KR20090116063A - 돼지태반 추출물을 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 돼지태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 항염증 또는 아토피성 피부염 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명의 돼지태반 추출물은 사람섬유아세포에서 과산화수소에 의한 세포 사멸을 억제하고 DNA 손상을 억제시키며, 항산화 효소인 카탈라제의 활성을 증가 시킬 뿐만 아니라, 사람각질세포에서 항아토피 관련 유전자인 MDC 및 TARC의 전사를 억제하고, 무모 마우스에서 피부염 유발제인 DNCB에 의한 자극으로 생성된 각질 두께를 감소시키고 수분함량을 증가시키며, 염증세포의 침윤을 억제하므로 항산화용, 항염증 또는 아토피성 피부염 치료용 약학조성물로 유용하다.

돼지태반, 항산화, 항염증, 항아토피, 각질, 주름, 보습

Description

돼지태반 추출물을 함유하는 조성물{Composition Containing Sus Domesticus Placenta Extract}

본 발명은 돼지태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 돼지태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 항염증 또는 아토피성 피부염 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

태반은 배 조직과 영양, 호흡, 배설 등을 담당하는 자궁조직 사이의 긴밀한 협조를 통해서 태아의 대사물질 교환을 담당하며, 모태와 태아를 연결하는 기능을 한다. 태반은 대부분의 포유류에서 볼 수 있으며, 태반에 의하여 태아는 모태로부터 충분한 산소와 영양을 공급받아 건강하게 발육할 수 있다.

야생 초식동물이 출산 후 기력을 회복하기 위해 자신의 태반을 먹는 것은 잘 알려진 사실로, 그 이유는 태반에는 성장에 필요한 아미노산, 단백질, 효소, 비타민, 당질, 지질 및 미네랄 등의 성분이 풍부하게 함유되어 있기 때문이다.

태반효능에 대한 연구는 1968년 쿠바의 Carlos Miyares Cao 교수에 의하여 본격화되기 시작하여 1980년부터는 피부색소 형성을 억제하는 후천성백반병 치료에 사용되었고, 최근에는 화장품과 건강식 이외에도 주사약과 의약품으로도 사용되고 있다.

태반에는 류신(leucin), 이소류신(isoleucin), 리신(lysine), 발린(valine), 스레오닌(threonine) 등의 필수아미노산 외에 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine) 등 수십 종류의 아미노산과 각종 활성 펩타이드, 비타민(B₁, B₂, B₆, B₁₂, C, D, E), 미네랄, 효소 등 많은 성분이 함유되어 있어 활성산소 제거, 세포 재생작용 등 인간 스스로의 자연 치유력을 높이는 효과를 가지고 있다고 알려져 있다.

이와 같은 태반의 효능을 바탕으로 한 기능성 제품을 개발하고자 하는 시도는 다양하였으나, 인태반의 경우, 폐기물 관리법에 의해 의약품 제조업소에서만 재활용할 수 있는 것으로 되어 있어 이용에 많은 제약이 발생하며, 상기와 같은 제약으로 인해 인태반 함유 화장품은 현재 고가에 판매되고 있는 실정이다. 한편, 동물태반의 경우, 소태반은 광우병에서 자유로울 수 없는 반면, 돼지태반은 인간의 장기와 여러 장기의 특징이 유사한 장점으로 인해 인태반과 소태반 화장품 시장의 대안으로 떠오르고 있는 실정이다.

태반 추출물과 관련된 종래기술에는 태반 추출물을 함유하는 바이오플라센타 피부도포용 조성물 및 그 제조방법(대한민국 특허등록 제10-0642681호), 태반 추출물을 함유하는 피부 도포용 조성물(대한민국 특허공개 제10-2007-0117355호), 태반 추출물을 이용한 섬유아세포의 배양방법 및 이를 이용한 피부재생용 조성물(대한 민국 특허등록 제10-0701297호), 임산부의 양수와 태반을 이용하는 방법과 그 용도(대한민국 특허공개 제10-2002-0024213호), 돼지 태반을 이용한 사료 첨가제 및 음수 첨가제의 제조방법과 이 추출물의 사료 이용(대한민국 특허등록 제10-0680140호) 및 사료첨가용 돼지 태반 추출물의 제조방법 및 사료화(대한민국 특허공개 제10-2007-0004477호) 등이 있다.

