KR102037039B1 - 플록쿨린을 포함하는 피부 미용을 위한 조성물 - Google Patents
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Abstract
일 양상은 플록쿨린을 포함하는 피부 미용을 위한 조성물을 제공한다. 플록쿨린을 포함하는 조성물은 피부의 장벽 개선, 보습, 미백, 세포 증식 효과 등을 나타내고, 콜라겐 합성 및 엘라스틴 합성을 촉진함으로써 피부 미용에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
피부 미용을 위한 조성물에 관한 것이다.
플록쿨린(Flocculin)은 라거 효모(Lager yeast) 세포벽의 렉틴 유사 단백질(lectin like protein)로, 라거 효모를 침전시키는 역할을 한다. 특히 만노오스와 결합력이 우수하여, 다른 효모벽의 만노오스와 결합하고 효모세포의 침전물을 생성시키기도 하며, 배양 중의 영양 고갈, 온도, UV와 같은 스트레스 인자로부터 효모를 보호하는 기능도 가지고 있다.
한편, 효모는 화장품 성분으로서 주름개선, 미백효과 등 피부 개선을 목적으로 사용되고 있다. 효모 추출액은 효모 세포를 원료로 단백질 분해 효소, 유기 용매 혹은 자가분해에 의해 세포벽을 파쇄시킨 후, 불용성 부분을 제거하고 농축시켜 화장품 성분으로서 이용된다. 이렇게 처리된 효모 추출물은 각종 단백질, 펩타이드, 아미노산, 미네랄 및 비타민 B군의 복합물로 구성되어 화장품 첨가물로서 유용하다. 그 밖에 효모추출물의 경우 피부 상처 치료 및 콜라겐 합성효과(US Patent 5,776,441, US Patent 6,177,105)에 알려져 있으며 여러 화장품 원료로 사용되고 있다. 하지만 현재까지 플록쿨린을 피부 미용 목적으로 화장료 조성물에 이용한 사례는 찾아볼 수 없다.
일 양상은 플록쿨린을 포함하는 피부 미용을 위한 화장료 조성물을 제공한다.
다른 양상은 플록쿨린을 포함하는 피부 미용을 위한 건강기능식품용 조성물을 제공한다.
다른 양상은 플록쿨린을 포함하는 피부 미용을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상은 플록쿨린을 포함하는 피부 미용을 위한 화장료 조성물을 제공한다. 다른 양상은 플록쿨린을 포함하는 피부 미용을 위한 건강기능식품용 조성물을 제공한다. 다른 양상은 플록쿨린을 포함하는 피부 손상, 또는 피부 노화를 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
"플록쿨린(Flocculin)"은 일반적으로 사카로마이세스 속 미생물에서 발현되는 세포벽의 렉틴 유사 단백질(lectin like protein)을 의미하는 것으로, Marika H.(1994. Purification and partial characterization of a flocculin from brewer's yeast) 등의 문헌에서 알려진 방법에 따라 사카로마이세스 속 미생물로부터 분리하거나, 상업적으로 구매하여 얻을 수 있다. 구체적으로 상기 사카로마이세스 속 미생물로 알려진 것들은 사카로마이세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii), 사카로마이세스 불데리(Saccharomyces bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스(Saccharomyces cariocanus), 사카로마이세스 카리오커스(Saccharomyces cariocus), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 시바리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스(Saccharomyces dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이더스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야누스(Saccharomyces eubayanus), 사카로마이세스 엑시구스(Saccharomyces exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스(Saccharomyces florentinus), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 마르티니에(Saccharomyces martiniae), 사카로마이세스 모나센시스(Saccharomyces monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 스펜세로럼(Saccharomyces spencerorum), 사카로마이세스 츄리센시스(Saccharomyces turicensis), 사카로마이세스 유니스포러스(Saccharomyces unisporus), 사카로마이세스 우바럼(Saccharomyces uvarum), 및 사카로마이세스 조나투스(Saccharomyces zonatus) 등이 있다. 알려진 플록쿨린의 아미노산 서열은, 예를 들면, NCBI Accession No: AIC64115.1, AFJ20718.1, BAG49462.1, 또는 ABS87371.1 등을 포함한다.
