WO2022071643A1 - 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물 - Google Patents

에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물 Download PDF

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WO2022071643A1
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skin
wound healing
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inflammatory
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조병성
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Definitions

  • the present invention relates to a novel composition
  • a novel composition comprising edelweiss-derived exosomes as an active ingredient, and more particularly, skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement, skin regeneration, anti-inflammatory, wound healing including edelweiss-derived exosomes as an active ingredient Or it relates to a composition for promoting wound healing.
  • the present invention relates to a cosmetic composition for improving skin elasticity, improving skin wrinkles, or regenerating skin comprising the composition, and a pharmaceutical composition for promoting anti-inflammatory, wound healing or wound healing.
  • MMP matrix metalloproteinase
  • Prostaglandin E2 Prostaglandin E2
  • COX-2 an enzyme that produces inflammatory cytokines
  • COX-2 an enzyme that produces inflammatory cytokines
  • MMP increases, which leads to collagen degradation, a decrease in skin elasticity, and the formation of skin wrinkles.
  • sunlight and ultraviolet rays are directly irradiated to the skin, a lot of free radicals are generated, and the antioxidant defense system of the skin is damaged by these free radicals, thereby increasing wrinkles and accelerating skin aging such as relaxation of the skin.
  • Substances known to be effective in improving skin wrinkles include adenosine and retinoic acid, but adenosine has insignificant clinical efficacy, and retinoic acid cannot be used for women of childbearing potential and has side effects such as erythema.
  • Inflammation is a defense reaction of the living body that appears in response to a pathological condition caused by physical or chemical trauma, infection by bacteria, fungi or viruses, and various allergens.
  • the inflammatory response appears as part of the innate immune response.
  • Various substances and physiological and chemical phenomena are involved in the inflammatory response, and recent studies have revealed that various inflammatory cytokines play an important role in the inflammatory response.
  • Major cytokines involved in the inflammatory response include IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IL-6, IL-8, IL-12, and IFN- ⁇ , and their expression and secretion increase and activation are inflammatory mediators. It is associated with a series of complex physiological responses such as secretion, immune cell infiltration, cell migration and tissue destruction, and symptoms such as erythema, edema, fever and pain.
  • Nonsteroidal anti-inflammatory drugs steroidal anti-inflammatory drugs, neuropeptide antagonists, COX inhibitors, antihistamines, and immunosuppressive agents such as cyclosporin A are used for the relief or treatment of inflammatory reactions or inflammatory diseases resulting from skin atrophy, vasodilation, pigmentation
  • cyclosporin A is used for the relief or treatment of inflammatory reactions or inflammatory diseases resulting from skin atrophy, vasodilation, pigmentation
  • problems causing side effects such as loss of room, hypersensitivity reaction, tolerance, and neutropenia.
  • these drugs have limitations in helping to control symptoms to an appropriate level rather than fundamental treatment.
  • extracellular vesicles Cells release various membrane types of ERs to the extracellular environment, and these ERs are commonly referred to as extracellular vesicles (EVs).
  • the extracellular vesicles are also called cell membrane-derived ERs, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, and the like, and in some cases, they are used separately from exosomes.
  • Exosomes are endoplasmic reticulum with a size of several tens to hundreds of nanometers having a double phospholipid membrane identical to that of a cell membrane, and contain proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo inside.
  • Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, and these signaling factors are known to be cell type-specific and differentially regulated according to the environment of secretory cells.
  • Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells.
  • Exosomes contain specific genetic material and bioactive factors according to the nature and state of the cells from which they are derived. In the case of proliferating stem cell-derived exosomes, it regulates cell behavior such as cell migration, proliferation and differentiation, and reflects the characteristics of stem cells related to tissue regeneration (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
  • exosomes called avatars of cells contain bioactive factors such as growth factors similar to cells, and serve as a carrier for transporting bioactive factors between cells, that is, communication between cells.
  • Exosomes are known not only to be released from animal cells such as stem cells, immune cells, fibroblasts and cancer cells, but also from cells of various organisms such as plants, bacteria, fungi, and algae.
  • the exosomes can be isolated from the plant stem cell culture in addition to the culture medium of cancer cells, immune cells, mesenchymal stem cells, and the like.
  • Edelweiss is one of the most famous alpine plants in the European Alps. It grows well in dry places and is distributed in Europe, Siberia, Himalayas, China, Korea, Japan and Sakhalin.
  • Edelweiss is rich in vitamin E, phenolic acid, and flavonoids such as luteolin and luteolin-7-glucoside, so it has skin soothing, antioxidant and UV protection effects.
  • the technology so far has dried the edelweiss leaves, stems, and roots, soaked them in water to infuse the active ingredients, and then filtered the filtrate or extracts obtained by hot water extraction or solvent extraction of edelweiss leaves, stems and roots as food or cosmetic raw materials. level used.
  • the callus culture medium contains growth regulators or callus inducing substances, so it is difficult to say that it is a natural cosmetic raw material, and there is a fear that the growth regulators contained in the culture medium may cause side effects such as skin troubles.
  • exosomes derived from edelweiss are effective in skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement, skin regeneration, anti-inflammatory, wound healing or wound healing promotion, etc., and skin elasticity containing edelweiss-derived exosomes as an active ingredient
  • a cosmetic composition for improvement, skin wrinkle improvement, or skin regeneration, and a pharmaceutical composition for anti-inflammatory, wound healing or wound healing promotion were developed.
  • Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement or skin regeneration comprising the composition, and a pharmaceutical composition for promoting anti-inflammatory, wound healing or wound healing.
  • the present invention provides a composition for improving skin elasticity, improving skin wrinkles, skin regeneration, anti-inflammatory, wound healing, or promoting wound healing, comprising exosomes derived from edelweiss as an active ingredient.
  • the term "edelweiss” refers to the genus Leontopodium ( Leontopodium sp. ) plants.