그러나, 상기한 연구 보고들에서는 돼지태반 추출물의 항산화, 항염증 및 항아토피 활성이 전혀 개시된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 돼지태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 돼지태반 추출물이 사람섬유아세포에서 과산화수소에 의한 세포사멸을 억제하고 DNA 손상을 억제시키며, 항산화 효소인 카탈라제의 활성을 증가시킬 뿐만 아니라, 사람각질세포에서 항아토피 관련 유전자인 MDC 및 TARC의 전사를 억제하고, 무모 마우스에서 피부염 유발제인 DNCB에 의한 자극 으로 생성된 각질두께를 감소시키고 수분함량을 증가시키며, 염증세포의 침윤을 억제함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 돼지태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 항염증 또는 아토피성 피부염 치료용 약학조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 돼지태반(Sus Domesticus Placenta) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용, 항염증용 또는 아토피성 피부염 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 돼지태반 추출물은 사람섬유아세포에서 과산화수소에 의한 세포사멸을 억제하고 DNA 손상을 억제시키며, 항산화 효소인 카탈라제의 활성을 증가시킬 뿐만 아니라, 사람각질세포에서 항아토피 관련 유전자인 MDC 및 TARC의 전사를 억제하고, 무모 마우스에서 피부염 유발제인 DNCB에 의한 자극으로 생성된 각질두께를 감소시키고 수분함량을 증가시키며, 염증세포의 침윤을 억제하므로 항산화용, 항염증 또는 아토피성 피부염 치료용 약학조성물로 유용하다.

본 발명은 일 관점에서, 돼지태반(Sus Domesticus Placenta) 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항산화용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 돼지태반(Sus Domesticus Placenta) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 돼지태반(Sus Domesticus Placenta) 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 돼지태반(Sus Domesticus Placenta) 추출물은 phosphate buffer solution, Tris buffer solution 및 물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 추출용매, 바람직하게는, phosphate buffer solution으로 추출된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 돼지태반(Sus Domesticus Placenta) 추출물은 (a) 돼지태반을 동결건조한 다음, 분말화하는 단계; (b) 상기 분말화된 태반을phosphate buffer solution, Tris buffer solution 및 물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 추출용매로 초음파 추출하는 단계; 및 (c) 상기 추출물을 원심분리한 다음, 상층액을 동결건조하여 건조분말을 수득하는 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적 분야에서 통상적인 방법에 따라 통상적인 약제학적 제형으로 제형화할 수 있다. 바람직한 약제학적 제형에는 정제, 경질 또는 연질캅셀, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제형, 주사용 제형, 연고제, 크림제, 겔제, 로숀 등과 같은 국소투여용 외용제 등이 있다. 이들 약학적 제형은 약제학적으로 허용되는 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제형의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등, 주사제의 경우에는 안정제, 보존제, 용해보조제, 완충제, 등장화제 등, 외용제의 경우에는 수성 또는 유성 연고기제, 산화방지제, 방부제, 증량제 등을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물의 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택할 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01~1g/㎏으로, 바람직하게는 0.05~0.5g/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서는 사람피부섬유아세포에 돼지태반 추출물을 처리하고 과산화수소(H₂O₂)를 처리한 다음, 트리판 블루(trypan blue) 염색법을 이용하여 세포생존 및 모양변화를 확인한 결과, 돼지태반 추출물이 과산화수소에 의한 세포사멸을 억제하고, 항산화 효소인 카탈라제(catalase)의 활성을 증가시키는 것을 확인하였다.

또한, 사람폐섬유아세포에 돼지태반 추출물을 처리하고 과산화수소를 처리한 다음, 트리판 블루(trypan blue) 염색법을 이용하여 세포생존 및 모양변화를 확인한 결과, 돼지태반 추출물이 과산화수소에 의한 세포사멸을 억제하고, DNA가 절단되는 현상을 감소시키는 것을 유전자 코메트 분석을 통해 확인하였다.

