JP5944896B2 - コウゾ抽出物を含有する組成物 - Google Patents

Description

本発明は、コウゾ抽出物を含有する組成物に係り、さらに詳しくは、皮膚に関わる種々の効能を提供することができる組成物に関する。

皮膚は、人体の一次的な防御膜であって、温度および湿度の変化、紫外線、公害物質などの外部環境の刺激から体内の器官を保護する機能をする。しかしながら、内的には、年を取るにつれて、新陳代謝を調節する各種のホルモンの分泌が減少し、免疫細胞の機能および細胞の活性が低下して生体に必要な免疫たんぱく質および生体構成たんぱく質の生合成が減り、外的には、オゾン層破壊などの環境汚染による紫外線、自由ラジカルおよび活性酸素の増加に起因して発生する物理的、化学的な刺激およびストレスによって皮膚の正常機能が弱化し、老化が促され、血色が悪くなり、皮膚トーンも暗くなるなど皮膚に種々の変化が生じてしまう。

しかしながら、現代社会は、若くて美しい外貌を重視するため、前記内的要因および外的要因による皮膚変化の問題点を予防または解消しようとするニーズが高く、これに応えるために、種々のしわ改善剤、弾力改善剤などが次から次へと開発されている。

一方、皮膚におけるしわ、弾力喪失、皮膚乾燥症などの症状は、皮膚を構成する物質であるコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、グリコスアミノグリカン、フィブロネクチンおよび糖たんぱく質の含有量および配列が変化若しくは減少し、水分との結合能が低下し、その結果、皮膚を構成する基質物質が減少し、皮膚の含水能が失われて現れる。なお、皮膚を構成するほとんどの細胞においては、炎症を引き起こすものと知られている炎症誘発サイトカインである腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα、Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α）、インターロイキン−１ベーター（ＩＬ−１β、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）、プロスタグランジンを生成する酵素であるシクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−２、ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の生合成が増大し、これらの炎症性因子によって皮膚組織を分解する酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ、Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の生合成が増大することが知られている。

このため、上述した如き皮膚細胞を増殖させたり、皮膚を構成する基質物質を増大させたりすることにより、皮膚を厚くする物質、シクロオキシゲナーゼ−２の生合成を抑える物質、腫瘍壊死因子の生合成を抑える物質、皮膚繊維芽細胞におけるトロポエラスチンおよびフィブリリンの生成を促す物質などが開発できる限り、しわ、弾力喪失、皮膚乾燥症などの皮膚の諸症状が緩和できるようになる。

そこで、本発明者らは、天然物のうち皮膚の全般的な問題点を改善可能な物質を見出すために鋭意努力したところ、コウゾ抽出物が、皮膚保湿、弾力などと関わる諸症状を改善することができ、しかも、皮下脂肪分解および白毛防止効能もあるということを知見し、本発明を完成するに至った。

そこで、本発明の目的は、皮膚の全般的な状態を改善することができ、脂肪分解効果に優れており、しかも、白毛を防止することのできる天然物を含有する組成物を提供することである。

上述した目的を達成するために、本発明は、コウゾ抽出物を含有する組成物を提供する。
また、本発明は、コウゾ抽出物を含有する組成物を皮膚保湿用、抗老化用、抗炎症用、スリーミング用および白毛防止用に用いる用途を提供する。

本発明の組成物は、コウゾ抽出物を含有することにより、保湿、抗老化、抗酸化、抗炎症などの効果を提供して全般的な皮膚状態を改善することができ、さらに、毛穴縮小および皮脂調節、にきび症状改善および血色改善効果を提供することができる。なお、メラニンの合成を促して白毛を防止することができ、体内脂肪量を減少させて高弾力で且つ滑らかな皮膚に仕上げることができる。

本発明の組成物は、コウゾ抽出物を有効成分として含有する。
本発明において用いられるコウゾ属には、ヒメコウゾ（Ｂｒｏｕｓｓｏｎｅｔｉａ ｋａｚｉｎｏｋｉ Ｓｉｅｂ）、カジノキ（Ｂｒｏｕｓｓｏｎｅｔｉａ ｐａｐｙｒｉｆｅｒａ Ｖｅｎｔ）、エギダクナム（Ｂｒｏｕｓｓｏｎｅｔｉａ ｋａｚｉｎｏｋｉ ｖａｒ． ｈｕｍｉｌｉｓ Ｕｙｅｋｉ）などがあり、落葉広葉性の灌木であり、韓国のほとんどの地域（主として、南部に多数分布されている）、中国、台湾、日本などに分布し、地理的に山すその日当たりのよい所、畝などに棲息する。コウゾは、その靭皮繊維が紙の原料として用いられてきており、且つ、種々の薬効を有していることから、強壮、明目作用、インポテンツ、水腫、益気、利尿などに効果があり、風を除去し、血をきれいにし、しかも、視力減退などに効能があると知られている。

本発明において用いられるコウゾ抽出物は、コウゾから浸出、煎出して得た浸出液だけではなく、浸出液をさらに一部もしくは全部濃縮して得た濃縮物または上記の濃縮物をさらに乾燥させて製造した針体、拡展剤、チンキ剤、流動エキスおよびコウゾ中に含有されて主効果を発揮する化学物質はもちろん、植物そのものを全て含む。なお、本発明においては、幹、根、葉、花、実などコウゾの全ての部分からの抽出物を使用することができ、ある特定の部分の抽出物に何ら限定されない。

本発明において用いられるコウゾ抽出物の製造には、公知の方法を用いることができる。例えば、コウゾを自然乾燥または強制乾燥など任意の方法により乾燥して細かく切った後、水、エタノール、ブタノール、アセトンなどの極性溶媒、エーテル、ヘキサン、ベンゼン、クロロホルム、エチルアセテートなどの非極性溶媒、前記非極性溶媒と極性溶媒との混合溶媒、アルカリ水などの溶媒、または大豆油、ゴマ油などの植物油などを用いて、冷浸、パーコレーション、温浸などの任意の方法によって浸出処理して有効成分を含有する浸出物を得る。浸出処理は、冷浸およびパーコレーションの場合に約１２〜９６時間、温浸の場合には使用する溶媒などの種類および温度に応じて異なるが、好ましくは、溶媒の還流温度に近い温度で約０．５〜２４時間行うことが好ましい。特に、含水アルコールに浸出したチンキ剤や流動エキスまたはエキスのものを用いることが好ましい。

本発明に係る化粧料組成物は、前記コウゾ抽出物を組成物の総重量に対して０．０００１〜９０重量％含有してもよく、例えば、０．１〜７０重量％含有してもよく、好ましくは、１〜５０重量％含有してもよく、さらに好ましくは、１〜２０重量％含有してもよい。前記コウゾ抽出物の含量が上述した範囲において用いられる場合に、皮膚状態の改善効果が得られながらも、皮膚安定性または剤形上問題が発生しない。

