CN106074665A - 一种毛梾叶中黄酮提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛梾叶中提取黄酮方法，以毛梾树叶为原材料，将前处理好的毛梾叶喷洒3％～5％的水置于真空冷却箱中冷却，冷却到0℃～‑2℃，冷却时间10～15s，用‑45℃～‑50℃冷媒进行冻结，冻结时间10～15min，然后干燥，先期加热板温度25℃～26℃，干燥程度达到85%～90%后，提升加热板温度到55℃左右，干燥时间15～20min。将干燥粉碎的毛梾叶粉进行闪式提取，提取剂为70%乙醇、1%盐酸甲醇、1%的β‑环糊精水溶液，提取时间为60～120 s，提取电压为110～200V，料液比1g:10～50ml，然后离心分离，旋转蒸发浓缩得提取物。提取物再用乙醇洗涤除盐、浓缩得到黄酮。

Description

一种毛梾叶中黄酮提取方法

技术领域

本发明属于从木本植物叶子中提取黄酮的领域，涉及一种从毛梾叶中快速提取黄酮的方法，属于生物工程、先进制造等领域。

背景技术

毛梾作为一种山茱萸科的落叶乔木，在我国有着很广的分布，一般使用种子进行繁殖。毛梾作为一种新型木本油料，耐贫瘠，耐干旱，适合大面积种植，毛梾籽可以用来提取油脂，树干可以制造家具，而毛梾叶子中黄酮等活性成分含量较高，可以用来开发利用。毛梾的树冠大，叶产量高，一株10年生的植株可产鲜叶50～100 kg，折算干叶8～16 kg。国外基本限于毛梾活性提取物的研究。采用各种天然抗氧化剂试验方法评估了毛梾提取物的潜在抗氧化能力。用水和乙醇从毛梾中提取的抗氧化物质与天然和合成的抗氧剂进行对比。此外，发现其提取物中含有很高的多酚和黄酮类物质，各种基团（自由基、羟基、烷基）清除活性都比Vc要高。

黄酮类化合物作为一种天然的抗氧化剂，一方面在体外可作为羟自由基和超氧阴离子的清除剂，通过给过氧化氢原子提供氢原子形成类黄酮自由基而终止自由基的连锁反应，抑制脂质氧化反应；另一方面，在体内黄酮类化合物不仅能够捕获自由基还可以提高内源性抗氧化物质的水平，保护生物大分子免受损伤。黄酮类化合物具有降压、降血脂、抗骨质舒松、抗心律失常等多种药理和保健作用 , 特别是具有抗自由基及抗癌、防癌的作用 ,使其在医药、食品领域的应用具有广阔的前景。

黄酮类化合物的提取方法很多，大致有传统提取法、超声辅助提取法、酶解提取法、闪式提取法等。传统提取法提取杂质多, 收率较低，提取液过滤、浓缩等操作困难且又费时。超声提取法提取时间缩短，能耗低，提取效率高。萃取温度低，不会破坏具有热不稳定、易水解或氧化特性的有效成分。但是，受超声波衰减因素的制约，超声有效作用区域为一环形，会形成超声空白区；将振子密封于不锈钢盒中，投入罐的中央，一方面不锈钢盒无法太大，否则装配、密封和维修都难以解决，另一方面太小功率达不到，超声波的作用就微乎其微，难以达到应有的效果。酶解法适用于被细胞壁包围的黄酮类物质 , 利用酶反应的高度专一性，破坏细胞壁，使其中的黄酮类化合物释放出来。但酶的活性受多因素制约且容易失活，制备混合酶液操作繁琐。闪式提取技术是利用高速机械剪切力和搅拌力，迅速破坏植物细胞组织，使组织细胞内部的有效成分与溶剂能够充分接触，并快速溶解，其具有提高提取效率，简化操作步骤、耗时短等优点。从毛梾叶中提取黄酮至今没有任何文献有报道，具有创造性。

