KR20140100235A - 광조사된 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)을 유효성분으로 포함하는 항생용(antibiotic) 조성물 - Google Patents

광조사된 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)을 유효성분으로 포함하는 항생용(antibiotic) 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광조사된 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)을 유효성분으로 포함하는 항생용(antibiotic) 조성물에 관한 것으로, 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO), 광조사된 환원형 그래핀 산화물 또는 광조사된 그래핀 복합체(graphene composite)를 유효성분으로 포함하는 항생용(antibiotic) 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 그래핀 기반 물질의 항생 활성을 증가시키는 방법을 제공한다: (a) 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO), 환원형 그래핀 산화물 및 그래핀 복합체(graphene composite)로 구성된 군으로부터 선택되는 그래핀 기반 물질을 준비하는 단계; 및 (b) 상기 그래핀 기반 물질에 광조사(photoirradiation)시키는 단계. 이러한 본 발명은 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에 대하여 탁월한 항생 활성, 즉, 정균/살균 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 강력한 항생 활성을 가지므로, 인체와 직접적으로 관련된 여러 분야에 적용되는 항생 물질로 유용하고 안전하게 사용할 수 있다.

Description

광조사된 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)을 유효성분으로 포함하는 항생용(antibiotic) 조성물{Antibiotic composition comprising UV irradiated-Graphene Oxide as an active ingredient}
본 발명은 광조사된 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)을 유효성분으로 포함하는 항생용(antibiotic) 조성물에 관한 것이다.
그래핀 산화물(Graphene oxide, GO)는 고 표면적 대 체적비(high surface-to-volume ratio), 기계적 강도 및 전기적 전달 특성과 같은 놀라운 물리-화학적 특징을 갖는 다목적의 얇은 탄소나노물질이다[1,2]. GO 나노시트(nanosheet)의 다양한 유도체들은 생화학 센서[3], 나노복합체(nanocomposites) [4], 광촉매(photocatalysis)[5], 나노전자공학(nanoelectronics)[6] 및 에너지 저장[7]에 많이 응용되며 활발하게 연구되어왔다. 다른 나노구조체들과 그래핀 유도체들의 기능화는 전기촉매 및 마찰공학 연구에 대한 이례적인 잠재력의 시너지 효과를 제공한다[8,9]. 그래핀 기반의 물질들이 유망한 응용을 위하여 종합 분야에서 많이 연구되고 있으나[3-9], 지금까지의 그래핀 기반 물질들의 바이오 의학적 응용은 상대적으로 제한적이다. 그러나, 최근 그래핀 기반 물질들의 생물학적 응용(예를 들면, 인간 골아세포 및 중간엽 기질세포의 세포 부착 증진 및 신경 줄기세포의 신경세포로의 분화 향상)에 대하여 많은 관심들이 집중되고 있다[10-12]. 한편, 그래핀 물질들은 세포막에 침착되어 강한 독성을 나타내고 세포자멸사(apoptosis)를 유발하는 것으로 나타났다[13]. 항-감염제의 개발을 위하여 그래핀 기반 나노시트의 이러한 특정한 세포독성을 활용하는 것은, 헬스케어환경의 개선에 대한 폭넓은 관심을 받아 성장 중인 분야이다.
미생물에서 일어나는 약물 저항성의 일반적인 발생은 의료 연구자들 및 재료 화학자들로 하여금 고 효용성의 항-미생물 특성을 갖는 신규 고급 소재를 확립할 수 있도록 하였다. 나노수준의 물질들과 그것의 하이브리드(예컨대, Ag, Cu, CuO, ZnO, MgO, TiO2 및 탄소나노튜브(carbon nanotubes, CNTs))는, 거대 물질(bulk material)과 비교하여 보다 우수한 항-미생물 효능을 나타냈다[14]. 또한, 선택적인 기능화 전략으로, 각각의 나노구조의 항-미생물 특성을 최적화하여 효과를 향상시킬 수 있다[15]. 실제로, 고 종횡비(high aspect ratio) 가장자리를 갖는 GO 나노시트는 미생물과의 직접적인 상호작용에 있어서 이상적인 나노구조 중 하나로 제시된다[16]. 최근 그래핀 및 그의 유도체를 기반으로 한 항-박테리아 연구들이 보고되었다. 즉, 그래핀 기반 항-박테리아 종이[17], 그래핀-키토산 복합체 필름[18], GO-코팅 섬유 직물[19], 그래핀-ZnO 하이브리드[20] 및 은-GO 기반 나노복합체[21-25]이다. 비록 그래핀 기반 물질들의 항-박테리아 특성에 관련된 일부 연구들이 보고되었으나, 다양한 박테리아 종에 대한 GO 나노시트의 항-박테리아 활성 및 작용 메카니즘에 대한 상세한 연구는 현재까지 보고된 바가 없다. 일반적으로, 특히 GO 나노시트 분산의 경계면에서 포유류 세포 및 미생물의 움직임은 명확하게 알려지지 않았다. 사실, 항박테리아 활성에 영향을 미칠 수 있는 GO 물질들의 몇 몇 중요한(임계적인) 물리-화학적 특징들이 있으나, 명확하지는 않다. 또한, 각각의 박테리아 종의 반응 복합성 및 GO 표면 상태 때문에, 작용 메카니즘을 밝히거나 이해하는 것은 어려운 일이다. 따라서, GO 나노시트의 항-박테리아 특성을 종합적으로 분석 연구하는 것이 가장 중요하다. 예를 들어, GO 나노시트의 최소 억제 농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)의 결정, GO 나노시트의 최소 살균 농도(minimum bactericidal concentration , MBC)의 결정 및 근본적인 작용 메카니즘의 평가, 특히 각각 다른 박테리아 종에 대한 평가가 특성을 밝히는 데 있어 주요한 특징이다. 또한, 낙관적인 적용을 위하여 개선된 특징을 분석하는 데 있어 광-활성화 GO 나노시트의 항-박테리아 특성 연구는 매우 신규한 것이다.
본 발명에서, 본 발명자들은 마이크로-희석법을 이용하여 그람-음성 박테리아 2 종 및 그람-양성 박테리아 2 종에 대한 GO 나노시트의 유효한 항-박테리아 효능을 확인하였다. 두 가지 다른 표면 상태, 즉, 자외선(ultraviolet, UV) 조사(irradiation) 전과 후(박테리아 접종 없이 물질 단독)에서 박테리아의 두 가지 유형 모두에 대한 GO 나노시트의 MIC 값을 측정하였다. 그리고 간단한 광반응이 나노물질의 물리/화학적 특성을 변경시킬 수 있다는 것을 확인하였다[26]. 이에, 본 발명에서 본 발명자들은 GO 나노시트의 두 가지 표면 상태를 활용하여 그들의 항-박테리아 특성을 확인하였다. X-선 광전자 스펙트럼(XPS) 및 자외선 광전자 스펙트럼(UPS) 기법을 이용하여 GO 나노시트의 물리-화학적 특징(UV 조사 전후)을 조사하였다. 또한, β-D-갈락토시다아제의 활성을 측정하여 일반 GO 나노시트 MBC 값 및 항-박테리아 작용 메카니즘을 확인하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 그래핀 기반 물질의 특성을 이용하여 항생용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 이에 본 발명자들은 그래핀 산화물을 광조사(특히, UV를 이용하여 광조사)한 경우, 그래핀 산화물의 항생(antibiotic) 효과가 크게 증가함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 광조사된 그래핀 기반 물질(Graphene-based material)을 유효성분으로 포함하는 항생용(antibiotic) 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 그래핀 기반 물질의 항생 활성을 증가시키는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 광조사된 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO), 광조사된 환원형 그래핀 산화물 또는 광조사된 그래핀 복합체(graphene composite)를 유효성분으로 포함하는 항생용(antibiotic) 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 그래핀 기반 물질의 항생 활성을 증가시키는 방법을 제공한다:
(a) 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO), 환원형 그래핀 산화물 및 그래핀 복합체(graphene composite)로 구성된 군으로부터 선택되는 그래핀 기반 물질을 준비하는 단계; 및
(b) 상기 그래핀 기반 물질에 광조사(photoirradiation)시키는 단계.
