CN104997848A - 一种构树叶总黄酮的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构树叶总黄酮的应用,属于药物用途领域,该药物对于脑缺血或心肌缺血有明显的抑制作用,可以长期服用,无副作用。
Description
技术领域
本发明属于药物用途领域,具体涉及植物提取物的应用。
背景技术
构树为桑科植物,构树在中国的温带、热带均有分布,不论平原或丘陵都能生长,该树种具有速生、适应性强、分布广、易繁殖、热量。构树的叶具有清热,凉血,利湿,杀虫,用于鼻衄,肠炎,痢疾。
从20世纪80年代开始,人们即开始对构树的化学和药理进行研究,见高允生,邱玉芳,高聆,等.构叶醇提取物与黄酮苷对离体心房的抑制作用[J].中 国药理学通报,1988,4 (2): 122-123。从构树的整株植物中分离得到了多个黄酮类化合物,对构树叶的乙醇提取物(BPAE)与总黄酮苷(BPF)对家兔和豚鼠离体心房的作用进行了研究,发现BPAE和BPF均有抑制家兔和豚鼠心房收縮的作用,且BPF的效价强度远大于 BPAE,证明了 BPF是构树抑制心房收縮的主要有效成分,同时也说明了构树叶具有类似钙拮抗剂的作用,构树叶总黄酮还有抑制人肝癌细胞的作用,但是还没有关于抑制脑缺血和心肌缺血方面的报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种构树叶总黄酮的应用。
为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是:
所述构树叶总黄酮在制备治疗心肌缺血或脑缺血药物中的应用。
所述构树叶总黄酮在制备抑制脑缺血后脑梗塞的药物中的应用。
构树叶总黄酮的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂湖丸剂。
构树叶总黄酮用量为30mg-300mg/天。
构树叶总黄酮的制备方法由以下步骤制成:
A、称取构树叶,加 12倍量60%乙醇浸泡30分钟,回流提取3次,每次2小时,过滤,滤液减压浓缩,加5倍量水,混匀,冷藏,过滤,滤液备用;
B、大孔吸附树脂纯化:步骤A所得滤液用盐酸调ph=3-4,用大孔吸附树脂进行纯化,上样流速为2倍柱体积每小时,饱和1小时,水洗脱6倍柱体积,40%乙醇洗脱6倍柱体积,40%乙醇洗脱液回收,减压浓缩,得到浓缩液,备用;
C、聚酰胺纯化:大孔吸附树脂纯化后的浓缩液用聚酰胺进行纯化,上样流速为1倍柱体积每小时,饱和1小时,20%乙醇洗脱10倍柱体积,60%乙醇洗脱15倍柱体积,60%乙醇洗脱液回收,减压干燥成干膏粉碎过60目筛,即得。
构树叶总黄酮的含量测定方法由以下步骤制成:
A、供试品溶液的制备:取构树叶总黄酮粉末,加60%乙醇,密封,回流提取60分钟,提取液过滤,用60%乙醇定容,精密吸取1ml,加蒸馏水5ml,然后加入5%亚硝酸钠溶液1ml,放置6分钟;再加入10%硝酸铝1ml,放置6分钟;加入4.3%氢氧化钠10ml,用蒸馏水定容,摇匀,放置15分钟,取蒸馏水,按上述步骤制成阴性对照液;
B、标准曲线制备:取构树叶总黄酮对照品,精密称定,加60%乙醇溶解并稀释,摇匀,得到对照品一级储备液,分别精密吸取一系列不同量的对照品一级储备液,再分别加不同量的水制成浓度均不同的对照品二级溶液,然后分别加入5%亚硝酸钠溶液1ml,放置6分钟;再加入10%硝酸铝1ml,放置6分钟;加入4.3%氢氧化钠1ml,用蒸馏水定容,摇匀,放置15分钟,得到对照品溶液;取6ml蒸馏水,按上述步骤制成阴性对照液,在513nm处测定,以浓度为横坐标,吸收度为纵坐标,做标准曲线;
C、结果:取供试品溶液测定吸收度,带入回归方程,计算总黄酮的含量。
