群失调等都会使皮肤受到损伤，而及时补充益生菌能够有效地缓解皮肤疾病，帮助皮肤维持正常功能。益生菌在皮肤健康方面的应用目前已在动物模型中得到证实，基于目前的研究，益生菌在皮肤衰老、痤疮、特异性皮炎、牛皮癣等皮肤疾病方面都有较好的功效。因此，开发出应用于皮肤健康领域的益生菌具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株新型副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)及其应用。所述副干酪乳杆菌分离自健康婴儿的粪便，耐酸能力和抗氧化能力很强，且能有效缓解多种因素造成的皮肤损伤，效果显著。

本发明涉及一株副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌VHProbi E12(Lactobacillus paracasei VHProbi E12)，已于2021年5月24日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021587。

本发明一方面提供了副干酪乳杆菌VHProbi E12在制备用于预防或缓解皮肤损伤的制品中的应用。

所述的制品为化妆品或药品。

本发明还提供了一种具有防晒或抗衰老功效的化妆品，包含副干酪乳杆菌VHProbi E12和/或副干酪乳杆菌VHProbi E12的发酵产物。

本发明还提供了一种用于缓解皮肤损伤的药品，包含副干酪乳杆菌VHProbi E12和/或副干酪乳杆菌VHProbi E12的发酵产物。

本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12耐酸性强；不产生溶血素，不溶解血细胞，对红霉素、四环素等常见的抗生素敏感，具有良好的生物安全性；能够耐受较高的盐度，最大耐受盐浓度为5％。

本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12具有较强的抗氧化能力，能有效清除DPPH自由基，清除率达到34.44％，显著高于对照菌副干酪乳杆菌IMC-4菌株。

本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能有效促进皮肤细胞增殖。

本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能大幅降低金黄色葡萄球菌侵染造成的细胞损伤，对细胞提供有力保护。被金黄色葡萄球菌侵染的对照组细胞死亡率高达55.7％，而同时加入副干酪乳杆菌VHProbi E12热灭活菌体的益生菌处理组细胞的死亡率下降至37.0％(P<0.005)，效果显著。

本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能有效降低紫外线UVB照射造成的皮肤细胞损伤。与对照组相比，UVB损伤组细胞的活力大幅下降，仅为49.1％，而经副干酪乳杆菌VHProbi E12灭活菌体预处理的益生菌处理组细胞活力高达72.6％(P<0.05)。

本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能有效降低过氧化氢氧化造成的细胞损伤。与对照组相比，过氧化氢损伤组细胞的活力大幅降至49.8％；而经过副干酪乳杆菌VHProbi E12灭活菌体预处理的益生菌处理组细胞活力达到59.4％，提高明显(P<0.005)。

本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能有效缓解过氧化氢氧化造成的皮肤损伤，具有显著的抗炎和免疫调节作用。与对照组相比，涂抹过氧化氢溶液后，皮肤细胞活力大幅降低，仅有50.6％，皮肤细胞对IL-1α、IL-1β和IL-8三种促炎症反应细胞因子的分泌水平均显著升高；而在涂抹过氧化氢溶液前，先经副干酪乳杆菌VHProbi E12灭活菌体预处理后的益生菌处理组皮肤细胞的活力能达到57.2％(P<0.05)，对IL-1α、IL-1β及IL-8的分泌水平也明显回落(p<0.005)，效果非常显著。

本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能有效降低TritonX-100对皮肤造成的损伤。与对照组相比，表面涂抹0.1％TritonX-100溶液的皮肤模型的跨膜电阻值下降了61.4％，而经副干酪乳杆菌VHProbi E12灭活菌体预处理后的益生菌处理组皮肤模型的跨膜电阻值的下降程度有所缓解，仅比对照组降低了52.4％(P<0.05)。

本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12对细菌感染、紫外线、氧化损伤及化学损伤等多种因素造成的皮肤损伤均具有一定的保护作用，可广泛应用于化妆品或药品中，应用前景广阔。