본 발명자들은 그래핀 기반 물질의 특성을 이용하여 항생용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 이에 본 발명자들은 그래핀 산화물을 광조사(특히, UV를 이용하여 광조사)한 경우, 그래핀 산화물의 항생(antibiotic) 효과가 크게 증가함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 광조사된 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO), 광조사된 환원형 그래핀 산화물 또는 광조사된 그래핀 복합체(graphene composite)를 유효성분으로 포함하는 항생용(antibiotic) 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “그래핀(Graphene)”은 탄소의 동소체 중 하나로서, 구조적, 화학적으로 매우 안정한 전도성 물질을 의미한다. 그래핀은 탄소원자들이 각각 sp2 결합으로 연결된 원자 하나 두께의 2 차원 구조로 육각형 형태 벌집 모형의 결정 구조를 이룬다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)”은 그래핀에 다양한 기능기가 붙은 산화된 형태를 의미한다.
그러나, 흑연의 산화와 초음파 분쇄 과정을 거쳐 생성된 그래핀은 기저면에 다양한 기능기를 갖게 되고 이로 인하여 완벽한 결정 구조에서 나타나는 그래핀 고유의 우수한 전기적 구조적 특성을 잃어버리게 된다. 이 특성을 복원하기 위해서는 추가적으로, 산화된 그래핀을 환원제로 환원시키는 과정이 필요하다. 즉, 그래핀 산화물 제조 과정에서는, 손상된 기저면을 복구시키기 위하여 그래핀 산화물을 환원시킨 환원형 그래핀 산화물을 만드는 것이 필수적이다. 이러한 환원형 GO(Reduced GO)를 획득하는 통상적인 방법 중의 하나가 장기간의 광조사 또는 광반응이다.
그러나 본 발명에서는 단기간의 광조사를 이용한다. 이는 일반적으로 알려진 결과와 다르게, 환원 대신에 GO의 기저면 및 가장자리의 산소 라디칼을 활성화시킴으로써 화학적 상태를 변경시키고 이로 인하여 항생 효과가 극대화될 수 있다.
GO의 기저면 및 가장자리 부분은 안쪽 부분에 비해 상대적으로 반응성이 높아 외부원소들과 화학적으로 결합된 많은 부분들이 존재한다. 특히 이들과 화학적으로 결합하는 외부 원소들 중 산소는 외부 원소의 대부분을 차지하며 이와 결합된 다양한 기능기들이 표면에 존재하게 되며, 광조사 과정을 거치면서 그래핀 표면에는 자유 라디칼 (free radical)과 같은 높은 반응성을 가진 부분이 남게 된다. 이러한 산소 자유 라디칼이 미생물에 영향을 미쳐 탁월한 항생 효과가 나타난다.
본 명세서에서 본 발명을 언급하면서 사용되는 용어 “광조사”, “광화학”, “광반응” 또는 “광촉매”는 어떤 유의 광(light)을 물체에 노출시켜 그것의 화학적, 물리적 또는 전기적 변화를 일으키는 것을 의미한다.
공지된 광원으로서, 예를 들어, 저압 수은 램프, 중압 수은 램프, 고압 수은 램프, 초고압 수은 램프, 엑시머 레이저, 화학적 램프, 흑광 램프, 마이크로파 여기 수은 램프, 금속 할라이드 램프, 나트륨 램프, 할로겐 램프, 제논 램프, 형광 램프, 태양광, 및 전자 빔 조사 기구 등이 이용될 수 있다. 또한, 필터가 불필요한 파장을 감소 또는 제거하기 위해 사용되거나, 또는 각종 광원이 조합되어 사용될 수 있다. 다수의 광원이 조합되어 광원으로서 사용되는 경우, 각종 광원으로부터 동시 조사, 시간차를 둔 연속 조사, 또는 동시 조사 및 연속 조사가 조합될 수 있다. 또한 광원은 용도에 따라서 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에서 이용할 수 있는 광으로는, 단파장의 광이면 어떠한 광도 이용할 수 있으며, 이에 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 광조사는 자외선(UV) 광, 가시선광, 적외선(IR) 광 또는 엑시머 레이저를 이용하여 실시하며, 예를 들면, 자외선(UV) 광이다.
본 발명의 광조사에 이용된 자외선(UV)은 100-400 nm 파장의 광이며, 예컨대, 150-350 nm, 200-300 nm, 220-280 nm 또는 240-260 nm 파장의 광이다.
본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 광조사는 자외선(UV) 광으로 10-40분 단기간 조사하는 것이며, 예를 들면 10-30분, 15-25분이다. 이러한 단기간의 자외선 조사는 GO의 완벽한 환원을 야기하지 않는다.
또한 본 발명에 따르면, 광조사 강도, 광조사 시간, 조사광 파장에 의해서도 본 조성물의 생성과 그 형상을 제어할 수 있다. 즉, 산소 작용기의 변형(alteration)은 노출 기간, 광원의 파장/강도 및 광원과 시료 사이의 거리와 같은 변수에 매우 의존적이므로 용도에 따라 적절히 변경할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항생용 조성물은 항박테리아, 항진균 또는 항바이러스 활성을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “항생용 조성물(antibiotic composition)”은 바이러스, 균류(fungi), 원생동물(protozoa) 및 세균(bacteria)을 포함하는 미생물을 사멸하거나 성장을 억제시키는 항생 물질(antibiotics)을 함유한 조성물을 의미한다. 따라서, 상기 항생 물질은 항생 활성, 즉, 항박테리아 활성(antibacterial activity), 항진균 활성(antifungal activity) 또는 항바이러스 활성(antiviral activity)을 갖는다. 예를 들면, 본 명세서에서 항생용 조성물은 항박테리아 활성을 갖는 조성물이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 항생용 조성물은 상기 항생 활성을 갖는 한 제한되지 않으며, 예컨대, 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아에 대해 항생 활성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 그람 음성 박테리아는 프로테우스(Proteus) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 클렙시엘라(Klebsiella) 속, 에스체리치아(Escherichia) 속 및 살모넬라(Salmonella) 속으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아이며, 예를 들면, 에스체리치아(Escherichia) 속 및 살모넬라(Salmonella) 속 박테리아이다. 또한, 상기 그람 양성 박테리아는 프로피오니박테리움(Propionibacterium) 속, 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속 및 엔테로코커스(Enterococcus) 속 으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 박테리아이며, 예를 들면, 바실러스(Bacillus) 속 및 엔테로코커스(Entercoccus) 속 박테리아이다.
