KR102640916B1 - 리기락토바실러스 루미니스 속 lmt16-11의 균주, 그 배양액, 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents
리기락토바실러스 루미니스 속 lmt16-11의 균주, 그 배양액, 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 리기락토바실러스 루미니스 속 LMT16-11의 균주, 그 배양액, 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관해 개시되어 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 항산화 또는 광노화 억제용 화장료 조성물은 기탁번호가 KCTC 14631BP 인 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 (Ligilactobacillus ruminis LMT16-11) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 상기 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
Description
본 발명은 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 리기락토바실러스 루미니스 속 균주, 그 배양액, 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
화장품 분야에서는 유산균 배양액이 1955년 상품화된 이후 현재까지 사용되고 있는데 주로 스트랩토코커스 (Streptococcus) 속, 락토바실러스 (Lactobacillus) 속, 락토코커스 (Lactococcus) 속, 류코노스톡 (Leuconostoc) 속, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 속 등을 이용하여 직접 배양액에 발효하여 여과하거나 추출하는 등의 원료 형태 및 활성 소재에 접종하여 발효한 후 여과하거나 추출하는 등의 연구가 활발하게 이루어지고 있다.
그 중에서도 락토바실러스 (Lactobacillus) 속을 이용하여 다양한 용도에 적용되고 있는 기술로는, 대한민국 등록특허공보 제10-1846796호「한국형 유산균으로 발효하여 얻은 유청을 포함하는 탄력 개선 또는 보습용 화장품」, 대한민국 등록특허공보 제10-1492003호「피부 주름 개선 및 보습 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 플란타룸 HY7714 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품」 및 대한민국 등록특허공보 제10-1998067호 「비피도박테리움 속 GFC-B09 및 이를 이용하여 제조된 발효물」등이 개시되어 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 상기 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 항산화 또는 광노화 억제용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 상기 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 육모, 발모, 양모, 및 탈모방지용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 기탁번호가 KCTC 14631BP 인 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 (Ligilactobacillus ruminis LMT16-11) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 상기 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 항산화 또는 광노화 억제용 화장료 조성물이 제공된다.
상기 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주는 전체 화장료 조성물에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 함유될 수 있다.
상기 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주는 Nrf2, AP-1, 및 Thioredoxin을 증가시킴으로써 항산화 활성을 나타낼 수 있다.
상기 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주는 세포 내 활성산소의 생성을 억제함으로써 항산화 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 기탁번호가 KCTC 14631BP 인 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 (Ligilactobacillus ruminis LMT16-11) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 상기 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 육모, 발모, 양모, 및 탈모방지용 화장료 조성물이 제공된다.
본 명세서에서 용어 "배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 리기락토바실러스 루미니스 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 상기 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다.
한편, 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의 균주 자체를 의미하는 것으로 피부 샘플 등으로부터 분리하여 선별한 균주 자체 또는 상기 균주를 배양하여 배양액으로부터 분리한 균주를 포함한다. 상기 균체는 배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해 배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다. 상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액으로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
상기 배양액은 리기락토바실러스 루미니스 균주를 배지를 MRS 배지에서 15℃ 내지 45℃ 에서 배양하여 수득된 것일 수 있다.