또한, 사람각질세포에 돼지태반 추출물과 인터페론 감마(hIFN-γ; interferon-γ)를 처리한 다음, PCR을 수행한 결과, 돼지태반 추출물이 항아토피 관련 유전자인 MDC 및 TARC(Thymus and activation-regulated chemokine)의 전사를 억제함을 확인하였고, 무모(hairless) 마우스에 피부염 유발제인 DNCB(dinitrochlolrobenzene)를 도포하고 돼지태반 추출물을 도포한 다음, 피부의 두께 및 수분함량을 측정한 결과, 돼지태반 추출물이 DNCB에 의한 자극으로 생성된 각질두께를 감소시키고 수분함량을 증가시키는 것을 확인하였고, 염증세포의 침윤억제효과를 H&E(헤마톡실린-에오신) 염색을 통하여 확인하였으며, 염증부위 내 세포 이주에 영향을 미치는 비만세포(mast cell)의 침윤현상을 톨루디엔블루(toluidine blue) 염색법으로 확인하였다.

아토피 피부염(Atopic dermatitis, AD)은 알레르기성 비염이나 천식을 동반하는 경우가 많은 만성 재발성의 염증성 피부질환으로, 한 해 태어나는 신생아 중 20%가 앓는다는 보고가 나올 정도로 매우 흔한 피부병이다. 아토피 피부염의 정확한 발병원인은 밝혀지지 않고 있으며, 유전학적, 면역학적 요인이나 이상 약물 반응, 환경요인, 미생물 등이 발병에 관여할 것이라고 보고 있다. 최근에는 아토피 피부염 환자의 혈청 내에서 세포면역의 중추적 역할을 담당하는 T 림프구의 수적, 기능적 장애 등이 보고된 바 있다. 또한, 아토피 피부염의 면역학적인 요인과 관련하여 CD4+ T 세포의 역할이 더욱 중요한 것으로 알려지고 있으며, 아토피 피부염 환자의 말초 혈액 및 피부 병변으로부터 분리한 항원 특이 T 세포 클론이 Th2로 밝혀졌고, 이 세포들에서 IL-4 등의 cytokine(싸이토카인) 프로필이 분비된다는 사실이 입증되었다 (Leung et al ., 2003; Baumer et al ., 2004).

아토피 피부염과 같은 알레르기 질환은 상호 견제를 통해 균형을 이루는 Th1/Th2 세포의 불균형에 의해 유발된 면역 질환 중의 하나인데, 환자의 피부에서 T 세포의 이동은 특이 chemokine(케모카인)과 그에 대한 수용체에 의해서 매개된다는 보고가 있다. Chemokine(chemoattractant cytokine)은 염증부위에 백혈구의 이동, 면역세포의 분화, HIV 감염의 억제와 면역 조절 기능 등 여러 가지 활성을 가지는 분자량이 작은 cytokine의 한 부류로써, 염증질환, 감염질환, 알레르기 질환, 혈관성질환, 암질환 및 자가면역질환 등의 여러 가지 병리학적 증상과 밀접하게 관련되어 있으며, 최근 새로운 chemokine과 수용체들이 발견되면서 면역세포의 발생과 성숙, Th1/Th2 cytokine의 균형 조절 작용 등 새로운 기능들이 많이 알려지고 있다 (Vestergaard et al., 2001; Tsuda et al., 2003; Xiao et al ., 2003).

다양한 chemokine 수용체들 중 CCR4는 Th2 세포에 많이 발현된다고 알려져 있고, 특히, 아토피 피부염 동물모델과 아토피 피부염 환자의 병변에서 과발현된다는 보고가 있다. 이러한 CCR4는 Th2 세포와 호산구의 선택적인 염증피부로의 동원을 통해 아토피 피부염의 병리기전에 중요한 역할을 하는 것으로 추측된다 (Na, Y. H. et al., 2005). CCR4에 특이적으로 결합하는 chemokine으로는 macrophage-derived chemokine(MDC/CCL22)와 thymusand activation-regulated chemokine(TARC/CCL17)가 알려져 있는데, MDC와 TARC는 아토피 피부염 환자에서 혈청농도의 증가, 아토피 피부염 동물모델에서 피부발현이 증가됨이 보고되었다 (Nakayama et al ., 2004).