为使上述剂型能够实现,需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料,例如:填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括:淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等;崩解剂包括:淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等;润滑剂包括:硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等;助悬剂包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等;粘合剂包括,淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等;甜味剂包括:糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等;矫味剂包括:甜味剂及各种香精;防腐剂包括:尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等;基质包括:PEG6000,PEG4000,虫蜡等。
本发明的剂型不限于上述几种,还可以按照常规方法制成其他剂型。
为了验证该药物的作用,做了如下实验:
构树叶总黄酮的提取
称取构树叶1kg,加 12倍量60%乙醇浸泡30分钟,回流提取3次,每次2小时,过滤,滤液减压浓缩至生药浓度1g/ml,加5倍量水,混匀,4-10度冷藏24小时,过滤,滤液备用。
大孔吸附树脂纯化:滤液用1mol/l的盐酸调ph=3-4,用HZ816型号的大孔吸附树脂进行富集纯化,1g树脂吸附6ml药液,上样药液浓度为0.16g/ml(生药浓度),上样流速为2倍柱体积每小时,饱和1小时,水洗脱6倍柱体积,40%乙醇洗脱6倍柱体积,40%乙醇洗脱液回收,减压浓缩至浓度0.2g/ml(生药浓度),备用。
聚酰胺纯化:大孔吸附树脂纯化后的药液用聚酰胺进行富集纯化,1g聚酰胺(40-60目)吸附15ml药液,,上样药液浓度为0.2g/ml(生药浓度),上样流速为1倍柱体积每小时,饱和1小时,20%乙醇洗脱10倍柱体积,60%乙醇洗脱15倍柱体积,60%乙醇洗脱液回收,减压干燥成干膏粉碎过60目筛,干膏的总黄酮含量在50%以上,回收率达90%以上。
总黄酮测定:
总黄酮含量测定方法
供试品溶液的制备
取构树叶总黄酮粉末0.1g,精密称定三份,,加60%乙醇150ml,密封,回流提取60分钟,提取液过滤,用60%乙醇定容至200ml。精密吸取1ml,加蒸馏水5ml,然后加入5%亚硝酸钠溶液1ml,放置6分钟;再加入10%硝酸铝1ml,放置6分钟;加入4.3%氢氧化钠10ml,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,放置15分钟。用阴性对照液做对照测定吸收度,带入回归方程,计算总黄酮的含量,结果见表2。
测定波长的选择
取对照品、供试品溶液适量,于400~700nm扫描,得知对照品溶液与样品溶液最大吸收波长一致,均为513nm,故确定513nm为测定波长。
标准曲线制备
取构树叶总黄酮对照品10.13mg,精密称定,置25ml容量瓶中,加60%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得到储备液。分别精密吸取储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml,完全转移至25ml容量瓶中,再分别加水5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0ml;然后分别加入5%亚硝酸钠溶液1ml,放置6分钟;再加入10%硝酸铝1ml,放置6分钟;加入4.3%氢氧化钠1ml,用蒸馏水定容至刻度,摇匀,放置15分钟。用阴性对照液(取6ml蒸馏水,按上述步骤依次加入亚硝酸钠等溶液,定容至25ml,摇匀)作对照,在513nm处测定。以浓度(X)为横坐标,吸收度(Y)为纵坐标,做标准曲线。结果见表1。
表-1 线性关系考察表
实验结果可见:总黄酮浓度在0.016~0.097mg/ml之间,线性关系良好。
表-2 含量测定结果
实验例1构树叶总黄酮对垂体后叶素致大鼠心肌缺血保护作用
实验目的
本实验以发生心肌缺血的动物数为指标,观察构树叶总黄酮粉对垂体后叶素致大鼠心肌缺血的作用,评价受试物抗心肌缺血的作用。
1 实验材料
1.1 供试品
名称:构树叶总黄酮,从构树叶中提取出总黄酮,缩写:gsy,总黄酮含量51%
1.2 阳性药、工具药及主要试剂