일 실시예에서, 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리나 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
다른 실시예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
상기 리기락토바실러스 루미니스 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "파쇄액"은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액으로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 균주, 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물의 용도를 제공한다. 상세하게는, 리기락토바실러스 루미니스 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 그의 배양액의 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 균주의 용도는 항산화, 광노화 억제, 육모, 발모, 양모, 및 탈모방지 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 항산화 활성은 ROS 억제 효과 및 항산화 인자인 Nrf2, AP-1 및 Thioredoxin 발현을 촉진함으로써 확인할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 광노화 억제 효과는 UVA 또는 UVB로부터 유도되는 ROS 의 발현을 억제하는 효능을 확인함으로써 알 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 육모, 발모, 양모, 및 탈모방지 효과는 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 이 모유두세포(Human dermal papilla cell)를 증식시키고, 모발성장 인자인 Vascular endothelial growth factor (VEGF), basic Fibroblast growth factor (bFGF), β-catenin 의 발현량이 증가함으로써 제공될 수 있다. 또한, 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 로 비듬균 (Malassezia furfur ATCC 14521) 생장을 억제함으로써 제공될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 인체에 해가 없으며, 그 첨가로 인해 화장품의 품질을 손상하지 아니하므로 화장료 조성물에 포함되어 사용되는데 적합하다. 특히, 본 발명의 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주 및 이로부터 파생되는 파쇄액, 배양액, 상기 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물은 세포독성이 없고, 산화질소의 생성을 직접적으로 억제하여 항산화 또는 광노화 억제에 효과가 있으며, 모유두세포의 증식 및 모발성장 인자의 발현을 촉진하고 비듬균 생장을 억제함으로써 육모, 발모, 및 탈모방지 효과가 있으므로, 기능성 화장료 조성물에 포함되어 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 마스크팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클린져, 샴푸, 린스, 컨디셔너, 헤어미스트, 헤어팩, 및 헤어에센스에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면, 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트계, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콘, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 마타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11, 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 상기 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물은 구체적으로는 건조 중량으로, 화장료 조성물 총 중량의 0.0001 중량% 내지 50 중량% 로 포함될 수 있으며, 상세하게는 0.0003 중량% 내지 40 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서 항산화, 광노화 억제, 육모, 발모, 양모, 및 탈모방지에 대한 우수한 효능을 나타내는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 리기락토바실러스 루미니스 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 상기 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하여 세포 내 활성산소의 생성함으로써 항산화 활성을 나타내거나 광노화를 억제하는 화장료 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 세포 내에서 Nrf2, AP-1, 및 Thioredoxin을 증가시킴으로써 항산화 활성을 나타내거나 광노화를 억제할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 리기락토바실러스 루미니스 균주가 모유두세포를 증식시켜 두피 상의 모발 수를 증가시키고, 모발성장 인자를 활성화시켜 모발을 성장시킴으로써 육모, 발모, 양모, 및 탈모방지용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 선발된 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주의 대표적 광학현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물의 항산화 효능을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 항산화 인자 유전자 발현량을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 UVA에 대한 광노화 억제 효과를 나타나는 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 UVB에 대한 광노화 억제 효과를 나타나는 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 모유두세포 (Human dermal papilla cell)의 증식 효과를 나타나는 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 모발성장 인자의 활성 효과를 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 비듬균 생장 억제 효과를 나타내는 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물의 항산화 효능을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 항산화 인자 유전자 발현량을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 UVA에 대한 광노화 억제 효과를 나타나는 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 UVB에 대한 광노화 억제 효과를 나타나는 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 모유두세포 (Human dermal papilla cell)의 증식 효과를 나타나는 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 모발성장 인자의 활성 효과를 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주 LMT16-11를 포함하는 화장료 조성물의 비듬균 생장 억제 효과를 나타내는 것이다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명하기로 한다.
이하에서 설명할 본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 명확하게 설명하기 위하여 제공되는 것이고, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있다.
본원 명세서에서 사용되는 "약", "실질적으로" 등의 정도의 용어는 고유한 제조 및 물질 허용 오차를 감안하여, 그 수치나 정도의 범주 또는 이에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 제공된 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 리기락토바실러스 루미니스 균주의 분리 및 동정
1.
리기락토바실러스 루미니스(
Ligilactobacillus ruminis
) 균주의 분리
성인 남성 분변으로부터 리기락토바실러스 루미니스 균주를 분리하였다. 먼저, 시료를 MRS 배지 (Difco Co., USA)에 도말하여 30℃에서 혐기 배양하였다. 시료의 전처리 방법은 무균적으로 샘플을 취하여 0.85% NaCl 용액 180 mL로 희석하고, 스토마쳐 (stomacher)로 5분간 균질화하였다. 이 후 0.85% NaCl 용액 9 ml이 담긴 튜브를 멸균하여 준비하고 준비된 튜브에 단계적으로 희석하여 샘플을 준비하였다. 이 후 MRS 평판 배지에 도말하여 37℃에서 2 내지 3일간 배양하였고, 나타난 콜로니들을 형태 및 색깔별로 구별하여 다시 순수 분리하였다. 이 후 균주들의 16s rRNA 유전자 염기서열을 시퀀싱 (sequencing)으로 해독하였다.