关于毛梾叶提取黄酮的专利目前还没有，关于闪式提取黄酮的专利有2015年公开的CN104351777A，公开了一种蓝莓枝黄酮及其提取方法。将粉碎后的蓝莓枝与乙醇的水溶液混合进行闪式提取,离心收集上清液得乙醇提取物。乙醇的水溶液的质量百分浓度为40％～80％；所述粉碎后的蓝莓枝与乙醇的水溶液的用量比为1g:20～60mL。闪式提取步骤中,闪式提取器的电压为30v～110v，提取时间为30 s～150 s，具体为120 s；2016年公布的CN105535061A，发明涉及一种提取艾叶中黄酮的方法，专利中用闪式提取法提取黄酮，然后用色谱柱进行纯化，得到高纯度的黄酮。

发明内容

本发明是以一种毛梾树的叶子为原料，采取冷冻干燥处理，粉碎机粉碎，得到毛梾叶粉，用闪式提取器提取黄酮，提取溶剂选择70%乙醇、1%盐酸甲醇和1%的β～环糊精水溶液，闪式提取后离心过滤，滤液再减压浓缩，得到毛梾叶提取物；提取物加入无水乙醇、蒸馏水、混合盐对提取物进行醇沉除杂，分层后取上相溶液减压浓缩，干物质用乙醇洗涤溶解去除残余的混合盐，得到提取率和纯度高的黄酮。

本发明的技术方案如下：

1.真空冷冻干燥毛梾叶

挑选新鲜、无虫害的毛梾叶，清洗去除表面灰尘和杂质。将前处理好的毛梾叶喷洒3％～5％的水置于真空冷却箱中进行冷却，冷却到0℃～-2℃，冷却时间10～15 s，然后用-45℃～-50℃冷媒进行冻结，冻结时间10～15 min,冻结完成后移入干燥室，干燥时先期加热板温度25℃～26℃，待干燥程度达到85%～90%后，提升加热板温度到55℃左右，继续干燥去除结合水，干燥时间15～20 min。干燥后毛梾叶用粉碎机粉碎为毛梾叶粉。

2.毛梾叶中黄酮的提取

干燥后的毛梾叶粉末10 g置于闪式提取器中，以70%乙醇、1%盐酸甲醇、1%β～环糊精的水溶液作为提取剂，以料液比1g：10～50mL加入溶剂，闪式提取电压为110～200V，提取时间60～120 s。提取后将滤液在离心机中5500～6000r/min离心10～15 min。用萃取剂对提取物进行2～4次萃取，合并萃取液于旋转蒸发仪中浓缩后得到毛梾提取物。旋转蒸发的温度为40～70℃，压力为0.125 Mp。

3.毛梾叶黄酮的醇沉除盐

烧杯中加入1g毛梾叶粗提物、21mL无水乙醇、30mL蒸馏水、再加混合盐（硫酸铵和碳酸氢二钠，二者的比例1:1）达到饱和，磁力搅拌25～30min后静置分层，将得到的上相在旋转蒸发仪中减压浓缩除去乙醇和水。得到的干物质再用无水乙醇进行洗涤溶解，除去剩余的少量混合盐。最后对溶解的萃取物减压浓缩。

本发明的有益效果：

1.本发明的原料是一种未被大量开发利用的木本植物—毛梾叶，其提取物中含有大量的黄酮类物质，具有抗氧化、抗衰老、抗癌等生理活性。

2.毛梾树作为一种新型木本植物，大量种植可绿化环境，其种子可提取油料，通过本方法叶子可提取黄酮，使其得到综合利用，提高其经济效益。

3.本方法干燥采取的真空冷冻干燥，真空冷冻干燥具有干燥时间短、干燥温度低，最大程度的保护黄酮等活性成分不受损伤；先期的冷却采用喷水真空冷却，冷却时间短；干燥过程中先低温后高温后显著缩短了干燥时间，后期高温干燥去除结合水，水分外移形成毛细通道，提取时利于黄酮溶出，这样就做到了节能减排，提高了黄酮的得率。而热风干燥加热温度高，黄酮易与其它成分发生反应，黄酮的损失大；常温干燥时间很长，光照使黄酮类物质易分解，黄酮得率低。