  • the Leontopodium genus ( Leontopodium sp. ) Plants are Leontopodium alpinum ( Leontopodium alpinum ), Leontopodium andersonii ( Leontopodium andersonii ), Leontopodium artemisiifolium ( Leontopodium artemisiifolium ), Topodium aurantiacum ( Leontopodium aurantiacum ), Leontopodium brachyactis ), Leontopodium calocephalum ), Leontopodium campestre ( Leontopodium campestre ), Leontopodium chui ( Leontopodium campestre ) chuii ), Leontopodium conglobatum , Leontopodium coreanum, Leontopodium dedekensii , Leontopodium delavayanum , Leontopodium delavayanum Lore (
  • exosomes refers to nano-sized vesicles having a membrane structure secreted or released from plant cells into the extracellular space, and is also referred to as exosome-like vesicles or exosome-like particles. is defined
  • skin elasticity refers to a property that the skin deformed by an external force easily returns to its original shape when the external force is removed.
  • Skin wrinkle refers to fine lines caused by deterioration of the skin, and may be caused by a genetic cause, a decrease in collagen and elastin present in the dermis of the skin, an external environment, and the like. Therefore, as used herein, the term “skin wrinkle improvement” refers to suppressing or inhibiting the generation of wrinkles on the skin, or alleviating the already generated wrinkles.
  • anti-inflammatory means preventing, suppressing, alleviating, ameliorating or treating inflammation
  • inflammatory diseases are examples that are not limited to the present invention, and include dermatitis, atopic dermatitis, eczema, bacterial infection, virus Inflammation due to infection or fungal infection, burns, inflammation due to burns, wounds, inflammation due to wounds, and the like.
  • wound or wound refers to a state in which a living body is damaged, and a tissue constituting the internal or external surface of the living body, for example, skin, muscle, nerve tissue, bone, soft tissue, internal organ, or blood vessel. It encompasses pathological conditions in which tissue is divided or destroyed.
  • the wound or wound is abrasion, laceration, cut, cut, avulsion, pressure sore, pit wound, destruction of tissue by radiation, penetrated wound, It includes gun shot wounds, burns, frostbite, surgical wounds, sutures after plastic surgery, chemical wounds, etc., and may include damage to any part of an object.
  • Iontophoresis refers to a method of allowing an ionized active ingredient to penetrate the skin with an electrical repulsive force by flowing a microcurrent to the skin to which an active material is applied, giving a potential difference, and changing the electrical environment of the skin means
  • Iontophoresis used in one embodiment of the present invention is a method in which a current from an external power source flows into an electrode patch on the skin and a microcurrent is introduced into the skin, and a battery is installed in the electrode patch itself to protect the skin.
  • a method in which microcurrent is introduced a method in which microcurrent is introduced into the skin through a patch equipped with a reversed electrodialysis means that generates an electric current through a difference in ion concentration between a high-concentration electrolyte solution and a low-concentration electrolyte solution, etc.
  • the present invention is not limited thereto, and it goes without saying that various types of iontophoresis may be used.
  • edelweiss-derived exosome refers to, for example, an edelweiss plant cell culture medium, an edelweiss callus culture medium or an edelweiss plant stem cell culture medium, or an edelweiss plant cell isolated from or equivalent to an edelweiss biological solution thereof. Or derived from plant stem cells, for example, it is meant to include all of the secreted and / or released exosomes.
  • composition comprising an edelweiss-derived exosome of one embodiment of the present invention as an active ingredient may exhibit at least one of skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement, skin regeneration, anti-inflammatory, wound healing or wound healing promoting efficacy.
  • the edelweiss-derived exosome is a culture solution of plant cells obtained from leaves or stem tissues of edelweiss, or a wound to a cotyledon germinated from an edelweiss seed to be separated and purified from the culture solution of the induced callus.
  • composition comprising the edelweiss-derived exosome of the present invention as an active ingredient may be a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a cosmetic composition for skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement, or skin regeneration comprising exosomes derived from edelweiss as an active ingredient.
  • the cosmetic composition may include shampoo, soap, rinse, surfactant-containing cleansing, cream, lotion, ointment, tonic, treatment, conditioner, suspension, emulsion, paste, gel, oil, wax, spray, aerosol, It may be a mist or powder, and preferably a lotion or cream.
  • the present invention provides an anti-inflammatory, wound healing or a pharmaceutical composition for promoting wound healing comprising an edelweiss-derived exosome as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention may be administered or treated by injection, microneedling, iontophoresis, application, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of injections, injections, sprays, liquids, or patches.
  • composition of one embodiment of the present invention when used as a pharmaceutical composition, it may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, trehalose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium carbonate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, but are not limited thereto.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention means an amount required for administration in order to expect anti-inflammatory, wound healing or wound healing promoting effect.
  • the blending ratio of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention can be appropriately selected according to the type, amount, form, etc. of the additional ingredients as described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be included in about 0.1 to 99% by weight, preferably about 10 to 90% by weight.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention may be adjusted depending on the severity of the disease, the type of formulation, the formulation method, the patient's age, sex, weight, health status, diet, excretion rate, administration time and administration method. can For example, when administering the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention to an adult, it may be administered at a dose of 0.001 mg/kg to 100 mg/kg per day, divided into 1 to several times.
  • composition of one embodiment of the present invention is prepared as a cosmetic composition
  • components commonly used in cosmetic compositions for example, moisturizing agents, antioxidants, oily components, ultraviolet absorbers, Emulsifiers, surfactants, thickeners, alcohols, powder components, colorants, aqueous components, water, various skin nutrients, etc. can be appropriately blended as needed.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is conventionally used as long as it does not impair its action (eg, skin condition improvement, skin elasticity improvement, skin wrinkle improvement or skin regeneration, etc.) in addition to exosomes derived from edelweiss.
  • a skin improving agent and/or a moisturizing agent may be mixed and used together.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is, for example, a patch, mask pack, mask sheet, cream, tonic, ointment, suspension, emulsion, paste, lotion, gel, oil, pack, spray, aerosol, mist, foundation, It can be applied to various forms such as powder and oil paper.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention may be used for the purpose of improving skin condition, improving skin elasticity, improving skin wrinkles, or regenerating skin, and the cosmetic formulation may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention includes components commonly used in cosmetic compositions, for example, it may include conventional adjuvants and carriers such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances.