상기 조성물은, 상기 사카로마이세스 속 미생물의 배양물 또는 추출물을 더 포함할 수 있다. 상기 배양물 또는 추출물은 당해 분야에 알려진 방법에 따라 통상의 기술자가 쉽게 얻을 수 있다. 예를 들어, 미생물의 배양은 시판되는 배지, 예를 들면 LB 배지, Ham's F10 (Sigma), MEM (Minimal Essential Medium, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma)등이 이용될 수 있다. 필요한 경우, 호르몬 또는 기타 성장 인자, 염, 완충제, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코오스 등이 공지된 적합한 농도로 보충될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 선택된 미생물에 따라 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있다. 또한, 상기 추출물은 물, 아세톤, 알콜, 예를 들면, C1-C6 알콜, 또는 이들의 혼합물을 용매로 이용하여 추출한 것일 수 있다. 상기 C1-C6 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 1,3-프로판디올, 부탄올, 펜탄올, 또는 헥산올 등일 수 있다. 상기 용매는 예를 들면, 물과 알콜의 혼합물 즉 알콜 수용액일 수 있다. 알콜 수용액의 알콜 농도는 1 내지 100(v/v)%, 예를 들면, 1 내지 99.5(v/v)%, 10 내지 100(v/v)%, 20 내지 100(v/v)%, 30 내지 100(v/v)%, 40 내지 100(v/v)%, 50 내지 100(v/v)%, 60 내지 100(v/v)%, 70 내지 100(v/v)%, 75 내지 100(v/v)%, 60 내지 90(v/v)%, 60 내지 80(v/v)%, 65 내지 75(v/v)%, 또는 70(v/v)%일 수 있다. 상기 알콜 수용액은 메탄올, 에탄올, 또는 부탄올 수용액일 수 있다. 상기 조성물은 상기 추출물의 분획물을 더 포함할 수 있다. 용어 "분획물(fraction)"은 추출물이 그 일부의 성분으로 나누어진 물질, 즉 분획된 물질을 나타낸다. 상기 분획물은 용매 분획화 (fractionation)에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 용매 분획화는 추출물을 용매와 혼합하고 상기 용매에 존재하는 물질을 분리하는 단계를 지칭하는 것일 수 있다.
용어 "피부 미용"은 피부 손상 또는 피부 노화로 인해 손상된 피부를 피부 주름 개선, 볼륨 강화, 탄력 개선, 또는 피부 재생 등의 방식으로 손상되기 이전의 상태로 되돌리는 것을 의미한다. 상기 피부는 얼굴, 손, 팔, 다리, 발, 가슴, 배, 등, 엉덩이, 및 두피를 포함하는 신체의 모든 피부 부위를 포함한다.
용어 "피부 손상"은 외부의 물리적 손상, 화학 물질, 세균, 곰팡이, 바이러스 등의 침투, 자외선에 대한 노출, 피부의 수분 손실, 노화 등에 의한 주름, 자유라디칼(활성산소) 등에 의한 산화, 피부 색소 침착, 피부 염증, 지루성 피부염, 붉어짐(발적, 홍반), 부종, 태선화, 습진, 소양감(가려움), 및 아토피 피부염 등을 포함하는 피부 조직 또는 세포의 임상적 및 미용적 관점에서의 손상을 포함한다.
용어 "피부 노화"는 시간의 흐름에 따른 내인성 노화 및 외부 환경에 의한 외인성 노화를 포함한다. 상기 피부 노화는 피부 주름, 잡티, 기미 등을 포함할 수 있다. 상기 피부 주름은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄일 수 있다. 피부 주름은 광노화, 연령, 얼굴 표정, 수분 부족, 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다. 상기 광노화는 자외선(UVA, UVB, 및 UVC 포함) 노출에 의한 피부 노화일 수 있다. 상기 피부 주름 개선은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것일 수 있다.
상기 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류도 적절하게 배합할 수 있다.
상기 조성물이 화장료 조성물인 경우, 화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 현탁액, 겔, 분말, 페이스트, 팩트, 마스크팩 또는 시트 또는 에어로졸 조성물을 포함하는 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 보존제, 안정화제, 계면활성제, 점증제, 용해제, 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 유화제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등 당해 분야에서 통상적으로 이용되는 첨가물을 더 포함할 수 있다. 상기 보존제 등의 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 40 중량%일 수 있다.