4.闪式提取法首次用在毛梾叶上提取黄酮，不仅能够快速提取黄酮，而且最大程度的提高了黄酮的得率。

5.对得到的黄酮粗提物进行醇沉除盐，提高了黄酮的纯度，并且减少了后续的精制纯化步骤，纯化更容易进行。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法作进一步说明，但不限于此。

实施例中使用的毛梾叶是由山东省济南市万路达园林公司提供，旋转蒸发仪、真空冷冻干燥、粉碎机、离心机由山东省齐鲁工业大学食品与生物工程学院实验室提供。

实例一：

1.真空冷冻干燥毛梾叶

挑选新鲜、无虫害的毛梾叶，清洗去除表面灰尘和杂质。将前处理好的毛梾叶喷洒3％的水置于真空冷却箱中进行冷却，冷却到0℃，冷却时间10 s，然后用-45℃冷媒进行冻结，冻结时间10min，冻结完成后移入干燥室，干燥时先期加热板温度25℃，待干燥程度达到85%后，提升加热板温度到55℃左右，继续干燥去除结合水，干燥时间15min。干燥后毛梾叶用粉碎机粉碎为毛梾叶粉。

2.毛梾叶中黄酮的提取

干燥后的毛梾叶粉末10 g置于闪式提取器中，以70%乙醇、1%盐酸甲醇、1%的β～环糊精的水溶液作为提取剂，以料液比1g：10mL加入溶剂，闪式提取电压为110V，提取时间60 s。提取后将滤液在离心机中5500r/min离心10 min。用萃取剂对提取物进行2次萃取，合并萃取液于旋转蒸发仪中浓缩后得到毛梾提取物。旋转蒸发的温度为40℃，压力为0.125 Mp。

3.毛梾叶黄酮的醇沉除盐

烧杯中加入1g毛梾叶粗提物、21mL无水乙醇、30mL蒸馏水、再加混合盐（硫酸铵和碳酸氢二钠，二者的比例1:1）达到饱和，磁力搅拌25min后静置分层，将得到的上相在旋转蒸发仪中减压浓缩除去乙醇和水。得到的干物质再用无水乙醇进行洗涤，除去剩余的少量混合盐。最后对萃取物减压浓缩，黄酮类物质提取率达到89.7%。

实例二：

1.真空冷冻干燥毛梾叶

挑选新鲜、无虫害的毛梾叶，清洗去除表面灰尘和杂质。将前处理好的毛梾叶喷洒5％的水置于真空冷却箱中进行冷却，冷却到-2℃，冷却时间15 s，然后用-50℃冷媒进行冻结，冻结时间15 min,冻结完成后移入干燥室，干燥时先期加热板温度26℃，待干燥程度达到90%后，提升加热板温度到55℃左右，继续干燥去除结合水，干燥时间20 min。干燥后毛梾叶用粉碎机粉碎为毛梾叶粉。

2.毛梾叶中黄酮的提取

干燥后的毛梾叶粉末10 g置于闪式提取器中，以70%乙醇、1%盐酸甲醇、1%的β～环糊精的水溶液作为提取剂，以料液比1g：50mL加入溶剂,闪式提取电压为200 V，提取时间120 s。提取后将滤液在离心机中6000 r/min离心15 min。用萃取剂对提取物进行4次萃取，合并萃取液于旋转蒸发仪中浓缩后得到毛梾叶提取物。旋转蒸发的温度为70℃，压力为0.125 Mp。

3.毛梾叶黄酮的醇沉除盐

烧杯中加入1 g毛梾叶粗提物、21 mL无水乙醇、30 mL蒸馏水、再加混合盐（硫酸铵和碳酸氢二钠，二者的比例1:1）达到饱和，磁力搅拌30 min后静置分层，将得到的上相在旋转蒸发仪中减压浓缩除去乙醇和水。得到的干物质再用无水乙醇进行洗涤溶解，除去剩余的少量混合盐。最后对萃取物减压浓缩，黄酮的提取率达到95.1%。

实例三:

