KR101779523B1

KR101779523B1 - 플라보노이드 유도체를 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101779523B1
Application number: KR1020100078281A
Authority: KR
Inventors: 백흥수
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2010-08-13
Filing date: 2010-08-13
Publication date: 2017-09-19
Also published as: KR20120021709A

Abstract

본 발명은 플라보노이드 유도체를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 함유함으로써 항노화, 항주름, 탄력 개선, 보습, 피부장벽 개선, 아토피, 항염, 여드름, 항균, 혈색 개선, 피부톤 개선, 모공 개선, 피지 조절, 트러블 개선, 슬리밍, 자외선 차단 및 미백 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

플라보노이드 유도체를 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing flavonoid derivatives}

피부는 인체의 일차 방어막으로서 온도 및 습도의 변화, 자외선 및 공해물질과 같은 외부환경의 자극으로부터 체내의 기관을 보호해 주는 기능을 한다. 그러나, 내적으로는 나이가 들어감에 따라 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되고, 외적으로는 오존층 파괴와 같은 환경오염으로 인한 자외선, 자유 라디칼 및 활성산소의 증가로 인하여 발생하는 물리적, 화학적 자극 및 스트레스로 인해 피부의 정상기능이 약화되고 노화가 촉진되며 혈색이 나빠지고 피부톤도 어두워지게 된다.

활성 산소종(ROS: reactive oxygen species)은, 특히 피부노화의 원인 물질로 작용하고 있다. 피부는 자외선에 노출되어 활성 산소종을 만드는 광화학적 반응들이 계속해서 일어나고 있다. 이들 활성 산소종들은 피부 세포 및 조직 손상을 주도한다. 이들은 항산화 효소와 비효소적인 항산화제들로 구성된 항산화 방어망을 파괴함으로써 산화제/항산화제 균형을 산화상태 쪽으로 기울게 한다. 결과적으로 계속된 산화적 스트레스는 지질 과산화, 단백질 산화, 피부 구성 성분을 파괴시키는 단백질 분해 효소의 활성화, 탄력 섬유인 콜라겐 엘라스틴의 사슬 절단 및 비정상적인 교차 결합, 히아루론산 사슬의 절단, 멜라닌 생성 반응 촉진, 및 DNA 산화와 같은 생체 구성 성분들의 손상을 야기한다. 이러한 생체 구성 성분의 손상으로 여러 가지 노화 현상들이 나타나는데 주름 생성, 탄력 감소와 같이 잘 알려진 노화현상 외에도 모공 넓어짐도 노화 현상으로 나타나게 된다. 주름 감소, 탄력 감소와 같은 노화 현상에 대해서는 많은 연구가 진행되었지만 모공과 관련해서는 많은 연구가 진행되지 못했다. 하지만 모공 넓어짐의 가장 중요한 원인 역시 산화적 스트레스이다.

산화적 스트레스에 따른 피부의 구조적 변화를 살펴보면, 피부의 구성성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아진다. 또한, 피부의 탄력과 인장을 담당하는 진피 조직의 세포외 기질(ECM: extracelluar matrix) 성분이 변화하게 된다. ECM은 크게 두 가지 성분으로 구성되어 있다. 하나는 ECM 전체의 약 2∼4%를 차지하는 탄력섬유이며, 또 다른 하나는 ECM 전체의 약 70∼80%를 차지하고 있는 콜라겐이다. 콜라겐은 산화적 스트레스의 영향으로 분해되어 결과적으로 피부내의 콜라겐이 줄어드는 현상이 나타나게 된다. 이와 같이 나이가 들어감에 따라 모공 주변의 세포외 기질이 줄어들게 되고, 결과적으로 모공이 넓어지게 된다. 그러므로 모공이 넓어지는 것을 막는 가장 좋은 방법은 산화적 스트레스를 억제하는 것이고, 넓어진 모공을 줄여 수 있는 가장 좋은 방법은 모공 주변의 콜라겐의 생성량을 증가시키는 것이다.

일반적으로 두피 및 얼굴을 포함한 피부에서 피지는 피부의 보습유지나 미생물의 침입을 막는 역할을 맡고 있지만, 사춘기 이후에는 여드름을 촉진시키게 된다. 특히, 30대 이후의 여성의 경우는 피지의 과잉분비로 인하여 번들거림, 화장의 들뜸, 및 모공확대와 같은 문제를 유발하기도 한다. 이러한 피지의 과잉분비에 대한 원인은 다양하지만, 그 가운데에 피지선의 활성에 있어 피지 분비를 촉진하는데 관여하는 호르몬 가운데 하나인 디하이드로테스토스테론의 양에 의해서 피지선의 세포가 활성화되어 피지 과분비가 일어난다고 알려져 있다.

5α-리덕타아제(5α-Reductase)는 피지선, 모낭, 전립선, 부고환등의 남성 호르몬 반응성 조직에서 존재하며, 남성 호르몬들 중의 하나인 테스토스테론(Testosterone)을 디하이드로테스토스테론(DHT: Dihydrotestosteron)으로 환원시키는데 관여하는 효소로서 그 전환에는 NADPH를 필요로 한다. 골격근 증가와 정자형성 등에는 테스토스테론이 관여하고, 여드름, 피지증가 및 전립선비대증 등에는 디하이드로테스토스테론이 해당 조직에서 관여한다고 알려져 있다(Diane et al; J. Invest Dermatol. 775-778, 1995. Bruchovsky, N et al; J.B.C. 243, 2112-2121, 1968). 또한, 피부의 피지선에서는 테스토스테론이 5α-리덕타아제에 의해서 디하이드로테스토스테론으로 전환되어 세포질 내에 있는 수용체 단백질(Receptor)과 결합하여 핵 내로 들어가 피지선 세포를 활성화하여 분화가 촉진됨으로써 피지선내의 피지를 과분비한다(Diane et al; J. Invest Dermatol. 105; 209-214).

또한 도시 지역과 산업단지에서는 자동차 배출가스, 중국 동부 공업지대를 지나며 미세 중금속 가루를 포함해 날아온 황사 또는 외부 오염물이 사람들의 피부를 오염시키며 피부 노화 및 피부 트러블의 원인이 될 수 있다. 이는 주로 오염 물질에 함유된 중금속과 미세먼지로 인한 것이다.

상기 중금속은 수은, 카드뮴, 납 및 구리와 같은 비중이 4이상인 모든 금속류를 말하며, 일반적으로 생체 내로 흡수되면 생체 내 물질과 결합하여 잘 분해되지 않는 유기복합체를 형성하기 때문에 몸 밖으로 빨리 배출되지 않고 간장, 신장 등의 장기나 뼈에 축적되는 성질이 강한 물질이다. 소량의 중금속에 장기간 노출될 경우 후지마비, 이상운동, 운동실조, 피부의 색소침착 및 각질화, 발톱, 발굽 또는 모발의 위축결손, 생식기능장해, 기형출산, 성장 저하 및 면역기능저하 등의 증상이 나타난다. 피부에서는 이러한 유해 중금속 미세 분진들이 대기 중에서 화학반응을 일으켜 질소산화물(NO) 및 황산화물(SO) 등과 같은 유해물질을 추가로 생성해 피부의 염증성 물질인 사이토카인 등을 증가시키고 아토피나 피부 트러블을 유발할 수 있다. 미세먼지는 클렌징으로 어느 정도 제거가 가능하지만, 미세할수록 흡착력이 강하기 때문에 모공에 깊숙이 스며든 미세먼지를 일반 클렌징으로 완벽하게 제거하는 것은 불가능한 실정으로 피부 트러블을 유발시킬 수 있는 염증 인자의 조절이 필요한 시점이다.

