CN115087428A - 包括植物乳杆菌乳酸菌死菌体或乳酸菌的培养物的用于防止或改善皮肤老化的化妆品组成物 - Google Patents
包括植物乳杆菌乳酸菌死菌体或乳酸菌的培养物的用于防止或改善皮肤老化的化妆品组成物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种改善皮肤老化的化妆品组成物，其包括从由从泡菜分离的植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)、从德式泡菜分离的植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)构成的群中选择的一种以上的乳酸菌的培养物，还可包括这些乳酸菌的一种以上的死菌体。根据本发明的改善皮肤老化的化妆品组成物，利用亲肤、安全且能提高皮肤机能的天然乳酸菌及乳酸菌培养物，通过抗氧化、缓和炎症、增进保湿、改善肤色、改善弹力及皱纹可促进皮肤老化改善效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)乳酸菌死菌体或乳酸菌的培养物的用于防止或改善皮肤老化的化妆品组成物。
背景技术
植物性乳酸菌是从诸如腌制类、泡菜等植物原料的发酵食品中分离出的乳酸菌，与动物性乳酸菌相比种类多，对外部环境的适应性优越。尤其，从泡菜分离的植物性乳酸菌在贫瘠的环境下培育，因此以各种生理活性物质的生产力优越而广为人知。据此，利用从泡菜分离的乳酸菌、其死菌体、培养物的化妆品原料开发正在活跃地进行。
泡菜是借助乳酸菌发酵的食品，从泡菜中分离的乳酸菌有肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、葡聚糖明串珠菌(Leuconostoc dextranicum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)等。
这些菌中，关于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的现有技术有，包括从泡菜分离的植物乳杆菌nF1菌株(保藏编号NITE P-1462)的死菌体的皮肤皱纹改善用化妆品组成物(韩国公开专利第2019-0002836号)、从泡菜分离的植物乳杆菌WiKim0060(Lactobacillus plantarum WiKim0060)及包括其的皮肤美白及保湿改善用组成物(韩国公开专利第2019-0055552号)、包括去除了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CJLP133菌株的菌体的培养物的皮肤皱纹改善用化妆品组成物(韩国公开专利第2019-0056176号)及皮肤抗菌用组成物(韩国公开专利第2019-0056176号)等。但是，这些先行技术仅涉及皮肤老化现象的改善皱纹、改善美白、改善保湿等一两个功效，未提供通过抗氧化、缓和炎症、增进保湿、改善肤色、改善弹力及皱纹来对皮肤老化现象进行全面的改善的效果。
现在，消费者对于化妆品不满足于片面的功能，而要求综合提供复合性的老化现象防止或改善效果，即抗氧化、抗炎症、增进保湿、改善皱纹、改善美白等功能的多重功能性化妆品。由此，需要通过对皮肤安全的乳酸菌原料的开发来提供符合消费者的要求的多重功能性化妆品。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种用于防止或改善老化的化妆品组成物，利用亲肤、安全且能提高皮肤机能的天然原料，通过抗氧化、缓和炎症、增进保湿、改善肤色、改善弹力及皱纹来表现皮肤改善效果，据此可满足想要看起来更年轻的欲求。
本发明的发明者发现，从泡菜分离的植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)、从由洋白菜制作的德式泡菜分离的植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)的培养物和这些菌的死菌体作为亲肤、安全且能提高皮肤机能的天然由来原料，通过抗氧化、抗炎、增进保湿、改善肤色、改善弹力及皱纹来促进防止及改善皮肤老化，从而完成了本发明。
因此，用于达成所述目的的本发明的技术性手段如下。
1.一种用于防止或改善老化的化妆品组成物，包括从由植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)、植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)构成的群中选择的乳酸菌的一种以上的培养物。
