CN114276958B

CN114276958B - 具有抗炎功效的三重益生菌发酵复合物的制备方法和应用

Info

Publication number: CN114276958B
Application number: CN202111564087.1A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 罗西; 迟俐
Original assignee: Wuxi Honghuan Micro Ecological Technology Co ltd
Current assignee: Wuxi Honghuan Micro Ecological Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2041-12-20
Also published as: CN114276958A

Abstract

本发明公开了具有抗炎功效的三重益生菌发酵复合物的制备方法和应用，属于微生物发酵技术领域。本发明的三重益生菌发酵复合物，由三株具有NO抑制率的益生菌发酵物双歧杆菌H1、植物乳杆菌H2、嗜酸乳杆菌H4发酵后提取的溶胞物，以2：1：3的比率混合得到。具有很高的抗炎功效，按照协同增效配比后，能明显的降低LPS刺激后，细胞中TNF‑α的表达，达到抗炎效果。

Description

具有抗炎功效的三重益生菌发酵复合物的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及具有抗炎功效的三重益生菌发酵复合物的制备方法和应用，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

益生菌是活性微生物，摄入适量时，对人体微生物的平衡有积极影响。益生菌类益生菌是人类最常见且最易接触的活性微生物。这些活性益生菌，通过各种机理，例如通过螯合金属离子的能力来充当抗氧化剂，来调节宿主中活性氧(ROS)合酶、一氧化氮合酶(NOS)的活力，使得氧化酶系活力下调，从而提高机体的防御能力来抵抗氧化应激，降低炎症因子的表达，来达到抗炎的效果。

硝普纳(SNP)，又名亚硝基铁氰化钠，容易分解，是一种有效的含铁的可提供NO的药物。NO本身是一种自由基，不仅能够通过多种途径抑制蛋白质，还能与生物体内其他物质相互作用形成次级因子，造成必需蛋白质、脂质和DNA氧化损失。

NO是一种来自于一氧化氮合酶(NOS)的细胞内和细胞间部分子，被认为是众多免疫系统产生的最通用物质。有报道称，过量的NO产生会加深炎症反应或导致基因突变和神经损伤。抗炎作用可通过抑制NO的产生来证实。因此，筛选抑制NO生成菌是得到具有抗炎活性益生菌的基础。

目前，益生菌抗炎主要应用在食品中，保护人体肠道的安全；在人体皮肤上的应用报道较少，且单一的益生菌发酵物很难达到理想的抗炎效果。本研究采用采用独特的抗炎靶点筛选具有抗炎功效的活性益生菌，通过相互复配协同增效来解决单一益生菌抗炎效果差的弊端，增添了益生菌发酵物在抗炎类护肤品原料中的应用新局面。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是：单一的益生菌发酵物很难达到理想的抗炎效果。

[技术方案]

本发明采用独特的抗炎靶点筛选具有抗炎功效的活性益生菌，通过相互复配协同增效来解决单一益生菌抗炎效果差的弊端，增添了益生菌发酵物在抗炎类护肤品原料中的应用新局面。

本发明提供一种双歧杆菌Bicilia-B01(Bifidobacterium sp.Bicilia-B01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021469。

所述双歧杆菌Bicilia-B01具有耐受NO的特性，在耐NO筛选培养基中于37℃条件下培养24h，OD₆₀₀可以达到2.4。

所述双歧杆菌的培养方法是，于厌氧手套箱中，挑取双歧杆菌Bicilia-B01单菌落接种至装有400mL无菌益生菌培养基的摇瓶中，摇瓶规格为500mL，放置在厌氧培养箱中，37℃培养24h。

本发明提供一种植物乳杆菌Bicilia-Lp01(Lactobacillus plantarum Bicilia-Lp01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021472。

所述植物乳杆菌Bicilia-Lp01具有耐受NO的特性，在耐NO筛选培养基中于37℃条件下培养24h，OD₆₀₀可以达到4.0。

所述植物乳杆菌的培养方法是于厌氧手套箱中，挑取植物乳杆菌单菌落接种至装有400mL无菌益生菌培养基的摇瓶中，摇瓶规格为500mL，放置在厌氧培养箱中，37℃培养24h。

本发明提供一种嗜酸乳杆菌Bicilia-La01(Lactobacillus acidophilusBicilia-La01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021471。