한편, 인체 내에는 약 200억 개나 되는 지방세포가 존재하고 있으며 포유류의 생체 내에서 에너지를 축적하거나 방출하는 역할을 담당하고 있다. 이 세포 내에서는 에너지의 축적과 방출에 대한 복잡한 조절 원리가 존재하는데 에너지의 수요보다 공급이 월등히 많을 경우에는 지방세포 내에 중성지방으로 저장되었다가, 에너지가 고갈되었을 때 다시 유리 지방산과 포도당으로 분해되어 사용된다. 비만은 이 과정의 불균형으로 인하여 과도한 에너지의 축적이 일어났을 때 발생하는 것으로, 지방세포의 크기가 커지거나 그 수가 증가하는 현상에 기인하는 것으로 보고 있다.

아름다운 몸매에 대한 여성들의 관심은 풍족한 생활에 의한 비만의 증가뿐 아니라 여성의 사회적 지위 향상, 경제적 독립, 그리고 질적인 삶의 욕구 등에 따라 급속도로 증대되고 있으며, 이에 따라 과도한 피하 지방의 제거 및 피부 탄력의 증진에 효과적인 슬리밍(slimming) 및 안티-셀룰라이트(anti-celullite) 화장품에 대한 관심도 계속 높아지고 있다.

본 발명자들은 특정 구조의 플라보노이드 유도체가 항노화, 항주름, 탄력 개선, 보습, 피부장벽 개선, 아토피, 항염, 여드름, 항균, 혈색 개선, 피부톤 개선, 모공 개선, 피지 조절, 트러블 개선, 슬리밍, 자외선 차단 및 미백 효과가 우수한 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 플라보노이드 유도체를 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 하기 화학식 1로 표현되는 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다:

상기 식에서,

X는 H 또는

이고,

Y₁ 및 Y₂는 각각 H 또는

이며, 이때 Y₁ 및 Y₂는 서로 같거나 다를 수 있고,

Z는

또는

이다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 함유함으로써 항노화, 항주름, 탄력 개선, 보습, 피부장벽 개선, 아토피, 항염, 여드름, 항균, 혈색 개선, 피부톤 개선, 모공 개선, 피지 조절, 트러블 개선, 슬리밍, 자외선 차단 및 미백 효과가 우수하였다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용하는 플라보노이드 유도체는 하기 화학식 1로 표현된다:

[화학식 1]

상기 식에서,

X는 H 또는

이고,

Y₁ 및 Y₂는 각각 H 또는

이며, 이때 Y₁ 및 Y₂는 서로 같거나 다를 수 있고,

Z는

또는

이다.

보다 바람직하게는 본 발명에서 사용하는 플라보노이드 유도체는 하기 표 1에 기재된 카지놀 A, B, E 및 H로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

화합물명	X	Y₁	Y₂	Z
카지놀 A	H		H
카지놀 B	H		H
카지놀 E		H
카지놀 H		H

본 발명에서 유효성분으로 사용되는 플라보노이드 유도체는 당업계에 공지된 방법에 따라 청시닥나무(Acer barbinerve Max.), 개시닥나무(Acer barbinervis var . glabrescens), 산닥나무(Wikstroemia trichotoma), 시닥나무(Acer tschonoskii var. rubripes), 삼지닥나무(Edgeworthia chrysantha), 마주잎꾸지나무(Broussonetia papyrifera for . oppositifolia), 민꾸지나무(Broussonetia papyrifera for . lucida), 두메닥나무(Daphne kamtschtica), 참닥나무(Broussonetia kazinoki Siebold), 애기닥나무(Broussonetia kazinoki var. humilis), 몽고뽕나무(Morus mongolica Schneider), 뽕나무(Morus alba L.), 고삼(Sophora flavescens Ait.), 개느삼(Echinosophora koreensis (Nakai) Nakai) 또는 잭후르츠(Artocarpus heterophyllus) 등의 천연물로부터 분리될 수 있다. 예를 들면, 상기 천연물을 당업계에 잘 알려진 방법으로 물 또는 유기용매로 추출한 후 이로부터 분리할 수 있다. 본 발명에 사용하는 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 이들 유기용매와 물의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 80% 에탄올을 사용한다. 이때, 추출온도는 10∼80℃가 바람직하며, 3∼24시간 동안 추출할 수 있다. 상기 추출온도 및 추출시간을 벗어나면 추출 효율이 떨어지거나 성분의 변화가 생길 수 있다.

또한 본 발명에서 사용하는 플라보노이드 유도체는 당업계에 공지된 방법에 따라 합성을 통해 수득될 수도 있으며, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수도 있다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 상기 플라보노이드 유도체를 조성물 총 중량에 대하여 0.0001∼90 중량%, 바람직하게는 0.001∼50 중량%로 함유할 수 있다. 그 함량이 0.0001 중량% 미만이면 그 효과가 미미하고, 90 중량%를 초과하면 제형 안정성이 나빠지므로 바람직하지 않다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 항노화, 항주름, 탄력 개선, 보습, 피부장벽 개선, 아토피, 항염, 여드름, 항균, 혈색 개선, 피부톤 개선, 모공 개선, 피지 조절, 트러블 개선, 슬리밍, 자외선 차단 및 미백 효과가 우수하였으며, 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 영양 로션, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 또는 피부 점착 타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있다.

또한, 각 제형의 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기한 본 발명의 필수성분인 플라보노이드 유도체 이외의 다른 성분들은 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

[시험예 1] 엘라스타아제 활성 억제 효과

본 발명에 의한 플라보노이드 유도체의 엘라스타아제 활성 저해능을 EGCG와 비교하여 측정하였다. 사용된 엘라스타아제와 기질은 미국 시그마알드리치로부터 상업적으로 구매하였고(Cat.No. E0127), 카지놀 A, B, E 및 H는 SIGMA, LANCASTER 및 TCI로부터 입수하였다.

96웰 플레이트(96-well plate)에서 10 mg/L Tris-HCL 완충액(pH 8.0)에 용해한 카지놀 A, B, E 및 H 각각 50 ㎕를 20 ㎍/mL 엘라스타아제·타입 Ⅲ 용액 50 ㎕와 혼합하였다. 양성대조군으로 EGCG 250 μM을 사용하였으며, 음성 대조군인 비처리군은 증류수를 사용하였다. 그 후, 상기 완충액으로 조제한 0.4514 ㎎/mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE 100 ㎕를 첨가하고, 25℃에서 15분간 반응시켰다. 반응종료 후, 파장 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 동일한 방법으로 공시험을 행하여 보정하였다. 엘라스타아제 활성 저해율은 하기 수학식 1에 의해 산출하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

시험물질	엘라스타아제 활성 저해율(%)
비처리군	0
EGCG	65
카지놀 A	73
카지놀 B	80
카지놀 E	75
카지놀 H	80

상기 표 2의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체의 엘라스타아제 활성 억제 정도가 엘라스타아제 활성 억제제로 알려져 있는 EGCG 보다 우수한 것을 확인하였다.