상기 조성물이 약학적 조성물인 경우, 약학적 조성물은 상기 플록쿨린을 유효한 양, 또는 유효 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 조성물이 건강기능식품용 조성물인 경우, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강기능식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 유제, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제 등의 일반적인 제형으로 제조될 수도 있고, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 젤리, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등의 임의의 건강식품 형태로 제조될 수도 있다. 상기 건강식품의 제제화를 위해 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 상기 첨가제로서 각종 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 이외에도 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다. 상기 건강기능식품용 조성물 중의 상기 플록쿨린의 추출물의 함량은 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료로서 제조될 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 함유할 수 있다.
본 발명자들은 상기 플록쿨린을 포함하는 조성물을 이용한 실험에서, 일반 효모 배양물 또는 무처리군에 대비하여 현저한 필라그린 발현 향상, 클라우딘 1 발현 향상, 히아루론산 합성효소 발현 향상, 각질탈각효소 발현 향상, 및 멜라닌 생성 억제 효과를 확인하였다. 따라서, 플록쿨린을 포함하는 조성물은 피부 미용, 또는 피부 관련 질환의 치료 등에 유용하게 이용될 수 있다.
플록쿨린을 포함하는 조성물은 피부의 장벽 개선, 보습, 미백, 세포 증식 효과 등을 나타내고, 콜라겐 합성 및 엘라스틴 합성을 촉진함으로써 피부 미용에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 HaCat 세포에서 플록쿨린의 필라그린 발현 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 HaCat 세포에서 플록쿨린의 클라우딘 1 발현 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 HaCat 세포에서 플록쿨린의 HAS3 발현 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 HaCat 세포에서 플록쿨린의 KLK7 발현 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 HaCat 세포에서 플록쿨린의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 HaCat 세포에서 플록쿨린의 클라우딘 1 발현 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 HaCat 세포에서 플록쿨린의 HAS3 발현 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 HaCat 세포에서 플록쿨린의 KLK7 발현 증가 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 HaCat 세포에서 플록쿨린의 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예 및 실험예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예 및 실험예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예 및 실험예는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실시예
1:
플록쿨린
준비
사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus)를 Marika H.(1994. Purification and partial characterization of a flocculin from brewer's yeast)의 방법에 따라 배양하고, 플록쿨린이 포함된 용액을 분리하였다. 분리한 플록쿨린 용액은 -70℃, 5.0 Torr 조건에서 동결 건조하여 파우더로 제조하였다.
비교예
1: 일반 효모 배양물 준비
사카로마이세스 파스토리누스를 Marika H.(1994.Purification and partial characterization of a flocculin from brewer's yeast)의 방법에 따라 배양하였다. 효모배양물을 3500 rpm에서 원심분리하고, 상등액을 0.45 μm 멤브레인 여과막으로 여과하여 제균하였다. 제균된 효모배양물은 -70℃, 5.0 Torr 조건에서 동결 건조하여 파우더로 제조하였다.
실험예
1:
피부장벽
인자
필라그린(Filaggrin)의
발현 확인
사람 각질형성세포주인 HaCat는 America type culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구매하였으며 10%의 소태아 혈청 (FBS, ATCC, Rockville, MD, USA)과 1%의 antibiotic/antimycotic (AA, ATCC, Rockville, MD, USA)을 첨가한 DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA)을 이용하여 37℃, 5%, CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
사람 각질형성세포에서 장벽강화 효과를 확인하기 위해, 사람 각질형성세포를 6 웰 세포 배양 접시에 5 x 105cells/웰 밀도로 접종한 후, 10%의 FBS와 1%의 AA가 첨가된 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 비교예 1, 또는 실시예 1을 첨가하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 트리졸 (RNA iso, TAKARA, 일본) 1 ㎖을 첨가하여 RNA를 분리하였다. Nanodrop 2000 (Thermo, USA)를 이용해 RNA를 정량 한 후, 42℃에서 55분, 70℃에서 15분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다 (Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). RT-PCR은 PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였고 사이버그린 (SYBRGreen supermix, Applied Biosystems, 미국)을 필라그린 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 94℃에서 5분 동안 중합효소 활성화, 95℃ 30초, 54℃ 1분, 72℃ 1분간 40 사이클로 중합반응 하였다. 프라이머의 염기서열은 아래의 표 1와 같다. 유전자의 발현양은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
그 결과, 무처리군 대비 실시예 1 첨가군에서 필라그린 발현이 2.84배 향상됨을 관찰하였다(도 1). 따라서, 실시예 1의 조성물의 우수한 피부 장벽 강화 효과를 기대할 수 있다.