附图说明

图1为菌落形态图；

图2为Riboprinter指纹图谱；

图3为RAPD指纹图谱；

图4为rep-PCR指纹图谱；

图5为VHProbi E12对HaCat细胞增殖的促进效果图；

图6为VHProbi E12对金黄色葡萄球菌感染的HaCat细胞的保护效果图；

图7为VHProbi E12对UVB损伤的HaCat细胞的保护效果图；

图8为VHProbi E12对过氧化氢氧化损伤的HaCat细胞的保护效果图；

图9为3D皮肤模型过氧化氢氧化损伤细胞因子检测结果图；

图10为3D皮肤模型过氧化氢氧化损伤细胞活力检测结果图；

图11为3D皮肤模型跨膜电阻值检测结果图。

具体实施方式

本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

本实施例中所使用的热灭活菌体的制备方法如下：

将副干酪乳杆菌VHProbi E12使用MRS液体培养基培养至稳定期，使用无菌PBS洗涤3次，并用无菌PBS将菌体重悬至5×10⁷CFU/mL，于70℃水浴中20分钟热灭活备用。

本实施例中所使用的HaCat细胞的准备方法如下：

人永生化角质形成细胞HaCat使用高糖DMEM(10％FBS)培养液培养至所需用量，胰酶消化计数，细胞悬液加入24孔板中，每个细胞培养孔中的细胞个数为2×10⁵，每孔培养液的添加量为0.6ml。放置二氧化碳培养箱(5％CO2，37℃)中培养24小时后，进行后续实验。

下面结合具体实施例，对本发明做进一步阐述。

实施例1副干酪乳杆菌VHProbi E12的分离筛选

1.1乳酸杆菌初筛

配制MRS(Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基：纯化水1000mL，蛋白胨10g，牛肉浸取物10g，酵母提取物5.0g,乙酸钠5g，葡萄糖5g，磷酸二氢钾2g，吐温80 1.0mL，柠檬酸二胺2.0g,碳酸钙20g，七水硫酸镁0.58g，七水硫酸锰0.25g，琼脂15g，调pH 6.2-6.5，121℃高压灭菌15min。

取1g来自1岁半的半年内未使用过益生菌制剂的健康婴儿的新鲜粪便，经无菌生理盐水稀释后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μL混匀液梯度稀释，涂布于MRS琼脂培养基后于37℃培养48h，待平板长出单菌落镜检。根据镜检结果，申请人共筛选出10株潜在乳酸杆菌，分别命名为PS-1，PS-2，……，PS-10。

1.2乳酸杆菌复筛

配置1L的MRS液体培养基115℃高压灭菌30min，待培养基冷却后加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h制成耐酸性培养基。

将筛选得到的10株乳酸杆菌PS-1，PS-2，……，PS-10，按5％的接种量分别接种于上述耐酸性培养基中，37℃静置培养72h，取发酵液进行菌量计数。

结果显示，所述10株乳酸杆菌发酵液中活菌量的对数值分别为7.41、8.15、6.81、8.51、7.07、7.31、6.27、6.92、7.55、5.45Log CFU/mL，其中PS-4菌株的菌量对数值最高，达8.51Log CFU/mL。从而说明，本发明筛选到的10株乳酸菌中PS-4菌株耐酸能力最强。

实施例2 PS-4菌株的鉴定

2.1菌落形态鉴定

将PS-4菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃培养48h。菌落形态如图1所示，PS-4菌株的单菌落呈乳白色，菌落直径在2mm左右，表面湿润，显微镜下呈短杆状，二端呈圆形，通常单独出现，呈短链状。

2.2生理生化特性鉴定

本实施例中接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量新鲜PS-4菌液，5000rpm/min离心5min，用PBS缓冲液洗2次，再用同体积PBS缓冲液重菌体后稀释50倍，作为接种液。

2.2.1盐度耐受性试验

在无菌条件下，向96孔板中分别加入190μL盐浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％的BSM液体培养基，每个盐浓度做3个平行，然后再加入10μL接种液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50μL高压灭菌过的石蜡油以防止培养过程中水分蒸发。置于37℃恒温培养，观察培养基是否变浑浊。