盐酸地尔硫卓片,缩写:DELZ,市售,临用前用氯化钠注射液或葡萄糖注射液溶解、稀释成2%浓度。石药集团中诺药业(石家庄)有限公司,规格:30mg,36片/盒,批准文号:国药准字H20054297,产品批号:066120302。
垂体后叶素,南京新百药业有限公司,规格:1ml:6单位,10支/盒,批准文号:国药准字H32026638,产品批号:120402。
1.3 实验系统
1.3.1动物种系:SD大鼠
1.3.2 动物级别:SPF。
1.3.3 动物性别和数量:160只,雄性。
1.3.4 动物年龄:4~6周龄。
1.3.5 动物体重:151~195g。
1.3.6 动物来源:中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所。
1.3.7 动物合格证号及发证单位、接收日期:合格证号0270472,发证单位是中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,接收日期是2012年09月14日。
1.3.8 饲养条件:动物饲养在河北省中西医结合医药研究院新药评价中心。光照12小时/天,温度18~20℃,相对湿度41~64%。大鼠笼养,5只/笼。
1.3.9 检疫过程:新领到的动物检疫期3天。在检疫期间观察动物饮水、摄食无异常情况,健康状况良好,无疾病和死亡征兆。
1.3.10 饲料:实验动物全价颗粒饲料,由北京科澳协力饲料有限公司提供,合格证号:0272010。
1.3.11 饮水:普通用水灌装饮水瓶,供动物自由饮用。每日冲洗饮水瓶并换水一次。
1.3.12 垫料:由河北省实验动物中心提供。
1.3.13 动物标识:苦味酸标记。
2 实验方法
动物按体重随机分为5组,构树叶总黄酮设(gsy)低、中、高剂量组,另设溶媒对照组和阳性对照组(DEZL),每组20只。gsy低、中、高剂量组拟给予剂量均为0.5、2.5、5g/kg;阳性对照组给予DELZ,1.3 g/kg。根据以上剂量设置情况,实验分组结果见附表3。
2.1 观测的指标、时间和内容
末次给药后1小时,乌拉坦腹腔注射麻醉,仰位固定,记录Ⅱ导心电图,稳定后,舌静脉注射垂体后叶素0.6∪/kg,5s内注完,分别记录注射后不同时间的心电图。
观察:正常大鼠心电图及注射垂体后叶素后即刻、15s、30s、(第一期)1、3、5、10、15min(第二期)的心电图,以心电图一期T波升高、ST段抬高大于0.1mv或二期T波低平、双相、倒置或PR及QT间期延长为阳性,以发生心肌缺血的动物数为指标进行统计学处理。
统计方法
实验数据为计数资料,运用SPSS 11.5软件进行卡方检验。
3 结果
根据T波的变化幅度统计出各组发生心肌缺血动物数,进行X 2检验,与注射垂体后叶素前比较,各组均有发生缺血性改变的动物;与溶媒对照组比较, gsy 0.5、2.5、5g/kg均可明显抑制心肌缺血的发生(P<0.05,P<0.01),其中,gsy随着剂量的增加发生缺血的动物数降低,有一定的量效关系,结果见附表4。
注:与溶媒对照组比较:*P<0.05,**P<0.01
4 结论
构树叶总黄酮有对抗垂体后叶素所致的心肌缺血有明显的抑制作用。
实验例2构树叶总黄酮对实验性脑缺血的保护作用
1 实验材料
1.1 实验动物
Wistar大鼠,清洁级,雄,75只,体重100-130g,购于中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,许可证号:0270472。光照12h/天,温度20-23℃,相对湿度40-60%,适应性饲养三天。
1.2 试剂与药品
红四氮唑(TTC)(国药集团化学试剂有限公司,批号:F20040908);
阳性对照药:尼莫地平(哈药集团制药总厂,批号:20080503)。
1.3 受试药物
构树叶总黄酮(自制,总黄酮含量51%),临用前用蒸馏水溶解。
2.实验方法
2.1分组及剂量设计
将实验动物按体重层次随机分为5组,15只/组,分别为模型组,阳性对照药尼莫地平组构树叶总黄酮高剂量组中剂量组和低剂量组;给药剂量见表5。
表-5 实验分组和给药剂量
2.2给药方法及周期
灌胃给药,连续7天,每天上午9-10点进行。
2.3实验过程及检测方法