[시험예 2] 콜라게나아제(MMP-1) 저해능

본 발명의 플라보노이드 유도체의 콜라게나아제 생성 저해능을 레티노인산과 비교하여 측정하였다. 먼저, 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96웰 플레이트에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/웰이 되도록 넣고, 70∼80% 정도 자랄 때까지 CO₂ 5%, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다. 여기에 카지놀 A, B, E 및 H를 각각 10 ㎍/ml 농도로 처리한 다음 24시간 배양한 후 세포배양액을 채취하였다.

상업적으로 이용가능한 콜라게나아제 측정기구(미국 아머샴파마샤, Catalog #: RPN 2610)를 이용하여 상기에서 채취한 세포배양액의 콜라게나아제 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게나아제 항체가 균일하게 도포된 96웰 플레이트에 채취한 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96웰 플레이트에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), sigma)을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1 M 황산을 넣어 발색반응을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띠게 되며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타난다.

흡광계를 이용하여 405 nm에서 노란색을 띠는 96웰 플레이트의 흡광도를 측정하였고, 하기 수학식 2에 의해 콜라게나아제의 발현 정도를 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 이때 카지놀을 처리하지 않은 군에서 채취한 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

시험물질	콜라게나아제 발현 정도(%)
대조군	100
레티노인산	75
카지놀 A	60
카지놀 B	65
카지놀 E	75
카지놀 H	60

상기 표 3의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체가 콜라게나아제 발현 저해제로 알려져 있는 레티노인산과 비교하여 동등 이상의 콜라게나아제 발현 저해 효과를 갖는 것을 확인하였다.

[실시예 1∼5 및 비교예 1]

하기 표 4의 조성에 따라 통상적인 방법으로 실시예 1∼5 및 비교예 1의 영양크림을 제조하였다(단위: 중량%).

성분	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	비교예 1
카지놀 A	0.5	-	-	-	0.125	-
카지놀 B	-	0.5	-	-	0.125	-
카지놀 E	-	-	0.5	-	0.125	-
카지놀 H	-	-	-	0.5	0.125	-
밀납	10	10	10	10	10	10
폴리솔베이트60	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
피이지 60 경화피마자유	2	2	2	2	2	2
솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
유동파라핀	10	10	10	10	10	10
스쿠알란	5	5	5	5	5	5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 (Estasan: Uniqema(제조사))	5	5	5	5	5	5
글리세린	5	5	5	5	5	5
부틸렌글리콜	3	3	3	3	3	3
프로필렌글리콜	3	3	3	3	3	3
트리에탄올아민	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
방부제, 색소 및 향료	적량	적량	적량	적량	적량	적량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량

[시험예 3] 피부 탄력 개선 효과

실시예 1∼5 및 비교예 1에서 제조한 영양크림의 탄력 개선 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 30∼40대의 건강한 여성 120명을 20명씩 6조로 나누어 실시예 1∼5 및 비교예 1의 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력변화를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 표 5의 결과값은 Cutometer SEM 575의 ΔR8(R8(왼쪽)-R8(오른쪽)) 값으로 기재하였는데, R8 값은 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

시험물질	피부탄력변화
실시예 1	0.12
실시예 2	0.16
실시예 3	0.15
실시예 4	0.27
실시예 5	0.18
비교예 1	0.10

상기 표 5의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유하는 실시예 1∼5를 도포한 군이 비교예 1을 도포한 군에 비하여 피부 탄력이 더 증가하는 것을 확인하였다.

[시험예 4] 피부 주름 개선 효과

실시예 1∼5 및 비교예 1에서 제조한 영양크림의 피부 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 40대의 건강한 여성 120명을 20명씩 6조로 나누어 실시예 1∼5 및 비교예 1의 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 실리콘을 이용하여 레플리카를 떠서 주름의 상태를 피부측정기(visiometer, SV600, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)로 측정하여 화상분석하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 하기 표 6의 값은, 도포 12주 후의 각각의 변수(parameter)값에서 도포 전 변수값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다.

사용 8주 후 임상 결과	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 1	0.21	0.21	0.16	0.02	0.01
실시예 2	0.19	0.18	0.13	0.02	0.02
실시예 3	0.18	0.19	0.12	0.03	0.02
실시예 4	0.21	0.21	0.16	0.02	0.01
실시예 5	0.21	0.22	0.15	0.01	0.02
비교예 1	0.27	0.26	0.21	0.03	0.03
R1 : 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값 R2 : 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균 R3 : 5개씩 나눈 R1값 중 최고 값 R4 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 차이 값

상기 표 6의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유하는 실시예 1∼5의 조성물이 피부 주름 개선 효과가 아주 우수함을 확인할 수 있었다.

[시험예 5] 각질형성세포 분화 촉진 효과

본 발명에 의한 플라보노이드 유도체의 각질형성세포의 분화 촉진 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같이 각질형성세포의 분화 시 생성되는 CE(Cornified Envelop)의 양을 흡광도를 이용하여 측정하였다.

먼저, 신생아의 표피로부터 분리해 일차 배양한 사람의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 뒤 하기 표 7의 시험물질을 배양액에 5 ppm 농도로 처리한 후 세포가 바닥 면적의 70∼80% 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이때, 저칼슘(0.03 mM) 처리군과 고칼슘(1.2 mM) 처리군을 각각 음성대조군 및 양성대조군으로 하였다. 그 다음 상기 배양한 세포를 수확하여 PBS(Phophate buffered saline)로 세척한 뒤 2% SDS(sodium dodecyl sulfate)와 20 mM 농도의 DTT(Dithiothreitol)를 함유한 10 mM 농도의 트리스-염산 완충액(Tris-HCl, pH 7.4) 1 ml를 가하여 소니케이션(sonication), 보일링(boiling) 및 원심분리를 하고, 침전물을 다시 PBS 1 ml에 현탁시켜 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액을 일부 취하여 단백질 함량을 측정하고, 세포 분화정도 평가 시 기준으로 삼았다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

시험물질	각질형성세포에서의 분화능(%)
저칼슘(0.03 mM) 용액 (음성대조군)	100
고칼슘(1.2 mM) 용액 (양성대조군)	210
카지놀 A	225
카지놀 B	196
카지놀 E	216
카지놀 H	228

상기 표 7의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 처리한 경우 각질 형성 세포의 분화가 촉진되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 카지놀 A, E 및 H는 양성대조군 보다도 우수한 효과를 보였다.

[시험예 6] 피부 장벽기능 회복 효과

본 발명에 의한 플라보노이드 유도체가 피부 손상으로 인해 손상된 피부 장벽기능의 회복에 미치는 효과를 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 카지놀 A, B, E 및 H 각각 1 중량%를 프로필렌글리콜 30 중량% 및 정제수 69 중량%로 구성된 비히클(vehicle; 음성대조군)에 혼합하여 시험물질을 준비하였다. 테이프 스트립핑(Tape Stripping) 방법을 이용하여 성인 남녀 12명의 상박 피부 장벽에 손상을 준 다음 상기에서 준비한 시험물질들을 각각 도포하면서 7일 동안 하루에 한번씩 경피수분손실량(TWEL)의 회복 정도를 Vapometer(Delfin, 핀란드)로 측정하여 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 표 8의 결과는 장벽 손상 전과 장벽 손상 후의 처리전 차이를 100% 기준으로 하여 비교하였다.

