CN101637503A - 构树叶总黄酮提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了构树叶总黄酮提取物及其制备方法与应用。该方法包括如下步骤：1)将构树叶粉碎成粉末；2)将构树叶粉末用乙醇的水溶液进行提取，过滤提取液后合并滤液，浓缩，得到浓缩液，浓缩液用脱脂溶剂脱脂后得脱脂浓缩液；3)将脱脂浓缩液进行分离纯化，干燥后，得到所述构树叶总黄酮提取物。该方法制备所得构树叶总黄酮提取物中，总黄酮的重量含量为20％～70％，收率为1％～30％。经药理试验证明，该构树叶总黄酮提取物可单独或与其它药物组合作为原料药应用于具有抑菌和抗炎药物的制剂中。该方法制备产物纯度高，方法简便实用，适合工业化生产。

Description

构树叶总黄酮提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种构树叶提取物及其制备方法与应用，特别是涉及一种构树叶总黄酮提取物及其制备方法与应用。

背景技术

构树(Broussonetia papyrifera(L.)Ven.t)为桑科构树属植物，在我国大部分地区有分布，日本、越南、印度等国亦有分布，资源十分丰富。构树的成熟果实，称为“楮实子”，收载于历版《中国药典》，为常见中药，具有补肾清肝、明目利尿的功效。构树叶又称为楮叶，性凉味甘，无毒，能清热利湿，凉血止血，杀虫解毒，可用于治疗吐血、衄血、血崩、外伤出血、水肿、疝气、痢疾和癣疮等。

从20世纪80年代开始，人们即开始对构树的化学和药理进行研究。如高允生等(高允生，邱玉芳，高聆，等.构叶醇提取物与黄酮苷对离体心房的抑制作用[J].中国药理学通报，1988，4(2)：122-123)。另外Lee等从构树的整株植物中分离得到了多个黄酮类化合物(Lee D，Bhat K，Fong H et al.Aromatase inhibitors fromBroussonetia papyrifera[J]..J.Nat.Prod，2001，64(10)：1286-1293)对构树叶的乙醇提取物(BPAE)与总黄酮苷(BPF)对家兔和豚鼠离体心房的作用进行了研究，发现BPAE和BPF均有抑制家兔和豚鼠心房收缩的作用，且BPF的效价强度远大于BPAE，证明了BPF是构树抑制心房收缩的主要有效成分，同时也说明了构树叶具有类似钙拮抗剂的作用。但目前尚没有关于具有抑菌和抗炎作用的构树叶总黄酮的相关研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种构树叶总黄酮提取物及其制备方法与应用。

本发明提供的制备构树叶总黄酮提取物的方法，包括如下步骤：

1)将构树叶粉碎成粉末；

2)将所述步骤1)得到的构树叶粉末用乙醇的水溶液进行提取，过滤提取液后合并滤液，浓缩，得到浓缩液，再对所述浓缩液用脱脂溶剂进行脱脂，得到脱脂浓缩液；

3)将所述步骤2)得到的脱脂浓缩液进行分离纯化，干燥后，得到所述构树叶总黄酮提取物。

该方法的步骤1)中，所述构树叶包含叶柄；所述粉末的目数为2-60目；

所述步骤2)中，乙醇的水溶液的体积百分比浓度为0-100％，优选40-75％ ；

所述提取方法为回流提取法、索氏提取法、超声提取法或闪式提取法，优选回流提取法；回流提取时，提取温度为乙醇的回流温度，优选50-100℃，提取次数为1-3次，每次提取所用时间为0.5-3小时；所述乙醇的水溶液的用量为所述步骤1)得到的构树叶粗粉质量的6-20倍；所述脱脂溶剂为石油醚或氯仿。

所述步骤2)中，乙醇的水溶液的体积百分比浓度为0-100％，优选40-75％；所述提取方法为回流提取法、索氏提取法、超声提取法或闪式提取法，优选回流提取法；所述乙醇的水溶液的用量为所述步骤1)得到的构树叶粉末质量的6-20倍；

所述步骤3)中，所述分离纯化的方法为溶剂萃取法、聚酰胺柱层析法或树脂吸附法；

其中，溶剂萃取法包括如下步骤：将所述步骤2)得到的脱脂浓缩液用水饱和的正丁醇或乙酸乙酯进行萃取，萃取完毕后合并正丁醇或乙酸乙酯层萃取液；所述水饱和的正丁醇或乙酸乙酯的用量为所述步骤2)得到的脱脂浓缩液体积的1/2-2倍；萃取次数为1-6次；

所述聚酰胺柱层析法包括如下步骤：将所述步骤2)得到的脱脂浓缩液用聚酰胺色谱柱进行分离，淋洗液依次为水和20-80％的乙醇水溶液，收集20-80％乙醇水溶液的洗脱液；所述聚酰胺色谱柱中，聚酰胺的用量为所述构树叶原料质量的0.5-2倍；