본 발명에서 유효 성분으로 이용될 수 있는 그래핀 산화물은 광조사된 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO), 광조사된 환원형 그래핀 산화물 또는 광조사된 그래핀 복합체(graphene composite)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 유효 성분은 광조사된 그래핀 산화물이고 그의 (O1s)/(C1s)비는 2.00-2.30이며 예컨대, 2.17이다. 본 발명에서 XPS를 이용하여 측정하였을 때, N-GO의 (O1s)/(C1s)비는 1.86이며 UV 조사 20분 후(UV-GO)의 (O1s)/(C1s)비는 2.17로, UV-GO의 (O1s)/(C1s)비가 N-GO에 비하여 약 1.2 배가 증가하였다. 또한 GO의 O1s 피크 강도도 UV 조사 20분 후 증가된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 유효 성분은 광조사된 그래핀 산화물이고 284.6 eV, 285.6 eV, 287.3 eV 및 288.7 eV 결합에너지에서 각각 C-C, C-OH, C-O-C 및 O=C-OH에 대한 피크를 나타낸다. 본 발명에서 상기 UV-GO의 피크들은 N-GO의 피크들에 비하여 약간씩 오른쪽으로 이동하였으며, 이는 C1s 값이 증가되었음을 나타낸다.
이러한 결과들은 그래핀 산화물 표면에 C=O, CO-O-CO 또는 COOH와 같은 산소 작용기들이 새롭게 형성되어 O1s 피크가 증가하고, 이로 인해 (O1s)/(C1s)비가 증가한 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 UV 조사에 의하여 산소 작용기가 활성화된다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 유효 성분은 광조사된 그래핀 산화물이고 4.00-4.50 eV 일함수(work function)를 가지며, 예컨대, 4.25 eV이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “일함수(work function)”는 물질 내에 있는 전자 하나를 표면에서 외부로 방출시키기 위해 필요한 최소의 열 또는 빛 등의 에너지 또는 일을 의미한다. 물질 내의 전자를 낮은 에너지 준위부터 채웠을 때, 가득 찬 최고의 에너지준위(페르미준위)와 물질의 전기력을 갓 벗어난 에너지준위와의 에너지 차이이다.
본 발명에서 UPS 스펙트럼에 의하여 측정된 N-GO 나노시트의 일함수는 4.4 eV이며, UV 조사 20분 후의 UV-GO 나노시트의 일함수는 4.25 eV로, N-GO 나노시트에 비하여 약 4 %가 감소하였다. 이러한 일함수의 감소는, 조사 후 일부 산소화된 기의 제거로 인한 전자 농도의 증가에 기인한 것일 수 있다.
따라서, GO 나노시트의 UV 조사가 GO의 전자적 구조에 있어 중요한 변화를 야기한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 유효 성분은 나노구조이다.
본 명세서에서 용어 “나노구조”는 직경 500 nm 이하, 예를 들면 400 nm 이하, 다른 예로는 200 nm 이하, 또 다른 예로는 100 nm 이하, 다른 예로는 60 nm 이하를 가지는 구조체를 의미한다. 상기 나노구조는 나노시트, 나노선, 나노섬유, 나노막대, 나노튜브, 분쇄 나노선, 나노플레이트, 나노박막, 나노테트라포드, 트리포드, 바이포드, 나노결정, 나노점, 양자선 또는 나노입자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 나노구조는 예컨대, 나노시트, 나노선, 나노막대, 나노튜브, 분쇄 나노선, 나노테트라포드, 트리포드, 바이포드, 나노결정, 나노점, 양자선 또는 나노입자이다.
본 발명의 유효성분인 그래핀 산화물은 본 발명의 조성물에 0.1-100 μg/ml, 0.2-50 μg/ml, 0.2-30 μg/ml, 0.2-10 μg/ml, 0.2-5 μg/ml, 0.2-3 μg/ml 또는 0.2-2 μg/ml로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 유효성분인 그래핀 산화물 외에, 추가적으로 항생 활성을 가지는 다른 공지된 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 무기계 화합물 또는 기타 천연물질이다.
무기계 화합물로는 몰리브덴(Mo), 비스무스(Bi), 코발트(Co), 바나듐(V), 은(Ag), 구리(Cu), 아연(Zn), 루데늄(Ru), 스트론튬(Sr), 칼륨(K), 가리윰(Ga), 탄타니윰(Ta), 타일리윰(Tl), 니오비윰(Nb), 백금(Pt), 철(Fe), 규소(Si), 지르코늄(Zr), 알루미늄(Al), 카드늄(Cd), 주석(Sn), 텅스텐(W), 니켈(Ni), 게르마늄(Ge), 안티몬(Sb), 인(P), 세슘(Cs), 바륨(Ba), 란타늄(La), 악티늄(Ac) 및 아세닉(As)을 포함할 수 있다. 기타 천연물질로는 식물추출물, 키토산 및 황토를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 항균이 필요한 물품에 사용될 수 있으며, 특히 본 발명의 항생용 조성물 자체를 이용한 물품으로도 제작될 수 있지만, 필름 형태 또는 코팅용 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항생용 조성물 자체를 이용하여 항균 타일을 제작할 수 있으며, 또한 일반 타일에 본 발명의 조성물로 이루어진 필름을 입힐 수도 있으며, 본 발명의 조성물을 분사하여 코팅을 통해 항균 기능성을 부여할 수도 있다.
본 발명의 조성물이 적용되는 분야는 특별히 종류를 한정하는 것은 아니며, 용도에 따라 적절히 적용할 수 있다. 예를 들면, 항균 도마, 항균 치약 용기, 항균 칫솔갑, 항균 화장품 용기, 항균 쓰레기통, 항균 대야, 항균 컵, 항균 병, 항균 쌀통, 항균 김치통, 항균 바가지, 항균 포장지, 항균 식품저장용기, 항균 박스, 항균 양념통, 항균 물통, 항균 음료용 병, 항균 부직포, 항균 섬유, 항균 행주, 항균 걸레, 항균 수세미, 항균 이불 커버, 항균 침대 커버, 항균 식탁매트, 항균 변기 시트 커버, 항균 불고기판, 항균 기저귀, 항균 생리대, 항균 마스크, 항균 붕대, 항균 밴드, 항균 의료 물품, 항균 과일 포장지, 항균 꽃 포장지, 항균 벽지, 항균 장판 및 항균 타일 등에 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 그래핀 기반 물질의 항생 활성을 증가시키는 방법을 제공한다:
(a) 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO), 환원형 그래핀 산화물 및 그래핀 복합체(graphene composite)로 구성된 군으로부터 선택되는 그래핀 기반 물질을 준비하는 단계; 및
(b) 상기 그래핀 기반 물질에 광조사(photoirradiation)시키는 단계.
본 명세서에서 사용되는 용어 “항생 활성 증가”는 그래핀 기반 물질의 표면에서 산소 라디칼(Oxygen radical)을 형성하여 박테리아 세포의 성장을 저해(정균) 또는 사멸시키는 능력(살균)이 향상된 것을 의미한다.
본 발명에서는 본 발명의 항생 활성을 확인하기 위하여, 그람-음성 박테리아 및 그람-양성 박테리아에 대한 N-GO 및 UV-GO 나노시트들의 MIC 및 MBC를 이용하였고, 이는 본 발명의 탁월한 정균 효과 및 살균 효과를 나타낸다.
MIC의 경우, UV-GO 나노시트(20 분 조사)는 E. coli 및 S. typhimuirum에 대하여 0.125 /mL의 MIC, B. subtilis에 대하여 0.25 /mL의 MIC 및 E. faecalis에 대하여 0.5 /mL의 MIC를 나타내었다. N-GO 나노시트는 E. coli 및 S. typhimuirum에 대하여 0.25 /mL의 MIC, B. subtilis에 대하여 0.5 /mL의 MIC 및 E. faecalis에 대하여 1 /mL의 MIC를 나타내었다. 즉, UV-GO 나노시트의 정균 효과는 N-GO의 MIC와 비교하여 각각 2 배씩 유효하게 향상되었다. 또한 이는 기준 항생제인 카나마이신보다 E. coli , S. typhimuirum 및 B. subtilis에 대하여 각각 512 배, E. faecalis에 대하여 256 배에 달하는 탁월한 정균 효과를 보여주고 있다.