本発明に係る組成物は、皮膚保湿用の組成物として使用可能である。前記皮膚保湿用の組成物は、皮膚バリア機能強化用および皮膚角質形成細胞分化誘導用に使用可能であり、これにより、本発明の組成物は、表皮分化の不完全性により生じる皮膚乾燥症、アトピー皮膚炎、接触性皮膚炎または乾癬などを予防または改善することができる。

また、本発明に係る組成物は、抗老化用の組成物として使用可能である。前記抗老化用の組成物は、コラゲナーゼの発現を抑えて皮膚弾力を増進させ、しわを改善することができる。

さらに、本発明に係る組成物は、抗菌および抗炎症用の組成物として使用可能である。前記抗菌および抗炎症用の組成物は、抗菌効果、特に、にきび原因菌に対する抗菌効果に優れており、しかも、炎症因子の発現を減少させて抗炎症効果を提供することから、皮膚トラブルを抑え、特に、にきび改善用に使用可能である。

さらにまた、本発明に係る組成物は、毛穴縮小および皮脂調節用の組成物として使用可能である。前記毛穴縮小および皮脂調節用の組成物は、コラーゲン合成を促して毛穴を縮小させ、過剰に分泌される皮脂を抑える。なお、前記組成物は、活性酸素の除去など優れた抗酸化力により皮膚刺激の生成を防御することができる。

加えて、本発明に係る組成物は、血色および皮膚トーン改善用の組成物として使用可能である。前記組成物は、皮膚に適用したときに毛細血管を拡張させ、血液循環を促すことにより皮膚に栄養分を円滑に供給し、皮膚老化を抑えて卓越した血色および皮膚トーン改善効果を有する。

また、本発明に係る組成物は、スリーミング用の組成物として使用可能である。前記スリーミング用の組成物は、中性脂肪を分解させ、セルライトを減少させてほっそりした体つきに仕上げることに効能があり、このため、皮膚用の剤形として投与したときに皮下脂肪を分解するスリーミング効果に非常に優れている。

さらに、本発明に係る組成物は、白毛防止用および白斑症治療用の組成物として使用可能である。

白毛の発生原因としては、メラノサイトの幹細胞消失、およびメラノサイトの活性低下が取り上げられている。特に、老化による白毛は、主として幹細胞の消失によって発生し、若白髪をはじめとする白毛の発生は、現代社会の環境的、精神的なストレスによるメラノサイトの活性低下によるものと知られている。

メラノサイトのメラニン合成活性は、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ、Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）の活性に大きく影響されるが、本発明に係るコウゾ抽出物含有組成物は、メラノサイトにおけるＭＩＴＦの発現を格段と上昇させて白毛を抑えて黒毛の誘発を促すことができる。

本発明の組成物は、皮膚外用剤組成物として使用可能であり、化粧料組成物または薬学組成物として製造可能である。

本発明に係る皮膚外用剤組成物は、化粧品学または皮膚科学的に許容可能な媒質または基剤を含有して剤形化可能である。これは、局所適用に適したあらゆる剤形であり、例えば、溶液、ゲル、固体、固練り無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球もしくはイオン型（リポーソム）および非イオン型の小嚢分散剤の形で、もしくはクリーム、スキン、ローション、パウダー、ゲル、軟膏、スプレイ、パック、皮膚貼着型またはスティックコンシーラーの形で提供可能である。なお、フォームの形でまたは圧縮された推進剤をさらに含有するエアロゾール組成物の形でも使用可能である。これら組成物は、当該分野における通常の方法により製造可能である。

また、本発明に係る化粧料組成物は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型もしくは非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性もしくは親油性活性剤、脂質小嚢または化粧品に通常用いられる任意の他の成分などの化粧品学もしくは皮膚科学分野において通常用いられる補助剤を含有してもよい。前記補助剤は、化粧品学または皮膚科学分野において通常用いられる量で取り込まれる。

さらに、本発明の組成物を医薬品に適用する場合には、コウゾ抽出物を有効成分として常用される無機もしくは有機の担体を加えて、固体、半固体または液状で非経口投与剤（けい皮投与または外用塗布）に製剤化可能である。非経口投与のための新たな製剤としては、軟膏、ローション、スプレイ、懸濁剤などが挙げられる。本発明に係る組成物は、当業界における通常の方法によって製剤化可能であり、界面活性剤、賦形剤、着色料、香辛料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、その他の商用の補助剤を適宜使用可能である。

本発明に係る組成物の投与量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重、治療すべき特定の疾患または病理状態、疾患または病理状態の深刻度、投与経路および処方者の判断に応じて異なる。このような因子に基づく投与量の決定は、当業者のレベル内にあり、治療すべき部位に外用塗布するなどして当業者のレベルにおいて適用可能である。一般に、投与量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜概ね２０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。好適な投与量は、２００μｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日である。

また、白毛防止用および白斑症治療用の組成物は、頭皮もしくは毛髪に塗布するシャンプー、リンス、コンディショニング、トーニックまたは頭皮エッセンスの剤形に容易に製造可能である。本発明に係る組成物は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤およびゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性もしくは親油性活性剤、脂質小嚢または化粧品に通常用いられる任意の他の成分などの化粧品学分野において通常用いられる補助剤を含有してもよい。これら補助剤は、化粧品学分野において通常用いられる量で取り込まれる。

さらに、各剤形の皮膚外用剤組成物において、上述した本発明の必須成分であるコウゾ抽出物以外の他の成分は、その他の皮膚外用剤の剤形または使用目的などに応じて当業者が簡単に適宜選定して配合することができ、この場合、他の原料と併用する場合に相昇効果が得られる。なお、本発明の組成物は、効果を高めるために、皮膚吸収促進物質をさらに含有してもよい。

以下、試験例および実施例を挙げて本発明の構成および効果についてより具体的に説明する。しかしながら、これらの試験例および実施例は本発明についての理解への一助となるために例示の目的だけで提供されたものであり、本発明の範ちゅうおよび範囲がこれに制限されるものではない。

［製造例１］コウゾ抽出物の製造
乾燥されたコウゾ全草１ｋｇを精製水１０Ｌに加え、沸騰するまで加熱した後、１０分間さらに加熱した。次いで、水を除去して洗浄し、別途に精製水１０Ｌを加えて再び洗浄した。残渣を風乾し、７０％エタノール２０Ｌに加えた後、還流装置を連結して加温して２４時間還流抽出した。８０網目の篩体を用いて固形分を除去し、残ったろ液を再びろ過した後、減圧濃縮器を用いてろ液中の溶媒を留去して約５０ｇの緑色固形分を得た。

［製造例２］コウゾ抽出物の製造
コウゾの幹、根、葉、花および実１ｋｇをきれいな水１０Ｌに入れ、冷却コンデンサー付き抽出器において５時間沸騰して抽出した後、３００網目のろ布でろ過し、５〜１５℃で５日間放置して熟成させた後、ろ紙でろ過した。このろ液を冷却コンデンサー付き蒸留装置において減圧濃縮してコウゾ抽出物７０ｇを得た。

［試験例１］角質形成細胞分化促進効果測定
前記製造例１に従い製造したコウゾ抽出物の角質形成細胞の分化促進効果を調べるために、下記のように角質形成細胞の分化時に生成される角化膜（ＣＥ：Ｃｏｒｎｉｆｉｅｄ Ｅｎｖｅｌｏｐ）量を吸光度を用いて測定した。