2.根据1的用于防止或改善老化的化妆品组成物，还包括从由植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)、植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)构成的群中选择的乳酸菌的一种以上的死菌体。
3.根据1或2的用于防止或改善老化的化妆品组成物，植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)从泡菜中分离。
4.根据1或2所述的用于防止或改善老化的化妆品组成物，植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)分别从由洋白菜或球芽甘蓝制作的德式泡菜中分离。
5.根据1的用于防止或改善老化的化妆品组成物，乳酸菌的培养物是，在乳酸菌培养用培养基中培养乳酸菌，进行离心分离后对获得的上等液进行冻结干燥而成。
6.根据1的用于防止或改善老化的化妆品组成物，乳酸菌的死菌体是，在乳酸菌培养用培养基中培养乳酸菌，进行离心分离后对沉淀的细胞进行热处理而获得。
根据本发明，提供了用于防止或改善老化的化妆品组成物，包括从由植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)、植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)构成的群中选择的乳酸菌的一种以上的培养物，还可包括乳酸菌的一种以上的死菌体。
本发明可表现如下效果，利用亲肤、安全且能提高皮肤机能的天然由来乳酸菌及利用这些乳酸菌的培养物，通过抗氧化、缓和炎症、增进保湿、改善肤色、改善弹力及皱纹来促进防止及改善皮肤老化，从而看起来更年轻。
附图说明
图1a示出对本发明实施例7的组成物在Hs68细胞中的细胞毒性确认结果，图1b示出MMP表达抑制能确认结果。
图2a示出对本发明实施例7的组成物在B16F10细胞中的细胞毒性(细胞生存率)测量结果，图2b示出在B16F10细胞中的黑色素生成量(黑色素含量)。
图3a示出对本发明实施例7的组成物在HaCaT细胞中的细胞毒性(细胞生存率)确认结果，图3b示出在HaCaT细胞中的HAS-2表达度。
图4a示出对本发明实施例7的组成物在RAW264.7细胞中的细胞毒性(细胞生存率)确认结果，图4b示出在RAW264.7细胞中的NO生成抑制能，图4c示出在RAW264.7细胞中的iNOS表达抑制能确认结果。
图5示出根据本发明实施例21及比较例5的乳霜化妆品的皮肤保湿力评价结果。
具体实施方式
本发明涉及一种用于防止或改善老化的化妆品组成物，包括从由植物乳杆菌Wikim125(Lactobacillus plantarum Wikim125，保藏编号：BP1910798)、植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)构成的群中选择的乳酸菌的一种以上的培养物。
本发明中，植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)可以从泡菜中分离，植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)可分别从德式泡菜，例如由洋白菜或球芽甘蓝制作的德式泡菜中分离。
本发明中，乳酸菌的培养物可以是将从由植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798、植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)构成的群中选择的乳酸菌分别在乳酸菌培养用培养基，例如MRS琼脂培养基中培养后，进行离心分离并对获得的上等液进行干燥而获得。
根据本发明的用于防止或改善老化的化妆品组成物，还可包括从由植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)、植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)构成的群中选择的乳酸菌的一种以上的死菌体。
本发明中，乳酸菌的死菌体可通过本发明领域内周知的方法获得，例如，在乳酸菌培养用培养基,即MRS琼脂培养基中培养乳酸菌，进行离心分离后对沉淀的细胞进行热处理而获得。
根据本发明的用于防止或改善老化的化妆品组成物，根据需要还可包括化妆品组成物中通常使用的追加成分，例如从由pH调节剂、表面活性剂、油脂类、乙醇类、保湿剂、杀菌保存剂、螯合剂、香料、色素、紫外线吸收剂、紫外线散射剂及抗氧化剂构成的群中选择的1种以上的成分，但不限定于此，这些追加成分的具体种类及使用量在本发明领域内是众所周知的。