MBC의 경우, N-GO 나노시트는 E. coli 및 S. typhimuirum에 대하여 0.5 /mL의 MBC, B. subtilis에 대하여 1 /mL의 MBC 및 E. faecalis에 대하여 2 /mL의 MBC를 나타내었다. 즉, N-GO 나노시트는 탁월한 살균 효과를 나타내고 있다.
또한 본 발명은, UV-나노시트의 향상된 항생 활성을 더욱 확인하기 위하여, 대표적인 박테리아 모델인 E. coli를 이용하여 추가적으로 효소 어세이를 실시하였다. 이는 박테리아 세포막이 파괴되면, 살아있는 박테리아 세포의 β-D-갈락토시다아제는 세포 밖으로 유출되어서 시약 속 ONPG (o-nitrophenol-β-D-galactopyranoside)의 가수분해를 추가적으로 촉진시켜 ONP (o-nitrophenol)를 형성하고, 이러한 ONPG 가수분해의 생산물인 ONP의 특정 흡광도를 측정하여 박테리아의 활성을 확인하는 방법이다.
본 발명에서는 ONPG를 함유한 세포 현탁액에 N-GO 및 UV-GO 시료와 같은 두 가지 종류의 GO 나노시트를 첨가하였다. 대조군 웰의 E. coli는 온전하기 때문에, ONPG를 촉매하는 β-D-갈락토시다아제가 현탁액으로 유출되지 않으므로, 대조군의 흡광도는 시간에 따라 달라지지 않는다. 그러나 본 발명의 방법에 따라 처리한 웰에서의 420 nm 흡광도는 시간에 따라 증가하였고, 이는 N-GO 및 UV-GO 나노시트가 E. coli의 세포막을 파괴하였다는 것을 명확하게 나타낸다. 특히, UV-GO 나노시트의 OD 곡선은 시간에 따라 N-GO 나노시트보다 약 2 배씩 증가하였으며, 이는 UV-GO 나노시트가 N-GO 나노시트보다 더욱 높은 수준의 세포 파괴 작용을 한다는 것을 나타낸다.
이러한 현상들은 GO 나노시트 표면에서의 광화학 반응의 영향으로부터 기인한다고 할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 단기간의 UV 노출은, GO 나노시트의 기저면 및 가장자리의 라디칼을 활성화시킴으로써 화학적 상태를 변경시킨다. 또한 이것은 활성 산소 작용기를 유지하고, 산소의 표면에 활성 라디칼을 보다 많이 생성하도록 하여, 결국 항생 활성이 탁월하게 증가된다.
본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 조성물을 실시할 수 있도록 구성된 것이므로, 이 들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 광조사된 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)을 유효성분으로 포함하는 항생용(antibiotic) 조성물을 제공한다.
(ⅱ) 또한 본 발명은 광조사를 이용하여 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)의 항생 활성을 향상시키는 방법을 제공한다.
(ⅲ) 이러한 그래핀 산화물은 그람 음성 및 그람 양성 박테리아에 대하여 탁월한 항생 활성, 즉, 정균/살균 효과를 나타낸다.
(ⅲ) 따라서, 본 발명은 강력한 항생 활성을 가지므로, 인체와 직접적으로 관련된 여러 분야에 적용되는 항생 물질로 유용하고 안전하게 사용할 수 있다.
도 1은 그래핀 산화물 나노시트의 UV-가시선 흡광도(a), 라만 스펙트럼(b), TEM 이미지(c) 및 ATM 이미지(d)를 나타낸다.
도 2는 일반 GO 나노시트에 대한 조사 스펙트럼(a) 및 Cls(b)와 20 분 동안 UV 조사된 GO 나노시트의 조사 스펙트럼(c) 및 Cls(d)를 나타내는 X-선 광전자 분광기(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS) 분석 결과이다.
도 3에서 (a)는 일반 GO 나노시트(N-GO, 흑색 선) 및 20 분 동안 UV 조사된 GO 나노시트(UV-GO, 적색 선)의 자외선 광전자 분광기(Ultraviolet photoelectron spectroscopy, XPS) 분석 결과이며, (b)는 (a)의 점선 부분을 확대한 것이다.
도 4는 GO 나노시트의 UV 조사 과정을 도식적으로 보여준다. UV 활성화 GO 나노시트는 산소 작용기를 보라색으로 표시하였다.
도 5는 GO 나노시트의 각각 다른 양에 따른 그람-음성(E. coli 및 S. typhimurium) 박테리아 콜로니(a)와 그람-양성(B. subtilis 및 E. Faecalis) 박테리아 콜로니(b)의 대표적인 페트리플레이트 이미지이다.
도 6은 E. coli에 대한 일반 GO 나노시트 및 UV 조사된 GO 나노시트의 시간별 ONP 흡광도를 나타내는 OD 곡선을 보여준다. 각 데이터의 포인트는 세 번을 독립적으로 실험의 평균을 나타낸다(±5% 오차). 오차 막대가 보이지 않는 경우는, 이는 기호보다 작다.
도 7은 GO 처리된 E. coli의 각각 다른 배율에서의 대표적인 FE-SEM 이미지이다((a) 및 (b)). (a)의 삽입된 이미지는 정상 E. coli 세포들의 형태를 보여준다(스케일 바=500 nm).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
재료 및 방법
1. 재료 및 기기
전구물질 시약 및 흑연 가루, 과망간산칼륨(KMnO4), 황산(H2SO4), 과산화수소(H2O2) 및 염산(HCL)과 같은 다른 화학 물질은 대정화금(주)(한국)으로부터 구입하였다. 모든 실험에는 18 MΩ 이상 저항의 Milli-Q water를 이용하였다. 본 발명에서 이용된 모든 화학물질들은 분석용 품질이며 추가적인 정제 없이 받아서 이용하였다. 직접 주입 티타늄 호른(direct immersion titanium horn)을 이용하여 VCX 750 모델(20 kHz, 75 W)로 초음파처리(ultrasonication)를 실시하였다. 분광광도기(Varian Cary 50)를 이용하여 UV-가시광선 분광광도계 분석을 실시하였다. 4.5 mV 레이저 전원과 Nd:YAG 레이저 빔 및 1,800 라인/mm 그레이팅(grating)을 갖는 532 nm 여기 파장의 조건으로 작동되는 LabRam HR800 micro-Raman spectroscope(Horiba Jobin-Yvon, 프랑스)을 이용하여 라만 스펙트럼을 기록하였다. 300kV 가속전압으로 고해상도 투과전자현미경(high resolution transmission electron microscope (HR-TEM), FEI Titan 80-300)를 이용하여 구조적 특징을 확인하였다. 간헐적 공기 모드(intermittent air mode)에서 원자현미경(Atomic force microscope (AFM), Bio-AFM Nanowizard II, JPK instruments)을 이용하여 이미지를 관찰하였다. HR-TEM용 구리 그리드를 이용한 드롭 캐스팅 방법(~5-10 μL)을 이용하여, 구조적 측정에 사용하는 GO 시료의 수용성 분산액을 제조하고, AFM용 운모 기질(mica substrate)을 새롭게 절단하였다. 각각의 측정 전에 외기 조건에서 용매를 증발시켰다.