2.
리기락토바실러스 루미니스 균주의 동정
(1) 형태학적 특성 분석
선발된 리기락토바실러스 루미니스 균주를 MRS 평판 배지 (Difco, USA)에서 배양하고 콜로니의 형태를 관찰하였다. 선발한 리기락토바실러스 루미니스 균주의 MRS 평판 배지에서 콜로니 형태는 하기 표 1에 나타내었다.
| LMT16-11 | |
| 형태 | 원형 |
| 크기 | 1.0-1.5 mm |
| 색 | 크림색 |
| 불투명도 | 불투명 |
| 융기 | 볼록 |
| 표면 | 거친표면 |
| 호기적 생장 | - |
| 혐기적 생장 | + |
도 1은 선발된 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주의 대표적 광학현미경 사진을 나타낸 것이다. 본 발명에 사용된 박테리아는 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 로, 대한민국 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁번호 KCTC14631BP로 2021.06.30 자에 기탁되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주는 막대형 간균으로서 전형적인 리기락토바실러스 속의 성상과 유사하였다.
(2) 16S rDNA 분석
분리된 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주의 16S rRNA 유전자를 증폭하고, 증폭된 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 상기 증폭은 LMT16-11 균주 게놈 DNA를 주형으로 하고, (주) 바이오닉스의 올리고뉴클레오티드들을 프라이머 세트로 한 PCR을 수행하여 이루어졌다. 분리된 LMT16-11 균주의 16S rDNA 뉴클레이오티드 서열을 EZBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/)를 사용하여 공지된 16S rDNA의 뉴클레오티드 서열과 비교하였다. 그 결과, 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11의 16S rDNA는 리기락토바실러스 루미니스(Ligilactobacillus ruminis) 종과 서열 동일성이 99.93% 이었다. 또한, 계통수 분석 결과, 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11은 리기락토바실러스 루미니스 종과 같았다. 그 결과, 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주는 리기락토바실러스 루미니스 종에 속하는 새로운 균주로 확인되었다.
본 발명자들은 LMT16-11 유산균을 “리기락토바실러스 루미니스 (Ligilactobacillus ruminis) LMT16-11”(수탁번호 KCTC 14631BP)로 명명하고 이를 한국생명공학연구원 소재 한국세포주은행 (Korea Collection for Type Cultures, KCTC)에 2021년 6월 30일자로 기탁하였다.
실시예 2. 리기락토바실러스 루미니스 균주 및 균주배양액의 제조
리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주를 배양하기 위해, 식물성 배지 성분을 포함하는 배지를 사용하였다. 2% yeast extract와 2% dextrose를 증류수에 녹인 후, 121℃에서 15분 동안 멸균하여 배지를 준비하였다. 멸균한 배지에 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 군주의 single colony를 접종하여 30℃ 혐기 챔버에서 24시간 동안 정치배양 하였다. 24시간이 지나면 배양액에서 1% volume의 균 배양액을 main culture용의 새로운 배지에 접종하여, 30℃ 혐기 챔버에서 20시간 정치배양 하였다. 배양이 종료되면 배양액의 박테리아를 제거하기 위하여 centrifugation (13,000 G/30 min)을 실시하였다. 배양액의 상층액을 회수한 후 잔존할 수 있는 박테리아를 모두 제거하기 위하여 0.22 μm filter를 이용하여 균을 완전히 제거하였다. 이후, 제균한 배양액 시료를 121℃에서 15분 동안 추가 멸균을 실시하였으며, 배양액 시료를 20 내지 40 배 농축하여 효능평가를 진행하였다.