  • other components can be appropriately selected and formulated by those skilled in the art without difficulty depending on the type or purpose of use of the cosmetic composition.
  • Another embodiment of the present invention provides a cosmetic method for controlling the skin condition of a mammal except for treatment by using the cosmetic composition.
  • skin condition control means to improve the skin condition and/or control the skin condition prophylactically
  • skin condition improvement refers to visually and/or tactile perception of the appearance and feeling of the skin. positive change that can be made.
  • skin condition improvement may be skin wrinkles improvement, skin elasticity improvement, or skin regeneration.
  • the cosmetic method of one embodiment of the present invention comprises: (a) applying the cosmetic composition directly to the skin of a mammal, (b) applying a patch, mask pack or mask sheet to which the cosmetic composition is applied or deposited on the skin of a mammal It includes contacting or attaching to, or sequentially performing (a) and (b).
  • a lotion or cream may be used as a cosmetic composition.
  • step (c) after step (b), the patch, mask pack or mask sheet is removed from the skin of the mammal, and the cosmetic composition is applied to the skin of the mammal It may further include the step of In step (c), a lotion or cream may be used as a cosmetic composition.
  • the mammal may be a human, a dog, a cat, a rodent, a horse, a cow, a monkey, or a pig.
  • the present invention provides a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition to a mammal, or the pharmaceutical composition is applied to the skin, an inflamed site or a wound site. It provides a method for accelerating wound healing.
  • the mammal may be a human, dog, cat, rodent, horse, cow, monkey, or pig.
  • composition of the present invention is less likely to contain impurities such as growth regulators compared to the conventional edelweiss callus culture medium, its filtrate or extract, and improves skin elasticity, improves skin wrinkles, regenerates skin, anti-inflammatory, wound healing and/or wound healing
  • impurities such as growth regulators compared to the conventional edelweiss callus culture medium, its filtrate or extract, and improves skin elasticity, improves skin wrinkles, regenerates skin, anti-inflammatory, wound healing and/or wound healing
  • the accelerating effect is excellent.
  • 1 is a graph showing the particle size distribution and the number of particles obtained by performing NTA (nanoparticle tracking analysis) on the edelweiss-derived exosome of the present invention.
  • 3 is a graph showing the relative amount of collagen increased after treatment of edelweiss-derived exosomes in human skin fibroblasts.
  • 4A to 4C are graphs showing that edelweiss-derived exosomes are treated in Scratch-Wound, and then the movement of human skin fibroblasts is greatly increased.
  • 5 is a graph showing that IL-6 induced by LPS is significantly reduced when RAW 264.7 cells are treated with edelweiss-derived exosomes.
  • FIG. 6 is a graph showing that IL-6 induced by LPS remarkably decreases in a concentration-dependent manner of exosomes when RAW 264.7 cells are treated with edelweiss-derived exosomes by concentration.
  • an edelweiss leaf-derived callus is induced, and the induced edelweiss callus is cell cultured. Then, select a callus with good growth state and culture it in large quantities to prepare an edelweiss callus culture solution.
  • edelweiss seeds are immersed in ethanol, washed with sterile water and disinfected with an antiseptic solution, and edelweiss seeds are germinated aseptically for callus induction.
  • Edelweiss callus is induced by cutting the germinated cotyledon with a knife, and the induced callus is cultured in a culture dish. Then, select a callus with good growth state and culture it in a large amount in a flask.
  • the edelweiss callus culture solution prepared in the same manner as in Example 1 was obtained from Biospectrum Co., Ltd. ( Leontopodium Alpinum callus culture solution supplier located in Gyeonggi-do, Korea).
  • the edelweiss callus culture medium was filtered with a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cell debris, wastes, and large particles. From the filtered culture solution, edelweiss-derived exosomes were isolated using tangential flow filtration (TFF).
  • NTA nanoparticle tracking analysis
  • Human skin fibroblasts purchased from Cell Bio
  • DMEM medium containing fetal bovine serum were dispensed in a multiwell plate and cultured for 24 hours.
  • the edelweiss-derived exosomes or edelweiss callus culture solution prepared in Example 2 was diluted in a serum-free medium, treated with human skin fibroblasts, and cultured with human skin fibroblasts.
  • the experimental group was classified as follows:
  • NC Negative Control
  • CM Edelweiss callus culture medium
  • the culture solution was recovered and centrifuged for an additional 48 hours, and the centrifuged culture solution was prepared.
  • the amount of collagen synthesized from human skin fibroblasts and accumulated in the culture medium was measured using an EIA kit for procollagen type I C-peptide (PIP) (purchased from Takara).
  • the measured amount of collagen was normalized by dividing the measured total number of cells using an MTT assay kit (purchased from Sigma) to determine the relative amount of collagen.
  • the edelweiss-derived exosomes of the present invention increased collagen synthesis in human skin fibroblasts compared to the negative control, whereas the edelweiss callus culture medium did not increase collagen synthesis (FIG. 3).
  • the edelweiss-derived exosome of the present invention has a functional activity useful as a cosmetic for skin elasticity improvement, wrinkle improvement and/or skin regeneration, that is, an activity to increase collagen synthesis. Therefore, the edelweiss-derived exosome of the present invention can be usefully used as an active ingredient in a cosmetic composition for skin elasticity improvement, wrinkle improvement and/or skin regeneration.
  • Negative control group (Negative control; NC): the experimental group treated only with serum-free medium;
  • PC Positive control
  • CM edelweiss callus culture medium
  • the edelweiss-derived exosome of the present invention is superior to the edelweiss callus culture medium for promoting the movement of human skin fibroblasts, that is, the wound recovery ability or the skin regeneration effect.
  • the exosome derived from edelweiss of the present invention can be usefully used as an active ingredient in a cosmetic composition for skin elasticity improvement, wrinkle improvement and/or skin regeneration, and a pharmaceutical composition for wound treatment or promoting wound treatment.
  • negative control group the experimental group treated with LPS only RAW 264.7 cells
  • PC Positive control group
  • the culture supernatant was taken and the inflammatory response was confirmed by measuring the inflammatory cytokines present in the culture supernatant.