先ず、新生児の表皮から分離して一次的に培養した人間の角質形成細胞を培養用フラスコに入れて底面に付着し、下記表１の試験物質を培養液に５ｐｐｍ濃度にて処理した後、細胞が底面面積の約７０〜８０％成長するまで５日間培養した。このとき、低カルシウム（０．０３ｍＭ）処理群と高カルシウム（１．２ｍＭ）処理群をそれぞれ陰性対照群、陽性対照群とした。次いで、前記培養した細胞を回収してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：Ｐｈｏｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ：ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）と２０ｍＭ濃度のジチオトレイトール（ＤＴＴ：Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を含有する１０ｍＭ濃度のトリス−塩酸緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）１ｍｌを加えて超音波処理、沸騰、遠心分離を行い、沈殿物をさらにＰＢＳ１ｍｌに懸濁させて３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。これとは別途に、前記超音波処理後の溶液を一部取ってたんぱく質含量を測定し、細胞分化度の評価時の基準とした。その結果を下記表１に示す。

前記表１に示すように、コウゾ抽出物である製造例１を処理した場合に角質形成細胞の分化促進効果に優れていることを確認することができた。

［試験例２］皮膚バリア機能修復効果測定
前記コウゾ抽出物が皮膚損傷により損傷された皮膚バリア機能の修復に及ぼす効果を測定するために、下記の実験を行った。成人男女１０名の上腕をテープストリッピング法を用いて皮膚バリアに損傷を与え、それぞれ下記表２の組成に従い製造した実施例１および比較例１の２群を塗布しながら７日間一日につき一回ずつ経皮水分損失量（ＴＷＥＬ）の修復度を水分蒸散計（フィンランドのデルフィン社製）により測定比較した。ここで、実施例１は前記製造例１が含有されている組成物であり、比較例１としての陰性対照群は、ビヒクルである。実験結果は、下記表３に示す。表３の結果は、バリア損傷前とバリア損傷後の処理前の差分を１００％基準として比較した。

前記表３から明らかなように、コウゾ抽出物である製造例１を処理する場合に高速で経皮水分損失量が正常に戻り、バリア損傷が修復されることを確認することができる。

［参考例１］実施例２および比較例２の製造
前記製造例１に従い製造したコウゾ抽出物を活用して、下記表４の組成比に従い外用剤を栄養クリームの剤形として実施例２と比較例２を製造した。下記配合成分の含量比の単位は、重量％である。

［試験例３］皮膚保湿力増加効果の測定
コウゾ抽出物が皮膚保湿力の増加に及ぼす効果を測定するために、前記表４の実施例２と比較例２を用いて皮膚保湿改善効果を確認した。評価方法は、下記の通りである。
乾燥皮膚として分類された４０〜５０代の成人男女６０名を対象として、それぞれ実施例２および比較例２の２群に対して３０名ずつ２組に分けて栄養クリームを毎日２回ずつ４週間顔面に塗布させた。塗布開始前と、塗布後１週目、２週目、４週目の時点、そして、塗布中止後２週目（合計６週目）に恒温、恒湿条件（２４℃、相対湿度４０％）において皮膚水分量測定器（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ ＣＭ８２５、ドイツのコラージュ＆カザカエレクトロニック社製）により皮膚水分量を測定した。その結果を下記表５に示す。表５の結果は、試験開始直前に測定した皮膚水分量測定器の値を基準として所定期間処置した後の測定値の増加分を百分率にて表示したものである。

前記表５から明らかなように、比較例２を塗布した場合には塗布が行われた４週までは約３０％の水分増加率を示すものの、塗布を中止した後には皮膚水分量が減少するのに対し、コウゾ抽出物を含有する実施例２を塗布した場合には塗布を中止した後にも３０％以上の皮膚水分増加率を示すことを確認することができる。これにより、コウゾ抽出物を含有する本発明の組成物は、皮膚保湿性に優れていることが分かる。

［試験例４］エラスターゼ活性抑制効能測定
前記製造例１のコウゾ抽出物のエラスターゼ活性阻害能をＥＧＣＧと比較して測定した。用いられたエラスターゼおよび基質は、米国シグマアルドリッチ社から商業的に購買した（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ０１２７）。

下記の試験方法によりエラスターゼ活性阻害作用を試験した。
９６ウェルプレートにおいて１０ｍｇ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ８．０）として調製した製造例１の５０μＬおよび２０μｇ／ｍＬエラスターゼタイプＩＩＩ溶液５０μＬを混合した。ＥＧＣＧ２５０μＭは陽性対照群として用い、陰性対照群である非処理群としては蒸留水を用いた。その後、前記緩衝液として調製した０．４５１４ｍｇ／ｍＬ Ｎ−スクシニル−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ｐ−ニトロアニリド（Ｎ−ＳＵＣＣＩＮＹＬ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ｐ−ＮＩＴＲＯＡＮＩＬＩＤＥ）１００μＬを添加し、２５℃で１５分間反応させた。反応終了後、波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。この方法と同様にして空試験を行って補正した。

エラスターゼ活性阻害作用の計算方法は、下記の通りである。結果を表６に示す。
エラスターゼ活性阻害率（％）＝｛１−（Ｃ−Ｄ）／（Ａ−Ｂ）｝×１００
Ａ：実験試料添加なし、酵素添加における波長４１５ｎｍにおける吸光度
Ｂ：実験試料添加なし、酵素無添加における波長４１５ｎｍにおける吸光度
Ｃ：実験試料添加、酵素添加における波長４１５ｎｍにおける吸光度
Ｄ：実験試料添加、酵素無添加における波長４１５ｎｍにおける吸光度

前記表６に示すように、コウゾ抽出物のエラスターゼ活性抑制の度合いが、エラスターゼ活性抑制剤として知られているＥＧＣＧと比較して、類似またはより優れていることが分かり、本発明のコウゾ抽出物のエラスターゼ活性抑制効果に優れていることを確認することができる。

［試験例５］コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）阻害能
前記製造例１のコウゾ抽出物のコラゲナーゼ生成阻害能をレチノイン酸と比較して測定した。

２．５％のウシ胎児血清入りダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉａ）が含まれている９６ウェルマイクロタイタープレート培養機（９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）に人間の繊維芽細胞を５,０００細胞／ウェルになるように入れて、約７０〜８０％生長するまでＣＯ₂５％、３７℃培養機において培養した。その後、製造例１のコウゾ抽出物を１０μｇ／ｍｌの濃度にて２４時間処理した後、細胞培養液を採取した。