根据本发明的用于防止或改善老化的化妆品组成物的剂型不限定于特别的形态，例如可提供为柔软化妆水、收敛化妆水、营养化妆水、眼霜、营养霜、按摩霜、洁面霜、洁面泡沫、卸妆水、散粉、浓缩精华、精华露、BB霜、防晒霜、面膜、润唇膏等形态。此外，就各剂型而言，根据本发明的用于防止或改善老化的化妆品组成物没有特别的限定，根据目的本发明领域的一般的技术人员可容易地选择来调配。
实施例
以下，借助实施例对本发明进行更详细地说明。但是下面的实施例仅仅用于例示本发明，本发明不限定于这些实施例的范围。
制造例1：制造乳酸菌死菌体
将从泡菜分离的植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)、从用济州产球芽甘蓝制作的德式泡菜分离的植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)、从用济州产洋白菜制作的德式泡菜分离的植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)分别在MRS琼脂(agar)培养基中在30℃下培养24小时，离心分离后，将沉淀的细胞在80℃下进行热处理60分钟，从而获得乳酸菌死菌体。
[表1]
乳酸菌死菌体制造实施例
| 区分 | 乳酸菌培养物 |
| 实施例1(死菌体1) | 植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)死菌体 |
| 实施例2(死菌体2) | 植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)死菌体 |
| 实施例3(死菌体3) | 植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)死菌体 |
制造例2：制造乳酸菌培养物
将从泡菜分离的植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)、从用济州产球芽甘蓝制作的德式泡菜分离的植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)、从用济州产洋白菜制作的德式泡菜分离的植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)分别在MRS琼脂培养基中在30℃下培养24小时，离心分离后将获得的上等液冻结干燥，从而获得了乳酸菌培养物。
[表2]
乳酸菌培养物制造实施例
| 区分 | 乳酸菌培养物 |
| 实施例4(培养物1) | 植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)培养物 |
| 实施例5(培养物2) | 植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)培养物 |
| 实施例6(培养物3) | 植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)培养物 |
制造例3：制造乳酸菌死菌体和培养物的混合组成物
将在制造例1及2中制造的乳酸菌死菌体和培养物按照下面[表3]示出的组成(重量比)混合，从而制造混合组成物。
[表3]
混合组成物的组成
实验例1：体外(in-vitro)有效性评价
为了对在制造例1至3制造的乳酸菌死菌体、乳酸菌培养物及乳酸菌死菌体和培养物的混合组成物分别进行关于改善皮肤老化的综合性有效性验证，进行了抗氧化(活性氧(ABTs)清除能力)、抗炎(NO抑制力)、抗炎及增进保湿(透明质酸酶抑制力)、美白(酪氨酸酶抑制力)及改善弹力(胶原酶抑制力)评价。乳酸菌死菌体及培养物的混合组成物即实施例1和2的情况，所有项目中评价结果优秀，从而确认了对改善皮肤老化有用。实验程序及评价结果如下。
实验例1-1：抗氧化效果(活性氧(ABTs)清除能力)评价
抗氧化活性测量的一环，即ABTS+[2,2'-Azino-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)]自由基清除活性，可对供氢抗氧化剂(hydrogen-donatingantioxidants)和连锁中断型抗氧化剂(chainbreaking antioxidants)均进行测量，是可适用于水相(aqueous phase)和有机相(organic phase)的测量法。
本发明中，将2.45mM过硫酸钾(potassium persulfate)以1:1(v/v)的比例混合于7mM ABTS溶液，将在暗处反应约24小时而形成的ABTS自由基溶液与试验用品混合，使其在暗处反应10分钟后，在734nm测量吸光度。利用下面的公式来计算ABTS自由基清除能(％)，表示在[表4]。
ABTs自由基清除能(％)＝(试验群的吸光度/无处理群的吸光度)×100
[表4]
抗氧化效果(活性氧(ABTs)清除能力)评价结果