结果显示，本发明所述PS-4菌株在1％～5％盐浓度下均可生长，当盐浓度高于6％时不再生长，其最大耐受盐浓度为5％。

2.2.2过氧化氢酶实验

取新鲜菌液，滴一滴于干净的载玻片上，然后在其上滴加一滴3％过氧化氢溶液，观察到PS-4菌株不产生气泡，是阴性反应。

2.2.3碳源代谢试验

本实验中所用的基础培养基配方如下：

蛋白胨1.5g；酵母提取物0.6g；吐温80 0.1g；盐溶液0.5mL；酚红18mg；蒸馏水100mL；pH7.4±0.2。盐溶液成分：MgSO₄·7H₂O 11.5g，MnSO₄·4H₂O 2.8g，蒸馏水100mL。

配制10g/100mL的糖、醇和苷类碳水化合物溶液，并用0.22μm的无菌过滤器进行过滤。在无菌条件下，向96孔板中加入20μL除菌后的碳水化合物溶液，每种碳水化合物4个平行，然后加入170μL灭菌后含酚红的基础培养基，再加入10μL接种液，不接菌反应孔作为对照。每孔加入50μL液体石蜡以防止培养过程中水分蒸发。37℃厌氧培养，以酚红为指示剂，观察培养基颜色变化。具体结果见表1。

表1 PS-4菌株碳源代谢结果

纤维二糖

蜜二糖

棉子糖

甘露醇

苦杏仁苷

蔗糖

半乳糖

+

-

+

-

+

乳糖

麦芽糖

甘露糖

水杨苷

海藻糖

阿拉伯糖

葡萄糖酸钠

-

+

-

+

松三糖

核糖

山梨醇

木糖

鼠李糖

/

+

-

/

注：“+”阳性反应；“-”阴性反应。

2.3分子生物学鉴定

2.3.1 16s rDNA基因序列分析

1、基因组DNA提取

参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作。

2、16s rDNA基因扩增

1)引物序列:

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

2)反应体系(50μL)

表2. 16s rDNA PCR扩增体系

3)电泳验证PCR产物核酸电泳结果为1500bp左右时符合要求。

4)PCR产物测序

通过测序获得PS-4菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO:1。通过将SEQ ID NO:1在NCBI数据库中进行比对，可以初步确定PS-4菌株为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。基因序列如下：

gctcgctccctaaaagggttacgccaccggcttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggtctcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactagagtgcccaactaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacctgatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcgcttcctcggttaagccgagggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcacgccgacaacagttactctgccgaccattcttctccaacaacagagttttacgacccgaaagccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaacctctcagttcggctacgtatcatcgccttggtgagccattacctcaccaactagctaatacgccgcgggtccatccaaaagcgatagcttacgccatctttcagccaagaaccatgcggttcttggatctatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccacttaagggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccactcgttccatgttgaatctcggtgcaagcaccgatcatcaacgagaactcgttcgactgc。

2.3.2 Riboprinter指纹图谱

用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入Riboprinter系统中，样品经过DNA制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。鉴定结果显示，本发明所述PS-4菌株为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，其Riboprinter指纹图谱结果见图2。

2.3.3 RAPD和rep-PCR指纹图谱鉴定

1、RAPD指纹图谱鉴定

1)引物序列：M13(5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’)；

2)RAPD反应体系

表3 RAPD反应体系

3)电泳

制备1.5％的琼脂糖凝胶板，DL2000 DNA Marker作为结果对照，稳压100V电泳80min，最后利用凝胶成像系统检测电泳图。PS-4菌株的RAPD指纹图谱如图3所示。

2、rep-PCR指纹图谱

1)rep-PCR引物

CTACGGCAAGGCGACGCTGACG。

2)rep-PCR的反应体系

表4 rep-PCR的反应体系

3)电泳

DL2000 DNA Marker作为结果对照。电压100V，电泳时间80min检测扩增结果。PS-4菌株的的rep-PCR指纹图谱如图4所示。

综上，将PS-4菌株的菌落形态以及生理生化特性结果上传至网站http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.html，同时结合文献De Clerck E，etal.Systematic and applied microbiology,2004,27(1)50公布的结果，进行比对。综合分子生物学的鉴定结果，可以得出结论，PS-4菌株为一株新的副干酪乳杆菌，将其命名为副干酪乳杆菌VHProbi E12(Lactobacillus paracasei VHProbi E12)，已于2021年5月24日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2021587。