商業的に利用可能なコラゲナーゼ測定器具（米国アマシャムファルマシア社製、Ｃａｔａｌｏｇ＃：ＲＰＮ２６１０）を用いて、採取した細胞培養液のコラゲナーゼ生成度を測定した。先ず、１次コラゲナーゼ抗体が均一に塗布された９６−ウェルプレートに採取した細胞培養液を入れて、３時間をかけて抗原−抗体反応を恒温槽において行った。３時間後に発色団が結合された２次コラーゲン抗体を９６−ウェルプレートに入れて、さらに１５分間反応させた。１５分後に、発色誘発物質（３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン、シグマ社製）を入れて室温下で１５分間発色を誘発させ、さらに１Ｍ硫黄酸を入れて発色反応を中止すると、反応液は黄色を帯び、反応の進み具合に応じて黄色の度合いが異なってくる。

黄色を帯びる９６−ウェルプレートの吸光度を吸光計を用いて４０５ｎｍにおいて測定し、下記数学式１によってコラゲナーゼの合成度を計算し、その結果は下記表７に示す。このとき、組成物を処理していない群から採取した細胞培養液の反応吸光度を対照群とした。

［数学式１］
コラゲナーゼ発現度（％）＝（物質処理細胞群の吸光度／対照群の吸光度）×１００

前記表７に示すように、コウゾ抽出物のコラゲナーゼ発現度が、コラゲナーゼ発現阻害剤として知られているレチノイン酸と比較しても、コラゲナーゼ発現阻害効果がほぼ同じレベルであることが分かる。

このような結果から、本発明に係るコウゾ抽出物は、基質メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−１）を阻害する効果を有するということを確認することができる。

［試験例６］皮膚弾力向上効能確認
コウゾ抽出物が皮膚弾力の改善に及ぼす効果を測定するために、前記表４の実施例３および比較例２を用いて皮膚弾力改善効果を確認した。評価方法は、下記の通りである。

３０〜４０代の健康な女性４０名に、それぞれ実施例３と比較例２の２群に対して２０名ずつ２組に分けて栄養クリームを毎日１回ずつ１２週間顔面に塗布させた後、皮膚弾力測定機（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＳＥＭ ５７５、ドイツのコラージュ＆カザカエレクトロニック社製）を用いて皮膚弾力を測定した。その結果は、下記表８に示す。表８の結果値は、Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＳＥＭ ５７５のΔＲ８（Ｒ８（左側）−Ｒ８（右側））の値として記載したが、Ｒ８値は皮膚粘弾性を示す。

前記表８に示すように、本発明のコウゾ抽出物が含有されている実施例３は、比較例２を塗布した群に比べて皮膚弾力性がさらに増大された。
したがって、本発明のコウゾ抽出物を含有する化粧料組成物は、皮膚弾力の向上に非常に効果的であることを確認することができる。

［試験例７］皮膚しわ改善効能の確認
コウゾ抽出物が皮膚しわの改善に及ぼす効果を測定するために、前記表４の実施例３および比較例２を用いてしわ改善効果を確認した。評価方法は、下記の通りである。

４０代の健康な女性４０名に、それぞれ実施例３と比較例２の２群に対して２０名ずつ２組に分けて栄養クリームを毎日１回ずつ１２週間顔面に塗布させた後、シリコンを用いてレプリカを作成し、しわの状態を皮膚測定機（ビジオメーター、ＳＶ６００、ドイツのコラージュ＆カザカエレクトロニック社製）により測定して画像解析した。その結果は、下記表９に示す。下記表９の値は、塗布１２週後のそれぞれの変数値から塗布前の変数値を差し引いた値の平均を示すものである。

前記表９に示すように、実施例２の外用剤組成物は、皮膚しわの改善効果に非常に優れているということが分かる。

［参考例２］実施例４および比較例３〜４の製造
前記製造例１に従い製造したコウゾ抽出物を活用して、下記表１０の組成比に従い、実施例４および比較例３〜４の外用剤を製造した。下記配合成分の含量比の単位は、重量％である。

具体的に説明すれば、実施例４は、前記製造例１のコウゾ抽出物を配合したものであり、比較例３は、にきび皮膚改善の有効成分を全く含有していないものであり、比較例４は、抗菌力に対する基準とする標準物質であり、にきび治療剤として多用するエリスロマイシンを含有するものである。

実施例４および比較例３〜４の製造方法は、下記の通りである。下記表１０のＡ相の成分を完全に溶解させ、別途の溶解槽においてＢ相の成分を完全に溶解させた後、Ｂ相をＡ相に添加して混合可溶化させた。ここにＣ相の成分を表１０に記載の配合比に従い添加して混合均一化させた後、ろ過してこの組成物を製造した。

［試験例８］にきび菌に対する抗菌力試験
実施例４および比較例３〜４の組成に従い製造されたそれぞれの化粧料組成物をもってにきび原因菌株であるプロピオニバクテリウム・アクネス＜ＡＴＣＣ６９１９：培地−ＢＨＩブロス＞に対して抗菌力を試験した。

にきび菌に対する抗菌力試験方法は、下記の通りである。

（１）試験菌液の準備
プロピオニバクテリウム・アクネスとしては、ＢＨＩブロスに接種して嫌気培養した培養液を使用した。

（２）希釈溶液の準備
ＢＨＩブロス（ｐＨ６．８）またはＬＢブロス（ｐＨ４．５）１５ｍｌに前記試験菌液を０．１５ｍｌ添加してよく混合したものを希釈溶液として使用した。

（３）試料準備
実施例３および比較例３〜４に従い製造した化粧料組成物原液をそのまま試料として使用した。

（４）抗菌力試験
１）９６ウェルの細胞培養管の１行目に出発濃度に合わせて試料を入れて、希釈溶液の総量を２００μｌずつ入れる。
２）１行目の混合液をよく混ぜた後、１００μｌを取って２行目に入れてよく混ぜた後、さらに１００μｌを取って３行目に入れるなどして二重希釈を行う。
３）３２℃で２４時間および４８時間静置培養した後、懸濁された度合いをもって菌の増殖有無を判断して菌の増殖がない最小濃度をＭＩＣ（最小阻止濃度、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）値として決定する。もし、混合液が不透明であって菌の増殖有無を判断し難い場合には、顕微鏡観察により確認する。

にきび菌に対する抗菌力試験結果を下記表１１に示す。ＭＩＣは、剤形に含有されている有効成分の濃度で換算して表記した。

ＭＩＣにおいて、ｐｐｍ濃度が小さいほど、にきび菌に対する抗菌力に対して有効な物質であるといえるが、実施例４の場合、公知のにきび治療剤であるエリスロマイシンを用いた比較例４よりもｐｐｍ濃度が小さいため、試験菌に対して優れた抗菌力を有するということを確認することができる。

［試験例９］脂質生成（Ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）抑制試験
ラットの繊維芽細胞株である３Ｔ３−Ｌ１細胞を１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）が含有されているダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｏｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅｓ ｍｅｄｉｕｍ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、ライフテクノロジーズ社製）入り６ウェル培養プレートに１×１０⁵細胞／ウェルにて付着した。２日経過後にさらに新たなＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）培地に交換し、２日間培養した。次いで、上記培養した細胞をさらに１μｇ／ｍｌインシュリン、０．５ｍＭ ＩＢＭＸおよび０．２５μＭデキサメタゾンを含有するＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）で分化誘導をし、２日経過後にさらにインシュリン入りＤＭＥＭに交換して５日間培養した。５日後にさらに正常培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ含有）に交換し、前記細胞が形態的に脂肪細胞に変化するまで観察しながら培養した。