  • the amount of inflammatory cytokines in the culture supernatant was measured using an IL-6 ELISA kit. According to the manufacturer's manual of the ELISA kit (purchased from R&D system), the production amount of IL-6 (inflammatory cytokine) in the group treated only with LPS, and the LPS-treated group with each of dexamethasone and edelweiss-derived exosomes The production amount of IL-6 (inflammatory cytokine) was confirmed.
  • the edelweiss-derived exosomes of the present invention have excellent anti-inflammatory effects. Therefore, the edelweiss-derived exosome of the present invention can be effectively utilized as an active ingredient in a pharmaceutical composition for anti-inflammatory, wound treatment or promoting wound treatment.
  • negative control group the experimental group treated with LPS only RAW 264.7 cells
  • PC Positive control group
  • CM Edelweiss callus culture medium
  • IL-6 ELISA kit purchased from R&D system
  • the production amount of IL-6 (inflammatory cytokine) in the group treated only with LPS, dexamethasone, edelweiss callus culture medium, and LPS treatment with each of edelweiss-derived exosomes The production amount of IL-6 (inflammatory cytokine) in the treated group was confirmed.
  • the production of IL-6 showed a tendency to increase as the treatment concentration increased.
  • the group treated with edelweiss-derived exosomes with LPS to RAW 264.7 cells significantly inhibited the production of IL-6 compared to the group treated with the edelweiss callus culture medium with LPS to RAW 264.7 cells, especially the treatment concentration It was confirmed that the edelweiss-derived exosomes had excellent anti-inflammatory effects, showing a tendency to suppress the production of IL-6 as ⁇ increases.
  • the edelweiss-derived exosomes of the present invention have excellent anti-inflammatory effects. Therefore, the edelweiss-derived exosome of the present invention can be effectively utilized as an active ingredient in a pharmaceutical composition for anti-inflammatory, wound treatment or promoting wound treatment.

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Abstract

본 발명은 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 항염, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 에델바이스 캘러스 배양액, 이의 여과물 또는 추출물에 비해 생장조절인자와 같은 불순물 함유 가능성이 낮으며, 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 항염, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진 효과가 우수하다.

Description

에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물
본 발명은 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 항염, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선 또는 피부재생용 화장료 조성물과, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물에 관한 것이다.
피부 노화가 일어나면, 피부탄력이 감소하고 피부주름이 증가하게 되는데, 피부탄력 감소 및 피부주름 형성은 콜라겐의 합성이 감소하고 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP(matrix metalloproteinase)의 발현이 촉진되어 나타나는 것으로 알려져 있다.
또한, 노화의 진행이나 자외선 등에 의해 피부 세포에서는 염증성 사이토카인을 생성하는 효소인 COX-2의 증가로 인한 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2)의 합성이 증가하고, 염증유발인자들의 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 염증 반응들로 인해서 MMP의 생합성이 증가하여 콜라겐 분해가 일어나고 피부탄력 감소와 피부주름 형성이 나타나게 된다. 특히, 일광 및 자외선이 피부에 직접 조사될 경우 자유라디칼을 많이 발생시키며, 이러한 자유라디칼에 의해 피부의 항산화 방어체계는 손상을 받게 되어 주름을 증가시키고, 피부를 이완시키는 등 피부노화를 가속화시킨다. 피부주름개선에 효과적이라고 알려진 물질로는 아데노신, 레티노인산(retinoic acid) 등이 있으나, 아데노신은 임상에서의 효능이 미미하고, 레티노인산은 가임여성에게 사용할 수 없고 홍반 등의 부작용이 있다.
염증은 물리적 또는 화학적 외상, 박테리아, 곰팡이 또는 바이러스에 의한 감염, 각종 알레르기 유발 물질 등에 의하여 야기되는 병리적 상태에 대응하여 나타나는 생체의 방어 반응이다. 염증반응은 선천성 면역 반응의 일환으로 나타난다. 염증반응에는 다양한 물질 및 생리·화학적 현상이 관여하는데, 최근의 연구에 따르면 다양한 염증성 사이토카인이 염증반응에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 염증반응에 관여하는 주요 사이토카인으로는 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-β 등이 있으며, 이들의 발현량 및 분비량 증가와 활성화는 염증매개물질 분비, 면역세포 침윤, 세포 이동 및 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열 및 통증 등의 증상과 관련이 있다.
일반적으로, 염증반응은 감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하면 큰 문제가 되지 않고 질환 부위가 정상으로 회복되지만, 감염원이 제거되지 않거나 내부 물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 급·만성 염증성 질환을 유발하게 된다. 염증반응이나 이로 인한 염증성 질환의 완화 내지는 치료를 위해 비스테로이드계 항염제, 스테로이드계 항염제, 신경 펩타이드 길항제, COX 억제제, 항히스타민제, 및 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제를 사용하지만, 피부 위축, 혈관 확장, 색소 탈실, 과민 반응, 내성, 및 호중구감소증(neutropenia) 등의 부작용을 일으키는 문제점이 있다. 또한, 이들 약제는 근본적인 치료보다는 증상을 적절한 수준으로 조절하는데 도움을 주는 한계도 있다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막을 갖는 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 엑소좀은 암세포, 면역세포, 중간엽 줄기세포 등의 배양액 외에도 식물줄기세포 배양액으로부터도 분리될 수 있다.
그러나 식물줄기세포로부터 유래된 엑소좀의 분리·정제 및 특성분석에 대한 연구는 아직 초기 단계이며, 이들 중 대부분은 단순히 식물착즙의 여과물 내에 혼합물로 혼재되어 있는 세포외 소포체를 엑소좀이라고 하면서 마케팅에 활용하고 있는 수준이다. 따라서 식물줄기세포로부터 유래된 엑소좀에 대한 보다 면밀한 특성분석 및 기능에 대한 연구가 필요하다.