实施例3副干酪乳杆菌VHProbi E12的溶血性及抗生素耐受性实验

3.1溶血性实验

(1)接种液制备：将冷冻保存的副干酪乳杆菌VHProbi E12菌株划线接种于MRS琼脂培养基中，在温度37℃培养24～48h，再经MRS液体培养基传代培养1次后，以5％的接种量把副干酪乳杆菌VHProbi E12接种到新鲜的MRS液体培养基中37℃培养24～48h，获得新鲜的菌液，作为接种液；

(2)血细胞培养基准备：称取TBS基础培养基的各种组分，溶解，121℃高压灭菌15min，等培养基冷却到50℃的时候加入5％的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板；

(3)划线培养：将测试菌株划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养箱培养，24～48h观察测试菌是否有溶血现象。

结果显示：副干酪乳杆菌VHProbi E12不能生长，血细胞平板没有变化，从而说明本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12不产生溶血素，不能够溶解血细胞。

3.2抗生素耐受性实验

(1)抗生素配制：氨苄青霉素、红霉素、庆大霉素、链霉素、四环素均配制成2048μg/mL的贮存液，-20℃保存备用。使用时将贮存液用BSM液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为1～1024μg/mL共11个梯度；

(2)接种液制备：取适量新鲜菌液(24h，37℃培养)，5000rpm离心5min，用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬菌体后稀释50倍，作为接种液；

(3)微量肉汤稀释法测定抗生素对副干酪乳杆菌VHProbi E12的最小抑菌浓度MIC值

a.96孔板第1列次加入不含抗生素的MRS液体培养基，作为阴性对照，向第2～12列依次加入190μL含不同浓度抗生素的MRS液体培养基，然后分别接种10μL上述接种液，做3个平行孔，并以1个孔不加菌液作为空白；

b.加入50μL石蜡油覆盖防止水分蒸发；

c.将96孔板于37℃培养24h后取出，测定OD₆₀₀值，用24h的结果统计抗生素对菌株的MIC值，具体结果见表5。

表5副干酪乳杆菌VHProbi E12的抗生素MIC值

MIC单位μg/mL

从表5的结果可以看出，本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12对红霉素、氨苄青霉素、四环素等常见抗生素敏感，生物安全性良好。

实施例4副干酪乳杆菌VHProbi E12清除DPPH自由基能力的测定

4.1 PBS菌悬液制备

将生长状态优良的单菌落接种于3mL的MRS液体培养基中，37℃条件下培养24h，以此培养液为接种液，按照2％的接种量接种于50mL的MRS液体培养基中，静置培养24h，获得菌株的培养液。吸取1mL菌液收集菌体后用1mLPBS缓冲液洗涤菌体2遍后再加入2mL PBS溶液重悬菌体备用。

4.2菌株清除DPPH自由基能力的测定

取1mL待测菌株的PBS菌悬液，加入1mL 0.4mM的现配的DPPH自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度A样本，测3次平行。对照组样品以等体积PBS溶液和DPPH·乙醇混合液，并以等体积PBS菌悬液和乙醇混合液空白调零。

清除率按下列公式计算：清除率％＝[1-(A_样品-A_空白)/A_对照]×100％。

以副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)IMC-4菌株为对照菌，结果如表6所示。

表6 DPPH自由基清除率

从表6的数据可以看出，本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能有效清除DPPH自由基，清除率达到34.44％，显著高于对照菌副干酪乳杆菌(L.paracasei)IMC-4菌株。

实施例5副干酪乳杆菌VHProbi E12在促进细胞增殖中的应用

将副干酪乳杆菌VHProbi E12热灭活菌体按MOI(Multiplicity of Infection，感染复数)值为10及100的比例加入HaCat细胞中，并设置对照组，继续培养24h后，待检测的每个细胞培养孔中加入终浓度为0.3mg/ml的MTT溶液，放置37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育3h。小心弃掉上清，每孔加入500ul的DMSO，37℃下孵育30min，使紫色结晶充分溶解，酶标仪490nm下检测吸光度值。每组设3个平行样本检测。检测结果见图5。