コウゾ抽出物の脂肪細胞内の脂肪蓄積抑制効能を評価するために、上記分化済み３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を用いて手段ＩＩＩ染色（Ｓ４１３６、シグマ−アルドリッチ社製）を行った。脂肪細胞をリン酸塩バッファー内において４％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．２）で常温下で固定した後にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄し、次いで、手段ＩＩＩで染色した後に写真を撮って目視により比較した。対照群は、試験物質や比較物質を添加していない培地のみを用いたものであり、他の比較群として、カフェイン５０μＭを処理した。脂肪蓄積抑制の度合いは、染色された度合いを＋＋＋、＋＋、＋、−に分けて等級を与えた。その結果を表１２に示す。

前記表１２に示すように、本発明において用いられたコウゾ抽出物は、脂質合成阻害効果があるということが分かる。このため、脂質合成が抑えられることにより、皮脂が減少されてにきび発生を抑えることができる。

［試験例１０］にきび改善と、皮脂分泌減少および刺激有無の試験
にきびに悩んでいる１２名に、前記実施例４および比較例３〜４に従い製造した化粧料組成物を一ヶ月間使用させた。にきび改善の尺度は１点から５点までにし、１点は、「改善されていない」、３点は、「普通である」、５点は、「非常に改善されている」と表記させた。実験結果は、下記の表１３に１２名の平均点数として表記した。

にきびの消滅時期は、消滅が認められた日数を基準として、にきび再発の有無は、一ヶ月後の結果を基準とした。皮脂分泌の減少は、１点から５点までにし、１点は、「減少されていない」、３点は、「普通である」、５点は、「非常に減少されている」と表記させた。実験結果は、下記表１３に１２名の平均点数で表記した。皮膚刺激の有無は、（刺激反応を示す人数）／（総試験者数）で示す。

前記表１３に示すように、実施例３は比較例３に比べてにきびが再発せず、全般的ににきび改善に対して優れた効果があるということが分かる。一方、抗菌力標準物質を含有する比較例４の場合、実施例４とほとんど同じ効能を示しているが、使用に際して刺激が強くて長期使用には皮膚刺激が懸念される。

［試験例１１］炎症改善効果
抗炎症効果は、プロスタグランジンの生成抑制効果で評価した。前記製造例１のコウゾ抽出物を用い、大食細胞を対象として効果を測定した。先ず、マウスの腹腔から採取した大食細胞に最終濃度が５００Ｍになるようにアスピリンを添加して細胞に残存するシクロオキシゲナーゼ（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ、ＣＯＸ）活性を非可逆的に抑えた。次いで、前記懸濁液１００μｌを９６ウェルの細胞培養管の各ウェルに入れて５％ＣＯ₂と３７℃条件の培養機において２時間培養して大食細胞を容器の表面に付着した。次いで、付着された大食細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、これを抽出物の効果試験に用いた。前記培養された大食細胞５×１０⁴細胞／ｍｌにＬＰＳを１％（ｗ／ｖ）含有するＲＰＭＩ培地を添加して１２時間培養した後、プロスタグランジンの生成を誘発し、抽出物を１００μｌ処理して遊離されたプロスタグランジンを酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）を用いて定量した。

このとき、抽出物のプロスタグランジンの生成抑制活性は、ＬＰＳを処理した群とＬＰＳを処理していない群においてそれぞれ生成されたプロスタグランジンの差分を１００％と設定し、ＬＰＳと試料を同時に処理して減少されたプロスタグランジンの百分率を用いて対照群と比較・判定し、その結果（プロスタグランジンの生成抑制効果）を下記表１４に示す。

前記表５に示すように、実験の結果、アスピリンで処理した対照群のようにコウゾ抽出物を処理した場合にもプロスタグランジンの生成抑制効果が非常に高いということが分かる。これにより、本発明のコウゾ抽出物は、優れた炎症改善効果を提供するということが分かる。

［試験例１２］５α−レダクターゼ活性抑制効果
５α−レダクターゼ活性抑制効果を確認するために、ＨＥＫ２９３−５αＲ２細胞において［¹⁴Ｃ］テストステロンが［¹⁴Ｃ］ジヒドロテストステロンに変換される割合を測定した。ＨＥＫ２９３細胞は、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−５αＲ２をトランスフェクションさせて２４ウェルプレートに１ウェル当たりに２．５×１０⁵細胞を入れて培養した（Ｐａｒｋら、２００３、ＪＤＳ．Ｖｏｌ．３１、ｐｐ１９１−９８）。翌日に酵素基質および阻害剤入りの新たな培地に交換した。培地の基質としては、０．０５μＣｉ［¹⁴Ｃ］テストステロン（米国アマシャムファルマシア社製）を使用した。阻害度を確認するために、製造例２のコウゾ抽出物１０μｇ／ｍｌを入れて、２時間をかけて３７℃、５％ＣＯ₂培養機において培養した。また、陽性対照群としてフィナステリドを使用した。培養培地を回収し、ステロイドを８００μｌエチルアセテートで抽出した。上部の有機溶媒層を分離して乾燥した後、残渣をさらに５０μｌエチルアセテートで溶かしてシリカプラスチックシートキーセルゲル６０エフ２５４（Ｓｉｌｉｃａ ｐｌａｓｔｉｃ ｓｈｅｅｔ ｋｉｅｓｅｌ ｇｅｌ Ｆ２５４）上において、展開溶媒系としてエチルアセテート−ヘキサン（１：１）を用いて展開した。

プラスチック試料を空気中において乾燥した後、同位元素の量を測定するためにバスシステムを使用したが、乾燥されたプラスチックシートとＸレイフィルムを一緒にバスカセットに入れて１週間後にフィルムに残っているテストステロンとジヒドロテストステロンの同位元素の量を測定した。その結果は、下記表１５に示す。

前記表１５の結果から、本発明のコウゾ抽出物は、テストステロンをジヒドロテストステロンに転換して細胞質内にある水溶体たんぱく質と結合して核内に取り込まれて皮脂腺細胞を活性化させ、分化を促すことにより、皮脂腺内の皮脂を過分泌させる５α−レダクターゼの活性を有効に抑えることにより、テストステロンのジヒドロテストステロンへの転換を遮断することが分かる。
したがって、本発明のコウゾ抽出物は、優れた５α−レダクターゼの活性抑制効果があり、皮脂の過分泌を抑える上で効果的である。

［参考例３］参照例５および比較例５の製造
前記製造例２に従い製造したコウゾ抽出物を活用して、下記表１６の組成比に従い、外用剤をローション剤形にして参照例５および比較例５を製造した。下記配合成分の含量比の単位は、重量％である。

＜参照例５および比較例５の製造方法＞
１）前記１１〜１４の成分を７０℃まで加熱しながら均一に混合して水相部を製造した。
２）前記１〜１０の成分を７０℃まで加熱しながら均一に混合して油相部を製造した。
３）前記１）の水相部に前記２）の油相部を投入し、７，２００ｒｐｍにて６分間ホモミキシングした。
４）前記３）の混合物を室温まで冷却した。