단색(monochromatic) Al Kα(hν = 1486.6 eV)을 X-선 원(source)으로 하는 ESCALAB 250 XPS 분석기를 15 kV 및 150 W에서 작동하여, UV 조사(20 분) 전후 GO의 X-선 광전자 분광기(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS) 분석 결과를 측정하였다. Shirley 백그라운드 제거 후, 가우시안 요소를 이용하여 C(1s)피크를 디콘볼루션(deconvolution)하였다. He I (21.2 eV)을 광자원으로 하는 자외선 광전자 스펙트럼(Ultraviolet photoelectron spectroscopy, UPS) 분석을 실시하였다.
2. GO 나노시트의 합성
변형된 Hummers 방법에 따라 전구 물질인 흑연 가루를 이용하여 GO 나노시트의 갈색 콜로이드 현탁액을 합성하였다[27,5]. 요약하면, 흑연 가루 2 g을 98% H2SO4(35 mL)에 첨가하여 1 시간 동안 교반시켰다. KMnO4 6 g을 20℃ 이하의 온도를 유지하면서 상기 용액에 점진적으로 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 35℃에서 30 분 동안 교반시켰다. 상기 결과물에 90 mL 물의 첨가하여 희석하고 격렬히 교반시켜 어두운 갈색 현탁액을 수득하였다. 상기 현탁액에 30% H2O2 용액(10 mL) 및 증류수(150 mL)를 추가로 첨가하였다. 상기 결과물인 산화 흑연 현탁액을 2 시간 동안 교반시켰다; 5 % HCl 수용성용액을 이용하여 반복적으로 원심분리 및 여과하여 상기 혼합물을 세척하고, 상기 용액이 pH가 중성이 될 때까지 증류수를 처리하였다. 최종적으로, 160 mL의 물을 첨가하여 침전물을 생성시켰고, 초음파 처리를 통해 균일한 GO 현탁액을 제조하였다.
3. 박테리아 종
본 발명에서 이용되는 그람-음성 2 종 (Escherichia coli (KACC 10005) 및 Salmonella typhimurium (KACC 40253))및 그람-양성 2 종(Bacillus subtilis (KACC 14394) 및 Entercoccusfaecalis (KACC 13807))의 병원성 박테리아는 한국농업미생물자원센터(대한민국)로부터 획득하였다.
4. 항-박테리아 활성 테스트
마이크로-희석법[28]을 이용하여 일반 GO(N-GO) 나노시트 및 UV 조사시킨 GO(UV-GO) 나노시트의 항-박테리아 활성을 확인하고 기준 약물인 카나마이신(아미노글리코시드계 항생제)와 비교하였다. AMRESCO(미국)에서 구입한 LB 액체 배지(Miller, Luria-bertani; LB)를 박테리아 종들에 대한 희석제로 이용하였다. 멸균한 LB 배지에 밤새 부유 배양하여 접종물을 준비하였다. 96 웰 플레이트에 2 배로 희석한 GO 나노시트 및 기준 약물 시료를 준비하였다. 약 107 CFU/mL 세포들을 접종하였다. 각 웰의 최종 부피는 0.2 mL이며, 24 시간 동안 35℃에서 인규베이션하였다. ELISA 리더를 이용하여 590 nm에서 상기 마이크로웰 플레이트를 판독하여 최소 억제 농도(MIC) 값을 확인하였다. 밤새 접종 후 미생물의 가시적인 성장이 억제된 항-미생물 대상 물질의 가장 낮은 농도를 MIC로 나타내었다[29].
본 발명의 살균 효과를 검사하기 위하여, 문헌에 기재된 방법[30,31]에 따른 배치 배양(batch culture)으로부터 최소 살균 농도(MBC, 즉, 박테리아의 99.9 %가 사멸된 그래핀 산화물 나노시트의 가장 낮은 농도)를 확인하였다. 영양 배지 플레이트 상의 콜로니 존재 여부 정도를 근거로 하여, 살균 효과를 일으키는 그래핀 산화물 나노시트의 농도를 선택하였다.
5. 광조사 ( Photoirradiation ) 효과
UV 광조사 효과를 확인하기 위하여, 제작된 GO 나노시트(배양 배지에 접종하기 전)를 254 nm 파장의 UV 광에 20 분 동안 노출시켰다. N-GO 및 UV-GO 시료의 항-박테리아 분석을 위한 마이크로 희석을 개별적으로 실시하였다. 모든 실험은 3 번 반복 실시하여 그 평균값을 구하였다.
6. GO 나노시트의 항-박테리아 메카니즘 평가
β-D-갈락토시다아제의 활성을 측정하여 GO 나노시트의 항-박테리아 효과를 확인하였다. 본 발명에서는 변형된 ONPG(o-nitrophenol-β-D-galactopyranoside) 테스트 방법을 이용하였다[31,32]. ~107 CFU/mL 농도의 세포 현탁액 1 mL 및 25 mM 농도의 ONPG 용액 1 mL을 동시적으로 PBS 버퍼 용액(pH 7.4) 5.5 mL에 첨가하여 제조된 표준 용액을 37℃ 인큐베이터에서 15 분 동안 진탕하였다. 두 가지 다른 유형의 GO(즉, 일반 GO 및 20 분 UV 조사된 GO)를 각각 100 μL (0.5 μg/mL)씩 96 웰 플레이트에 첨가하고 개별적으로 표지하였다. PBS에 세포 현탁액 및 ONPG를 함유한 상기 표준 용액 100 μL를 각각의 웰에 첨가하고 표지하였다. 멀티-라벨 마이크로플레이트 리더(Perkin Elmer VICTOR3)를 이용하여 다른 시간 간격으로 420 nm(OD420 nm)에서 광학 밀도 변화를 측정하였다. 또한, GO가 없는 대조군 시료를 동일한 시간에서 측정하였다.
결과 및 논의
1. 광학 흡광도, 라만 스펙트럼 및 GO 나노시트의 형태
GO의 특징을 밝혀내기 위하여, 광학 흡광도, 격자 구조 및 형태와 같은 근본적인 특성을 실험하였고 다음과 같이 확인하였다. 변형된 Hummers 방법을 통하여 합성된 GO 나노시트의 수용성 분산액은 234 nm에서 최대 흡광도 파장을 나타냈다(도 1의 (a)). 이러한 흡광 피크는 GO 막의 폴리아로메틱(C-C 결합) 시스템(polyaromatic system)에서의 전형적인 π-π* 전자 전이(electron transition)와 일치한다. 약 300 nm에서의 숄더는 C-O 결합의 n-π* 전이 때문이다[33]. 라만 분광법은 탄소함유 물질의 격자 구조적 특징(예컨대, 결함, 불규칙 및 도핑 수준)을 확인하는데 효율적인 툴로 일반적으로 간주된다. D 및 G 밴드는 탄소 물질의 라만 스펙트럼의 특징으로 잘 알려져 있다. D-밴드는 A1g 대칭의 진동(breathing)κ-포인트 포논(phonon)으로부터의 규칙/불규칙 정도와 관련되어 있으며, G-밴드는 스택킹(stacking) 구조의 지표이며, 이는 sp2 혼성화 탄소 원자의 E2g 포논에 해당된다[34]. 도 1의 (b)에 나타난 바와 같이, 라만 스펙트럼은 각각 약 1352 cm-1에서 D-밴드, 1594 cm-1에서 G-밴드가 나타난다. 흑연의 일반적인 라만 스펙트럼은 ~1570-1cm에서 강한 G 피크가 나타나는 것으로 확인되었다[35]. 흑연이 산화함에 따라, G-밴드는 긴 파수(wave number) 쪽으로 이동하고 이는 기저면과 가장자리에 일부 산소화된 작용기를 갖는 GO가 형성되었기 때문이다. 추가적으로 GO의 지형적 구조를 가시화하기 위하여 HR-TEM(도 1의 (c)) 및 AFM(도 1의 (d))를 이용하였다. 두 이미지 모두 막에 주름이 있는 형태와 같은 얇은 시트로 구성되어 있다. 특히, HR-TEM 이미지는 GO 나노시트의 선명한 가장자리를 나타낸다. 또한 AFN 이미지에서도 GO 나노시트의 얇은 막 상의 주름 또는 얇은 홈이 확인되었으며 이는 TEM 이미지와 일치한다.