시험물질	경피수분손실량(TWEL, %)
시험물질	처리전	1일	2일	3일	4일	5일	6일
음성대조군	100	121	112	98	70	62	43
카지놀 A	100	108.7	84.6	59.8	44.4	34.4	35.6
카지놀 B	100	106.3	87.2	60.7	45.8	35.8	20.6
카지놀 E	100	115.3	89.5	64.3	46.3	36.3	29.6
카지놀 H	100	114.6	88.4	67.8	43.6	33.6	30.3

상기 표 8의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 처리할 경우 빠른 속도로 경피 수분 손실량이 정상으로 돌아오며 장벽 손상이 회복됨을 확인할 수 있었다.

[시험예 7] 피부 보습 효과

건조 피부로 분류된 40∼50대 성인 남녀 120명을 20명씩 6조로 나누어 실시예 1∼5 및 비교예 1의 영양크림을 매일 2회씩 4주간 안면에 도포하게 하였다. 도포 개시 전과, 도포 후 1주, 2주, 4주 경과한 시점 및 도포를 중지한 2주 경과(총 6주 경과) 후에 항온, 항습 조건(24℃, 상대습도 40%)에서 피부수분량측정기(Corneometer CM825, C+K Electronic Co., 독일)로 피부수분량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 표 9의 결과는 시험개시 직전에 측정한 피부 수분량 측정기 값을 기준으로 하여 일정기간 처치한 후의 측정값의 증가분을 백분율로 표시한 것이다.

시험물질	수분 증가율(%)
시험물질	1주 경과	2주 경과	4주 경과	6주 경과
실시예 1	38.6	41.6	40	32.6
실시예 2	36.2	38.2	38.7	34.3
실시예 3	37.6	37.8	37.2	31.5
실시예 4	32.4	33.9	33.6	32.5
실시예 5	38.1	37.1	37.2	36.1
비교예 1	30	32	32	15

상기 표 9의 결과에서, 비교예 1을 도포한 경우에는 도포가 이루어진 4주까지는 약간의 수분 증가율을 보이지만, 도포를 중지한 후에는 피부수분량이 현저히 감소하는 반면, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유한 실시예 1∼5를 도포한 경우에는 도포를 중지한 후에도 일정한 수준의 피부 수분 증가율을 보이는 것을 확인하였다.

[시험예 8] 혈색 개선 효과

본 발명에 의한 화장료 조성물의 피부 혈액 순환 촉진 효과를 평가하기 위하여, LDPI(Laser Doppler Perfusion Imager)를 이용하여 피부에서의 혈액순환 정도를 측정하였다. LDPI는 피부에서의 혈액순환을 측정하는 기기로 널리 알려져 있고 현재 사용되고 있는 기기로서, 피부의 모세혈관에서 혈액의 속도 및 양 뿐만 아니라 소동맥과 소정맥에서의 흐름까지 측정해 낼 수 있는 매우 민감한 기기이다.

항온항습실에서 얼굴을 비누로 수세한 후 30분간 적응시키고, LDPI를 이용하여 초기값을 측정하였다. 먼저 평소 손발이 차가운 여성 30명의 이마 아래 부분의 초기 혈류량을 LDPI로 측정하였다. 그런 다음 실시예 1∼5 및 비교예 1을 1주일 동안 피시험자들에게 사용하도록 한 후에 측정한 혈류량과 상기 초기 측정값을 비교한 결과(피부 혈류량 변화)를 하기 표 10에 나타내었다.

화장료 사용 전후 LDPI 결과-피부 혈류량

시험물질	1주 사용 후 피부 혈류량 변화율(%)
실시예 1	35
실시예 2	26
실시예 3	27
실시예 4	35
실시예 5	29
비교예 1	5

상기 표 10의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유하는 실시예 1∼5의 화장료 조성물은 비교예 1 보다 피부 혈류량을 증가시켰으며, 이러한 혈액 순환 촉진을 통해 혈색이 개선되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 궁극적으로 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유하는 화장료 조성물이 피부의 영양분을 효과적으로 전달하고 피부 노화를 억제하며 지연시키는 데 기여할 수 있음을 시사한다.

[시험예 9] 피부톤 개선 효과

상기 실시예 1∼5 및 비교예 1에서 제조한 영양크림의 피부톤 개선 효과를 알아보기 위하여 30명의 피험자에게 각각 사용(저녁 1회/일 도포, 총 1주간)하도록 한 후, Facial Stage DM-3 (Moritex, Japan) 기기를 활용하여 피부톤 개선 정도를 평가하였다. 피부톤 개선율은 피부의 명도 및 색채 측정값으로 피부의 명도 및 색채 변화 값으로 판단하였으며, 그 결과는 하기 표 11에 나타내었다.

시험물질	피부톤 개선율(%)
시험물질	명도(평균±표준편차)	색채(평균±표준편차)
실시예 1	27±2.46	29±2.03
실시예 2	23±2.35	23±2.15
실시예 3	23±2.56	29±2.14
실시예 4	25±2.05	25±3.06
실시예 5	30±2.14	32±2.54
비교예 1	5±2.34	5±2.05

표 11의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유하지 않는 비교예 1은 유의적인 피부톤 개선 효능을 보이지 않은 반면, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 실시예 1∼5는 사용 전보다 사용 후의 피부톤이 많이 개선되는 것을 확인하였다.

[시험예 10] 모공 축소 효과

<콜라겐 생합성 촉진을 통한 모공 축소 효과>

본 발명에 의한 플라보노이드 유도체의 콜라겐 생합성 촉진 효과를 TGF-β와 비교하여 측정하였다. 먼저, 섬유아세포(fibroblast)를 24 웰에 1웰 당 10⁵개씩 파종(seeding)하여 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이를 24시간 동안 무혈청 DMEM 배지로 배양한 후 무혈청 배지에 녹인 본 발명의 카지놀 A, B, E 및 H와 TGF-β 를 각각 10 ng/ml씩 처리하고 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이들의 상층액을 떠내어 프로콜라겐 I형 ELISA 키트를 이용하여 프로콜라겐의 증감여부를 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다. 이때 콜라겐 합성능은 비처리군을 100으로 하여 대비한 것이다.

시험물질	콜라겐 합성능(%)
비처리군	100
TGF-β	183.5
카지놀 A	183.2
카지놀 B	179.5
카지놀 E	189.5
카지놀 H	192.3

상기 표 12의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체는 양성대조군인 TGF-β와 동등한 수준의 높은 콜라겐 합성능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체가 모공 주변의 콜라겐 생성량을 증가시켜 넓어진 모공을 축소시킬 수 있음을 확인하였다.

<모공 축소 효과>

실시예 1∼5 및 비교예 1에서 제조한 영양크림의 모공 축소 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 모공 크기가 넓은 피험자 남녀 12명을 선정하여 얼굴에 실시예 1∼5 및 비교예 1의 영양크림을 4주간 매일 바르게 하였다. 모공 축소의 효과에 대한 판정은 실험 전과 4주 후 사진을 찍어서 전문가들의 육안 평가로 이루어졌다. 그 결과는 하기 표 13에서 나타내었다[평가 등급(0: 전혀 축소되지 않았다, 5: 매우 축소되었다)].