末次给药后1h 以水合氯醛麻醉,暴露大脑中动脉,将吸有10ul-50%三氯化铁溶液的小片滤纸敷在大脑中动脉上,待30min 后中动脉变黑, 取下滤纸, 逐层缝合伤口,回笼饲养。于术后24h ,麻醉后将大鼠断头取脑, 去除嗅球、小脑和低位脑干,其余部分冠状切成厚度相同的5片,经TTC染色后,正常组织呈红色,梗塞组织为白色,将白色组织仔细分离并称重,以梗塞组织重量占总脑重量及手术侧半脑重量的百分比作为脑梗塞范围。
3.统计方法
实验数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,运用SPSS11.5软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。
4.实验结果
各组梗塞区占半脑、全脑的重量百分比见下表6。
表-6 构树叶总黄酮对大鼠局灶性脑缺血的梗塞面积的影响
注:与模型组相比,*:p<0.05
5.小结:
在本实验体系中,构树叶总黄酮对大鼠局灶性脑缺血后的脑梗塞面积均有抑制作用,其中总黄酮高剂量组、中剂量组与阳性对照药尼莫地平组相似,均与模型组有显著性差异(p<0.05),且与剂量呈正相关,结果表明构树叶总黄酮对脑缺血有一定的抑制作用。
实验例3 构树叶总黄酮高中低剂量组对心肌缺血和脑缺血时TXB2、6-Keto-PGF1α 含量的影响。
健康Wistar大鼠50只,体重200±20g,雌雄各半,分别按照实验例1制备25只心肌缺血大鼠,按照实验例2制备脑缺血大鼠,分为五组,每组十只,分别是生理盐水组、心可舒组、构树叶总黄酮高、中、低剂量组,各组大鼠5只脑缺血大鼠和5只心肌缺血大鼠,各组无差异。
注:与生理盐水组比较,*P<0.05,**P<0.01;与心可舒组比较,#P<0.05,##P<0.01
构树叶总黄酮与生理盐水相比,高中低剂量组及心可舒组TXB2的含量明显降低,构树叶总黄酮的高中低剂量组明显低于心可舒组。构树叶总黄酮各剂量组6-Keto-PGF1α的含量明显高于生理盐水及心可舒组。
具体实施方式
:实施例1:构树叶总黄酮的制备
A、称取构树叶2kg,加 12倍量60%乙醇浸泡30分钟,回流提取3次,每次2小时,过滤,滤液减压浓缩至生药浓度为1g/ml,加5倍量水,混匀,4-10℃冷藏24小时,过滤,滤液备用;
B、大孔吸附树脂纯化:步骤A所得滤液用盐酸调ph=3-4,用大孔吸附树脂进行纯化,上样药液的浓度为0.16 g/ml(生药浓度),上样流速为2倍柱体积每小时,饱和1小时,水洗脱6倍柱体积,40%乙醇洗脱6倍柱体积,40%乙醇洗脱液回收,减压浓缩至浓度为0.2 g/ml的浓缩液,备用;
C、聚酰胺纯化:大孔吸附树脂纯化后的浓缩液用聚酰胺进行纯化,上样药液的浓度为0.2g/ml(生药浓度),上样流速为1倍柱体积每小时,饱和1小时,20%乙醇洗脱10倍柱体积,60%乙醇洗脱15倍柱体积,60%乙醇洗脱液回收,减压干燥成干膏粉碎过60目筛,即得。
实施例2:构树叶总黄酮含量测定方法
A、供试品溶液的制备:取构树叶总黄酮粉0.2g,加60%乙醇150ml,密封,回流提取60分钟,提取液过滤,用60%乙醇定容至200ml,精密吸取1ml,加蒸馏水5ml,然后加入5%亚硝酸钠溶液1ml,放置6分钟;再加入10%硝酸铝1ml,放置6分钟;加入4.3%氢氧化钠10ml,用蒸馏水定容,摇匀,放置15分钟,取蒸馏水,按上述步骤制成阴性对照液;
B、标准曲线制备:取构树叶总黄酮对照品10mg,精密称定,置于25ml容量瓶中,加60%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得到对照品一级储备液,分别精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml的对照品一级储备液,再分别加5.0、4.0、3.0、2.0、1.0ml的水制成浓度均不同的对照品二级溶液,然后分别加入5%亚硝酸钠溶液1ml,放置6分钟;再加入10%硝酸铝1ml,放置6分钟;加入4.3%氢氧化钠1ml,用蒸馏水定容,摇匀,放置15分钟,得到对照品溶液;取6ml蒸馏水,按上述步骤制成阴性对照液,在513nm处测定,以浓度为横坐标,吸收度为纵坐标,做标准曲线;
C、结果:取供试品溶液测定吸收度,带入回归方程,计算总黄酮的含量为51%。
实施例3:片剂制备
称取构树叶总黄酮100g,加入微晶纤维素100g,乳糖200g,充分混匀,加入交联羧甲基纤维素钠,混合均匀,用24目筛制粒,70℃烘干,整粒,加入1%硬脂酸镁,混匀,压片,制成1000片片剂。