이에 본 연구에서는, PE의 아토피 피부염에 대한 치료효과를 확인하고자, HaCaT 세포(사람각질세포; 서울대학교 피부과)에 hIFN-γ(인터페론-감마, interferon-γ)로 자극하였을 때 유도되는 염증성 chemokine인 MDC와 TARC에 대한 PE의 억제효과를 조사하였다.

실시예 1: 돼지태반 추출물의 제조

동결건조된 제주산 돼지태반 0.76g을 25㎖의 PBS(phosphate buffer solution)에 녹여서 -70℃에서 해동과 냉동을 2회 반복한 다음, 30초 간격으로 10회 초음파 추출(sonication)을 수행하고 13,000rpm, 4℃에서 1시간 동안 원심분리 하여 상등액만을 취한 다음, 상등액을 다시 24,000rpm(100,000Xg)에서 1시간 동안 원심분리하여 얻은 상등액 15㎖를 동결건조하였다. 상기에서 수득한 동결건조물 약 0.42g을 본 발명의 실험에 사용하였다 (이하, PE로 명명함).

실험예 1: 돼지태반 추출물의 항산화 효능 확인

1-1. 돼지태반 추출물의 세포생존률 분석

사람피부섬유아세포는 제주대학병원에서 얻은 7세 남아의 포경수술로 인해 적출된 피부조직을 이용하여 분리하였다. 적출한 조직을 콜라겐분해효소(collagenase)를 이용하여 표피와 진피로 분리한 다음, 트립신(Trypsin)을 이용 하여 진피에서 사람피부섬유아세포를 분리하여 형태를 확인하였다. 확인된 사람 피부섬유아세포는 DMEM 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린-스트렙토 마이신(penicillin-streptomycin)을 가하여 100Φ 디쉬(dish)에서 37℃, 5%의 CO₂ 배양기로 배양하였다.

96 well plate에 사람피부섬유아세포를 5×10⁴cell/㎖가 되도록 접종하여 16시간 동안 배양한 다음, PE를 각각 0.01, 0.1 및 1㎎/㎖로 처리하고 1 시간 후, 과산화수소(H₂O₂)를 100uM이 되도록 처리하고 BrdU를 동시에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. BrdU assay는 Roche사의 제품(cat 11647229001)을 사용하여 하기와 같은 방법으로 수행하였다. BrdU 20㎕/well로 처리하여 24시간 동안 배양한 다음, 배지를 제거하고 Fixdenant를 well당 200㎕씩 첨가하여 30분 동안 상온에서 반응시켰다. Fixdenant 제거 후, anti-BrdU POD solution을 well당 100㎕씩 처리하고 상온에서 100분 동안 반응시킨 다음, 세척액(washing solution)으로 3회 세척(washing)한 다음, 기질을 well당 100㎕씩 넣고 30분 동안 반응시켜 발색시켰다. 1M 황산을 well당 25㎕씩 처리하여 반응을 중지시킨 다음, ELISA reader를 이용하여 450nm와 690nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, PE의 저농도 처리군에서도 H₂O₂에 의한 세포사멸이 억제됨을 알 수 있었다.

1-2. 사람피부섬유아세포에서 H ₂ O ₂ 에 의한 항산화 효능 확인

6 well plate에 사람피부섬유아세포를 1×10⁵cell/㎖가 되도록 접종하고 16 시간 경과 후, PE를 각각 0.1 및 1㎎/㎖로 처리하고 1시간 동안 전배양한 다음, 500uM의 H₂O₂를 처리하고 16 시간 동안 배양한 다음, 배지를 제거하고 PBS로 세척하여 50mM 인산칼륨 완충액(potassium phosphate buffer) 1㎖로 라이시스(lysis)하였다. 각각의 시료를 14,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음, 상층액만을 취하여 효소원으로 사용하였다.