1.真空冷冻干燥毛梾叶

挑选新鲜、无虫害的毛梾叶，清洗去除表面灰尘和杂质。将前处理好的毛梾叶喷洒4％的水置于真空冷却箱中进行冷却，冷却到-2℃，冷却时间13s，然后用-45℃冷媒进行冻结，冻结时间12min，冻结完成后移入干燥室，干燥时先期加热板温度26℃，待干燥程度达到86%后，提升加热板温度到55℃左右，继续干燥去除结合水，干燥时间18min。干燥后毛梾叶用粉碎机粉碎为毛梾叶粉。

2.毛梾叶中黄酮的提取

干燥后的毛梾叶粉末10 g置于闪式提取器中，以70%乙醇、1%盐酸甲醇、1%的β～环糊精的水溶液作为提取剂，以料液比1g：30mL加入溶剂,闪式提取电压为160 V，提取时间80 s。提取后将滤液在离心机中6000r/min离心13 min。用萃取剂对提取物进行3次萃取，合并萃取液于旋转蒸发仪中浓缩后得到毛梾提取物。旋转蒸发的温度为60℃，压力为0.125 Mp。

3.毛梾叶黄酮的醇沉除盐

烧杯中加入1g毛梾叶粗提物、21mL无水乙醇、30mL蒸馏水、再加混合盐（硫酸铵和碳酸氢二钠，二者的比例1:1）达到饱和，磁力搅拌28 min后静置分层，将得到的上相在旋转蒸发仪中减压浓缩除去乙醇和水。得到的干物质再用无水乙醇进行洗涤溶解，除去剩余的少量混合盐。最后对萃取物减压浓缩，黄酮提取率达到95.8%。

Claims (4)

1.一种毛梾叶中黄酮提取方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）挑选新鲜、无虫害的毛梾叶，清洗去除表面灰尘和杂质，将前处理好的毛梾叶喷洒水后置于真空冷却箱中进行冷却一段时间，然后用冷媒进行冻结，冻结完成后移入干燥室，干燥时先期加热板低温，后期高温去除结合水，干燥后毛梾叶用粉碎机粉碎为毛梾叶粉；

（2）干燥后的毛梾叶粉末10g置于闪式提取器中，以70%乙醇、1%盐酸甲醇、1%β～环糊精的水溶液作为提取剂进行闪式提取，提取后将滤液在离心机中离心，用萃取剂对提取物进行多级萃取，合并萃取液于旋转蒸发仪中浓缩后得到毛梾提取物；

（3）烧杯中加入1g毛梾粗提物、21mL无水乙醇、30mL蒸馏水、混合盐，磁力搅拌后静置分层，将得到的上相在旋转蒸发仪中减压浓缩除去乙醇和水，得到的浓缩液再用无水乙醇进行洗涤溶解，除去混合盐对黄酮纯度的影响，最后对萃取物减压浓缩得到高纯度的黄酮。

2.根据权利要求书1中所述的一种毛梾叶中黄酮提取方法，其特征在于：在步骤（1）中，将前处理好的毛梾叶喷洒3％～5％的水置于真空冷却箱中进行冷却，冷却到0℃～-2℃，冷却时间10～15 s，然后用-45℃～-50℃冷媒进行冻结，冻结时间10～15 min，冻结完成后移入干燥室，干燥时先期加热板温度25℃～26℃，待干燥程度达到85%～90%后，提升加热板温度到55℃左右，继续干燥去除结合水，干燥时间15～20 min，干燥后毛梾叶用粉碎机粉碎为毛梾叶粉。

3.根据权利要求书1中所述的一种毛梾叶中黄酮提取方法，其特征在于：在步骤（2）中，闪式提取电压为110～200V，提取时间60～120 s，料液比1g:10～50ml，离心速率为5500～6000r/min，离心10～15min，旋转蒸发的温度为40～70℃，萃取次数为2～4次。

4.根据权利要求书1中所述的一种毛梾叶中黄酮提取方法，其特征在于：在步骤（3）中，磁力搅拌25～30min，混合盐为饱和状态。