在分离纯化之前，可按照如下方法对聚酰胺色谱柱进行预处理：将聚酰胺在95％乙醇中浸泡12小时后，回流2小时。过滤，用水清洗多次。装入柱中，继续用水洗涤至乙醇含量小于1％，即可使用。

所述树脂吸附法包括如下步骤：将所述步骤2)得到的脱脂浓缩液用吸附树脂柱进行分离，淋洗液依次为水、20-80％的乙醇水溶液和95％的乙醇水溶液，收集20-80％乙醇水溶液的洗脱液。

在分离纯化之前，可按照如下方法对树脂吸附柱进行预处理：将树脂先用95％乙醇(树脂∶乙醇的体积比为1∶2)浸泡12小时，回流2小时，然后装入树脂柱。加入高于树脂层10厘米的95％乙醇浸泡2小时，放出浸液，至洗涤液在试管中加水稀释(1毫升洗涤液加4毫升水)不混浊并且洗脱液紫外光谱扫描不得检出吸收峰为止。再用水洗涤至乙醇含量小于1％，即可使用。

所述吸附树脂柱中，树脂的型号为D101或AB-8，所述树脂的用量为所述构树叶原料质量的0.5-2倍。

所述干燥方法选自下述方法中的一种或两种：减压干燥法、冷冻法和喷雾干燥法。上述干燥方法均为常规操作。

另外，按照上述方法制备得到的构树叶总黄酮提取物，及该提取物在制备抑菌和抗炎药物中的应用，以及以该提取物为活性成分的抑菌和抗炎药物，也属于本发明的保护范围。

本发明提供的方法制备所得构树叶总黄酮提取物，按照比色法测定的总黄酮的重量含量为20％～70％，收率为1％～30％。经药理试验证明，该构树叶总黄酮提取物可单独或与其它药物组合作为原料药应用于具有抑菌和抗炎药物的制剂中。该方法制备所得构树叶总黄酮的纯度高，方法简便实用，适合工业化生产。

具体实施方式

本发明中，采用下述文献报道的比色法对总黄酮含量进行测定：迟玉新，窦德强.楮实子与构树叶中总黄酮的含量测定.中国现代中药2008，10(11)：16-17。该方法的简要操作过程如下：精密称取一定量的总黄酮提取物，制备样品溶液。加Al(NO₃)₃/NaNO₂试液显色，以式I所示芦丁为对照品，于505nm处进行比色测定。根据吸光度值的测定，即可计算得到构树叶中总黄酮的含量。

R＝OGlc(6-1)ORha

(式I)

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明中所述乙醇水溶液的浓度均为体积百分比浓度。

实施例1、制备构树叶总黄酮

用溶剂提取法和溶剂萃取法制备构树叶总黄酮：

将目数为30目的构树叶(含叶柄)粉末1kg，用60％的乙醇水溶液回流提取2次，每次用10倍体积量的上述60％乙醇水溶液提取2小时，合并提取液，回收乙醇溶液，浓缩至小体积(无醇味)，先用浓缩液一半体积量的石油醚脱脂，萃取至近无色。然后经水饱和的等量正丁醇或乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩回收正丁醇或乙酸乙酯得到浸膏；将浸膏经减压干燥得总黄酮提取物。

正丁醇萃取所得提取物为125g，测得总黄酮为53g，在浸膏中重量百分比为42.4％，占构树叶原料药材总重的百分比即收率为5.3％；乙酸乙酯萃取所得提取物为80g，测得总黄酮为45g，在浸膏中重量百分比为56.2％，占构树叶原料药材总重的百分比即收率为4.5％。

实施例2、制备构树叶总黄酮

用溶剂提取法和聚酰胺柱层析法制备构树叶总黄酮：

将目数为45目的构树叶粉末1kg，用60％的乙醇水溶液回流提取2次，每次用10倍体积量的上述60％乙醇水溶液提取2小时，合并提取液，回收乙醇溶液，浓缩至小体积，采用小体积浓缩液一半体积量的石油醚脱脂，萃取至近无色。脱脂后溶液经按照常规方法预先处理过的聚酰胺层析柱进行分离，依次用水、95％的乙醇水溶液进行洗脱，水洗脱除杂质，收集95％的乙醇水溶液的洗脱液，减压回收乙醇，干燥得总黄酮提取物80g，测得总黄酮为45g，占所述干燥后的总黄酮提取物的重量百分比为56.2％，占构树叶原料药材总重的百分比即收率为4.5％。