에델바이스(Edelweiss)는 유럽 알프스에서 가장 유명한 고산식물 중 하나로서, 건조한 곳에서 잘 자라고 유럽, 시베리아, 히말라야, 중국, 한국, 일본 및 사할린 등에 분포한다. 에델바이스는 비타민 E, 페놀산, 루테올린과 루테올린-7-글루코사이드와 같은 플라보노이드가 많아 피부 진정, 항산화 및 자외선 보호 효과 등이 있다. 그러나 현재까지의 기술은 에델바이스 잎, 줄기, 뿌리를 건조한 후 물에 담가 유효성분을 우려낸 후 여과하여 얻은 여과물이나 에델바이스 잎, 줄기, 뿌리를 열수 추출이나 용매 추출하여 얻은 추출물을 식품이나 화장품 원료로 사용하는 수준이다.
그 밖에 에델바이스 잎 등에 상처를 내어 유도한 캘러스를 배양하여 얻은 캘러스 배양액을 이용하는 기술이 소개되고 있으나, 이 역시 캘러스 배양액 자체 또는 이를 건조한 후 열수 추출이나 용매 추출 등으로 추출하여 얻은 추출물을 화장품 성분으로 이용하고 있는 정도이다. 또한, 캘러스 배양액에는 생장조절물질이나 캘러스 유도물질이 포함되어 있어 천연물질의 화장품 원료라고 하기 어렵고 배양액 내에 포함된 생장조절물질 등이 피부 트러블 등의 부작용을 일으킬 우려가 있다.
본 발명자는 에델바이스로부터 유래된 엑소좀이 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 항염, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진 등에 효능이 있는 것을 확인하고, 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선 또는 피부재생용 화장료 조성물과, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물을 개발하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 항염, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선 또는 피부재생용 화장료 조성물과, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 항염, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "에델바이스"는 레온토포디움 속 (Leontopodium sp.) 식물을 의미한다. 예를 들어, 상기 레온토포디움 속 (Leontopodium sp.) 식물은 레온토포디움 알피눔(Leontopodium alpinum), 레온토포디움 안데르소니(Leontopodium andersonii), 레온토포디움 아르테미시포리움(Leontopodium artemisiifolium), 레온토포디움 아우란티아쿰(Leontopodium aurantiacum), 레온토포디움 브라키아크티스(Leontopodium brachyactis), 레온토포디움 카로세파룸(Leontopodium calocephalum), 레온토포디움 캄페스테레 (Leontopodium campestre), 레온토포디움 추이(Leontopodium chuii), 레온토포디움 콘그로바튬(Leontopodium conglobatum), 레온토포디움 코레아눔(Leontopodium coreanum), 레온토포디움 데데켄시(Leontopodium dedekensii), 레온토포디움 데라바야눔(Leontopodium delavayanum), 레온토포디움 디스코로르(Leontopodium discolor), 레온토포디움 파긴겐스(Leontopodium fangingense), 레온토포디움 파우리에이(Leontopodium fauriei), 레온토포디움 포레스티아눔(Leontopodium forrestianum), 레온토포디움 프란체티(Leontopodium franchetii), 레온토포디움 기라르디(Leontopodium giraldii), 레온토포디움 하스티오이데스(Leontopodium haastioides), 레온토포디움 할라이산넨스(Leontopodium hallaisanense), 레온토포디움 하프로필로이데스 (Leontopodium haplophylloides), 레온토포디움 하야키넨스(Leontopodium hayachinense), 레온토포디움 히말라야눔(Leontopodium himalayanum), 레온토포디움 자코티아눔(Leontopodium jacotianum), 또는 레온토포디움 자포니쿰(Leontopodium japonicum)일 수 있고, 바람직하게는 레온토포디움 알피눔(Leontopodium alpinum)일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 식물세포로부터 세포외 공간으로 분비 또는 방출된 막 구조를 갖는 나노 사이즈의 소낭을 의미하며, 엑소좀-유사 베지클 또는 엑소좀-유사 파티클로도 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 탄력"은 외력에 의해 변형된 피부가 해당 외력이 제거되었을 때 쉽게 원형으로 복귀되는 특성을 의미한다. "피부 주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐과 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "항염"이란 염증을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 것을 의미하고, 염증성 질환으로는 본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 곰팡이 감염으로 인한 염증, 화상, 화상으로 인한 염증, 상처, 상처로 인한 염증 등을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "상처 또는 창상(wound)"은 생체가 손상된 상태를 의미하며, 생체 내부 또는 외부 표면을 이루는 조직, 예를 들면 피부, 근육, 신경조직, 뼈, 연조직, 내부기관 또는 혈관조직이 분단 또는 파괴된 병리학적 상태를 포괄한다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서 상처 또는 창상은 찰과상(abrasion), 열상(laceration), 자상, 절상, 결출상(avulsion), 욕창, 와창, 방사선 조사에 의한 조직의 파괴, 관통상(penetrated wound), 총상(gun shot wound), 화상, 동상, 수술상, 성형수술 후 봉합 부위, 화학적 창상 등을 포함하며 개체의 어떠한 부분에 대한 손상이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 명세서에서 사용된 "에델바이스 유래의 엑소좀"이란 용어는 예를 들어, 에델바이스 식물세포 배양액, 에델바이스 캘러스 배양액 또는 에델바이스 식물줄기세포 배양액, 또는 이들과 동등한 에델바이스의 생물학적 용액으로부터 분리되거나 에델바이스 식물세포 또는 식물줄기세포로부터 유래된, 예를 들어 분비 및/또는 방출된 엑소좀을 모두 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 항염, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진 효능 중 적어도 하나의 효능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 에델바이스 유래의 엑소좀은 에델바이스의 잎 또는 줄기 조직으로부터 얻은 식물세포의 배양액, 또는 에델바이스 종자로부터 발아된 떡잎에 상처를 내어 유도시킨 캘러스의 배양액으로부터 분리 정제될 수 있다.
본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 화장료 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.
본 발명은 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부탄력개선, 피부주름개선 또는 피부재생용 화장료 조성물을 제공한다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 샴푸, 비누, 린스, 계면활성제-함유 클렌징, 크림, 로션, 연고, 토닉, 트리트먼트, 컨디셔너, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 오일, 왁스, 스프레이, 에어졸, 미스트, 또는 파우더일 수 있고, 바람직하게는 로션이나 크림일 수 있다.