细胞活力(％)＝(检测样品吸光度-空白吸光度)/(对照组吸光度-空白吸光度)×100。

从图5可知，与对照组相比，添加副干酪乳杆菌VHProbi E12热灭活菌体的两个益生菌处理组HaCat细胞的活力均得到显著提高。从而说明，本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12热灭活菌体能明显促进HaCat细胞的增殖(MOI:10，p<0.05；MOI:100，p<0.05)。

实施例6副干酪乳杆菌VHProbi E12在降低金黄色葡萄球菌感染细胞损伤中的应用

将HaCaT细胞原培养液更换为无抗性无血清DMEM培养液。实验设置对照组和益生菌处理组，其中：对照组每孔细胞中接种金黄色葡萄球菌菌液1μL；益生菌处理组每孔中接种金黄色葡萄球菌菌液1μL，同时按MOI值为10的比例加入副干酪乳杆菌VHProbi E12热灭活菌体。

将细胞培养板置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养16h；细胞培养上清液离心去杂质；按照乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(碧云天C0016)产品说明进行检测操作并计算细胞毒性或死亡率(％)。

从图6的结果可知，被金黄色葡萄球菌侵染的对照组HaCaT细胞死亡率高达55.7％，而同时加入副干酪乳杆菌VHProbi E12热灭活菌体的益生菌处理组HaCaT细胞的死亡率下降至37.0％(P<0.005)。从而说明，本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能大幅降低金黄色葡萄球菌侵染造成的细胞损伤，对细胞提供有力保护。

实施例7副干酪乳杆菌VHProbi E12在降低细胞光损伤中的应用

实验设置对照组、UVB损伤组、益生菌处理组，其中：

(1)对照组：细胞正常培养，不加益生菌，未经UVB照射；

(2)UVB损伤组：UVB紫外灯下进行光照，光剂量为60mJ/cm2；

(3)益生菌处理组：先将副干酪乳杆菌VHProbi E12灭活菌体按MOI值为100的比例加入HaCat细胞中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养3h；然后UVB紫外灯下进行光照，光剂量为60mJ/cm2；

照射结束后，将细胞置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养16h。

待检测的每个细胞培养孔中加入MTT溶液，终浓度为0.3mg/ml，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育3h。小心弃掉上清，每个24孔板细胞培养孔中加入500ul的DMSO，37℃下孵育30min，使紫色结晶充分溶解，酶标仪490nm下检测吸光度值。每组设3个平行样本检测。分别计算各组的细胞活力。

细胞活力(％)＝(检测样品吸光度-空白吸光度)/(对照组吸光度-空白吸光度)_╳100。

检测结果如图7所示，与对照组相比，UVB损伤组HaCat细胞的活力大幅下降，仅为49.1％，而经副干酪乳杆菌VHProbi E12灭活菌体预处理的益生菌处理组细胞活力高达72.6％(P<0.05)。从而说明，本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能有效降低紫外线UVB照射造成的皮肤细胞损伤。

实施例8副干酪乳杆菌VHProbi E12在降低细胞氧化损伤中的应用

实验设置对照组、过氧化氢损伤组、益生菌处理组。其中：

(1)对照组：细胞正常培养；

(2)过氧化氢损伤组：加入终浓度为0.5mM的过氧化氢溶液；

(3)益生菌处理组：先按MOI值为10的比例将副干酪乳杆菌VHProbi E12灭活菌体加入HaCat细胞中，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养3h，然后加入终浓度为0.5mM的过氧化氢溶液。

以上各组细胞均置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养1h。各组细胞弃掉原培养液，并使用PBS润洗两次，每孔再加入0.6mL的新鲜培养液。置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养16h。将待检测的每个细胞培养孔中加入终浓度为0.3mg/ml的MTT溶液，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育3h。小心弃掉上清，每个24孔板细胞培养孔中加入500ul的DMSO，37℃孵育30min，使紫色结晶充分溶解，酶标仪490nm下检测吸光度值。每组设3个平行样本检测。分别计算各组的细胞活力。

检测结果如图8所示，与对照组相比，过氧化氢损伤组HaCat细胞的活力大幅下降，仅为49.8％；而经过副干酪乳杆菌VHProbi E12灭活菌体预处理的益生菌处理组细胞活力达到59.4％，提高明显(P<0.005)。从而说明，本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能有效降低过氧化氢氧化造成的细胞损伤。