实施例3、制备构树叶总黄酮

溶剂提取法和树脂吸附法制备构树叶总黄酮：

将目数为60目的构树叶粉末1kg，乙醇的体积百分含量为60％的乙醇水溶液回流提取2次，每次用10倍体积量的上述60％乙醇水溶液提取2小时，合并提取液，回收乙醇溶液，浓缩至小体积，经小体积浓缩液一半量的石油醚萃取后得脱脂溶液。脱脂溶液经已预先处理过的D101大孔吸附树脂柱，依次用水、65％的乙醇水溶液、95％的乙醇水溶液进行洗脱，65％的乙醇洗脱液减压回收乙醇，干燥得总黄酮提取物105g，测得总黄酮为51g，占所述干燥后的总黄酮提取物的重量百分比为48.5％，占构树叶原料药材总重的百分比即收率为5.1％。

实施例4、构树叶总黄酮的抗炎活性研究

构树叶总黄酮抑制小鼠耳廓肿胀实验：

总黄酮(TFS)溶液的制备：按实施例3制备所得构树叶总黄酮提取物，分别精密称定提取物，用纯净水分别定容至100mL容量瓶中，加入1mL吐温-80，纯净水稀释至刻度，摇匀，得到浓度为4.4mg/mL、8.8mg/mL、17.6mg/mL的TFS低、中、高剂量总黄酮溶液，分别为TFS3高、中、低剂量组。

将实施例1制备所得正丁醇萃取提取物和实施例2制备所得提取物按照与上完全相同的方法制备总黄酮溶液，分别为TFS1和TFS2。

阳性对照品溶液的制备：将醋酸地塞米松片置研钵中研成细粉，精密称取一定量的细粉，用纯净水溶解并定容至100ml容量瓶中，加入吐温-80 1mL，用纯净水稀释至刻度，得浓度为0.082mg/mL的阳性对照品溶液。

方法与结果：健康小鼠98只随机分成7组，即TFS3高、中、低剂量组、TFS2和TFS1、阳性对照组和空白对照组，每组14只。TFS3低、中、高剂量组，分别以100，200，400mg/kg灌胃给药，TFS2和TFS1只有200mg/kg剂量，阳性对照组给地塞米松组1.8mg/kg，空白对照组给同体积的生理盐水，1次/d，连续7d，末次给药1h后在小鼠右耳用注射器涂0.2ml的二甲苯，左耳作为自身对照，涂耳1h后处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径为9mm的打孔器分别在两耳相应部位打孔，电子天平称重，左耳为对照，以两耳重量差为肿胀程度，计算肿胀度抑制率(％)。

肿胀度抑制率(％)＝(给药组肿胀度-对照组肿胀度)/对照组肿胀度。

结果显示：与空白对照组相比，TFS3各剂量组(100、200和400mg/kg)和TFS2以及TFS1对小鼠耳廓肿胀有明显抑制作用，并呈剂量依赖性，地塞米松阳性对照组(1.8mg/kg)对小鼠耳廓肿胀亦有显著的抑制作用。结果如表1所示。

表1、构树叶对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(X±S)

与空白对照组比较，^*P＜0.01，n＝12。

实施例5、构树叶总黄酮的抑菌活性研究

对本发明提供的构树叶总黄酮提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用进行研究。上述两菌种均购自中国医学细菌保藏管理中心，大肠杆菌的编号为CMCC(B)44102，金黄色葡萄球菌的编号为CMCC(B)26001。

供试品溶液的制备：按照实施例3制备所得65％乙醇水溶液的洗脱物，95％乙醇水溶液的洗脱物；按照实施例1的方法制备正丁醇萃取总黄酮提取物和实施例2的方法制备总黄酮提取物。

方法与结果：

灭菌与消毒：将培养皿、镊子、三角耙、移液管(0.5mL、10mL)、试管各取若干分别用报纸包扎紧密，放入电热恒温干燥箱内140℃，干热灭菌4小时。取出冷却放于无菌室备用。

含药纸片的制备：选用吸水力较强而质地均匀的滤纸，用打孔机打成直径6mm的圆片若干，置洁净干燥培养皿，用报纸包扎紧密，放人电热恒温干燥箱内140℃，干热灭菌2h，放入无菌操作台内。

液体培养基的配制：准确称取牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、NaCl0.5g放入烧杯，牛肉膏用玻璃棒放入表面皿称取，用热水融化倒入。在烧杯中加入80mL蒸馏水，用玻璃棒搅匀，然后，放在石棉网上加热使其溶解。药品完全溶解后，再加蒸馏水使培养基至100mL。先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，加减NaOH直至pH值为7.2。取8个灭菌后的试管用移液管分别加入5mL配好的培养基，用胶塞封好。

无菌溶液的制备：将上述配制好的液体、固体培养基及蒸馏水放入手提式不锈钢蒸汽消毒器中，维持121℃，0.1Mpa高压灭菌15min。待压力正常，稍凉后，取出放入无菌室备用。