시험물질	평가 등급
실시예 1	3
실시예 2	2
실시예 3	4
실시예 4	3
실시예 5	4
비교예 1	0

상기 표 13의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유하는 실시예 1∼5의 화장료가 모공의 크기를 감소시키는 효과가 우수함을 알 수 있었다.

[시험예 11] 피지 분비 억제 효과

<5α-리덕타아제 활성 억제를 통한 피부 과분비 억제 효과>

5α-리덕타아제 활성 억제 효과를 확인하기 위해서 HEK293-5αR2 세포에서 [¹⁴C]테스토스테론이 [¹⁴C]디하이드로테스토스테론(DHT)으로 변환되는 비율을 측정하였다. HEK293 세포에 p3 x FLAG-CMV-5αR2를 형질감염시켜서 24 웰 플레이트에 웰당 2.5 x 10⁵ 세포로 넣고 배양하였다(Park et al., 2003, JDS. Vol. 31, pp. 191-98). 다음날 효소 기질과 저해제가 첨가된 새로운 배지로 바꿔주었다. 배지의 기질로는 0.05 μCi [¹⁴C]테스토스테론(Amersham Pharmacia biotech, UK)을 사용하였다.

5α-리덕타아제 활성 억제 정도를 확인하기 위해서 카지놀 A, B, E 및 H를 각각 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 수거하여 스테로이드를 800 ㎕ 에틸아세테이트로 추출한 다음 상부의 유기용매층을 분리하여 말린 후 남은 잔유물을 다시 50 ㎕ 에틸아세테이트로 녹여서 실리카 플라스틱시트 카이젤겔 60 F254(Silica plastic sheet kieselgel 60 F254) 상에서 에틸아세테이트-헥산(1:1)을 용매로 하여 전개하였다.

플라스틱 시료를 공기 중에서 건조한 후, 동위원소의 양을 측정하기 위하여 바스 시스템을 사용하였는데, 건조된 플라스틱 시트와 엑스레이 필름을 함께 바스 카셋트에 넣어 1주일 후에 필름에 남아있는 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론의 동위원소 양을 측정한 다음 하기 수학식 3 및 4에 따라 전환율 및 저해율을 각각 산출하였으며, 그 결과를 하기 표 14에 나타내었다.

시험물질	전환율(%)	저해율(%)
카지놀 A	24.3	49.3
카지놀 B	20.3	57.7
카지놀 E	23.8	50.4
카지놀 H	24.5	48.9
대조군	48.0	-
양성대조군[피나스테라이드(Finasteride)]	27.6	42.5

상기 표 14의 결과에서, 테스토스테론을 디하이드로테스토스테론으로 전환시켜 세포질 내에 있는 수용체 단백질과 결합해 핵 내로 들어가 피지선 세포를 활성화하고 분화를 촉진시켜 피지선 내에서 피지를 과분비시키는 역할을 하는 5α-리덕타아제의 활성을 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체가 효과적으로 억제함으로써 테스토스테론의 디하이드로테스토스테론으로의 전환을 차단하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체가 5α-리덕타아제의 활성을 효과적으로 억제시킴으로써 피지의 과분비를 억제시킬 수 있음을 확인하였다.

<피지 분비 억제 효과>

상기 실시예 1∼5 및 비교예 1에서 제조한 영양크림의 피지 분비 억제 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 피지분비가 많다고 느끼는 피험자 남녀 30명을 선정하여 지정된 부위에 실시예 1∼5 및 비교예 1의 영양크림을 4주간 매일 바르게 하였다. 그런 다음 피지량 측정기(Sebumeter SM810, C+K Electronic Co., 독일)를 사용하여 2주 및 4주 경과 후 평균 피지 감소율(%)을 각각 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 15에서 나타내었다.

시험물질	피지 감소율(%)
시험물질	2주 경과 후	4주 경과 후
실시예 1	16.5	26.2
실시예 2	14.4	24.8
실시예 3	15.1	35.6
실시예 4	17.7	24.7
실시예 5	13.7	23.8
비교예 1	5	5

상기 표 15의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 실시예 1∼5는 이를 함유하지 않은 비교예 1 보다 피지가 과잉으로 분비되는 것을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

[시험예 12] 활성 산소종(ROS) 생성 억제 효과

사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(keratinocyte)를 24웰 플레이트의 각 웰에 5×10⁴개를 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 16시간 후, 카지놀 A, B, E 및 H를 1%로 처리하였다. 2시간 뒤에 배양액을 제거한 다음, 각 웰에 100 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질형성세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B 15 W, Sankyo Dennki社, Japan)를 이용하여 자외선 30 mJ/㎠를 조사한 후, PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액 200 ㎕를 첨가하였다. 여기에 카지놀 A, B, E 및 H를 다시 처리하고 일정 시간대별로 자외선 자극에 의해 증가한 활성 산소종의 양을 정량하였다. ROS의 양은 ROS에 의해 산화되는 DCF-DA(dichlorofluorescin diacetate)의 형광을 측정하는 Tan의 방법을 참고하여 정량하였으며(Tan et al., 1998, J. Cell Biol. Vol. 141, pp1423-1432), 대조군의 ROS에 대한 비율을 산출한 결과를 하기 표 16에 나타내었다.

시험물질	UVB 30 mJ/㎠조사 후 경과된 시간
시험물질	0hr	2hr	3hr
비히클	100	244	287
UVB + 비히클	100	325	381
UVB + 카지놀 A	100	248	269
UVB + 카지놀 B	100	278	296
UVB + 카지놀 E	100	271	298
UVB + 카지놀 H	100	268	289

상기 표 16의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체가 자외선에 의해 피부 세포 손상을 일으키는 것으로 알려진 ROS의 생성을 효과적으로 억제하여 항산화 효능이 뛰어남을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체가 산화를 억제하고 노화를 막음으로써 모공이 넓어지는 것을 예방할 수 있으며, 피부 자극의 생성을 방어함으로써 피부 트러블을 개선시킬 수 있음을 확인하였다.

[시험예 13] 미백 효과

<티로시나제 저해 효과>

티로시나제 효소는 버섯류(Mushroom)로부터 추출된 것으로 시그마(SIGMA)사의 것을 사용하였다. 먼저 기질인 티로신을 증류수에 용해시켜 0.3 mg/ml의 용액으로 만들고 그 용액을 1.0 ml씩 시험관에 넣은 다음, 여기에 포타슘-포스페이트 완충용액(0.1 mol 농도, pH 6.8) 1.0 ml 및 증류수 0.7 ml를 첨가하여 반응액을 제조하고 이어지는 실험에 사용하였다.

카지놀 A, B, E 및 H를 에탄올 용액에 적당농도로 각각 혼합하여 준비한 시료액 0.2 ml를 상기 반응액에 넣은 다음 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시켰다. 이때 대조군은 각 시험물질 대신 용매만을 0.2 ml 넣은 것으로 준비하였고, 양성대조군으로는 아스코르브산을 사용하였다. 이 반응액에 2500 유닛/ml의 티로시나제 용액 0.1 ml씩을 넣고 다시 37℃ 항온조에서 10분 동안 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음물 속에 넣어 급냉시켜 반응을 중지시킨 후 광전분광분석계로 475 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 17에 나타내었다. 각 시험물질의 티로시나제 저해 효과는 하기 수학식 5로 산출하였다.