［試験例１３］皮脂分泌抑制効果
コウゾ抽出物が皮脂分泌抑制に及ぼす効果を測定するために、前記表１６の参照例５および比較例５を用いて皮脂分泌抑制効果を確認した。評価方法は、下記の通りである。

皮脂分泌が多いと感じる被験者男女１０名を選定して、指定された部位に参照例５および比較例５のローションを４週間毎日塗布させた。皮脂減少の効果に対する判定は、皮脂量測定機を用いて行い、その結果は、下記表１７に示す。

前記表１７の結果から、本発明のコウゾ抽出物を有効成分として含有する参照例５は、コウゾ抽出物を含有していない比較例５よりも過剰で分泌される皮脂を有効に抑えるということが分かる。
したがって、本発明のコウゾ抽出物を含有する皮膚外用剤組成物は、優れた皮脂分泌抑制効果がある。

［試験例１４］活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）生成抑制効果
人間の表皮組織から分離した角質形成細胞（ケラチノサイト）を２４ウェル型細胞培養プレートの各ウェルに５×１０⁴個入れて２４時間付着させた。１６時間後に、製造例２のコウゾ抽出物１％で処理した。２時間後に培養液を除去した後、各ウェルに１００μｌのリン酸緩衝塩液（ＰＢＳ）を入れた。この角質形成細胞に紫外線Ｂ（ＵＶＢ）ランプ（型番：Ｆ１５Ｔ８、ＵＶＢ１５Ｗ、日本三共電気社製）を用いて紫外線３０ｍＪ／ｃｍ²を照射した後、ＰＢＳを取り、各ウェルに角質形成細胞培養液２００μｌを添加した。ここにコウゾ抽出物をさらに処理し、所定時間帯別に紫外線刺激によって増大した活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）の量を定量した。ＲＯＳの量は、ＲＯＳによって酸化されるジクロロフルオレシンジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ、ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ）の蛍光を測定するＴａｎらの方法を参考して定量した（Ｔａｎら、１９９８、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１４１、ｐｐ１４２３−１４３２）。対照群のＲＯＳに対する割合を下記表４に示す。

前記表１８から明らかなように、本発明のコウゾ抽出物が、紫外線によって皮膚細胞損傷を引き起こすと知られているＲＯＳの生成を有効に抑えて抗酸化効能に優れていることが分かる。
したがって、本発明のコウゾ抽出物は、酸化を抑えて老化を防ぐことにより、毛穴が広くなることを予防することができ、皮膚刺激の生成を防御することができる。

［試験例１５］コラーゲン生合成の促進
コウゾ抽出物のコラーゲン生合成の促進効果をＴＧＦ−βと比較して測定した。
先ず、繊維芽細胞を２４ウェルに１ウェル当たりに１０⁵個ずつ播種して約９０％生長するまで培養した。これを２４時間無血清ＤＭＥＭ培地で培養した後、無血清培地に溶かされた本発明のコウゾ抽出物とＴＧＦ−β１０ｎｇ／ｍｌで処理し、２４時間をかけてＣＯ₂培養機において培養した。これらの上澄み液を取り、プロコラーゲン型（Ｉ）ＥＬＩＳＡキット〔ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ（Ｉ）〕を用いてプロコラーゲンの増減有無を調べてみた。その結果は表１９に示し、コラーゲンの合成能は非処理群を１００として対比したものである。

前記表１９の結果から、本発明に係るコウゾ抽出物は、陽性対照群であるＴＧＦ−βのように高いコラーゲン合成能を示すということを確認することができる。
したがって、本発明のコウゾ抽出物は、毛穴周りのコラーゲン生成量を増大させて広くなった毛穴を縮小させることができる。

［試験例１６］毛穴縮小効果試験
コウゾ抽出物が毛穴縮小に及ぼす効果を測定するために、前記表１６の参照例５および比較例５を用いて毛穴縮小効果を確認した。評価方法は、下記の通りである。

毛穴が広い被験者男女１０名を選定して顔に参照例５および比較例５のローションを４週間毎日塗布させた。毛穴縮小の効果に対する判定は、実験前および４週後に写真を撮って専門家の目視評価により行われた。その結果は、下記表２０に示す（評価等級０：全く縮小されていない。〜５：非常に縮小されている）。

前記表２０の結果から、本発明に係るコウゾ抽出物は、毛穴を縮小させる効果に優れていることが分かる。

［試験例１７］皮膚炎症因子の発現減少効果
本発明のコウゾ抽出物の皮膚炎症因子であるＰＧＥ−２の発現を抑える効果を測定するために、酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）を行った（ＳＥ Ｄｕｎｓｍｏｒｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７１： ２４５７６−２４５８２， １９９６）。

細胞は、以前に継代培養された培地に黄砂（０．１ｐｐｍ）を２４時間培養した後、培地に交換し、コウゾ抽出物を処理して２４時間さらに培養し、培地を回収して９６ウェルプレート培養機にコーティングした。一次抗体（単一クローン抗体）を処理し、３７℃で９０分間反応させた。二次抗体である抗マウス免疫グロブリンＧ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）をさらに約９０分間反応させた後、緩衝溶液で洗浄し、次いで、アルカリンフォスファターゼ基質溶液（ジエタノールアミン緩衝溶液内の１ｍｇ／ｍｌｐ−ニトロフェニルホスファート）を常温下で３０分間反応させ、吸光度計を用いて４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。前記本発明に係る有効成分を処理していない細胞培養液の吸光度を対照群とした。ＰＧＥ−２の発現抑制効果は、下記数学式２によって算出した。その結果は、下記表２１に示す。

［数学式２］
ＰＥＧ−２の発現抑制率（％）＝（Ａ−Ｂ）／Ａ＊１００
Ａ：試料を添加していないウェルの吸光度
Ｂ：試料を添加したウェルの吸光度

前記表２１から明らかなように、本発明のコウゾ抽出物は、皮膚の炎症因子であるＰＧＥ−２の発現を有効に抑えることを確認することができた。
したがって、本発明のコウゾ抽出物は、皮膚炎症因子の発現を抑えて皮膚トラブルを防ぐ効果に優れていることが分かる。

［試験例１８］血色改善効果
コウゾ抽出物が血液改善に及ぼす効果を測定するために、前記表１６の参照例５および比較例５を用いて皮膚血液循環促進効果を確認した。評価方法は、下記の通りである。

皮膚血液循環促進効果の測定は、レーザードップラー血流測定装置（ＬＤＰＩ：Ｌａｓｅｒ Ｄｏｐｐｌｅｒ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｉｍａｇｅｒ）を用いて皮膚における血液循環の度合いを測定して行われた。ＬＤＰＩは、皮膚における血液循環を測定する機器として広く知られており、現在用いられている機器であり、皮膚の毛細血管における血液の速度および量だけではなく、小動脈および小静脈における流れまで測定可能な非常に敏感な機器である。