| 프라이머 이름 | 서열 |
| 필라그린 | 정방향 5'-GGCACTGAAAGGCAAAAAGG-3' (서열번호 1) |
| 역방향 5'-AAACCCGGATTCACCATAATCA-3' (서열번호 2) | |
| β-액틴 | 정방향 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3' (서열번호 3) |
| 역방향 5'-GACACCTTCAACACCCCAGC-3' (서열번호 4) |
실험예
2:
피부세포
결속 인자
클라우딘
1(
Claudin
1)의
발현 확인
사람 각질형성세포주인 HaCat는 America type culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구매하였으며 10%의 소태아 혈청 (FBS, ATCC, Rockville, MD, USA)과 1%의 antibiotic/antimycotic (AA, ATCC, Rockville, MD, USA)을 첨가한 DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA)을 이용하여 37℃, 5%, CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
사람 각질형성세포를 6 웰 세포 배양 접시에 5 x 105cells/웰 밀도로 접종하여 10%의 FBS와 1%의 AA가 첨가된 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 비교예 1, 또는 실시예 1를 첨가하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 트리졸 (RNA iso, TAKARA, 일본) 1 ㎖을 첨가하여 RNA를 분리하였다. Nanodrop 2000 (Thermo, USA)를 이용해 RNA를 정량한 후, 42℃에서 55분, 70℃에서 15분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다 (Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). RT-PCR은 PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였고 사이버그린 (SYBRGreen supermix, Applied Biosystems, 미국)을 클라우딘 1 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 50℃에서 2분, 95℃ 10분에서 반응 후 95℃ 10초와 60℃ 1분간 40 사이클로 중합반응 하였다. 프라이머의 염기서열은 하기의 표 2와 같다. 유전자의 발현양은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
그 결과, 무처리군 대비 실시예 1 첨가군에서 클라우딘 1 발현이 1.45배 증가하는 것을 확인하였다(도 2). 따라서 실시예 1 조성물의 우수한 피부 보습 효과를 기대할 수 있다.
| 프라이머 이름 | 서열 |
| Claudin 1 | 정방향 5'-GCTCTAGAATTCCGAGCGAGTCATGGCCAACGC-3' (서열번호 5) |
| 역방향 5'-GCTCTAGAATTCTCACACGTAGTCTTTCCCGCT-3' (서열번호 6) | |
| β-actin | 정방향 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3' (서열번호 7) |
| 역방향 5'-GACACCTTCAACACCCCAGC-3' (서열번호 8) |
실험예
3: 히아루론산 합성 효소
HAS3의
발현 확인
사람 각질형성세포주인 HaCat는 America type culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구매하였으며 10%의 소태아 혈청 (FBS, ATCC, Rockville, MD, USA)와 1%의 antibiotic/antimycotic (AA, ATCC, Rockville, MD, USA)을 첨가한 DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA)을 이용하여 37℃, 5%, CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
사람 각질형성세포를 6 웰 세포 배양 접시에 5 x 105cells/웰 밀도로 접종하여 10%의 FBS와 1%의 AA가 첨가된 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양된 세포에 비교예 1 또는 실시예 1을 첨가하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 트리졸 (RNA iso, TAKARA, 일본) 1 ㎖을 첨가하여 RNA를 분리하였다. Nanodrop 2000 (Thermo, USA)를 이용해 RNA를 정량 한 후, 42℃에서 55분, 70℃에서 15분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다 (Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). RT-PCR은 PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였고 사이버그린 (SYBRGreen supermix, Applied Biosystems, 미국)을 HAS3 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 94℃에서 5분 동안 중합효소 활성화, 95℃ 30초, 54℃ 1분, 72℃ 1분간 40 사이클로 중합반응 하였다. 프라이머의 염기서열은 하기의 표 3와 같다. 유전자의 발현양은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
그 결과, 일반 효모배양물(비교예 1) 대비 라거 효모의 플록쿨린이(실시예 1) 더 많은 양의 히아루론산 합성효소를 발현시킴을 확인하였다(도 3). 따라서, 증가된 히아루론산 합성효소가 피부 내 수분 포집 능력을 향상시킬 수 있으므로, 실시예 1 조성물의 우수한 피부 보습 효과를 기대할 수 있다.