시험물질	티로시나제 저해율(%)
대조군(무첨가)	0
아스코르브산	52
카지놀 A	88
카지놀 B	86
카지놀 E	89
카지놀 H	84

상기 표 17의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체의 티로시나제 억제율이 높아 미백 효과가 우수함을 알 수 있었다.

카지놀 A, B, E 및 H, 및 코지산을 각각 0.001 중량%로 함유한 시료를 시험물질로 하여 일정 농도로 B16/F10 멜라노마 세포(한국세포주은행)의 배양액에 첨가하여 3일간 배양한 후 배양액을 제거하고 PBS로 세척하고 1 N NaOH로 세포를 녹여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시험물질을 첨가하지 않은 세포를 대조군으로 하여 대조군에서의 멜라닌 함량과 비교하여 각 시험물질의 멜라닌 생성 저해 정도를 측정하였다. 수학식 6에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 18에 나타내었다.

시험물질	멜라닌생성 억제율(%)
대조군	0
코지산	53
카지놀 A	84
카지놀 B	77
카지놀 E	87
카지놀 H	82

상기 표 18의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체의 멜라닌 생성 억제율이 높아 미백 효과가 우수함을 알 수 있었다.

[실시예 6∼10 및 비교예 2,3] 항균 조성물

하기 표 19에 나타낸 성분 및 함량(중량%)에 따라 실시예 6∼10 및 비교예 2,3의 항균 조성물을 제조하였다. 이때, 비교예 3은 항균력에 대한 기준으로 삼을 표준물질로서, 여드름 치료제로 많이 사용하는 에리트로마이신(erythromycin)을 함유시킨 것이다.

제조 방법은 다음과 같다. 하기 표 19의 성분 중 A상의 성분들을 완전 용해시키고, 별도의 용해조에서 B상의 성분들을 완전 용해시킨 다음, B상을 A상에 첨가하여 혼합 가용화시켰다. 여기에 C상의 성분들을 표 19에 기재된 배합비율에 따라 첨가하여 균일하게 혼합한 다음 여과하여 항균 조성물을 제조하였다.

성분		실시예 6	실시예 7	실시예 8	실시예 9	실시예 10	비교예 2	비교예 3
A	탈이온수(Deionized Water)	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
	EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
	글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
B	에탄올	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	PEG-60 경화 피마자유 (hydrogenated castor oil)	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4
	향료(perfume)	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04
C	카지놀 A	5.0	-	-	-	1.25	-	-
	카지놀 B	-	5.0	-	-	1.25	-	-
	카지놀 E	-	-	5.0	-	1.25	-	-
	카지놀 H	-	-	-	5.0	1.25	-	-
	에리트로마이신	-	-	-	-	-	-	5.0

[시험예 14] 여드름균에 대한 항균력 시험

실시예 6∼10 및 비교예 2,3의 항균 조성물을 가지고 여드름 원인 균주인 프로피오니박테리움 아크네스(기탁번호: ATCC 6919, 배지-BHI 액체배지(broth))에 대한 항균력을 시험하였다. 여드름균에 대한 항균력 시험 방법은 다음과 같다.

<시험물질 준비>

프로피오니박테리움 아크네스는 BHI 액체배지에 접종하여 혐기 배양한 배양액을 사용하였다. BHI 액체배지(pH 6.8) 또는 LB 액체배지(pH 4.5) 15 ml에 상기 균 배양액을 0.15 ml 첨가하여 잘 혼합한 것을 희석용액으로 사용하였다. 실시예 6∼10 및 비교예 2,3 조성물 원액 그대로를 시험물질로 사용하였다.

<항균력 시험>

1) 96웰 플레이트 1번 행에 출발 농도에 맞도록 각 시험물질을 넣고 희석용액으로 총량을 200 ㎕로 맞췄다.

2) 1번 행의 혼합액을 잘 섞어준 다음 100 ㎕를 취하여 2번 행에 넣고 잘 섞어준 다음, 다시 100 ㎕를 취하여 3번 행에 넣는 방식으로 이중 희석(double dilution)하였다.

3) 32℃에서 24시간 및 48시간 정치 배양한 후 현탁된 정도로 균의 증식 유무를 판단하여 균의 증식이 없는 최소농도를 MIC(최소저지농도; Minimum Inhibitory Concentration) 값으로 결정하였다. 만약 혼합액이 불투명하여 균의 증식 유무를 판단하기 어려우면 현미경 관찰을 통하여 확인하였다.

여드름균에 대한 항균력 시험 결과를 아래 표 20에 나타내었다. MIC는 제형에 함유된 유효성분의 농도로 환산하여 표기하였다.

시험물질	pH	프로피오니박테리움 아크네스
실시예 6	5.7	> 50 ppm
실시예 7	5.7	> 40 ppm
실시예 8	5.7	> 30 ppm
실시예 9	5.7	> 40 ppm
실시예 10	5.7	> 50 ppm
비교예 2	5.7	>최고 농도(항균력 없음)
비교예 3	5.7	> 100 ppm

MIC에서 ppm 농도가 작을수록 여드름균에 대한 항균력에 대하여 유효한 물질이라고 할 수 있는데, 실시예 6∼10의 경우 공지의 여드름 치료제인 에리트로마이신을 사용한 비교예 3보다 ppm 농도가 작게 나와 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유하는 조성물이 시험균에 대하여 우수한 항균력을 가짐을 확인할 수 있었다.

[시험예 15] 지질합성(Lipogenesis) 억제 시험

생쥐의 섬유아세포주(fibroblast cell line)인 3T3-L1 세포를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecos modified eagles medium, GIBCO BRL, Life Technologes 社) 배지가 담긴 6웰 배양 플레이트(culture plate)에 1x10⁵ 세포/웰로 부착시켰다. 2일이 지난 후 다시 새로운 DMEM(10% FBS 함유) 배지로 교환하고 2일 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 배양한 세포를 다시 인슐린(insulin) 1 ㎍/㎖, IBMX 0.5 mM, 덱사메타손(dexamethasone) 0.25 μM 및 하기 표 21에 기재된 시험물질 50 μM을 함유한 DMEM(10% FBS 함유)으로 분화를 유도하고, 2일이 경과한 후 다시 인슐린이 포함된 DMEM으로 교환하여 5일 동안 배양하였다. 5일 후 다시 정상 배지(DMEM, 10% FBS 함유)로 교환하고 상기 세포가 형태적으로 지방세포로 변화할 때까지 관찰하면서 배양하였다.

본 발명에 의한 플라보노이드 유도체의 지방세포 내 지방 축적 억제 효능을 평가하기 위하여 상기에서 분화가 완료된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 수단 III(S4136, sigma-aldrich)으로 염색하였다. 보다 상세하게는, 지방 세포를 인산염 완충액 내에서 4% 파라포름알데하이드(pH 7.2)로 상온에서 고정한 후에 PBS로 수세해 준 다음 수단 III으로 염색한 후에 사진을 찍어서 육안 비교하였다. 대조군은 시험물질을 첨가하지 않은 배지만을 사용한 것이고, 양성대조군으로 카페인 50 μM을 처리하였다. 지방 축적 억제 정도는 염색된 정도를 +++, ++, + 및 - 로 나누어 등급을 부여하였다. 그 결과를 표 21에 나타내었다.