恒温恒湿室において石鹸で洗顔した後に３０分間適応させ、ＬＤＰＩを用いて初期値を測定した。実験に参加した人員は、普段手足が冷たい女性２０名であり、ＬＤＰＩを用いて額の下部の初期血流量を測定した。

前記参照例５および比較例５を１週間被試験者に使用させた後、血流量と皮膚温度を初期測定値と比較し、血流量を皮膚初期の測定値と比較してその結果を下記表２２に示す。

前記表２２の結果から、本発明のコウゾ抽出物を含有する参照例５は、有効成分を含有していない比較例５よりも血液循環をさらに促すことにより、血色を改善するということを確認することができる。
これは、究極的に、本発明に係るコウゾ抽出物を含有する組成物が皮膚の栄養分を有効に伝達し、皮膚老化を抑えて遅延させるのに寄与することを示唆する。

［試験例１９］皮膚トーンの改善効果
コウゾ抽出物が皮膚トーンの改善に及ぼす効果を測定するために、前記表１６の参照例５および比較例５を用いて皮膚トーン改善効果を確認した。評価方法は、下記の通りである。

１０名の被験者を対象として、対象者にそれぞれ使用（夕方に一日につき１回塗布、合計１週間）させた後、Ｆａｃｉａｌ Ｓｔａｇｅ ＤＭ−３（日本モリテックス社製）機器を活用して皮膚トーン改善の度合いを評価した。皮膚の明度および色彩測定値の変化値をもって皮膚トーン改善率を判断した。その結果は、下記表２３に示す。

表２３の結果から明らかなように、本発明のコウゾ抽出物を含有していない比較例５は、有意な皮膚トーンの改善効能を示さなかったものの、本発明によりコウゾ抽出物を有効成分として含有する参照例５は、使用前よりも使用後の皮膚トーンが大幅に改善されていた。

［試験例２０］脂肪細胞内の中性脂肪の分解促進効果
ラットの繊維芽細胞株（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）である３Ｔ３−Ｌ１細胞を１０％のウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）入りダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉａ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、ライフテクノロジーズ社製）が含有されている６ウェル培養プレートに１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて付着した。２日経過後にさらに新たなＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）培地に交換し、２日間培養した。その後、前記培養した細胞をさらに１μｇ／ｍｌインシュリン、０．５ｍＭ ＩＢＭＸおよび０．２５μＭデキサメタゾンを含有するＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）に分化誘導をし、２日経過後にさらにインシュリンが含まれているＤＭＥＭに交換して５日間培養した。５日後にさらに正常培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ含有）に交換し、前記細胞が形態的に脂肪細胞に変化するまで観察しながら培養した。

コウゾ抽出物の脂肪細胞内の中性脂肪分解促進効能を評価するために、上記分化済み３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を用いて実験を行った。３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄し、脂肪酸無し０．５％ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）を含む無色のＤＭＥＭを添加した後に取ってそれぞれ実験に使用した。対照群は、試験物質や比較物質を添加していない培地のみを使用したものであり、その結果値を１００％としたときにその他の値を換算して示す。なお、他の比較群としてカフェイン５０μＭを処理した。脂肪分解度は、脂肪細胞から培養液中に遊離されたブドウ糖濃度を測定することにより判断した。ブドウ糖の定量は、米国シグマ社（米国ミズーリ州のセントルイス）から購入したＧＰＯ−トラインダーキットを用いた発色反応法により行い、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を表２４に示す。

前記表２４から明らかなように、本発明のコウゾ抽出物を処理した群は、対照群と比較したときに、脂肪細胞から培養液中に遊離されるブドウ糖の濃度が格段と増大することが分かる。なお、本発明のコウゾ抽出物を処理した群は、陽性対照群としてカフェインを処理した群よりもさらに優れた脂肪分解効果を有することが分かる。

［参考例４］参照例６および比較例６の製造
前記製造例２に従い製造したコウゾ抽出物を活用して、下記表２５の組成比に従い、外用剤をローション剤形にして参照例６および比較例６を製造した。下記配合成分の含量比の単位は、重量％である。

［試験例２１］スリーミング効果
コウゾ抽出物が及ぼすスリーミング効果を測定するために、前記表２５の参照例６と比較例６を用いてスリーミング効果を確認した。評価方法は、下記の通りである。

局所肥満やセルライトに悩んでいる女性のうち、肥満度指数（ＢＭＩ：Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ、体重（ｋｇ）／身長（ｍ）²）が２１〜２７である２５〜４６歳の成人女性４０名を対象として、４週間朝と夕方に一日につき２回一方の大腿部に自宅において使用者のマッサージとともに前記剤形のローションを使用し、８週間使用前、使用後を機器で評価し、研究者（皮膚科医者）による評価およびアンケート評価によって効果有無を判断した。

超音波を用いた皮下脂肪層の厚さ（単位：ｍｍ）の測定は、ウルトラサウンド−ＥｕＢ ４１５ ＵＳスキャナーを用いて行った。得られた数値は、両側検定としてスチューデントの検定またはウィルコクソン検定を用いて使用前と使用後を比較して統計的な有意性を分析した（有意レベルα＝０．０５）。その結果は、下記表２６に示す。

前記表２６から明らかなように、本発明のコウゾ抽出物を含有する参照例６を使用した場合に、コウゾ抽出物を含有していない比較例６と比べて、大腿部の周りが有意的に減少していることが分かる。試験期間を通じて被検者の体重には変化がなかった。

また、前記評価を行うと共に、機器を用いて皮膚弾力を測定した。このとき、皮膚弾力測定機（Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ ＳＥＭ５７５、ドイツのコラージュ＆カザカエレクトロニック社製）を用いた。セルライトの度合いは、専門研究者による目視評価により行われた。得られた数値は、両側検定としてウィルコクソン検定を用いて使用前と使用後を比較して統計的な有意性を分析した（有意レベルα＝０．０５）。評価指標のうち弾力は、全体の弾力を意味するＲ２値（１に近いほど弾力が良好である）の変化で評価し、セルライトの度合いは、目視評価によって０点から４点まで５段階で評価した（０点：セルライトが非常に多い、〜４点：セルライトがない）。その結果は、表２７に示す。

前記表２７から明らかなように、研究者による効能評価において、比較例６に比べて、参照例６を使用した部位におけるセルライトが統計的に有意に減少され、皮膚弾力が増大した。
したがって、本発明のコウゾ抽出物を含有する皮膚外用剤組成物は、皮下脂肪とセルライトを有効に減少させ、皮膚の弾力を増大させることにより、優れたスリーミング効果を示す。