| 试验用品 | 试验浓度 | 活性氧(ABTs)清除能(％) |
| 实施例1 | 50mg/mL | 98.69 |
| 实施例2 | 50mg/mL | 99.42 |
| 实施例3 | 50mg/mL | 97.08 |
| 实施例4 | 1mg/mL | 36.37 |
| 实施例5 | 1mg/mL | 52.02 |
| 实施例6 | 1mg/mL | 41.05 |
| 实施例7 | 1mg/mL | 55.29 |
| 实施例8 | 1mg/mL | 51.00 |
| 实施例9 | 1mg/mL | 42.53 |
| 实施例10 | 1mg/mL | 45.68 |
| 实施例12 | 1mg/mL | 47.81 |
| 实施例13 | 1mg/mL | 39.30 |
此外，确认了针对实施例4至6(培养物1至3)，ABTS自由基的活性抑制了50％的最小抑制浓度(IC50，mg/ml)。如下面[表5]至[表7]所示，分别在1.47mg/ml、0.96mg/ml、1.35mg/ml的低浓度下也表现了优秀的ABTS自由基清除效果。
[表5]
培养物1的各浓度抗氧化效果评价结果
[表6]
培养物2的各浓度抗氧化效果评价结果
[表7]
培养物3的各浓度抗氧化效果评价结果
实验例1-2：抗炎效果(NO抑制力)评价
哺乳类如果受到炎症性刺激，则借助巨噬细胞合成NO(nitric oxide，一氧化氮)，这是扩张血管并抑制炎症的神经传递物质。
因此，想要确认抑制NO自由基的效果，将试验用品和10mM亚硝基铁氰化钠二水合物混合，使其在25℃反应150分钟，按照每0.5mL分株后放入1％磺胺1mL并在室温下反应10分钟，然后混合2mL 0.1％N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐，在室温进行30分钟反应后，在540nm测量吸光度。从而利用下面的公式计算NO自由基清除能(％)，其结果在[表8]表示。
NO自由基清除能(％)＝(试验群的吸光度/无处理群的吸光度)×100
[表8]
抗炎症效果(NO生成抑制率)评价结果
| 试验用品 | 试验浓度 | NO生成抑制率(％) |
| 实施例1 | 50mg/mL | 44.59 |
| 实施例2 | 50mg/mL | 32.09 |
| 实施例3 | 50mg/mL | 80.22 |
| 实施例4 | 1mg/mL | 53.01 |
| 实施例5 | 1mg/mL | 30.24 |
| 实施例6 | 1mg/mL | 43.58 |
| 实施例7 | 1mg/mL | 74.18 |
| 实施例8 | 1mg/mL | 59.85 |
| 实施例9 | 1mg/mL | 53.44 |
| 实施例14 | 1mg/mL | 54.35 |
| 实施例15 | 1mg/mL | 59.33 |
| 实施例16 | 1mg/mL | 66.67 |
此外，确认针对实施例4至6(培养物1至3)，NO自由基的活性抑制了50％的最小抑制浓度(IC50，mg/ml)。如[表9]至[表11]所示，分别在0.80mg/ml、3.19mg/ml及1.41mg/ml的低浓度下也表现了优秀的NO自由基清除效果。
[表9]
培养物1(实施例4)的各浓度抗炎症效果评价结果
[表10]
培养物2(实施例5)的各浓度抗炎症效果评价结果
[表11]
培养物3(实施例6)的各浓度抗炎症效果评价结果
实验例1-3：抗炎及增进保湿效果(透明质酸酶抑制力)评价
透明质酸酶(hyaluronidase)作为将皮肤保湿因子即透明质酸(hyaluronicacid)加水分解的酶，具有引发炎症的功能，因此利用通过确认透明质酸酶的活性抑制程度来测量抗炎症效果的方法(Y Kakegawa,et al.,Japanese J.Inflammation,4:437-438,1984)，评价抗炎效果。
将试验用品添加至在1M醋酸缓冲溶液(pH3.5)中融化的透明质酸酶溶液(10mg/ml)0.1ml，使其在37℃反应20分钟，添加12.5mM CaCl2 0.1ml后，再次使其在37℃反应20分钟后，添加在0.1M醋酸缓冲溶液(pH3.5)0.25ml中融化的透明质酸溶液
使其在37℃反应40分钟，添加0.4N NaOH 0.1ml和0.4M四硼酸钾0.1ml，使其在100℃反应3分钟并冷却，然后放入ρ-二甲氨基苯甲醛溶液
再次使其在37℃反应20分钟后发色，在540nm测量吸光度。从而利用下面的公式计算透明质酸酶抑制能，其结果在[表12]表示。
透明质酸酶抑制能(％)＝(试验群的吸光度/无处理群的吸光度)×100
[表12]
抗炎及增进保湿效果(透明质酸酶抑制力)评价结果
| 试验用品 | 试验浓度 | 透明质酸酶抑制能(％) |
| 实施例1 | 50mg/mL | 51.19 |
| 实施例2 | 50mg/mL | 52.10 |