实施例9副干酪乳杆菌VHProbi E12在缓解皮肤过氧化氢氧化损伤中的应用

3D重建人体皮肤模型EpiSkin^TM购于上海斯安肤诺生物科技有限公司，是一种正常人类角质形成细胞在胶原基质上经过气液培养而成的体外重建人类表皮模型。该模型在组织结构上能够模拟正常人类表皮的分层结构，包含具有屏障功能的角质层。

EpiSkin^TM3D皮肤模型分为对照组、过氧化氢损伤组、益生菌处理组，其中：

(1)对照组：在皮肤模型表面上均匀涂抹无菌PBS；

(2)过氧化氢损伤组：在皮肤模型表面均匀涂抹终浓度为2mM的过氧化氢溶液；

(3)益生菌处理组：先在皮肤模型表面均匀涂抹副干酪乳杆菌VHProbi E12热灭活菌体，37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育3h后，再涂抹终浓度为2mM的过氧化氢溶液。

将各组皮肤模型置于37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育1h；然后使用无菌PBS缓冲液反复冲洗皮肤模型表面至少10次，擦干表面液体，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养72h后，对3D皮肤模型分别进行促炎症反应细胞因子和细胞活力检测，每组设3个平行样本进行检测：

1、细胞因子检测：

吸取下层培养液，使用ELISA方法对培养液中的IL-1α、IL-1β及IL-6进行测定。结果如图9所示。

2、皮肤细胞活力检测：

使用MTT法，即将3D皮肤组织在含有终浓度为0.3mg/mlMTT的检测培养基中孵育3h，使用打孔器将皮肤组织从支架中切割分离，置于1.5mlEP管中，加入1ml DMSO，在避光条件下将皮肤组织浸泡2h，并涡旋震荡，使紫色结晶充分溶解，酶标仪490nm下检测吸光度值。计算各组皮肤细胞的活力，如图10所示。

细胞活力％＝(检测样品吸光度-空白吸光度)/(对照组吸光度-空白吸光度)×100。

从图9的结果可知，与对照组相比，涂抹过氧化氢溶液后，皮肤模型对IL-1α、IL-1β和IL-8三种促炎症反应细胞因子的分泌水平均显著升高；而在涂抹过氧化氢溶液前，先经副干酪乳杆菌VHProbi E12灭活菌体预处理后的益生菌处理组皮肤模型对IL-1α、IL-1β及IL-8的分泌水平明显回落(p<0.005)。从而表明，本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12对过氧化氢氧化造成的皮肤损伤具有显著的抗炎和免疫调节作用。

从图10的结果可知，与对照组相比，涂抹过氧化氢溶液后，皮肤细胞活力大幅降低，仅有50.6％，而涂抹过氧化氢溶液前，先经副干酪乳杆菌VHProbi E12灭活菌体预处理后的益生菌处理组细胞的活力能达到57.2％(P<0.05)。从而说明，本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能有效缓解过氧化氢氧化对皮肤造成的损伤。

实施例10副干酪乳杆菌VHProbi E12在缓解TritonX-100造成的皮肤损伤中的应用

TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，是一种非离子表面活性剂，能破坏脂质双分子层，除去细胞的质膜和内膜系统，破坏分子间微弱结合键的大部分蛋白质抗原。0.1％的TritonX-100处理皮肤样本，会对皮肤细胞造成损伤，而损伤后的皮肤跨膜电阻值会显著下降。

EpiSkin^TM3D皮肤模型分为对照组、TritonX-100损伤组、益生菌处理组，其中：

(1)对照组：在皮肤模型表面上均匀涂抹无菌PBS；

(2)TritonX-100损伤组：在皮肤模型表面均匀涂抹0.1％的TritonX-100溶液；

(3)益生菌处理组：先在皮肤模型表面均匀涂抹副干酪乳杆菌VHProbi E12热灭活菌体，37℃，5％二氧化碳培养箱中孵育3h后，再涂抹0.1％的TritonX-100溶液；

将各组皮肤模型置于37℃、5％二氧化碳培养箱中孵育1h；然后使用无菌PBS缓冲液反复冲洗皮肤模型表面至少10次，擦干表面液体，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中继续培养24h后，分别检测皮肤模型的跨膜电阻值。每组设3个平行样本检测。