实施例4:胶囊剂制备
称取构树叶总黄酮100g,加入微晶纤维素50g,加入交联聚维酮10g,乳糖130g,充分混匀,加入5%聚维酮K30水溶液30ml,再加水15ml,充分搅拌,混合均匀,用24目筛制粒,70℃烘干,整粒,加入1%硬脂酸镁,混匀,装入胶囊得1000粒胶囊。
实施例5:颗粒剂制备
称取100g构树叶总黄酮原料,加入蔗糖500g,糊精2500g,充分混匀,加水180ml,充分搅拌,混合均匀,用24目筛制粒,70℃烘干,整粒,分装成500袋。
实施例6:滴丸剂制备
称取1000g聚乙醇6000,70℃水浴熔化,加入1000g构树叶总黄酮原料,边加边搅拌,加完充分搅拌,滴制成丸,制成1000粒滴丸。
Claims (6)
1.一种构树叶总黄酮的应用,其特征在于:所述构树叶总黄酮在制备治疗心肌缺血或脑缺血药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述构树叶总黄酮在制备抑制脑缺血后脑梗塞的药物中的应用。
3.根据权利要求1-2任一项所述的应用,其特征在于:构树叶总黄酮的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:构树叶总黄酮的用量为30mg-300mg/天。
5.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于构树叶总黄酮的制备方法由以下步骤制成:
A、称取构树叶,加 12倍量60%乙醇浸泡30分钟,回流提取3次,每次2小时,过滤,滤液减压浓缩,加5倍量水,混匀,冷藏,过滤,滤液备用;
B、大孔吸附树脂纯化:步骤A所得滤液用盐酸调ph=3-4,用大孔吸附树脂进行纯化,上样流速为2倍柱体积每小时,饱和1小时,水洗脱6倍柱体积,40%乙醇洗脱6倍柱体积,40%乙醇洗脱液回收,减压浓缩,得到浓缩液,备用;
C、聚酰胺纯化:大孔吸附树脂纯化后的浓缩液用聚酰胺进行纯化,上样流速为1倍柱体积每小时,饱和1小时,20%乙醇洗脱10倍柱体积,60%乙醇洗脱15倍柱体积,60%乙醇洗脱液回收,减压干燥成干膏粉碎过60目筛,即得。
6.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于构树叶总黄酮的含量测定方法由以下步骤制成:
A、供试品溶液的制备:取构树叶总黄酮粉末,加60%乙醇,密封,回流提取60分钟,提取液过滤,用60%乙醇定容,精密吸取1ml,加蒸馏水5ml,然后加入5%亚硝酸钠溶液1ml,放置6分钟;再加入10%硝酸铝1ml,放置6分钟;加入4.3%氢氧化钠10ml,用蒸馏水定容,摇匀,放置15分钟,取蒸馏水,按上述步骤制成阴性对照液;
B、标准曲线制备:取构树叶总黄酮对照品,精密称定,加60%乙醇溶解并稀释,摇匀,得到对照品一级储备液,分别精密吸取一系列不同量的对照品一级储备液,再分别加不同量的水制成浓度均不同的对照品二级溶液,然后分别加入5%亚硝酸钠溶液1ml,放置6分钟;再加入10%硝酸铝1ml,放置6分钟;加入4.3%氢氧化钠1ml,用蒸馏水定容,摇匀,放置15分钟,得到对照品溶液;取6ml蒸馏水,按上述步骤制成阴性对照液,在513nm处测定,以浓度为横坐标,吸收度为纵坐标,做标准曲线;
C、结果:取供试品溶液测定吸收度,带入回归方程,计算总黄酮的含量。
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RONG MIN CHEN,ET AL: "Natural PTP1B Inhibitors from Broussonetia papyrifera", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS》 * |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN108524605A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-09-14 | 青岛农业大学 | 一种构树叶黄酮的提取方法及提取物的应用 |
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