또한, 본 발명은 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 투여 또는 처리될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물이 약학 조성물로 사용되는 경우 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 에델바이스 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(예를 들어, 피부상태개선, 피부탄력개선, 피부주름개선 또는 피부재생 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부 개선제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 피부상태개선, 피부탄력개선, 피부주름개선 또는 피부재생 등의 목적으로 사용될 수 있으며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물의 피부 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부 상태 조절이란 피부 상태를 개선시키고/시키거나 피부 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부 상태 개선이란 피부의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부 상태 개선이란 피부주름 개선, 피부탄력 개선 또는 피부재생일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (a) 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함한다. 상기 (a) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하거나, 상기 약학 조성물을 피부, 염증 부위 또는 상처 부위에 도포하는 단계를 포함하는, 염증치료, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진(accelerating wound healing)을 위한 방법을 제공한다. 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
본 발명의 조성물은 종래의 에델바이스 캘러스 배양액, 이의 여과물 또는 추출물에 비해 생장조절인자와 같은 불순물 함유 가능성이 낮으며, 피부탄력개선, 피부주름개선, 피부재생, 항염, 상처 치유 및/또는 상처 치유 촉진 효과가 우수하다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀에 대해 NTA(nanoparticle tracking analysis)를 수행하여 얻은 입자 크기 분포와 입자수를 나타내는 그래프이다.
도 2는 형광 염색된 에델바이스 유래의 엑소좀이 인체 피부 섬유아세포로 전달되는 것을 확인한 세포 형광 현미경 이미지이다(녹색: 세포 내로 전달된 엑소좀, 청색: 세포 핵).
도 3은 인체 피부 섬유아세포에 에델바이스 유래의 엑소좀을 처리한 후 증가하는 상대적인 콜라겐 양을 도시한 그래프이다.
도 4A 내지 도 4C는 에델바이스 유래의 엑소좀을 스크래치-운드(Scratch-Wound)에 처리한 후 인체 피부 섬유아세포의 이동이 크게 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 5는 에델바이스 유래의 엑소좀을 RAW 264.7 세포에 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 IL-6가 현저하게 감소하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 6은 에델바이스 유래의 엑소좀을 농도별로 RAW 264.7 세포에 처리한 경우 엑소좀 농도의존적으로 LPS에 의해 유도되는 IL-6가 현저하게 감소하는 것을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 에델바이스 캘러스 배양액의 제조
당업계에 알려진 식물 캘러스 유도 및 배양 방법에 따라, 에델바이스 잎 유래 캘러스를 유도하고, 유도된 에델바이스 캘러스를 세포 배양한다. 그리고, 성장상태가 좋은 캘러스를 선택하고 대량으로 배양하여 에델바이스 캘러스 배양액을 준비한다.
예를 들어, 상업적으로 입수가능한 에델바이스 종자를 에탄올에 침지한 후 멸균수로 세척하고 소독액으로 소독하고, 캘러스 유도를 위해 에델바이스 종자를 무균상태에서 발아시킨다. 발아된 떡잎에 칼로 상처를 내어 에델바이스 캘러스를 유도하고, 유도된 캘러스를 배양접시에서 배양한다. 그리고, 성장상태가 좋은 캘러스를 선택하고 플라스크에서 대량으로 배양한다.
실시예 2: 에델바이스 유래의 엑소좀의 제조
실시예 1과 같은 방식으로 제조된 에델바이스 캘러스 배양액을 바이오스펙트럼 주식회사(대한민국 경기도에 소재하는 Leontopodium Alpinum 캘러스 배양액 공급업체)에서 입수하였다. 에델바이스 캘러스 배양액을 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액으로부터, 접선흐름여과법(Tangential Flow Filtration; TFF)을 이용하여 에델바이스 유래의 엑소좀을 분리하였다.
분리된 에델바이스 유래의 엑소좀의 크기와 농도는 NS300(Malvern Panalytical에서 구입)을 이용한 나노입자트래킹분석(nanoparticle tracking analysis; NTA)으로 확인하였다(도 1).
실시예 3: 에델바이스 유래의 엑소좀의 피부 섬유아세포 전달능의 확인
에델바이스 유래의 엑소좀이 인체 피부 섬유아세포(세포바이오에서 구입) 내로 전달되는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 분석을 수행하였다. 실시예 2에서 준비된 에델바이스 유래의 엑소좀의 막을 형광 염색하기 위하여 PKH67(시그마에서 구입) 형광 염료와 반응하였다. 반응 후 반응액을 MW3000(Thermo Fisher Scientific에서 구입) 컬럼으로 분획하여 엑소좀 막에 염색되지 않는 유리 PHK67(free PKH67)을 제거하였다. 음성대조군으로는 PKH67 형광 염료를 완충용액과 반응시킨 후 MW3000 컬럼으로 분획한 것을 사용하였다. PKH67로 염색된 엑소좀을 미리 배양하여 준비된 인체 피부 섬유아세포와 함께 배양한 후 시간에 따른 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 세포의 핵을 염색하기 위하여 훼스트 형광 염료(시그마에서 구입)를 사용하였다. 엑소좀의 세포 내 전달 여부를 확인한 결과, 형광 염색된 엑소좀이 세포 내로 전달되어 녹색 형광이 세포 내부에 시간의 경과에 따라 축적되는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 4: 콜라겐 생성 촉진 효과의 확인
우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에 분산된 인체 피부 섬유아세포(세포바이오에서 구입)를 멀티웰 플레이트에 분주한 후 24시간 배양하였다. 이후 실시예 2에서 준비된 에델바이스 유래의 엑소좀 또는 에델바이스 캘러스 배양액을 무혈청 배지에 희석한 후 인체 피부 섬유아세포에 처리하고 인체 피부 섬유아세포를 배양하였다. 피부 섬유아세포를 이용한 콜라겐 생성 효능의 확인을 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다:
(1) 음성대조군(Negative Control; NC): 무혈청 배지만 인체 피부 섬유아세포에 처리한 실험군;
(2) 에델바이스 캘러스 배양액(CM): 실시예 2에서 준비된 에델바이스 캘러스 배양액을 무혈청 배지에 희석하여 인체 피부 섬유아세포에 처리한 실험군 (입자수 기준 처리농도: 5.0×108 입자/mL);
(3) 에델바이스 유래의 엑소좀(EXO): 실시예 2에서 준비된 에델바이스 유래의 엑소좀을 무혈청 배지에 희석하여 인체 피부 섬유아세포에 처리한 실험군 (처리농도: 5.0×108 입자/mL).