2. XPS 분석
UV 광 조사(20 분) 전후의 GO 나노시트의 화학적 상태 변화를 확인하기 위하여 XPS 분석을 이용하였다. N-GO 및 UV-GO의 조사 스펙트럼(survey spectrum) 및 디콘볼루션된(deconvoluted) C1s XPS 스펙트럼은 도 2의 (a)-(d)에 나타내었다. 관찰된 바와 같이 조사 스펙트럼은 약 284.6 eV에서 C1s 결합 에너지를 갖고 약 533.2 eV에서 O1s 결합 에너지를 갖는다. 흥미롭게도, GO의 O1s 피크 강도는 20 분 UV 조사에 의하여 증가된다(도 2c). XPS 스펙트럼으로부터 N-GO 및 UV-GO의 (O1s)/(Cls) 비율을 계산하였으며 각각 1.86과 2.17로 나타났다. 284.3 eV, 285.3 eV, 287.2 eV 및 288.5 eV 결합 에너지에 있는 N-GO의 디콘볼루션된 피크들은 각각 C-C, C-OH, C-O-C 및 O=C-OH 작용기에 의한 것이다(도 2의 (b))[16,36-38].
UV-GO의 피크들은 각각 C-C, C-OH, C-O-C 및 O=C-OH 작용기에 의하여 284.6 eV, 285.6 eV, 287.3 eV 및 288.7 eV 결합에너지로 약간 이동한 것을 확인하였다(도 2의 (d)). XPS 분석으로부터, UV 조사에 의하여 산소 작용기가 약간 활성화된다는 것을 확인하였다. 환원형 GO(Reduced GO)를 획득하는 주요한 방법 중의 하나가 광조사 또는 광반응이라는 것은 잘 알려져 있다. 일부 그룹들이 광조사를 기반으로 하여, 환원형 GO의 생산을 확인하였다. 예를 들면, Wu 등은 N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide)가 있을 때 GO 분산액에 UV를 조사하여 환원형 GO를 수득하였고[39], Ding 등은 UV 조사하여 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone, PVP) 안정화 환원 GO를 수득하였다[40]. UV 광조사외에도 태양광선 및 엑시머 레이저(excimer laser)와 같은 다른 광원들 또한 환원형 GO을 성공적으로 합성하는 것으로 확인되었다[41].
UV 조사 뒤 파생되는 GO 환원의 근본적인 메카니즘은 GO의 기저면과 가장자리의 산소 작용기(oxygen functional groups)가 제거되는 것이다. 그러나, 본 발명의 UV 조사(20 분)는 GO 표면 상의 산소 작용기의 원자 비율을 뛰어나게 활성화하였다. 이러한 결과는 공지된 문헌들과는 반대되는 것이다[39-41]. 본 발명자들은 XPS 결과로부터, 산소 작용기의 변형(alteration)이 노출 기간, 소스의 파장/강도 및 광원과 시료 사이의 거리와 같은 변수에 매우 의존적이라는 것을 제시한다. 단기간의 노출(즉, 20분 조사)은 GO 표면의 환원을 대신한 산소 라디칼의 기능적 변화에 대한 주요 원인이고; 반면, 모든 공지된 문헌들은, 2-10 시간과 같이 장시간의 UV 조사 후에만 수용성 GO가 환원형 GO로 환원됨을 보고하고 있다[39-41].
추가적으로 본 발명에서의 GO 조사에 이용된 UV 램프원은 ~254 nm 파장을 갖는다. 따라서, GO의 UV 조사 20 분은 GO의 완벽한 환원을 야기하지 않는다. 이러한 결과는 GO의 광화학 반응에 대한 최근의 보고와 일치한다. Koinumo 등은 두 가지 다른 환경, 예컨대, O2 및 N2에서의 GO의 광환원을 확인하였는데 N2에서는 광반응 후에 산소 함량이 즉시 감소했으나, 반면 O2에서는 UV 조사 30 분 까지 거의 변화가 없었다.
3. UPS 분석
UV광 조사 전후 합성된 GO 나노시트의 전자 구조를 규명하는데 자외선 광전자 스펙트럼(UPS)을 이용한다. 본 연구에서, 고광자 플럭스 UV원(high photon flux UV source)을 이용되며, 이는 높은 표면 민감도를 가지며 표면에 있는 흡착 분자 단층막을 연구하는 데 이상적이다.
UPS원은 가전자대(valence band) 전자만을 여기(excited)할 수 있기 때문에, 가전자대의 전자들의 분포에 관한 상세한 정보를 제공할 수 있으며, 이에 DOS(density of states)는 페르미 준위(Fermi level)에 가깝다. N-GO 및 UV-GO 나노시트 상에서 He-I UPS 측정기에 의하여 획득된 가전자대 스펙트럼은 도 3의 (a)에 나타나있다. 이는 일함수(work function,φ)를 갖는 스펙트럼의 너비 및 광자 에너지(hv) 간의 관계를 나타낸다. 컷 오프(cut off) 부분을 확대한 것은 도 3의 (b)에 나타냈다. UPS 스펙트럼에 의하여 측정된 상기 N-GO 나노시트의 일함수는 4.4 eV이다. 이것은 GO 나노시트의 일함수에 대한 이전의 보고들과 일치한다[43].
GO 나노시트의 UV 조사는 GO의 전자적 구조에 있어 중요한 변화를 야기한다. GO 나노시트에 20 분 동안 조사한 후, 일함수는 4.25 eV로 감소되었다. 이러한 일함수의 감소는, 조사 후 일부 산소화된 기의 제거로 인한 전자 농도의 증가에 기인한 것일 수 있다. 관찰된 일함수는 보고된 GO 값 및 그것의 환원된 형태 사이에 근접하게 누워있다[43,44]. 이것은 지속된 UV 노출이 GO의 환원을 야기한다는 것을 나타낸다. 비록 본 발명에서 UV광 노출에 의하여 GO의 전자적 상태가 변경된 것을 입증하고 있지만, 이러한 물질의 UV 조사 효과로 간주되는 선명한 사진을 관찰하기는 아직 힘들다. XPS 분석에서 언급한 바와 같이, GO 나노시트 표면 상의 산소 작용기의 제거를 매개하는 몇 가지 흥미로운 요소들이 있다.