试验菌的培养：在无菌室内取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，接菌针用酒精灯灭菌后，在酒精灯下用其分别在试验菌斜面上取得少量放入装有液体培养基的试管中。加上胶塞后放入医用培养箱中，37℃培养24h。取出放入无菌室备用。

固体培养基的配制：以不含任何抗生素的牛肉膏蛋白胨培养基作为基础培养基。配方：牛肉膏1.5g、蛋白胨5g、氯化钠2.5g、水500mL和琼脂10g，加酸碱调节pH值为7.6。

抑菌试验方法：采用滤纸片法。具体操作如下：将6mm纸片制成分别含不同体积百分比浓度的待试药物，按梯度稀释法进行2倍稀释(样品分别稀释成1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1；32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024这10个浓度)加入含菌平板中，观察有无抑菌圈，判定是否具有抑菌活性，具有抑菌作用的含药物浓度最低的纸片的药物浓度，即为药物对该细菌的MIC值药物浓度用梯度稀释法以无菌蒸馏水稀释，接种量为1.0×10⁶cfu，培养条件和时间为37℃，24h。

抑菌试验结果：通过观察，无抑菌圈表示无抑菌作用，有抑菌圈表示有抑菌作用，具有抑菌圈的含药物浓度最低的纸片的药物浓度，即为药物对该细菌的MIC。结果表明：大孔吸附树脂柱65％乙醇水溶液洗脱部分抑菌活性最强。其中，大孔吸附树脂柱65％乙醇水溶液洗脱部分即为构树叶总黄酮部分。试验结果如表2所示。可知，总黄酮提取物的抑菌活性最强。

表2、构树叶提取物对两种菌抑制作用的MIC值(mg/mL)

Claims (10)

1、一种制备构树叶总黄酮提取物的方法，包括如下步骤：

1)将构树叶原料粉碎成粉末；

2)将所述步骤1)得到的构树叶粉末用乙醇的水溶液进行提取，过滤提取液后合并滤液，浓缩，得到浓缩液，再对所述浓缩液用脱脂溶剂进行脱脂，得到脱脂浓缩液；

3)将所述步骤2)得到的脱脂浓缩液进行分离纯化，干燥后，得到所述构树叶总黄酮提取物。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述构树叶包含叶柄；所述粉末的目数为2-60目；

所述步骤2)中，乙醇的水溶液的体积百分比浓度为0-100％，优选40-75％；所述提取方法为回流提取法、索氏提取法、超声提取法或闪式提取法，优选回流提取法；所述乙醇的水溶液的用量为所述步骤1)得到的构树叶粉末质量的6-20倍；所述脱脂溶剂为石油醚或氯仿；

所述步骤3)中，所述分离纯化的方法为溶剂萃取法、聚酰胺柱层析法或树脂吸附法；所述干燥方法选自下述方法中的一种或两种：减压干燥法、冷冻法和喷雾干燥法。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，回流提取时，提取温度为乙醇的回流温度，优选50-100℃，提取次数为1-3次，每次提取所用时间为0.5-3小时；

所述步骤3)中，溶剂萃取法包括如下步骤：将所述步骤2)得到的脱脂浓缩液用水饱和的正丁醇或乙酸乙酯进行萃取，萃取完毕后合并正丁醇或乙酸乙酯层萃取液；

所述聚酰胺柱层析法包括如下步骤：将所述步骤2)得到的脱脂浓缩液用聚酰胺色谱柱进行分离，淋洗液依次为水和20-80％的乙醇水溶液，收集20-80％乙醇水溶液的洗脱液；

所述树脂吸附法包括如下步骤：将所述步骤2)得到的脱脂浓缩液用吸附树脂柱进行分离，淋洗液依次为水、20-80％的乙醇水溶液和95％的乙醇水溶液，收集20-80％乙醇水溶液的洗脱液。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，溶剂萃取法中，所述水饱和的正丁醇或乙酸乙酯的用量为所述步骤2)得到的脱脂浓缩液体积的1/2-2倍；萃取次数为1-6次；

所述聚酰胺柱层析法中，所述聚酰胺色谱柱中，聚酰胺的用量为所述构树叶原料质量的0.5-2倍；

所述树脂吸附法中，所述吸附树脂柱中，树脂型号为D101或AB-8，所述树脂的用量为构树叶原料质量的0.5-2倍。

5、权利要求1-4任一所述方法制备得到的构树叶总黄酮提取物。

6、根据权利要求5所述的提取物，其特征在于：所述构树叶总黄酮提取物中，总黄酮的质量百分含量为20％～70％。

7、权利要求5或6所述构树叶总黄酮提取物在制备抑菌药物中的应用。

8、以权利要求5或6所述构树叶总黄酮提取物为活性成分的抑菌药物。

9、权利要求5或6构树叶总黄酮提取物在制备抗炎药物中的应用。

10、以权利要求5或6所述构树叶总黄酮提取物为活性成分的抗炎药物。