시험물질	저해율
대조군	+++
카페인	+
카지놀 A	+
카지놀 B	+
카지놀 E	+
카지놀 H	+

상기 표 21의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체가 우수한 지질합성 저해 효과를 갖는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유하는 조성물은 지질 합성을 억제시킴으로써 피지를 감소시켜 여드름 발생을 억제할 수 있다.

[시험예 16] 여드름 개선 효과

여드름을 보유하고 있는 70명을 10명씩 7조로 나누어 상기 실시예 6∼10 및 비교예 2,3의 조성물을 한 달간 사용하도록 하였다. 여드름 개선 척도는 1점에서 5점까지로 하고, 1점은 '아니다', 3점은 '보통이다', 5점은 '매우 그렇다'로 표기하도록 하였다.

또한 여드름 소멸 시기는 소멸이 판독된 일수를 기준으로 하였으며, 여드름 재발은 1개월 뒤의 결과를 기준으로 하였다. 피지 분비감소는 1점에서 5점까지로 하고, 1점은 '아니다', 3점은 '보통이다', 5점은 '매우 그렇다'로 표기하도록 하였다. 각 실험 결과는 각 조의 평균점수를 산출하여 하기 표 22에 나타내었다. 피부자극의 유무는 (자극반응을 보인 명수)/(조별 시험자수)로 표시하였다.

시험물질	염증성 여드름 개선	면포성 여드름 소멸시기	여드름 재발	피지분비 감소	자극 유무
실시예 6	4.0	1일	무	3.8	0/10
실시예 7	4.2	2일	무	4.1	0/10
실시예 8	4.1	2일	무	4.1	0/10
실시예 9	4.1	1일	무	4.3	0/10
실시예 10	4.3	2일	무	4.1	1/10
비교예 2	2.1	13일	유	2.0	0/10
비교예 3	4.2	2일	무	4.1	9/10

상기 표 22의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유하는 실시예 6∼10은 비교예 2에 비해 여드름이 재발되지 않았고, 전반적으로 여드름 개선에 대해 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다. 한편, 항균력 표준물질을 함유한 비교예 3의 경우, 여드름 개선 효과는 우수하였으나, 사용 시 피부 자극이 강하여 장기간 사용하기에 적합하지 않았다.

[시험예 17] 염증 개선 효과

본 발명에 의한 플라보노이드 유도체의 항염증 효과를 알아보기 위하여, 대식세포에서 프로스타글란딘의 생성 억제 효과를 측정하였다. 우선, 마우스의 복강에서 채취한 대식세포에 최종농도가 500 μM이 되도록 아스피린을 첨가해 세포에 잔존하는 시클로옥시제나제(COX: cyclooxygenase) 활성을 비가역적으로 억제하였다. 그런 다음 상기 현탁액을 96 웰의 세포배양관의 각 웰에 100 ㎕를 넣어 5% CO₂와 37℃ 조건의 배양기에서 2시간 동안 배양하여 대식 세포를 용기 표면에 부착시켰다. 이어, 부착된 대식 세포를 PBS로 3회 세척한 후 이를 이어지는 시험에 사용하였다. 상기 배양된 대식세포 5x10⁴ 세포/ml에 LPS를 1%(w/v)로 함유하는 RPMI 배지를 첨가하여 12시간 동안 배양한 후 프로스타글란딘의 생성을 유발하고 카지놀 A, B, E 및 H를 각각 100 ㎕씩 처리한 다음 효소면역 분석법(ELISA)을 이용하여 유리된 프로스타글란딘을 정량하였다.

이때, 시험물질의 프로스타글란딘의 생성억제 활성은 LPS를 처리한 군과 처리하지 않은 군에서 각각 생성된 프로스타글란딘의 차이를 100%로 설정하고, LPS와 시료를 함께 처리하여 감소된 프로스타글란딘의 백분율을 통하여 대조군과 비교, 판정하였으며, 그 결과(프로스타글란딘의 생성억제 효과)를 하기 표 23에 나타내었다.

시험물질	프로스타글란딘 생성 억제 활성(%)
블랭크(Blank)	100
대조군(아스피린 처리군)	25.0
카지놀 A	26.7%
카지놀 B	24.4%
카지놀 E	25.3%
카지놀 H	23.5%

상기 표 23의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 처리한 경우, 아스피린을 처리한 대조군과 동등한 수준으로 프로스타글란딘의 생성을 억제 시켰다. 이를 통해 본 발명의 플라보노이드 유도체가 우수한 염증 개선 효과를 가질 뿐만 아니라 염증 억제를 통한 피부 트러블도 개선시킬 수 있음을 확인하였다.

[실시예 11∼15 및 비교예 4]

하기 표 24의 조성에 따라 통상적인 방법으로 슬리밍 로션을 제조하였다(단위: 중량%).

성분	실시예 11	실시예 12	실시예 13	실시예 14	실시예 15	비교예 4
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량
카지놀 A	1.0	-	-	-	0.25	-
카지놀 B	-	1.0	-	-	0.25	-
카지놀 E	-	-	1.0	-	0.25	-
카지놀 H	-	-	-	1.0	0.25	-
식물성 경화유	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50
스테아린산	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60
폴리글리세롤-10 펜타스테아릭 & 베헤닐 알코올 & 소듐 스테아로일 락틸레이트	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
아라키딜 베헤닐 알코올 & 아라키딜글루코사이드	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
세틸아릴 알코올 & 세테아릴글루코사이드	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
PEG-100 스테아레이트 & 글리세롤 올레이트 & 프로필렌글리콜	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
메도우폼 열매기름	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
세틸 옥타노에이트	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00	4.00
사이클로메티콘	6.00	6.00	6.00	6.00	6.00	6.00
메틸파라벤	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20	0.20
프로필파라벤	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10
디소디움 EDTA	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
트리메탄올아민	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13
글리세린	8.00	8.00	8.00	8.00	8.00	8.00
카보머	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13	0.13

[시험예 18] 슬리밍 효과

<지방세포 내 중성지방의 분해 촉진 효과>

생쥐의 섬유아세포주(fibroblast cell line)인 3T3-L1 세포를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecos modified eagles medium, GIBCO BRL, Life Technologes 社) 배지가 담긴 6웰 배양 플레이트(culture plate)에 1x10⁵cells/well로 부착시켰다. 2일이 지난 후 다시 새로운 DMEM(10% FBS 함유) 배지로 교환하고 2일 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 배양한 세포를 다시 인슐린 1 ㎍/㎖, IBMX 0.5 mM, 덱사메타손(dexamethasone) 0.25 μM 및 하기 표 25에 기재된 시험물질 50 μM을 함유한 DMEM(10% FBS 함유)로 분화를 유도하고 2일이 경과한 후 다시 인슐린이 포함된 DMEM으로 교환하여 5일 동안 배양하였다. 5일 후 다시 정상 배지(DMEM, 10% FBS 함유)로 교환하고 상기 세포가 형태적으로 지방세포로 변화할 때까지 관찰하면서 배양하였다.