跨膜电阻值检测方法为：将EVOM2跨膜电阻仪的功能开关调至OHMs，连接电极，将电极放入预热至37℃的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中平衡20min。移除皮肤模型培养板中的培养基，加入预热的HBSS，上层每孔加0.5ml，下层每孔加1.5ml，37℃平衡20min，移除HBSS，重新加入37℃预热的HBSS，测定跨膜电阻值。用一个未接种皮肤细胞的空白载体重复上述步骤以获得空白值。计算各组皮肤模型的跨膜电阻值。

跨膜电阻值(TEER)＝(测定电阻值—空白值)*皮肤模型表面积(cm²)。

从图11的结果可知，与对照组相比，表面涂抹0.1％TritonX-100溶液的皮肤模型的跨膜电阻值大幅下降了61.4％，而经副干酪乳杆菌VHProbi E12灭活菌体预处理后的益生菌处理组皮肤模型的跨膜电阻值的下降程度有所缓解，仅比对照组降低了52.4％(P<0.05)。从而说明，本发明提供的副干酪乳杆菌VHProbi E12能有效降低TritonX-100对皮肤造成的损伤，效果非常显著。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株副干酪乳杆菌及其在缓解皮肤损伤中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1433

<212> DNA

<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)

<400> 1

gctcgctccc taaaagggtt acgccaccgg cttcgggtgt tacaaactct catggtgtga 60

cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta ttcaccgcgg cgtgctgatc cgcgattact 120

agcgattccg acttcgtgta ggcgagttgc agcctacagt ccgaactgag aatggcttta 180

agagattagc ttgacctcgc ggtctcgcaa ctcgttgtac catccattgt agcacgtgtg 240

tagcccaggt cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc 300

accggcagtc ttactagagt gcccaactaa atgctggcaa ctagtcataa gggttgcgct 360

cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg 420

tcattttgcc cccgaagggg aaacctgatc tctcaggtga tcaaaagatg tcaagacctg 480

gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 540

gtcaattcct ttgagtttca accttgcggt cgtactcccc aggcggaatg cttaatgcgt 600

tagctgcggc actgaagggc ggaaaccctc caacacctag cattcatcgt ttacggcatg 660

gactaccagg gtatctaatc ctgttcgcta cccatgcttt cgagcctcag cgtcagttac 720

agaccagaca gccgccttcg ccactggtgt tcttccatat atctacgcat ttcaccgcta 780

cacatggagt tccactgtcc tcttctgcac tcaagtttcc cagtttccga tgcgcttcct 840

cggttaagcc gagggctttc acatcagact taaaaaaccg cctgcgctcg ctttacgccc 900

aataaatccg gataacgctt gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc 960

cgtggctttc tggttggata ccgtcacgcc gacaacagtt actctgccga ccattcttct 1020

ccaacaacag agttttacga cccgaaagcc ttcttcactc acgcggcgtt gctccatcag 1080

acttgcgtcc attgtggaag attccctact gctgcctccc gtaggagttt gggccgtgtc 1140

tcagtcccaa tgtggccgat caacctctca gttcggctac gtatcatcgc cttggtgagc 1200

cattacctca ccaactagct aatacgccgc gggtccatcc aaaagcgata gcttacgcca 1260

tctttcagcc aagaaccatg cggttcttgg atctatgcgg tattagcatc tgtttccaaa 1320

tgttatcccc cacttaaggg caggttaccc acgtgttact cacccgtccg ccactcgttc 1380

catgttgaat ctcggtgcaa gcaccgatca tcaacgagaa ctcgttcgac tgc 1433

Claims

1.一种副干酪乳杆菌，其特征在于，所述副干酪乳杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2021587。

2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌在制备用于预防或缓解皮肤损伤的制品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为化妆品。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为药品。

5.一种具有防晒或抗衰老功效的化妆品，其特征在于，所述的化妆品包含有权利要求1所述的副干酪乳杆菌和/或权利要求1所述副干酪乳杆菌的发酵产物。

6.一种用于缓解皮肤损伤的药品，其特征在于，所述的药品包含有权利要求1所述的副干酪乳杆菌和/或权利要求1所述副干酪乳杆菌的发酵产物。