실시예 3. 리기락토바실러스 루미니스 균주의 항산화 효과
3-1. ROS 억제 효능
HDFn (Human dermal fibroblast, neonatal) 세포에 H2O2를 인위적으로 처리한 후 형광물질을 통해 ROS 억제 효능을 평가하였다. Black 96-well plate에 HDFn 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후 새로운 배지로 교체해주고, 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액을 농도 별로 투여하여 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 식염수로 세척하고 H2O2와 DCFH-DA를 처리하여 37℃에서 30분 동안 방치한 후 485 nm에서 흡수파장, 538 nm에서 방출파장을 측정하였다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물의 항산화 효능을 확인한 결과이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액 농도 2% (v/v)를 포함하는 화장료 조성물은 25.0%의 항산화 효능을 확인하였다.
3-2. 항산화 인자 활성화 효과
HDP (Human dermal papilla) 세포에 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액을 처리하여 항산화 유전자 발현량 변화를 확인하였다. 96-well plate에 HDP 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. Overnight 한 다음 새로운 배지로 교환해주고 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액을 투여하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS로 충분히 세척하여 cDNA를 합성하고 100 ng/μL 씩 정량 하여 Real-time PCR을 진행하였다. 상대적인 발현율은 Housekeeping gene (β-actin)으로 Normalization하였다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주를 포함하는 화장료 조성물의 항산화 인자 유전자 발현량을 확인한 결과이다. 도 3에서 나타난 바와 같이, 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액 농도 2% (v/v)를 포함하는 화장료 조성물은 항산화 인자인 Nrf2, AP-1 및 Thioredoxin을 각각 2.5배, 1.4배 및 2.7배 증가시키는 효능을 보이는 것을 확인할 수 있다.
실시예 4. 광노화 억제 효과
4-1. 광노화(UVA) 억제 효과
HDFn (Human dermal fibroblast, neonatal) 세포에 UVA를 인위적으로 처리한 후 형광물질을 통해 ROS 억제 효능을 평가하였다. 48-well plate에 HDFn 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후 새로운 배지로 교체해주고, 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액을 농도 별로 투여하여 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 식염수로 세척하고 DCFH-DA를 처리하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 1시간 후 식염수로 세척한 다음 식염수를 well 당 100 μL씩 분주하여 UVA를 조사한 다음 485 nm에서 흡수파장, 538 nm에서 방출파장을 측정하였다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주를 포함하는 화장료 조성물의 UVA에 대한 광노화 억제 효과를 나타나는 것이다. 도 4에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 배양액 농도 2% (v/v)에서 배양된 리기락토바실러스 루미니스 균주가 포함된 화장료 조성물은 UVA에 의해 유도되는 ROS 를 20.2% 억제함을 확인할 수 있다.
4-2. 광노화(UVB) 억제 효과
HDFn (Human dermal fibroblast, neonatal) 세포에 UVB를 인위적으로 처리한 후 형광물질을 통해 ROS 억제 효능을 평가하였다. 48-well plate에 HDFn 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후 새로운 배지로 교체해주고, 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액을 농도 별로 투여하여 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 식염수로 세척하고 DCFH-DA를 처리하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 1시간 후 식염수로 세척한 다음 식염수를 well 당 100 μL씩 분주하여 UVB를 조사한 다음 485 nm에서 흡수파장, 538 nm에서 방출파장을 측정하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주를 포함하는 화장료 조성물의 UVB에 대한 광노화 억제 효과를 나타나는 것이다. 도 5에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 배양액 농도 2% (v/v)에서 배양된 리기락토바실러스 루미니스 균주가 포함된 화장료 조성물은 UVB 에 의해 유도된 ROS를 45.8% 억제하는 효능을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 육모, 발모, 양모, 및 탈모방지효과
5-1. 모유두세포 증식 효과(Human dermal papilla cell proliferation)
HDP (Human dermal papilla) 세포에 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액을 처리하여 HDP 세포 증식 효과를 확인하였다. 96-well plate에 HDP 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액을 농도 별로 투여하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 Cell counting kit-8 (CCK-8) 시약을 배지 내에 0.5% 함유되도록 처리한 다음 3시간 뒤 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주를 포함하는 화장료 조성물의 모유두세포 (Human dermal papilla cell)의 증식 효과를 나타나는 것이다. 도 6에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 배양액 농도 2% (v/v)에서 배양된 리기락토바실러스 루미니스 균주가 포함된 화장료 조성물은 약 36% 모유두세포를 증식시키는 것을 확인할 수 있었다.