플라보노이드 유도체의 지방세포 내 중성지방 분해 촉진 효능을 평가하기 위하여 상기에서 분화가 완료된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 실험을 실시하였다. 3T3-L1 지방세포를 PBS로 2회 세척하고 지방산이 없는 0.5% 우혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 포함한 무색의 DMEM을 첨가한 후 이를 취하여 각 실험에 사용하였다. 대조군은 시험물질을 첨가하지 않은 배지만을 사용한 것이고, 그 결과값을 100%로 하였을 때 기타 값을 환산하여 나타내었다. 또한, 양성대조군으로 카페인 50 μM를 처리하였다. 지방 분해 정도는 지방세포로부터 배양액 중으로 유리된 포도당 농도를 측정함으로써 판단하였다. 포도당의 정량은 미국 시그마社(St. Louis, MO, U.S.A.)로부터 구입한 GPO-trinder 키트를 이용한 발색반응법으로 하였으며, ELISA 판독기를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 25에 나타내었다.

시험물질	유리된 글리세롤의 양
대조군	100%
카페인	115%
카지놀 A	124%
카지놀 B	123%
카지놀 E	124%
카지놀 H	135%

상기 표 25의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 처리한 군은 대조군과 비교했을 때 지방세포로부터 배양액 중으로 유리되는 포도당의 농도가 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 플라보노이드 유도체를 처리한 군은 양성대조군인 카페인을 처리한 군보다 더욱 우수한 지방분해 효과가 있음을 알 수 있었다.

<피하지방두께 측정>

국소 비만이나 셀룰라이트가 있는 여성 중 BMI(Body Mass Index, 체중(kg)/신장(m)²)가 21∼27인 25∼46세의 성인 여성 60명을 대상으로 4주 동안 아침과 저녁 하루 2회 한쪽 허벅지에 집에서 사용자의 마사지와 함께 상기 제형의 로션을 사용하고 8주 동안 사용 전후를 기기평가, 연구자(피부과 의사)에 의한 평가 및 설문평가에 의해 효과 여부를 판단하였다.

초음파를 이용한 피하 지방층의 두께(단위: mm) 측정은 Ultrasound-EuB 415 US 스캐너를 이용하였고, 얻어진 수치는 양측검정으로 Student t test 또는 Wilcoxon test를 이용하여 사용 전/후를 비교하여 통계적인 유의성을 분석하였으며(유의수준 α=0.05), 그 결과를 하기 표 26에 나타내었다.

시험물질	피하지방두께의 감소율(%)
실시예 11	15
실시예 12	16
실시예 13	13
실시예 14	18
실시예 15	14
비교예 4	0

상기 표 26의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유한 실시예 11∼15를 사용한 경우 플라보노이드 유도체를 함유하지 않는 비교예 4와 비교하여 허벅지 둘레가 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 시험기간 동안 피검자의 몸무게는 변화가 없었다.

<셀룰라이트 관찰>

셀룰라이트 정도는 전문연구자에 의한 육안 평가로 이루어졌다. 셀룰라이트 정도는 육안 평가에 의해 0점에서 4점까지 5 단계로 평가하였으며(0점: 셀룰라이트가 아주 많다, 4점: 셀룰라이트 없음), 그 결과를 하기 표 27에 나타내었다.

시험물질	셀룰라이트 평가 등급 변화 (평가등급 사용전-평가 등급사용 후)
실시예 11	2.1
실시예 12	1.6
실시예 13	2.1
실시예 14	2.3
실시예 15	1.8
비교예 4	3.8

상기 표 27의 결과에서, 연구자에 의한 효능 평가에서 비교예 4에 비해 실시예 11∼15를 사용한 부위에서 통계적으로 유의하게 셀룰라이트가 감소되고 피부 탄력이 증가되었다.

[실시예 16∼20 및 비교예 5, 6]

하기 표 28의 조성으로 구성된 실시예 16∼20 및 비교예 5, 6을 제조하였다(단위: 중량%). 비교예 6은 통상적으로 사용되고 있는 UV 흡수제인 OMC(octyl 4-methoxycinnamate)를 함유하는 화장료 조성물이다.

성분	실시예 16	실시예 17	실시예 18	실시예 19	실시예 20	비교예 5	비교예 6
카지놀 A	4	-	-	-	1	-	-
카지놀 B	-	4	-	-	1	-	-
카지놀 E	-	-	4	-	1	-	-
카지놀 H	-	-	-	4	1	-	-
OMC	-	-	-	-	-	-	4
글리세린	4	4	4	4	4	4	4
부틸렌글리콜	4	4	4	4	4	4	4
히알루론산	5	5	5	5	5	5	5
베타글루칸	7	7	7	7	7	7	7
카보머	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	8	8	8	8	8	8	8
스쿠알렌	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
스테아릴 글루코사이드	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4
스테아릴 알코올	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량

[시험예 19] 자외선 차단 지수 측정

본 발명에 의한 화장료 조성물의 UVB 차단 효과를 확인하기 위하여 자외선 차단지수(SPF, Sun Protection Factor)를 문헌에 보고된 일반적인 방법(J. Soc. Cosmet. Chem., 40, pp127-133, 1989)에 따라 SPF 분석기(SPF Analyzer, Optometrics USA, SPF290S)를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 하기 표 29에 나타내었다.

UVB 차단 효과는 UVB의 차단지수인 SPF(Sun Protection Factor)로 나타내는데, 여기서 자외선차단지수란 무처리된 피부상에 MED(Minimal Erythemal Dose)를 생성시키는데 요구되는 자외선량에 대한 자외선 차단제가 처리된 피부상에 MED를 생성시키는데 요구되는 자외선량으로 정의되고 하기 수학식 7로 계산된다. 따라서, SPF가 높을수록 UVB 차단 효과가 우수한 것을 의미한다. 여기서 MED는 피부에 홍반을 일으키는 최소 자외선 조사량(최소홍반량)을 말한다.

시험물질	자외선차단지수 (SPF)
실시예 16	17
실시예 17	13
실시예 18	15
실시예 19	19
실시예 20	15
비교예 5	4
비교예 6	15

상기 표 29의 결과에서, 본 발명에 의한 플라보노이드 유도체를 함유하는 실시예 16∼20은 자외선 차단 물질을 함유하지 않는 비교예 5 보다 자외선 차단 효과가 우수하였고, 공지의 자외선차단제인 OMC를 함유하는 비교예 6과 비교하여 동등 이상의 자외선차단능을 보였다.

Claims

플라보노이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 피부 탄력 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물로서,
상기 플라보노이드 유도체는 카지놀 B 및 카지놀 H로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 피부 탄력 및 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
플라보노이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 보습 및 피부 장벽 보호용 화장료 조성물로서,
상기 플라보노이드 유도체는 카지놀 B 및 카지놀 H로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 보습 및 피부 장벽 보호용 화장료 조성물.
플라보노이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 모공 축소용 화장료 조성물로서,
상기 플라보노이드 유도체는 카지놀 B 및 카지놀 H로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 모공 축소용 화장료 조성물.
플라보노이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 피부 혈색 및 피부톤 개선용 화장료 조성물로서,
상기 플라보노이드 유도체는 카지놀 B 및 카지놀 H로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 피부 혈색 및 피부톤 개선용 화장료 조성물.
플라보노이드 유도체를 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물로서,
상기 플라보노이드 유도체는 카지놀 H인 것을 특징으로 하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항 내지 제 5항에 있어서, 상기 플라보노이드 유도체의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.125 내지 5.0 중량%인 화장료 조성물.
제 1항 내지 제 5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 영양 로션, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 또는 피부 점착 타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물.
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