所述嗜酸乳杆菌Bicilia-La01具有耐受NO的特性，在耐NO筛选培养基中于37℃条件下培养24h，OD₆₀₀可以达到3.9。

所述嗜酸乳杆菌的培养方法是，于厌氧手套箱中，挑取嗜酸乳杆菌单菌落接种至装有400mL无菌益生菌培养基的摇瓶中，摇瓶规格为500mL，放置在厌氧培养箱中，37℃培养24h。

本发明还提供具有抗炎功能的组合物，所述组合物包含双歧杆菌Bicilia-B01的溶胞物、植物乳杆菌Bicilia-Lp01的溶胞物、嗜酸乳杆菌Bicilia-La01的溶胞物，三者的质量比例是2:1:3或3:1:2；所述双歧杆菌Bicilia-B01或植物乳杆菌Bicilia-Lp01或嗜酸乳杆菌Bicilia-La01的溶胞物是指液态培养结束后，除去发酵上清液，收集微生物菌体，将菌体破碎、过滤，收集滤清部分，即得到溶胞物。

所述组合物1mg/mL及以上浓度范围使用，都能够发挥抗炎功效。

本发明还提供应用所述具有抗炎功能的组合物制备的化妆品、护肤品。将所述具有抗炎功能的组合物与其它溶剂、载体、赋形剂、美白剂、保湿剂、维生素、防晒霜、香水、染料、抗菌剂等以适当的比例调整使用。[有益效果]

本发明以从人体内筛选到双歧杆菌、植物乳杆菌属、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、唾液乳杆菌出发，采用含有硝普钠的益生菌培养基诱导培养，待生长一段时间后分别测定对应益生菌的菌体浓度OD₆₀₀。将耐受NO的菌株(表现为在筛选培养基中能大量增殖的菌株)筛选出来，再通过发酵后测定对应菌株发酵产物的NO抑制率；分别分析发酵液、溶胞物、以及不同组分配比间的NO抑制率差异，得出最佳的益生菌发酵物配比，组成具有抗炎功效的三重益生菌发酵复合物。

生物材料保藏

双歧杆菌Bicilia-B01(Bifidobacterium sp.Bicilia-B01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021469。

植物乳杆菌Bicilia-Lp01(Lactobacillus plantarum Bicilia-Lp01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021472。

嗜酸乳杆菌Bicilia-La01(Lactobacillus acidophilus Bicilia-La01)，于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO:M 2021471。

附图说明

图1实施例4测得的三种益生菌溶胞物的复合物在不同浓度下对炎症因子的抑制作用。

图2实施例6测得的三种益生菌溶胞物的复合物鸡胚绒毛尿囊膜试验结果。

具体实施方式

术语定义

溶胞物，是指微生物液态培养结束后，除去发酵上清液，收集微生物菌体，将菌体破碎、过滤，收集滤清部分，即得到溶胞物。制备溶胞物时，活性益生菌破壁条件是900～1200Bar，破壁次数为3～5遍，过滤所用膜孔径为50～220nm。例如，在离心管底部分别收集每株菌的菌泥，用适量无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心10min后去除上清；如此清洗3遍后，收集底部的菌体备用。将清洗干净的菌体，按照菌泥：无菌纯净水＝1：9的比率，加纯净水重悬。重悬后的菌体分别采用高压匀浆机破壁，破壁压力为1000Bar，循环5次，温度控制在40℃以下。破壁后，分别收集破壁液，在9000rpm条件下离心10min，取上清液，分别用220nm的滤膜过滤得到上清液，分装在干净离心管中，即为溶胞物。

抗炎，是指控制炎症因子的上调，降低或者消除炎症反应。

具有NO抑制率益生菌筛选培养基组分为：蛋白胨5～10.0、酵母粉5.0～10g/L、葡萄糖10～20.0g/L、牛肉膏5～10.0g/L、吐温-80 0.5～1mL、磷酸氢二钾0.5～2.0g/L、乙酸钠2～5.0g/L、柠檬酸氢二铵0.5～2.0g/L、七水硫酸镁0.25～0.58g/L、硫酸锰0.1～0.25g/L、硝普钠0.5～2g/L，pH 6.5～6.8，固体含有15～20g/L琼脂。