| 实施例3 | 50mg/mL | 90.49 |
| 实施例4 | 1mg/mL | 36.13 |
| 实施例5 | 1mg/mL | 44.06 |
| 实施例6 | 1mg/mL | 33.55 |
| 实施例7 | 1mg/mL | 52.85 |
| 实施例8 | 1mg/mL | 33.33 |
| 实施例11 | 1mg/mL | 62.20 |
| 实施例13 | 1mg/mL | 47.32 |
| 实施例15 | 1mg/mL | 55.64 |
| 实施例17 | 1mg/mL | 55.60 |
此外，确认针对实施例4至6(培养物1至3)，透明质酸酶活性抑制了50％的最小抑制浓度(IC50，mg/ml)。如[表13]至[表15]所示，分别在1.36mg/ml、2.09mg/ml及3.99mg/ml的低浓度下也表现了优秀的透明质酸酶抑制效果。
[表13]
培养物1(实施例4)的各浓度透明质酸酶抑制力评价结果
[表14]
培养物2(实施例5)的各浓度透明质酸酶抑制力评价结果
[表15]
培养物3(实施例6)的各浓度透明质酸酶抑制力评价结果
实验例1-4：美白效果(酪氨酸酶抑制力)评价
酪氨酸酶是促进生物体内酪氨酸的氧化并帮助黑色素生成的酶。应用下述方法来评价美白效果，即对抑制酪氨酸酶的功能，对抑制酪氨酸氧化并形成称为黑色素的黑色的高分子的程度进行测量的方法(Pomerantz S.H.:J.Biochem.,24:161-168,1996)。对借助比色法测量酪氨酸酶的作用结果生成的多巴色素(DOPA chrome)的yagi等的方法进行变形，从而测量酪氨酸酶抑制活性。具体地，在50mM磷酸钠缓冲溶液(pH6.8)2.3mL中放入10mML-DOPA 0.5mL和0.5mL 110unit/ml蘑菇酪氨酸酶及试验溶液20μl后，在
反应10分钟后，在475nm测量吸光度，从而利用下面的公式计算酪氨酸酶抑制能(％)并在[表16]表示。
酪氨酸酶抑制能(％)＝(试验群的吸光度/无处理群的吸光度)×100
[表16]
美白效果(酪氨酸酶抑制力)评价结果
| 试验用品 | 试验浓度 | 酪氨酸酶抑制能(％) |
| 实施例1 | 50mg/mL | 85.68 |
| 实施例3 | 50mg/mL | 79.61 |
| 实施例4 | 1mg/mL | 44.13 |
| 实施例6 | 1mg/mL | 32.62 |
| 实施例7 | 1mg/mL | 34.13 |
| 实施例8 | 1mg/mL | 24.19 |
| 实施例14 | 1mg/mL | 47.89 |
| 实施例15 | 1mg/mL | 35.04 |
此外，确认针对实施例4至6(培养物1至3)，酪氨酸酶活性抑制了50％的最小抑制浓度(IC50，mg/ml)。如[表17]至[表18]所示，分别在2.03mg/ml及4.16mg/ml的低浓度下也表现了优秀的酪氨酸酶抑制效果。
[表17]
培养物1(实施例4)的各浓度酪氨酸酶抑制力评价结果
[表18]
培养物3(实施例6)的各浓度酪氨酸酶抑制力评价结果
实验例1-5：弹力及皱纹改善效果(胶原酶抑制力)评价
胶原酶(collagenase)作为分解胶原的酶而被周知，其表达因紫外线的照射而大大增加，是因紫外线导致胶原的减少·变性的主要原因，是皮肤的皱纹形成等主要原因，利用这一点对试验群测量胶原酶抑制效果，从而评价弹力及皱纹改善效果。
胶原酶的酶活性抑制实验利用了使用胶原的染色物质即azocoll的azocoll方法。酶抑制活性测量是针对试验用品0.1mL向0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.5)0.25mL中添加4mMCaCl2，添加融化了4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg(0.3mg/ml)的基质液和胶原酶(0.2mg/ml)酶溶液0.15mL并在室温反应20分钟后，添加6％枸橼酸0.5mL，添加2.5mL乙酸乙酯后，在320nm测量吸光度。从而利用下面的公式计算胶原酶抑制能(％)，其结果在[表19]表示。
胶原酶抑制能(％)＝(试验群的吸光度/无处理群的吸光度)×100
[表19]
弹力及皱纹改善效果(胶原酶抑制力)评价结果
| 试验用品 | 试验浓度 | 胶原酶抑制能(％) |
| 实施例1 | 50mg/mL | 79.33 |
| 实施例3 | 50mg/mL | 93.44 |
| 实施例4 | 1mg/mL | 36.73 |
| 实施例6 | 1mg/mL | 25.95 |
| 实施例7 | 1mg/mL | 33.36 |
| 实施例8 | 1mg/mL | 31.75 |
| 实施例14 | 1mg/mL | 25.36 |