| 프라이머 이름 | 서열 |
| HAS3 | 정방향 5'- CTTAAGGGTTGCTTGCTTGC -3' (서열번호 9) |
| 역방향 5'- GTTCGTGGGAGATGAAGGAA -3' (서열번호 10) | |
| β-actin | 정방향 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3' (서열번호 11) |
| 역방향 5'-GACACCTTCAACACCCCAGC-3' (서열번호 12) |
실험예
4: 각질 탈각 효소
KLK7의
발현 확인
사람 각질형성세포주인 HaCat는 America type culture collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구매하였으며 10%의 소태아 혈청 (FBS, ATCC, Rockville, MD, USA)와 1%의 antibiotic/antimycotic (AA, ATCC, Rockville, MD, USA)을 첨가한 DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA)을 이용하여 37℃, 5%, CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
사람 각질형성세포를 6 웰 세포 배양 접시에 5 x 105 cells/웰 밀도로 접종하여 10%의 FBS와 1%의 AA가 첨가된 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 상기 세포에 비교예 1, 또는 실시예 1을 첨가하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 트리졸 (RNA iso, TAKARA, 일본) 1 ㎖을 첨가하여 RNA를 분리하였다. Nanodrop 2000 (Thermo, USA)를 이용해 RNA를 정량 한 후, 42℃에서 55분, 70℃에서 15분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다 (Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). RT-PCR은 PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였고 사이버그린 (SYBRGreen supermix, Applied Biosystems, 미국)을 KLK7 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 50℃에서 2분, 95℃ 10분에서 반응 후 95℃ 10초와 60℃ 1분간 40 사이클로 중합반응 하였다. 프라이머의 염기서열은 하기의 표 4와 같다. 유전자의 발현양은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
일반 효모배양물(비교예 1) 대비 라거 효모의 플록쿨린이(실시예 1) 더 많은 양의 각질 탈각 효소(KLK7)를 발현시킴을 확인하였다(도 4). 따라서, 실시예 1 조성물의 매끈하고 밝은 피부톤 보정 효과를 기대할 수 있다.
| 프라이머 이름 | 서열 |
| KLK 7 | 정방향 5'- GCATCCCCGACTCCAAGAA-3' (서열번호 13) |
| 역방향 5'- CAGGGTACCTCTGCACACCAA-3 (서열번호 14) | |
| β-actin | 정방향 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3' (서열번호 15) |
| 역방향 5'-GACACCTTCAACACCCCAGC-3' (서열번호 16) |
실험예
5: 멜라닌 생성 억제 효과 확인
쥐의 색소세포(murine melanoma)인 B16 F10 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM에 현탁시켜 웰당 1 × 105 cells으로 6-웰 플레이트에 접종하여 웰 바닥에 부착될때까지 배양하였다. 멜라닌 생성 유도를 위하여, 0.1 μM α-MSH를 처리하고, 이후 시료별로 첨가한 후 3일간 배양하였다. 멜라닌 생성능 실험의 양성대조군으로 알부틴 100 ppm 을 처리하였다. 배양한 세포는 PBS로 씻고 트립신(trypsin)으로 회수하였다. 회수한 세포를 혈구계(hematocytometer)로 계수하여 각 처리 그룹별로 1×106 cells/mL으로 동일한 세포수가 되도록 모아, 1000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포만을 얻었다. 회수된 세포를 60에서 1시간 건조시켜 10% DMSO가 포함된 1M NaOH용액 100 ㎕을 넣어 세포내의 멜라닌을 얻었다. 이 멜라닌 액을 마이크로플레이트 리더로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성 저해율을 평가하였다.
그 결과, 일반 효모배양물(비교예 1) 대비 라거 효모의 플록쿨린이(실시예 1) 멜라닌 생성을 더 많이 억제 시킴을 확인하였다(도 5). 따라서, 실시예 1 조성물은 피부 세포 내의 멜라닌 생성을 억제함으로써 우수한 미백 효과를 가질 수 있다.
<110> Cosmax Co., Ltd.
<120> Composition comprising flocculin for improving skin condition
<130> PN118795
<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<400> 16
gacaccttca acaccccagc 20
Claims (6)
- 플록쿨린(flocculin)을 포함하는 피부 미용을 위한 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 플록쿨린은 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 균주로부터 분리된 것인 화장료 조성물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 사카로마이세스 속 균주는 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus)인 화장료 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 화장료 조성물은 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 균주의 배양물 또는 그의 추출물을 더 포함하는 것인 화장료 조성물.
- 플록쿨린(flocculin)을 포함하는 피부 미용을 위한 건강기능식품용 조성물.
- 삭제
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