实施例1：耐NO益生菌的筛选

益生菌培养基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母粉5.0、葡萄糖20.0、牛肉膏10.0、吐温-801mL、磷酸氢二钾2.0、乙酸钠5.0、柠檬酸氢二铵2.0、七水硫酸镁0.58、硫酸锰0.25、pH 6.5～6.8，固体含有20g/L琼脂，121℃灭菌20min备用。

耐NO筛选培养基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母粉5.0、葡萄糖20.0、牛肉膏10.0、吐温-80 1mL、磷酸氢二钾2.0、乙酸钠5.0、柠檬酸氢二铵2.0、七水硫酸镁0.58、硫酸锰0.25、硝普钠2g/L，pH 6.5～6.8，固体含有20g/L琼脂。121℃灭菌20min备用。

操作步骤：

步骤1：菌种活化

将双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、副干酪乳杆菌共24株益生菌，于厌氧手套箱内，将菌种冻存管分别均匀涂布于益生菌固体平板上，放在厌氧培养箱中，37℃培养24h。

步骤2：菌种传代、种子培养

长出单菌落后，于厌氧手套箱中，分别挑取单菌落，接种在装有5mL液体益生菌培养基的摇菌管中，在厌氧培养箱中37℃条件下，培养16～18h，OD₆₀₀约为1.0作为益生菌种子液。

步骤3：

将培养好的益生菌种子液，于厌氧手套箱中，按照初始OD₆₀₀＝0.2的量，接种至装有无菌新鲜耐NO筛选培养基的摇瓶中，规格为500mL三角瓶装液400mL，放置在厌氧培养箱中，37℃条件下培养24h。

步骤4：

培养结束后，取混合均匀的培养液，分别测定对应菌株的菌体浓度OD₆₀₀，结果如表1所示。

表1

试验筛选出具有NO耐受性的3株益生菌，分别是：双歧杆菌H1(即：双歧杆菌Bicilia-B01)、植物乳杆菌H2(即：植物乳杆菌Bicilia-Lp01)、嗜酸乳杆菌H4(即：嗜酸乳杆菌Bicilia-La01)。将筛选出的3株菌，分别划线在耐NO筛选培养基上进行复筛，待长出单菌落后，放置于4℃冰箱，密封保存备用。

实施例2：实施例1中筛选得到的三株益生菌发酵物对NO抑制率试验。

操作步骤：

步骤1：

将筛选得到的3株耐NO益生菌，于厌氧手套箱中，挑取单菌落接种至装有400mL无菌益生菌培养基的摇瓶中，摇瓶规格为500mL，放置在厌氧培养箱中，37℃培养24h。

步骤2：

益生菌发酵滤液制备：将培养好的益生菌发酵液，分别用50mL离心管分装，9000rpm离心10min，收集上清液，采用0.22μm滤膜过滤，放置在干净离心管中，得到益生菌发酵滤液；

益生菌溶胞物制备：在离心管底部分别收集每株菌的菌泥，用适量无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心10min后去除上清；如此清洗3遍后，收集底部的菌体备用。将清洗干净的菌体，按照菌泥：无菌纯净水＝1：9的比率，加纯净水重悬。重悬后的菌体分别采用高压匀浆机破壁，破壁压力为1000Bar，循环5次，温度控制在40℃以下。破壁后，分别收集破壁液，在8000rpm条件下离心10min，取上清液，分别用220nm的滤膜过滤得到上清液，分装在干净离心管中，即为益生菌溶胞物。

NO抑制活性的筛选：NO自由基在人体皮肤炎症反应中起到关键调控作用，NO可使iNOS上调，也会引起IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子相关上调，使皮肤发炎。

方法：取96孔板，分别加入0.5mM的亚硝基铁氰化钠二水化合物(SNP)溶液50μL，加入益生菌溶胞物(即样品)10μL后，在UV-A照射60min后，添加Griess试剂A(1％磺胺溶在2％磷酸水溶液)50μL，Griess试剂B(0.1％N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐)50μL，在550nm处检测吸光值，并计算NO抑制率，计算方法：

抑制率％＝[1-(As/Ac)]×100；

其中，Ac代表以水替代样品反应后的吸光值、As代表样品反应后的吸光值。

测试结果如表2：

表2

样品	NO抑制率％
		双歧杆菌H1发酵滤液(BH1F)	10.46
双歧杆菌H1溶胞物(BH1L)	80.89
		植物乳杆菌H2发酵滤液(PH2F)	16.45
植物乳杆菌H2溶胞物(PH2L)	76.03
		嗜酸乳杆菌H4发酵滤液(AH4F)	21.34
嗜酸乳杆菌H4溶胞物(AH4L)	69.97