| 实施例15 | 1mg/mL | 21.70 |
此外，确认针对实施例4至6(培养物1至3)，胶原酶活性抑制了50％的最小抑制浓度(Inhibition Concetration，IC50(mg/ml))。如[表20]及[表21]所示，分别在3.12/ml及4.78mg/ml的低浓度下也表现了优秀的胶原酶抑制效果。
[表20]
培养物1(实施例4)的各浓度胶原酶抑制效果评价结果
[表21]
培养物3(实施例6)的各浓度胶原酶抑制评价结果
实验例2：细胞中的体外(in-vitro)有效性评价
为了对实施例7的组成物验证细胞水平中的皮肤老化改善相关的综合有效性，进行了细胞毒性、改善皱纹(Hs68细胞、ATCC、利用实时(real time)PCR的MMP-1的mRNA表达确认)、改善美白(B16F10细胞、韩国细胞株银行、黑色素含量确认)、改善保湿(HaCaT细胞、ATCC、利用实时PCR的HAS-2表达确认)、抗炎症改善(RAW264.7细胞、韩国细胞株银行、NO生成抑制能及利用实时PCR的iNOS的mRNA表达确认)评价。其结果为，在
以下的浓度未观察到细胞毒性，通过MMP-1的mRNA表达抑制、黑色素生成减少、HAS-2表达促进、NO生成抑制、iNOS mRNA表达抑制确认了皮肤老化改善效果优秀。通过独立样本Student t-test实施显著性检验，当p值不到0.05时，统计上判定为存在显著的差异。实验程序及评价结果如下：
实验例2-1：皱纹改善效果(MMP1表达抑制)评价
皮肤老化是因皮肤真皮层存在的细胞外基质的结构性变化而产生的，可以说是因为皮肤真皮组织的胶原质中皮肤弹力成分蛋白质即胶原的减少。细胞外基质分解通过matrix-metalloproteinases(MMPs，基质金属蛋白酶)实现，借助MMP-1产生胶原的分解并产生皱纹，因此对通过MMP-1表达抑制能的效能进行评价的结果为，在
以下的浓度未观察到细胞毒性，在
浓度显著减少，在
浓度中52.63％MMP-1 mRNA表达被抑制。
1-1)细胞培养
实验中使用的Hs68细胞在ATCC购入并使用。DMEM培养基中添加使用10％FBS和1％青霉素/链霉素，在37℃、相对湿度90％、5％CO2培养器进行培养并使用。
1-2)细胞生存率
将Hs68细胞以5×103细胞/孔的浓度在96-孔板培养了24小时。将试验用品按浓度进行处理并培养24小时。将MTT溶液
按照每
添加，追加培养4小时。去除上等液，添加
二甲基亚砜(DMSO)并在570nm测量吸光度。细胞生存率通过下面的公式计算。
细胞生存率(％)＝(试验用品添加群的吸光度/试验用品无添加群的吸光度)×100
1-3)实时PCR
为了确认Hs68细胞中MMP-1的mRNA表达而进行了实时PCR。Hs68细胞在60mm板以5×105细胞/孔的形式分株，在37℃、5％CO2培养器培养24小时。将实施例1按浓度处理45分钟后，处理TNF-α
使其反应24小时后，去除上层液。细胞利用Trizol试剂(Ambion,USA)进行溶解。cDNA根据Revertra ACE-α-(Toyobo,Japan)的制造指示合成。合成的cDNA利用GAPDH(Hs02786624_g1)、MMP1(Hs00899658_m1)引物和Taqman反应混合物(Thermofisher,USA)进行了实时PCR。
图1a示出Hs68细胞中的细胞毒性确认结果，图1b示出MMP表达抑制能确认结果。
实验例2-2：美白效果(黑色素生成抑制)评价
皮肤的黑化是因为皮肤存在的黑色素形成细胞(melanocyte)的黑色素生成增加。通过UV漏出等外部刺激，黑色素形成细胞从L-酪氨酸形成黑色素，此时与各种酶相关。B16F10细胞中为了促进黑色素合成而处理黑色素合成刺激荷尔蒙即α-MSH(200nM)，确认黑色素含量减少，从而评价美白效果。在
以下的浓度未观察到细胞毒性，在
浓度黑色素含量显著减少，在
浓度中抑制46.69％黑色素生成。
1-1)细胞培养
实验中使用的B16F10细胞在韩国细胞株银行购入并使用。在DMEM培养基中添加10％FBS和1％青霉素/链霉素来使用，在37℃、相对湿度90％、5％CO2培养器进行培养并使用。
1-2)细胞生存率
将B16F10细胞以4×103细胞/孔的浓度在96-孔板分株并培养了24小时。培养24小时后，将α-MSH(200nM)和试验用品按浓度进行处理并培养72小时。将MTT溶液
按照每
添加，追加培养4小时。去除培养基，添加
二甲基亚砜(DMSO)并在570nm测量吸光度。细胞生存率通过下面的公式计算。
细胞生存率(％)＝(试验用品添加群的吸光度/试验用品无添加群的吸光度)×100
1-3)黑色素含量
将B16F10细胞以4×104细胞/孔的浓度分株在6-孔板上并培养了24小时。将200nM浓度的α-MSH和试验用品同时处理并在72小时促进黑色素合成。72小时后，培养的细胞进行胰蛋白酶/EDTA处理并离心分离。然后利用1N NaOH在80℃反应1小时后，在405nm测量吸光度。