이후, 추가로 48시간 배양하여, 배양액을 회수하고 원심분리한 후, 원심분리된 배양액을 준비하였다. 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드(PIP)에 대한 EIA 키트 (Takara에서 구입)를 이용하여 인체 피부 섬유아세포로부터 합성되어 배양액에 축적된 콜라겐 양을 측정하였다. 측정된 콜라겐 양을 MTT 어세이 키트(Sigma에서 구입)를 이용하여 측정된 총 세포수로 나누어 정규화하여 상대적인 콜라겐 양을 결정하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀은 음성대조군과 비교하여 인체 피부 섬유아세포에서 콜라겐 합성을 증가시킨 반면에, 에델바이스 캘러스 배양액은 콜라겐 합성을 증가시키지 않았다(도 3).
상기 결과에 따르면, 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀은 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 피부재생용 화장품으로서 유용한 기능적 활성, 즉 콜라겐 합성을 증가시키는 활성을 갖는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀은 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 피부재생용 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
실시예 5: 피부 섬유아세포를 이용한 피부 재생 효능의 확인
실시예 2와 같이 준비된 에델바이스 유래의 엑소좀이 인체 피부 섬유아세포에서 상처 회복능을 촉진하는지 여부를 평가하기 위하여 스크래치-운드 어세이(Scratch-Wound Assay)를 시행하였다. 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에 분산된 인체 피부 섬유아세포를 상처 유도용 컬처 플레이트(ImageLock Plate; EssenBio에서 구입)에 5,000 세포/웰의 밀도로 분주하고 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 배양하여 90% 이상의 밀집도를 확인한 후, 운드메이커(WoundMaker; EssenBio에서 구입)를 이용하여 스크래치를 유발하였다. 인체 피부 섬유아세포를 이용한 피부 재생 효능의 확인을 위해 실험군을 다음과 같이 분류하였다:
(1) 음성대조군(Negative control; NC): 무혈청 배지만 처리하는 실험군;
(2) 양성대조군(Positive control; PC): 10% 우태아혈청이 포함된 배지를 처리하는 실험군;
(3) 에델바이스 캘러스 배양액(CM): 실시예 2에서 준비된 에델바이스 캘러스 배양액을 무혈청 배지에 희석하여 처리하는 실험군 (입자수 기준 처리농도: 1.0×109 입자/mL);
(4) 에델바이스 유래의 엑소좀(EXO): 실시예 2에서 준비된 에델바이스 유래의 엑소좀을 무혈청 배지에 희석하여 처리하는 실험군 (처리농도: 1.0×109 입자/mL).
이후, 상기 실험군 각각을 스크래치-운드(Scratch-Wound)에 처리하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 동안 인체 피부 섬유아세포를 배양하면서 6시간, 12시간 및 24시간이 경과한 시점에서 각각 상처 회복능을 인큐사이트(Incucyte)(Sartorius로부터 구입)로 측정하였다.
상처 회복능을 측정한 결과, 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀을 처리한 경우 처리 후 6시간이 경과한 시점에서 양성대조군에 비해 인체 피부 섬유아세포의 이동을 크게 증가시켰으며, 모든 측정 시간(처리 후 6시간, 12시간 및 24시간)에서 음성대조군 및 에델바이스 캘러스 배양액에 비해 인체 피부 섬유아세포의 이동을 크게 증가시킨 것을 확인하였다(도 4A 내지 도 4C).
상기 실험 결과로부터, 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀은 에델바이스 캘러스 배양액 보다 인체 피부 섬유아세포의 이동 촉진 효능, 즉 상처 회복능 내지는 피부재생 효능이 우수한 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀은 피부탄력개선, 주름개선 및/또는 피부재생용 화장료 조성물과, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 약학 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
실시예 6: 에델바이스 유래의 엑소좀의 1차 항염 효능 평가
실시예 2와 같이 준비된 에델바이스 유래의 엑소좀이 항염 효능을 나타내는지 확인하기 위해, RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시키고 이를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)의 각 웰에 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하였다. 다음 날 LPS가 포함된 새로운 배지(1% FBS와 200 nM의 LPS를 포함한 DMEM 배지)에 희석한 에델바이스 유래의 엑소좀을 24시간 동안 RAW 264.7 세포에 처리하였다. 항염 효능 평가를 위한 실험군은 다음과 같이 분류하였다:
(1) 음성대조군 (Negative control): LPS만을 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군;
(2) 양성대조군 (Positive control; PC): LPS와 함께 200 μM 덱사메타손 (dexamethasone)을 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군;
(3) 에델바이스 유래의 엑소좀 (EXO): 실시예 2에서 준비된 에델바이스 유래의 엑소좀을 LPS 배지에 희석하여 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군 (처리농도: 1.0×109 입자/mL).
배양이 끝난 후 배양 상층액(culture supernatant)을 취하고 배양 상층액 내에 존재하는 염증성 사이토카인을 측정하여 염증 반응을 확인하였다. 배양 상층액 내의 염증성 사이토카인 양은 IL-6 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. ELISA 키트 (R&D system에서 구입) 제조사의 매뉴얼에 따라, LPS만을 처리한 군에서의 IL-6 (염증성 사이토카인)의 생성량과, 덱사메타손 및 에델바이스 유래의 엑소좀 각각과 함께 LPS가 처리된 군에서의 IL-6 (염증성 사이토카인)의 생성량을 확인하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS와 함께 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀을 처리한 경우, LPS만 RAW 264.7 세포에 처리한 음성대조군에 비해 현저하게 IL-6의 생성을 억제하였으며, LPS와 함께 덱사메타손을 RAW 264.7 세포에 처리한 양성대조군에 비해서도 IL-6의 생성량이 감소함을 확인하였다.