筛选得出，双歧杆菌H1溶胞物(BH1L)、植物乳杆菌H2溶胞物(PH2L)、嗜酸乳杆菌H4溶胞物(AH4L)具有较高NO抑制率。

实施例3：高NO抑制率活性益生菌发酵物的配比试验。

将实施例2中筛选所得的三株活性益生菌溶胞物进行复配，筛选出按照不同质量比率混合后具有协同增效NO抑制率的配比组合。

步骤1：

将实施例2制得的双歧杆菌H1溶胞物(BH1L)、植物乳杆菌H2溶胞物(PH2L)、嗜酸乳杆菌H4溶胞物(AH4L)，按照表3所示的质量比例混合，用超纯水稀释2倍后作为样品备用。

步骤2：

NO抑制率试验——取96孔板，分别加入0.5mM的亚硝基铁氰化钠二水化合物(SNP)溶液50μL，加入步骤1样品10μL后，在UV-A照射60min后，添加Griess试剂A(1％磺胺溶在2％磷酸水溶液)50μL，Griess试剂B(0.1％N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐)50μL，在550nm处检测吸光值。

计算方法：

抑制率％＝[1-(As/Ac)]×100；

测试结果用Calcusyn 2.0计算出EC 50时的CI(combination index)值，其中CI＝1添加有效果，CI<1具有协同效果，CI>1具有拮抗效果。测试结果如下表3所示：

表3

组号	BH1L份数	PH2L份数	AH4L份数	CI指数
					1	1	1	4	0.82
2	1	2	3	0.75
					3	1	3	2	0.77
4	1	4	1	0.92
					5	2	1	3	0.66
6	2	2	2	0.95
					7	2	3	1	0.95
8	3	1	2	0.68
					9	3	2	1	0.77
10	4	1	1	0.83

注：BH1L为双歧杆菌H1溶胞物；PH2L为植物乳杆菌H2溶胞物；AH4L为嗜酸乳杆菌H4溶胞物。

实施例4：

操作步骤：

步骤1:

取实施例2中制备的三种益生菌溶胞物：双歧杆菌H1溶胞物(BH1L)、植物乳杆菌H2溶胞物(PH2L)、嗜酸乳杆菌H4溶胞物(AH4L)按照质量比2：1：3混合得到复合物。复合物分别用DEME稀释5倍(对应图1的20％浓度)、10倍(对应图1的10％浓度)、20倍(对应图1的5％浓度)。比如：10％浓度的100μL DMEM样品体系中，含10μL复合物、90uL DMEM。

TNF-α含量测试方法：

细胞接种：RAW264.7细胞在完全培养基中生长(含10％FBS和1％双抗的高糖DMEM培养基)。取出培养基，PBS洗，再加入6mL PBS，将细胞放置培养箱10min(根据细胞贴壁情况可适当延长)，收集细胞，按照1.5×10⁴个/孔接种于96孔板中，每孔100μL，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。吸出培养基，空白组加入100μL DMEM，对照组加入100μL含1μg/mL LPS的DMEM，样品组加入100μL含1μg/mL LPS和不同浓度复合物的DMEM。7h后，收集培养液，用ELISA试剂盒检测TNF-α含量。

测试结果如图1所示，当复合物浓度达到5％，即达到50mg/mL时，能显著降低TNF-α的含量。

实施例5具有抗炎活性的三重益生菌发酵复合物的制备

种子培养：

将筛选得到的双歧杆菌H1、植物乳杆菌H2、嗜酸乳杆菌H4，于厌氧手套箱中分别接种在益生菌液体培养基，放置在厌氧培养箱中培养24h，获得益生菌种子液；

发酵罐发酵：

发酵罐接种，将培养好的益生菌种子，按照1％接种量分别接种至3只装有7L无菌益生菌培养基的10L发酵罐中培养，37℃，200rpm搅拌开始发酵，过程通入氮气保压，用2mol/L氢氧化钠调节pH在6.5～7.0范围内。当发酵至罐内葡萄糖消耗完全，菌种OD₆₀₀不再上升时，发酵结束。