4. GO 나노시트의 항-박테리아 특성 및 광조사 효과
나노물질과 미생물 간의 직접적인 상호작용을 통하여 세포 시스템을 물리적으로 붕괴하여, 나노물질의 정균(bacteriostatic)/살균(bactericidal) 특성에 대한 근본적인 메카니즘을 확인하였다. 이후의 메카니즘은, 증가된 활성 산소 종(ROS) 수준을 통한 산화적 스트레스의 발생으로 인한 것이다[45]. 이러한 과정들은 생물학적 시스템에서 호흡 효소들(respiratory enzymes)의 억제, APT 생산, 세포막 보전 및 수송 과정의 붕괴를 야기하고 궁극적으로 박테리아 세포를 사멸에 이르게 한다. 최근 CNT, 퓰러린(fullerene), 흑연, 산화 흑연 및 그래핀 나노복합체의 하이브리드와 같은 탄소 기반 나노물질들이 상당히 높은 항-박테리아 특성을 갖는 것으로 확인되었다[46-48]. 특히, 표면에 날카로운 가장자리를 갖는 초박형 시트의 GO/환원형 GO는 박테리아와 효과적으로 상호작용할 수 있고 유효한 생물학적 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인되었다[16]. 이러한 현상 외에도, 연구자들은 밀집된 그래핀 시트 사이에 박테리아가 갇힘으로써 미생물의 불활성이 나타날 수 있다는 것을 확인하였다[49]. 따라서, 그래핀 기반 물질의 항-박테리아 특성들의 근본적인 설명은 문헌들을 이용할 수 있다.
본 발명에서, 본 발명자들은 GO 나노시트들의 항-박테리아 활성(20분 UV 광조사 전후)을 비교 평가하였다. UV-GO의 항-박테리아 효과를 비교하는 특별한 이유는 그것의 UV 및 UV 근처 부분에서의 각각 유효한 광학 흡광 및 방출 스펙트럼 때문이다[8]. 초기 연구들에서, 기능화된 금속 나노구조들 및 GO 나노시트들의 UV 조사가 광화학 반응을 발생시킬 수 있고, 활성 광촉매를 나타낼 수 있는 것으로밝혀졌다. 최근 연구에서의 활성 광화학 반응 과정을 예상하면서, 본 발명자들은 20분 동안 254 nm 파장의 UV 조사하여 GO 나노시트를 처리하였다. XPS 분석에서 언급된 바와 같이, 긴 노출은 산소 작용기가 제거되어 GO 표면을 환원할 수 있기 때문에, 짧은 시간을 이용하였다. 또한 이것은 활성 산소 작용기를 유지할 수 있으며, 산소의 표면에 활성 라디칼을 보다 많이 생성하여 항-미생물 작용에 있어서 박테리아 세포막과 깊은 상호작용을 할 것으로 예상된다.
그람-음성 박테리아 및 그람-양성 박테리아에 대한 N-GO 및 UV-GO 나노시트들의 MIC를 확인하기 위하여 마이크로-희석법[28]을 이용하였다. 박테리아 배양액을 함유한 LB 액체 배지의 각 웰에, 준비된 검사 시료의 두 배인 희석액을 분산하였다. 표 1에서 보여주는 바와 같이, 본 발명에서 이용된 박테리아 종들이 GO 나노시트들의 낮은 농도에서 민감한 것을 확인하였다. UV 광조사(박테리아 접종물과 혼합하기 전)에 노출된 GO의 MIC가 N-GO 나노시트보다 향상된 효과를 나타내는 것을 관찰하였다. 검사된 4 가지 박테리아 종들 중, 그람-음성 박테리아는 그람-양성 종들보다 GO 나노시트들에 더욱 민감하였다. 예를 들어, E. coli 및 S. typhimuriumwere에 대한 N-GO의 MIC는 각각 0.25 /mL이나, B. subtilis 및 E. faecalis에 대한 MIC는 각각 0.5 및 1 /mL이다. 박테리아 성장 억제에 있어서, 잘 알려진 기준 항생제인 카나마이신의 결과보다 N-GO 및 UV-GO 나노시트의 MIC 결과가 비교적으로 우월하다. 도 4는 UV 조사 및 그로 인해 파생된 GO 나노시트의 항-박테리아 작용이 향상된 과정을 보여주는 그림이다. UV-GO의 보다 나은 항-박테리아 효능을 보여주기 위하여 색깔로 나타내었다. N-GO 나노시트에서는 녹색의 박테리아 세포(생존세포)가 조금 존재하지만, UV-GO 나노시트에서는 거의 모두 적색으로 보이는 박테리아 세포(사멸세포)를 확인할 수 있어 탁월한 항-박테리아 효과를 나타낸다.
그람-음성 및 그람-양성 박테리아 종들에 대한 GO 나노시트의 최소 억제 농도(MIC) 및 최소 살균 농도(MBC). 결과는 평균 ± 표준 편차이다(n=3).
박테리아 종 일반 GO (N- GO )의 MIC (/ mL ) UV 조사된 GO(UV-GO)의 MIC (/ mL ) 카나마이신의 MIC (/ mL ) 일반 GO (N- GO )의 MBC (/ mL )
E. coli 0.25 0.125 64 0.5
S. typhimurium 0.25 0.125 64 0.5
B. subtilis 0.5 0.25 128 1
E. faecalis 1 0.5 128 2
마찬가지로, GO의 살균 효과를 확인하는 데도 유효하다. 일반적으로 항세균제는 두 가지 유형, 즉, (i) 정균 및 (ii) 살균이 있다. 전자는 박테리아 성장을 억제하는 것으로 사멸하지 않는 반면, 후자는 사실상 박테리아들을 사멸하는 것이다[50]. GO 나노시트의 살균 효과를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 LB 영양 배지 페트리플레이트 상의 콜로니 존재 여부 정도를 근거로 하여 GO 나노시트의 MBC를 실험하였다[30,31]. 대조군 시료 및 다른 농도의 검사(예컨대, MIC 및 MBC) 시료를 함유하는 페트리플레이트들의 대표적인 사진들을 도 5의 (a)(그람-음성 종) 및 도 5의 (b)(그람-양성 종)에 나타내었다. 검사된 모든 박테리아 종들은 GO에 노출된 후 박테리아 콜로니 형성이 억제되었음이 도 5에 명백하게 나타난다. 이는 살균제로 작용할 수 있는 어떠한 물질도 MBC 값이 해당 MIC 값보다 4 배 이상 되지 않는다는 것을 보여준다[50]. 그러므로, 상기 GO 나노시트들의 MBC 실험 결과들은 GO 나노시트의 살균 활성을 증명한다.
UV-나노시트의 향상된 항-박테리아 효과를 더 깊이 확인하기 위하여, 대표적인 박테리아 모델인 E. coli를 이용하여 효소 어세이를 실시하였다. β-D-갈락토시다아제는 인체 및 미생물(예컨대, E. coli)에 존재하는 엑소글리코시다제(가수분해효소)이다. 이것은 당(이당류), 지방 및 글루코시드에서의 β-D-글루코시드 결합(β-D-glycosidic bond)에 대한 중요한 생물학적 역할인 가수분해 활성을 제공한다. 항세균제가 박테리아 세포(E. coli)를 파괴하면, 살아있는 박테리아 세포의 β-D-갈락토시다아제는 세포 밖으로 유출되어서 용액 속 ONPG (o-nitrophenol-β-D-galactopyranoside)의 가수분해를 추가적으로 촉진시켜 ONP (o-nitrophenol)를 형성한다. ONPG 가수분해의 생산물인 ONP는 420 nm의 특정 흡광도를 갖는다. ONPG는 구리/티타늄 산화물/키도산 나노입자 및 사차 암모늄염의 항-박테리아 메카니즘을 확인하는 데 이용되어왔다[31,32]. 본 발명에서는 ONPG를 함유한 세포 현탁액에 N-GO 및 UV-GO 시료와 같은 두 가지 종류의 GO 나노시트를 첨가하였다. 다른 시간 간격으로 420 nm의 특정 흡광도를 측정하였으며, 대조군의 흡광도 역시 같은 시간에 측정하였다.