［試験例２２］形質転換細胞株を用いたコウゾ抽出物のＭＩＴＦ発現促進効果
白毛防止効果を確認するために、コウゾ抽出物のＭＩＴＦ発現促進効果を確認した。このために、［形質転換細胞株と白斑症マウスを用いた白毛防止物質スクリーニング方法およびその白毛防止物質を含有する白毛防止用の組成物］（大韓民国出願番号１０−２００７−００７２１８２）を用いた。発現ベクターｐＭＩＴＦ−ＧＬｕｃで形質転換されたＭｅｌａｎ−ａメラノサイト細胞株ＭＩＴＦ−ＧＬｕｃ（寄託番号：ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００１６２）を１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、以下、ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１μＭ ＴＰＡ（Ｓｉｇｍａ社製）、４００μｇ／ｍｌＧ４１８入りＲＰＭＩ１６４０培地において３７℃、１０％ＣＯ₂条件で培養した。陽性対照群であるＩＢＭＸはシグマ社から購入して１００μＭの濃度で使用した。形質転換メラニン細胞（ｍｅｌａｎ−ａ）を２４ウェルマイクロタイタープレート（２４−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）に５０,０００細胞／ウェルになるように継代培養した。翌日に、継代培養された細胞に試験物質としての前記製造例１のコウゾ抽出物（１０００ｘストック）を最終濃度１０、５０ｐｐｍで処理し、陰性対照群としては０．１％ＤＭＳＯを、陽性対照群としては１００μＭ ＩＢＭＸを処理した後に３７℃で３日間培養した。培養後に、ＧＬｕｃの量を定量するためには少量の培地のみ測定プレートに移して基質と反応させた。具体的には、細胞培養皿から少量の培地を取って測定プレートに移した後、この培地に１Ｘ ＧＬｕｃ ａｓｓｓｙ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ〔ニュー・イングランド・バイオラボ（ＮＥＢ）社製〕を４：１の割合にて入れて、ルミノメーターを用いて４７０ｎＭにて発生する光の量を測定した。その結果を下記表２８に示す。

前記表２８から明らかなように、コウゾ抽出物が形質転換メラノサイトのＭＩＴＦ発現を促していることが分かる。

［試験例２３］白毛発生が促進された白斑症マウスを用いた生体内コウゾ抽出物の白毛防止および黒毛誘発効能評価
白斑症マウス（Ｃ５７ｂｌ／６−Ｍｉｔｆ^mi-vit）は、米国ジャクソン研究所から購入して使用した。前記白毛発生が促進されたマウスを用いた白毛防止物質効果実験方法は、下記の通りである。１２週齢のマウスの背側毛を脱毛器で除去した。但し、毛を除去する部位の広さは、各個体ごとに同一に調節した。毛を抜いた翌日から一日につき２回ずつ白毛防止物質を毛抜け部位に塗布した。白毛防止物質の運搬体としては、ＥｔＯＨ：１、３−ＢＧ：ＤＷ＝３：２：５（体積比）の混合物を使用し、前記運搬体を陰性対照群として、ここにＩＢＭＸ５０ｍＭを添加した液を陽性対照群として、そして前記製造例１のコウゾ抽出物を２．５％添加した液を試験群として使用した。約３週間が経過した後に、各物質間の白毛防止効能の差分が目視されると、新たに生えた毛を集め、毛髪内のメラニン量を測定した。毛髪内メラニン量はたんぱく質加水分解酵素であるエスペラーゼ（ノボザイムズ社製）を用いて測定した。バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ９．３）にエスペラーゼを１ＮＰＵ／ｍｌの濃度になるように溶かして反応バッファーを製造した。反応バッファー１ｍｌにマウス毛髪５ｍｇを入れて、３７℃で１,０００ｒｐｍの速度で震盪しながら１３時間反応させた後、瞬時の遠心分離により毛髪と反応液を分離した。このようにして反応液を９６ウェルプレートに入れ、４０５ｎｍの波長における吸光度を測定すれば、反応液内のメラニン量を測定することができる。白毛発生が促進された白斑症マウスモデルに陰性対照群、陽性対照群、試験群物質を処理した場合、その効能を目視し、且つ、毛髪内メラニンの定量方法により測定した結果を表２９に示す。

表２９の結果から明らかなように、コウゾ抽出物は、白毛発生が促進されたマウス生体内における白毛を抑え、毛髪内メラニン量を増大させて黒毛誘発を促進することが分かる。

［剤形例１］栄養化粧水
下記表３０に記載の組成に従い、通常の方法により栄養化粧水を製造した。

［剤形例２］栄養ローション
下記表３１に記載の組成に従い、通常の方法により栄養ローションを製造した。

［剤形例３］栄養クリーム
下記表３２に記載の組成に従い、通常の方法により栄養クリームを製造した。

［剤形例４］パック
下記表３３に記載の組成に従い、通常の方法によりパックを製造した。

［剤形例５］軟膏
下記表３４に記載の組成に従い、通常の方法により軟膏を製造した。

［剤形例６］マッサージクリーム
下記表３５に記載の組成に従い、通常の方法によりマッサージクリームを製造した。

［剤形例７］毛髪シャンプー
下記表３６に記載の組成に従い、通常の方法により毛髪シャンプーを製造した。

［剤形例８］毛髪コンディショニング
下記表３７に記載の組成に従い、通常の方法により毛髪コンディショニングを製造した。

［剤形例９］頭皮ヘアトニック
下記表３８に記載の組成に従い、通常の方法により頭皮ヘアトニックを製造した。

［剤形例１０］頭皮エッセンス
下記表３９に記載の組成に従い、通常の方法により頭皮エッセンスを製造した。

Claims (6)

1. １）コウゾの全草を乾燥する段階、
   ２）前記１）の段階で乾燥されたコウゾの全草に水を添加して加熱し、次いで、前記水を除去して洗浄し、前記洗浄後の残渣を乾燥する段階、及び
   ３）前記２）の段階で得られた乾燥後の残渣にエタノールを添加して還流抽出し、次いで、固形分を除去して得られたろ液をろ過した後、前記ろ過後のろ液を減圧下で濃縮する段階
   を経て製造されるコウゾ抽出物を有効成分として含有し、白毛防止の用途で用いられる皮膚外用剤組成物。
2. １）コウゾの全草を乾燥する段階、
   ２）前記１）の段階で乾燥されたコウゾの全草に水を添加して加熱し、次いで、前記水を除去して洗浄し、前記洗浄後の残渣を乾燥する段階、及び
   ３）前記２）の段階で得られた乾燥後の残渣にエタノールを添加して還流抽出し、次いで、固形分を除去して得られたろ液をろ過した後、前記ろ過後のろ液を減圧下で濃縮する段階
   を経て製造されるコウゾ抽出物を有効成分として含有し、白斑症抑制の用途で用いられる皮膚外用剤組成物。
3. 前記皮膚外用剤組成物の白毛防止または白斑症抑制の効果は、前記コウゾ抽出物によるメラノサイトのＭＩＴＦの発現促進の効果であるかまたはメラノサイトのチロシナーゼの発現促進の効果である請求項１または２に記載の皮膚外用剤組成物。
4. 前記皮膚外用剤組成物は、化粧料組成物である請求項１または２に記載の皮膚外用剤組成物。
5. 前記皮膚外用剤組成物は、医薬用組成物である請求項１または２に記載の皮膚外用剤組成物。
6. 前記抽出物は、前記皮膚外用剤組成物の総重量に対して０．０００１〜９０重量％含有される請求項１または２に記載の皮膚外用剤組成物。