发酵液后处理：

5000g离心10min，收集菌泥沉淀，将菌泥用纯净水按照1：9比率重悬起来，采用高压匀浆机，1200Bar破壁4遍，过程温度控制在37℃。破壁液采用200nm陶瓷膜过滤，得到双歧杆菌H1溶胞物、植物乳杆菌H2溶胞物、嗜酸乳杆菌H4溶胞物；并分别按照2：1：3的比率混合，得到具有抗炎功效的三重益生菌发酵复合物。

实施例6具有抗炎功效三重益生菌发酵复合物安全性评价。

人体斑贴试验

根据标准：《化妆品安全技术规范》-2015版规定进行试验。

试验方法如下：

选取30名(20～40岁)受试者，受试者身体健康，皮肤健康状态良好，无高度过敏体质，且近一个月未进行过斑贴试验。

将实施例5中制备得到的三重益生菌发酵复合物，滴加在斑贴测试器所附载的滤纸片上，滴加量为20μL，对照孔为空白对照(去离子水)，并将载有受试样品滤纸片的斑贴器黏贴在前手臂内侧。持续作用24h后，去除斑贴器，静坐30min，待压痕消失后观察皮肤的反应。分别记录揭掉斑贴器后30min、24h、48h斑贴处皮肤的反应。结果如下表4所示：

表4

注：10％表示浓度为10％三重益生菌发酵复合物、50％表示浓度为50％三重益生菌发酵复合物、100％表示100％三重益生菌发酵复合物。

表中-表示阴性反应，安全无刺激；±表示可疑反应(微弱红斑)；+表示弱阳性反应(出现明显红斑、水肿)

试验结果：人体斑贴试验受试者30例均表现为阴性反应，无刺激性。

(2)鸡胚绒毛尿囊膜试验:

鸡胚绒毛尿囊膜血管试验是通过检测化学物质对绒毛尿囊膜的损伤来评价刺激性。

实验设计：

1.阳性对照：0.1N氢氧化钠(NaOH)溶液

1％SDS(Dodecyl Sulfate Sodium Salt)溶液

2.阴性对照：0.9％灭菌生理盐水(NaCl)溶液

3.测试样品：实施例5制备的三重益生菌发酵复合物

实验结果如图2所示。

如图2所示，HET-CAM assay中，0.9％灭菌生理盐水无明显变化；1％SDS溶液毛细血管逐渐消失；0.1N氢氧化钠(NaOH)溶液，1min部分较细血管边缘逐渐模糊，5min细血管开始消散，10min主血管逐渐模糊，部分血管完全消散；100％三重益生菌发酵复合物无明显变化。因此高浓度的三重益生菌表现出无刺激。

实施例7

具有抗炎功效的三重益生菌发酵复合物在化妆品配方中的应用：

表5三重益生菌抗炎精华液

表6三重益生菌抗炎乳液

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.组合物，其特征在于，含有双歧杆菌Bicilia-B01的溶胞物、植物乳杆菌Bicilia-Lp01的溶胞物、嗜酸乳杆菌Bicilia-La01的溶胞物，三者的质量比例是2:1:3或3:1:2；

所述溶胞物是指液态培养结束后，离心除去发酵上清液，收集微生物菌体，将菌体破碎、过滤，收集滤清部分，即得到溶胞物；

所述双歧杆菌Bicilia-B01（Bifidobacterium sp. Bicilia-B01），于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO: M 2021469；

所述植物乳杆菌Bicilia-Lp01（Lactobacillus plantarum Bicilia-Lp01），于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO: M 2021472；

所述嗜酸乳杆菌Bicilia-La01（Lactobacillus acidophilus Bicilia-La01），于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO: M 2021471。

2.应用权利要求1所述组合物制备的护肤品。

3.权利要求1所述组合物在制备护肤品中的用途。

4. 双歧杆菌Bicilia-B01（Bifidobacterium sp. Bicilia-B01），于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO: M 2021469。

5. 植物乳杆菌Bicilia-Lp01（Lactobacillus plantarum Bicilia-Lp01），于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO: M 2021472。

6. 嗜酸乳杆菌Bicilia-La01（Lactobacillus acidophilus Bicilia-La01），于2021年4月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学；保藏编号为：CCTCC NO: M 2021471。

7.权利要求4所述双歧杆菌Bicilia-B01或权利要求5所述植物乳杆菌Bicilia-Lp01或权利要求6所述嗜酸乳杆菌Bicilia-La01在制备护肤品中的用途。