광학 밀도(optical density, OD)곡선은 도 6에 나타내었으며, 이는 대조군의 흡광도가 시간에 따라 달라지지 않았다고 볼 수 있다. 대조군 웰의 E. coli는 온전하기 때문에, ONPG를 촉매하는 β-D-갈락토시다아제가 현탁액으로 유출되지 않는다. 그러나 항세균제를 처리한 웰에서의 420 nm 흡광도는 시간에 따라 증가하였고, 이는 N-GO 및 UV-GO 나노시트가 E. coli의 세포막 및 세포내 성분인 β-D-갈락토시다아제를 상당히 파괴하였다는 것을 명확하게 나타낸다. 특히, UV-GO 나노시트의 OD 곡선은 UV-GO 나노시트가 N-GO 나노시트보다 더욱 높은 수준의 세포 파괴 작용을 한다는 것을 나타내며, 그 결과 많은 양의 β-D-갈락토시다아제 유출 및 ONPG의 ONP로의 촉매 작용을 야기했다.
이러한 현상은 GO 나노시트 표면에서의 광화학 반응의 영향으로부터 기인한다고 할 수 있다. GO 나노시트는 일부가 그 가장자리에 카르복시 기와 같은 산소 작용기를 가지며 기저면에는 하이드록실 기 및 에폭시 기를 갖는다. 광화학 반응 기간에 따라, 산소화된 기의 숫자를 변경시킬 수 있고 이것은 GO 면에서의 양성자 전도를 매개할 수 있는 것으로 확인되었다[42]. 또한, 초기 연구에서 반도체형 박막(4 시간 조사 후)에 포함된, 금속 나노입자들과 유사한 환원형 GO는 광촉매 활성 및 박테리아 불활성이 향상되어 유효한 양자(quantum) 효율성을 나타냈다[51].
비록 상기 가설이 본 발명인 20 분 조사한 UV-GO 나노시트의 화학적 상태에 직접적으로 적용되지 않을 수도 있다 하더라도, 본 발명자들은 짧은 기간의 UV 노출이 GO 나노시트의 기저면 및 가장자리의 라디칼을 활성화시킴으로써 화학적 상태를 변경시킬 수 있다는 것을 제시한다. 따라서, 직접적인 접촉 및 GO 나노시트로 인한 ROS 효과의 영향과 같은 알려진 요인들 외에, 광조사 효과에 의해서도 항-박테리아 효과를 최적화할 수 있다. E. coli 및 S. typhimuirum에 대하여 0.125 /mL의 MIC, B. subtilis에 대하여 0.25 /mL의 MIC 및 E. faecalis에 대하여 0.5 /mL의 MIC를 나타낸 UV-GO 나노시트(20 분 조사)의 항-박테리아 활성은 N-GO의 MIC와 비교하여 유효하게 향상되었다. 추가적으로, 세포벽 손상 및 이로 인한 물리적 변화들에 대한 보다 나은 이해를 돕기 위하여, UV-GO 나노시트에 처리된 E. coli 세포 및 어떠한 처리도 하지 않은 정상 E. coli 세포의 FE-SEM(electron microscope) 이미지를 비교하였다(도 7). 관찰된 바와 같이, UV-GO 나노시트에 처리된 E. coli는 세포 외부막에 심각한 손상을 받은 의미 있는 형태적 변화를 나타냈다. 따라서, 세포 보전(integrity)의 파괴는 세포 내부 구조의 충돌을 초래하여 세포 용해를 야기했다.
본 발명자들은 상기 결과들로부터, UV 조사에 의하여 GO 나노시트의 항-박테리아 특성이 향상 및/또는 최적화될 수 있다는 것을 추측하였다. 또한, 본 발명자들은 추가적인 UV 흡광 또는 근적외선 흡광 물질로 GO 나노시트의 표면을 특정하게 변경한 경우, 항-감염성(anti-infective) 또는 항-생물부착성(anti-biofouling) 응용의 개발에 GO 코팅을 긍정적으로 이용할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (23)

  1. 광조사된 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO), 광조사된 환원형 그래핀 산화물 또는 광조사된 그래핀 복합체(graphene composite)를 유효성분으로 포함하는 항생용(antibiotic) 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항생용 조성물은 항박테리아, 항진균 또는 항바이러스 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 항박테리아는 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아에 대해 항생 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 그람 음성 박테리아는 에스체리치아(Escherichia) 속 및 살모넬라(Salmonella) 속 미생물이고, 상기 그람 양성 박테리아는 바실러스 (Bacillus) 및 엔테로코커스(Entercoccus) 속 박테리아인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 광조사는 자외선(UV) 광, 가시선광, 적외선(IR) 광 또는 엑시머 레이저를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 광조사는 자외선(UV) 광으로 10-40분 단기간 조사하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 유효성분은 광조사된 그래핀 산화물이고 그의 (O1s)/(C1s)비가 2.00-2.30인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 유효성분은 광조사된 그래핀 산화물이고 284.6 eV, 285.6 eV, 287.3 eV 및 288.7 eV 결합에너지에서 각각 C-C, C-OH, C-O-C 및 O=C-OH에 대한 피크를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 유효성분은 광조사된 그래핀 산화물이고 4.00-4.50 eV 일함수(work function)를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 유효성분은 나노구조인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 나노구조는 나노시트, 나노선, 나노막대, 나노튜브, 분쇄 나노선, 나노테트라포드, 트리포드, 바이포드, 나노결정, 나노점, 양자선 또는 나노입자인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 다음 단계를 포함하는 그래핀 기반 물질의 항생 활성을 증가시키는 방법:
    (a) 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO), 환원형 그래핀 산화물 및 그래핀 복합체(graphene composite)로 구성된 군으로부터 선택되는 그래핀 기반 물질을 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 그래핀 기반 물질에 광조사(photoirradiation)시키는 단계.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 항생 활성은 항박테리아, 항진균 또는 항바이러스 활성인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 항박테리아는 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아에 대해 항생 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 방법은 그람 음성 박테리아 또는 그람 양성 박테리아에 대해 증가된 항생 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 그람 음성 박테리아는 에스체리치아(Escherichia) 속 및 살모넬라(Salmonella) 속 미생물이고, 상기 그람 양성 박테리아는 바실러스 (Bacillus) 및 엔테로코커스(Entercoccus) 속 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 12 항에 있어서, 상기 광조사는 자외선(UV) 광, 가시선광, 적외선(IR) 광 또는 엑시머 레이저를 이용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 광조사는 자외선(UV) 광으로 10-40분 단기간 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 12 항에 있어서, 상기 광조사된 그래핀 기반 물질은 그래핀 산화물이고 그의 (O1s)/(C1s)비가 2.00-2.30인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 12 항에 있어서, 상기 광조사된 그래핀 기반 물질은 그래핀 산화물이고 284.6 eV, 285.6 eV, 287.3 eV 및 288.7 eV 결합에너지에서 각각 C-C, C-OH, C-O-C 및 O=C-OH에 대한 피크를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 12 항에 있어서, 상기 광조사된 그래핀 기반 물질은 그래핀 산화물이고 4.00-4.50 eV 일함수(work function)를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 12 항에 있어서, 상기 그래핀 기반 물질은 나노구조인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 나노구조는 나노시트, 나노선, 나노막대, 나노튜브, 분쇄 나노선, 나노테트라포드, 트리포드, 바이포드, 나노결정, 나노점, 양자선 또는 나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.
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