图2a示出B16F10细胞中的细胞毒性(细胞生存率)测量结果，图2b示出B16F10细胞中的黑色素生成量(黑色素含量)。
实验例2-3：保湿效果(HAS-2表达增加)评价
为了使得皮肤屏障顺畅地运转，涉及各种种类的基质、糖、蛋白质等，相互作用。其中透明质酸(HA)作为存在于细胞外连接组织的高分子糖胺聚糖(glycosaminoglycan)，起到阻止水分蒸发的障壁作用。众所周知，HA的含量随着年龄增长而减少，由于这样的内在原因或外在原因导致的HA含量减少是皮肤弹力减少、皮肤粗糙、皱纹等的主要原因。HA借助通过持续性的透明质酸合成酶(HAS)的合成和透明质酸酶(HYAL)的分解来调节含量，利用这一点，通过HAS-表达增加来评价保湿效果。其结果为，确认在
以下的浓度未观察到细胞毒性，在
浓度HAS-2表达显著增加，在
浓度HAS-2mRNA表达增加54％。
1-1)细胞培养
实验中使用的HaCaT细胞在ATCC购入并使用。在DMEM培养基中添加10％FBS和1％青霉素/链霉素来使用，在37℃、相对湿度90％、5％CO2培养器进行培养并使用。
1-2)细胞生存率
将HaCaT细胞以1×105细胞/孔的浓度分株在96-孔板上并培养了24小时。将试验用品按浓度处理并培养24小时。将MTT溶液
按照每
添加并追加培养4小时。去除培养基，添加
二甲基亚砜(DMSO)并在570nm测量吸光度。细胞生存率通过下面的公式计算。
细胞生存率(％)＝(试验用品添加群的吸光度/试验用品无添加群的吸光度)×100
1-3)实时PCR
为了确认HaCaT细胞中HAS-2的mRNA表达而进行实时PCR。HaCaT细胞在60mm板以6×105细胞/孔的形式分株，在37℃、5％CO2培养器培养24小时。将试验用品按浓度处理24小时后，去除上层液。已处理的细胞利用Trizol试剂(Trizol reagent，Ambion,USA)来溶解。cDNA根据Revertra ACE-α-(Toyobo，Japan)的制造指示来合成。合成的cDNA利用GAPDH(Hs02786624_g1)、HAS-2(Hs00193435_ml)引物和Taqman反应混合物(Thermo fisher，USA)进行实时PCR。其结果为，确认在
以下的浓度未观察到细胞毒性，在
浓度HAS-2 mRAN表达增加率为1.54％，生成增加率为54％。
图3a示出HaCaT细胞中的细胞毒性(细胞生存率)确认结果，图3b示出HaCaT细胞中的HAS-2表达度。
实验例2-4：抗炎症效果(NO生成抑制及iNOS表达抑制)评价
为了对导致自身免疫疾病和炎症性疾病的NO生成抑制能进行评价，针对RAW264.7细胞处理炎症媒介物质即LPS(lipopoly-saccharide，脂多糖)，使得NO生成显著增加，对通过试验用品的NO生成抑制及iNOS表达抑制的抗炎效能进行了评价。其结果为，在
以下的浓度未观察到细胞毒性，NO生成在
至
浓度显著减少，在
浓度NO生成减少了61.57％，iNOS mRNA表达在
至
浓度显著减少，在
浓度iNOS mRNA表达减少了50.40％
1-1)细胞培养
实验中使用的RAW264.7细胞在韩国细胞株银行购入并使用，在DMEM培养基中添加10％FBS和1％青霉素/链霉素来使用，在37℃、相对湿度90％、5％CO2培养器进行培养并使用。
1-2)细胞生存率
将RAW264.7细胞以5×104细胞/孔的浓度在96-孔板培养24小时。将试验用品按浓度处理并培养24小时。将MTT溶液
按照每
添加，并追加培养4小时。去除上等液，添加
二甲基亚砜(DMSO)并在570nm测量吸光度。细胞生存率通过下面的公式计算。
细胞生存率(％)＝(试验用品添加群的吸光度/试验用品无添加群的吸光度)×100
1-3)NO生成抑制
将RAW264.7细胞以5×104细胞/孔的浓度分株在96-孔板，并在含有10％FBS的DMEM培养基中培养了24小时。去除培养基，在DMEM(无血清)培养基，和按浓度稀释的试验用品一起，以
浓度处理LPS并再次培养24小时。放入和培养上等液
相同的容量的Griess试剂反应10分钟后，在540nm测量吸光度。
NO生成抑制能(％)＝(试验用品添加群的吸光度/试验用品无添加群的吸光度)×100
1-4)实时PCR
为了确认RAW264.7细胞中iNOS的mRNA表达而进行实时PCR。RAW264.7细胞在6-孔板以5×105细胞/孔的形式分株，在37℃、5％CO2培养器培养24小时。将样品按浓度处理24小时后，去除上层液。细胞利用Trizol试剂(Ambion,USA)来溶解。cDNA根据Revertra ACE-α-(Toyobo，Japan)的制造指示来合成。合成的cDNA利用GAPDH(Mm99999915_g1)、iNOS(Mm00440502_m1)、引物和Taqman反应混合物(Thermo fisher，USA)进行实时PCR。