카탈라제(Catalase)의 활성은 H₂O₂의 분해에 따라 감소하는 흡광도를 측정하는 Aebi 방법을 이용하였다. 50mM 인산완충액(phosphate buffer solution)(pH7.0)에 30% H₂O₂를 넣어 제조한 10.5mM 기질용액(solution)(A240=0.5) 1㎖에 각 시료 50㎕를 가한 다음, 43.6M-1cm-1의 exitinction coefficient를 사용하여 흡광광도계(UV/visible spectrophotometer)로 240nm에서 10초마다 1분 동안 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, PE의 농도 의존적으로 카탈라제 활성이 증가함을 확인할 수 있었다.

1-3. 사람피부섬유아세포에서 H ₂ O ₂ 에 의한 세포사멸 억제효과 확인

사람피부섬유아세포에 H₂O₂를 처리하여 산화스트레스를 주었을 때, PE의 효과를 관찰하였다.

6 well plate에 사람피부섬유아세포를 0.5×10⁵cell/㎖가 되도록 접종하고 16시간 경과 후, PE를 1㎎/㎖ 처리하고 1 시간 동안 전배양한 다음, 100uM의 H₂O₂를 처리하고 16 시간 경과 후 트리판 블루(trypan blue) 염색법을 이용하여 세포를 관 찰한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, H₂O₂만 처리한 세포에 비하여 PE를 같이 처리한 세포에서 더 많은 세포가 살아있음을 확인할 수 있었다.

1-4. 사람폐섬유아세포에서 H ₂ O ₂ 에 의한 세포사멸 억제효과 확인

사람폐섬유아세포(lung fibroblast)인 HEL 299 세포(한국세포주 은행 KCLB, No 10137)에 H₂O₂를 처리하여 산화스트레스를 주었을 때, PE의 효과를 관찰하였다. 사람폐섬유아세포는 DMEM 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 가하여 100Φ dish에서 37℃, 5%의 CO₂ 배양기로 배양하였다.

6 well plate에 사람폐섬유아세포를 1×10⁵cell/㎖가 되도록 접종하고 16 시간 경과 후, PE를 1㎎/㎖ 처리하고 1시간 동안 전배양한 다음, 100uM의 H₂O₂를 처리하고 16 시간 경과 후 세포를 관찰한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, H₂O₂만 처리한 세포에 비하여 PE를 같이 처리한 세포에서 더 많은 세포가 살아있음을 확인할 수 있었다.

또한, 트리판 블루(trypan blue) 염색법을 이용하여 세포수를 측정한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, H₂O₂에 의하여 사멸된 세포도 발견되었지만 PE가 사람폐섬유아 세포에서 H₂O₂에 의한 세포사멸을 탁월하게 억제함을 알 수 있었다.

1-5. 유전자 코메트 분석( DNA Comet assay )

사람폐섬유아세포에서 DNA damage 억제 효과를 확인하기 위하여 유전자 코메트 분석(DNA comet assay; single cell gel electrophoresis assay)를 수행하였다.

96 well plate에 사람폐섬유아세포를 4×10⁴cell/㎖가 되도록 접종하고 16 시간 경과 후, PE를 1㎎/㎖으로 30분간 처리하고 1시간 동안 전배양한 다음, 100uM의 H₂O₂를 3분간 ice 상에서 처리하고 상기 사람폐섬유아세포를 수집하여 3분 동안 2,000rpm으로 원심분리하였다. 상기 세포를 PBS 1㎖로 세척하고 다시 1,000rpm로 원심분리하여 상층액을 제거한 다음, 1% 아가로즈(agarose)가 도포된 슬라이드에 50㎕씩 분주하고 커버글라스를 덮은 다음, 4℃에서 10분 동안 방치하였다. 그 후, 커버글라스를 제거하고 0.7% 저용해 아가로즈(low melting agarose)를 도포한 다음, 다시 커버글라스로 덮고 4℃에서 20분 동안 방치하였다.