5-2. 모발성장 인자 활성 효과
HDP (Human dermal papilla) 세포에 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액을 처리하여 모발성장 유전자 발현량 변화를 확인하였다 96-well plate에 HDP 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. Overnight 한 다음 새로운 배지로 교환해주고 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액을 투여하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS로 충분히 세척하여 cDNA를 합성하고 100 ng/μL씩 정량 하여 Real-time PCR을 진행하였다. 상대적인 발현율은 Housekeeping gene (β-actin)으로 Normalization하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주를 포함하는 화장료 조성물의 모발성장 인자의 활성 효과를 나타내는 것이다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 배양액 농도 2% (v/v)에서 배양된 리기락토바실러스 루미니스 균주를 포함하는 화장료 조성물은 모발성장 인자인 VEGF, bFGF 및 β-catenin을 각각 4.1배, 2.1배 및 1.9배 증가시키는 효능을 보였다.
5-3. 비듬균 생장 억제 효과(Anti-dandruff)
최소저해생육농도 시험법 (Minimum inhibition concentration assay)을 이용하여 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액의 비듬균 (Malassezia furfur ATCC 14521) 생장 억제 효능을 확인하였다. 본 시험에서 말라세지아 푸르푸르 (Malassezia furfur ATCC 14521) 균주를 이용하였으며, 최소 2차 계대배양된 균주를 배양배지에 활성화시켜 사용하였다. 활성화시킨 균주를 96-well plate에 well 당 105~6 CFU/mL이 되도록 분주한 다음, 리기락토바실러스 루미니스 균주 배양액을 농도 별로 처리하였다. 양성대조군으로 Ketoconazole을 사용하였다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 리기락토바실러스 루미니스 균주를 포함하는 화장료 조성물의 비듬균 생장 억제 효과를 나타내는 것이다. 도 8에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 배양액 농도 10% (v/v)에서 배양된 리기락토바실러스 루미니스 균주를 포함하는 화장료 조성물은 비듬균의 생장을 97.6% 억제하는 효과를 나타내었다.
본 명세서에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 개시하였으며, 비록 특정 용어들이 사용되었으나, 이는 단지 본 발명의 기술 내용을 쉽게 설명하고 발명의 이해를 돕기 위한 일반적인 의미에서 사용된 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시예 외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형예들이 실시 가능하다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명의 기술적 사상이 벗어나지 않는 범위 내에서, 다양하게 치환, 변경 및 변형될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 때문에 발명의 범위는 설명된 실시예에 의하여 정하여 질 것이 아니고 특허 청구범위에 기재된 기술적 사상에 의해 정하여져야 한다.
Claims (9)
- 삭제
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- 기탁번호가 KCTC 14631BP 인 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 (Ligilactobacillus ruminis LMT16-11) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 상기 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 육모, 발모, 양모, 및 탈모방지용 화장료 조성물.
- 제 5 항에 있어서,
상기 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주는 전체 화장료 조성물에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 육모, 발모, 양모 및 탈모방지용 화장료 조성물. - 제 5 항에 있어서,
상기 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주는 모유두세포를 증식시킴으로써 두피 상의 모발의 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 육모, 발모, 양모, 및 탈모방지용 화장료 조성물. - 제 5 항에 있어서,
상기 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주는 모발성장 인자를 활성화시킴으로써 모발을 성장시키는 것을 특징으로 하는 육모, 발모, 양모, 및 탈모방지용 화장료 조성물. - 제 5 항에 있어서,
상기 리기락토바실러스 루미니스 LMT16-11 균주는 비듬균의 생장을 억제시킴으로써 탈모를 방지하는 것을 특징으로 하는 육모, 발모, 양모, 및 탈모방지용 화장료 조성물.
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| KR102394638B1 (ko) | 2015-09-30 | 2022-05-09 | (주)아모레퍼시픽 | 유산균 유래의 세포외 소낭을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 조성물 |
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