图4a示出RAW264.7细胞中的细胞毒性(细胞生存率)确认结果，图4b示出RAW264.7细胞中的NO生成抑制能，图4c示出RAW264.7细胞中的iNOS表达抑制能确认结果。
制造例4：制造乳酸菌死菌体和培养物的混合组成物的固型粉末
将在制造例3中制造的实施例7及8的混合组成物分别通过喷雾干燥机(BuchiCo.B-290，Swiss，Inlet 160℃，Outlet 100℃，Pump 10％，Aspirator 100％)进行喷雾干燥，从而获得乳酸菌死菌体及培养物混合组成物的固型粉末。其组成(重量比)如下面的[表22]所示。
[表22]
乳酸菌死菌体和培养物的混合组成物的固型粉末组成
制造例5：制造乳酸菌死菌体及培养物的液状聚合物泡囊组成物
从制造例3中制造的实施例7的混合组成物中，通过利用高压分散器(Suflux,NLM100,1,0000bar,60℃)的高压分散工艺获得了益生菌液状聚合物泡囊原料。液状聚合物泡囊的组成(重量比)如下面[表23]所示。
[表23]
液状聚合物泡囊组成物的组成
实验例3：稳定性评价
对制造例4中制造的固型粉末组成物及制造例5中制造的液状聚合物泡囊组成物进行随着温度条件的相稳定性(变色、变味、相分离与否等)评价，其结果在下面的[表24]表示。
如[表24]所示，固型粉末组成物作为成型添加剂含有麦芽糊精和异麦芽酮糖醇，作为稳定剂含有磷脂质的情况，确认稳定，液状聚合物泡囊组成物含有罗望子多糖，作为稳定剂含有磷脂质和聚甘油-6油酸酯的情况，确认稳定。
[表24]
固型粉末及液状聚合物泡囊组成物的稳定性评价结果
安全性评价基准-◎：没有变化，○：浅黄色变化，▲：黄色变化及产生变味★：相分离产生，★★：相分离及变色、变味产生
制造例6：制造含有乳酸菌死菌体及培养物的乳霜化妆品
利用乳化制造机(T.K.Homo Mixer Markll,Model 2.5,3,000rpm,75℃)，通过乳液乳化工艺从制造例4制造的实施例18的固型粉末原料制造乳霜化妆品。其组成(重量比)如下面[表25]所示。
[表25]
乳霜化妆品的组成
实验例4：乳霜化妆品的皮肤保湿力评价
对制造例6中制造的乳霜化妆品的保湿力评价如下。使用利用含有水分时施加交流电流时电阻减少的原理的Janus Pro(株式会社派，韩国)的水分测量仪，用水清洗试验者胳膊的前臂后，将乳霜化妆品每
点涂2cm×2cm规格，利用乳胶手套好好涂抹并涂布后，分别测量涂布之后不久、1小时后、2小时后角质层内的水分含量，其结果在图5示出。如图5所示，含有乳酸菌死菌体和培养物的混合组成物的乳霜化妆品(实施例21)与未含有乳酸菌死菌体和培养物的混合组成物的乳霜化妆品(比较例5)相比，表现了优秀的水分含量增加及保湿力。
Claims (6)
1.一种用于防止或改善皮肤老化的化妆品组成物，其特征在于，
包括从由植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)、植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)构成的群中选择的乳酸菌的一种以上的培养物，通过抗氧化、抗炎症、增进保湿、改善皱纹及改善美白来防止或改善皮肤老化。
2.根据权利要求1所述的用于防止或改善皮肤老化的化妆品组成物，其特征在于，
还包括从由植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)、植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)构成的群中选择的乳酸菌的一种以上的死菌体。
3.根据权利要求1或2所述的用于防止或改善皮肤老化的化妆品组成物，其特征在于，
植物乳杆菌Wikim125(保藏编号：BP1910798)从泡菜中分离。
4.根据权利要求1或2所述的用于防止或改善皮肤老化的化妆品组成物，其特征在于，
植物乳杆菌Wikim126(保藏编号：BP1910799)及植物乳杆菌Wikim127(保藏编号：BP1910800)分别从由洋白菜或球芽甘蓝制作的德式泡菜中分离。
5.根据权利要求1所述的用于防止或改善皮肤老化的化妆品组成物，其特征在于，
乳酸菌的培养物是，在乳酸菌培养用培养基中培养乳酸菌，进行离心分离后对获得的上等液进行冻结干燥而成。
6.根据权利要求2所述的用于防止或改善皮肤老化的化妆品组成物，其特征在于，
乳酸菌的死菌体是，在乳酸菌培养用培养基中培养乳酸菌，进行离心分离后对沉淀的细胞进行热处理而获得。
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