상기 실험 결과로부터, 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀은 항염 효능이 우수한 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀은 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 약학 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
실시예 7: 에델바이스 유래의 엑소좀의 2차 항염 효능 평가
실시예 2와 같이 준비된 에델바이스 유래의 엑소좀이 항염 효능을 나타내는지 재차 확인하기 위해, RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시키고 이를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)의 각 웰에 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하였다. 다음 날 LPS가 포함된 새로운 배지(1% FBS와 200 nM의 LPS를 포함한 DMEM 배지)에 희석한 에델바이스 유래의 엑소좀을 24시간 동안 RAW 264.7 세포에 처리하였다. 항염 효능 평가를 위한 실험군은 다음과 같이 분류하였다:
(1) 음성대조군 (Negative control): LPS만을 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군;
(2) 양성대조군 (Positive control; PC): LPS와 함께 200 μM 덱사메타손 (dexamethasone)을 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군;
(3) 에델바이스 캘러스 배양액 (CM): 실시예 2에서 준비된 에델바이스 캘러스 배양액을 LPS 배지에 희석하여 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군 (단백질 함량 기준 처리농도: 50 μg/mL, 100 μg/mL, 500 μg/mL);
(4) 에델바이스 유래의 엑소좀 (EXO): 실시예 2에서 준비된 에델바이스 유래의 엑소좀을 LPS 배지에 희석하여 RAW 264.7 세포에 처리한 실험군 (단백질 함량 기준 처리농도: 50 μg/mL, 100 μg/mL, 500 μg/mL).
배양이 끝난 후 배양 상층액(culture supernatant)을 취하고 배양 상층액 내에 존재하는 염증성 사이토카인을 측정하여 염증 반응을 확인하였다. 배양 상층액 내의 염증성 사이토카인 양은 IL-6 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. ELISA 키트 (R&D system에서 구입) 제조사의 매뉴얼에 따라, LPS만을 처리한 군에서의 IL-6 (염증성 사이토카인)의 생성량과, 덱사메타손, 에델바이스 캘러스 배양액 및 에델바이스 유래의 엑소좀 각각과 함께 LPS가 처리된 군에서의 IL-6 (염증성 사이토카인)의 생성량을 확인하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS와 함께 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀을 처리한 경우 LPS만 RAW 264.7 세포에 처리한 음성대조군에 비해 현저하게 IL-6의 생성을 억제하였으며, LPS와 함께 덱사메타손을 RAW 264.7 세포에 처리한 양성대조군에 비해서도 IL-6의 생성량이 감소함을 확인하였다.
한편, LPS와 함께 에델바이스 캘러스 배양액을 RAW 264.7 세포에 처리한 군에서는 처리 농도가 증가함에 따라 IL-6의 생성이 증가하는 경향을 보였다. 반면에, LPS와 함께 에델바이스 유래의 엑소좀을 RAW 264.7 세포에 처리한 군에서는 LPS와 함께 에델바이스 캘러스 배양액을 RAW 264.7 세포에 처리한 군에 비해 현저하게 IL-6의 생성을 억제하였으며, 특히 처리 농도가 증가함에 따라 IL-6의 생성이 억제되는 경향을 보여 에델바이스 유래의 엑소좀이 항염 효과가 우수한 것을 확인하였다.
상기 실험 결과로부터, 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀은 항염 효능이 우수한 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 에델바이스 유래의 엑소좀은 항염, 창상 치료 또는 창상 치료 촉진용 약학 조성물의 유효성분으로 유용하게 활용될 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (18)

  1. 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부탄력개선, 피부주름개선 또는 피부재생용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    샴푸, 비누, 린스, 계면활성제-함유 클렌징, 크림, 로션, 연고, 토닉, 트리트먼트, 컨디셔너, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 오일, 왁스, 스프레이, 에어졸, 미스트, 또는 파우더인, 피부탄력개선, 피부주름개선 또는 피부재생용 화장료 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    크림 또는 로션인, 피부탄력개선, 피부주름개선 또는 피부재생용 화장료 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 에델바이스 유래의 엑소좀은 에델바이스 식물세포 배양액, 에델바이스 캘러스 배양액 또는 에델바이스 식물줄기세포 배양액, 또는 이들과 동등한 에델바이스의 생물학적 용액으로부터 분리되거나, 에델바이스 식물세포 또는 식물줄기세포로부터 유래된 것인, 피부탄력개선, 피부주름개선 또는 피부재생용 화장료 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 에델바이스 유래의 엑소좀은 에델바이스의 잎 또는 줄기 조직으로부터 얻은 식물세포의 배양액, 또는 에델바이스 종자로부터 발아된 떡잎에 상처를 내어 유도시킨 캘러스의 배양액으로부터 분리 정제된 것을 특징으로 하는, 피부탄력개선, 피부주름개선 또는 피부재생용 화장료 조성물.
  6. 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    주사, 마이크로니들링, 이온토포레시스, 도포, 또는 이들의 조합에 의해 투여 또는 처리되는, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 에델바이스 유래의 엑소좀은 에델바이스 식물세포 배양액, 에델바이스 캘러스 배양액 또는 에델바이스 식물줄기세포 배양액, 또는 이들과 동등한 에델바이스의 생물학적 용액으로부터 분리되거나, 에델바이스 식물세포 또는 식물줄기세포로부터 유래된 것인, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 에델바이스 유래의 엑소좀은 에델바이스의 잎 또는 줄기 조직으로부터 얻은 식물세포의 배양액, 또는 에델바이스 종자로부터 발아된 떡잎에 상처를 내어 유도시킨 캘러스의 배양액으로부터 분리 정제된 것을 특징으로 하는, 항염증, 상처 치유 또는 상처 치유 촉진용 약학 조성물.
  11. 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 포유동물의 피부 상태를 조절하는 미용방법.
  12. 제11항에 있어서,
    (a) 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함하는, 미용방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는, 미용방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서는 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.
  16. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 미용방법.
  17. 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계, 또는 에델바이스 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 피부, 염증 부위 또는 상처 부위에 도포하는 단계를 포함하는, 염증치료, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진을 위한 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 염증치료, 상처 치료 또는 상처 치료 촉진을 위한 방법.
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