은박지로 싼 병에 용해완충액(lysis buffer) 35㎖를 채우고 계면활성제인 Triton X-100 350㎕를 첨가한 다음, 90분 동안 용해시켜 언와인딩 완충액(unwindng buffer)을 제조한 다음, 전기영동기에 완충액을 넣고 전압 25V 및 전류 300mA가 되도록 완충액의 첨가량을 조절하여 상기 세포가 분주된 슬라이드를 세포가 위로 향하게 놓고 암실에서 20분 동안 전기영동하였다. 전기영동 후, 암실에서 10분 동안 0.4M 트리스 완충액(Tris buffer)(pH7.5)으로 슬라이드를 3번 세척하고 70% 에탄올(EtOH)로 고정한 다음, 24시간~1주일 동안 암실에서 상기 슬라이드를 건조시킨 다음, 에티디움브로마이드(EtBr; Ethidiumbromide)로 염색하여 형광현미경으로 관 찰한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, PE의 DNA damage 억제 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 2: 돼지태반 추출물의 항아토피 효능 확인

2-1. 사람각질세포에서 항아토피 관련 gene 발현 변화 확인

60Φ 디쉬(dish)에 사람각질세포인 HaCaT 세포(서울대학교 피부과)를 1× 10⁵cell/㎖가 되도록 접종하고 18시간 경과 후, PE 각각 0.25, 50, 100 및 200 ㎎/㎖와 인터페론 감마(hIFN-γ; interferon-γ)(최종농도 10ng/㎖)를 동시 처리하여 16 시간 동안 배양하였고, total RNA 추출은 TRI-reagent(MRC)를 이용하여 분리하였다. 세포에 TRI-reagent 500㎕를 첨가하여 균질화한 다음, 클로로포름 100㎕를 첨가하여 1,200rpm로 원심분리하였다. 상층액에 동량의 이소프로판올을 첨가하고 1,200rpm로 원심분리하여 RNA를 침전시키고 75%의 DEPC(Diethylpyrocarbonate 1,2-Erucoyl-sn-Glycero-3-phosphocholine) 처리된 에탄올로 세척한 다음, 건조시켜 DEPC 처리된 증류수 20㎕에 녹였다. 260nm에서의 흡광도를 측정하여 RNA를 정량하였고, A260/A280nm의 비율이 1.7~1.9 범위 내의 값을 갖는 RNA를 실험에 사용하였다. 모든 실험은 RNase-free한 조건하에서 이루어졌다. 세포로부터 cDNA 합성을 위하여 1㎍의 total RNA를 oligo(dT) 18 primer, dNTP(0.5 μM), 1 unit RNase inhibitor 및 M-MuLV reverse transcriptase(2U)로 70℃ 5분, 25℃ 5분, 37℃ 60분, 그리고 70℃에서 15분간 heating 반응을 수행하였다. 역전사중합 반응(PCR; Polymerase Chain Reaction)은 합성된 cDNA로부터 MDC, TARC, 베타-엑틴(β-Actin)을 증폭시키기 위하여 1㎕ cDNA, 4μM의 5'과 3' primer, 10x buffer(10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 250μM dNTP, 25mM MgCl₂ 및 1 unit PCR 중합효소(Taq polymerase; Promega, USA)를 첨가하고 증류수(distilled water)를 가하여 전체 25㎕가 되도록 조정한 다음, Thermal Cycler(Perkin-Elmer社, USA)를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 수행에 사용한 프라이머 서열(primer sequences)은 하기 표 1에 나타내었다.

대상 유전자	프라이머 서열 (센스/안티센스)	서열번호	산물크기(bp)
MDC	5'-GCATGGCTCGCCTACAGACT-3' 5'-GCAGGGAGGGAGGCAGAGGA-3'	1 2	497
TARC	5'-ATGGCCCCACTGAAGATGCT-3' 5'-TGAACACCAACGGTGGAGGT-3'	3 4	351
베타-엑틴 (β-actin)	5'-ATGGGTCAGAAGGATT-CCTATG-3' 5'-CAGCTCGTAGCTC-TTCTCCA-3'	5 6	588

이 때 PCR 조건은 94℃/45초, 55~60℃/45초, 72℃/60초, 35회이였으며, PCR에 의하여 생성된 산물은 1.5% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동을 실시하고 에티디움브로마이드(EtBr; Ethidiumbromide)로 염색하여 특정밴드(band)를 확인하였다. 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, MDC의 타겟 사이즈는 497bp로 확인되었고, TARC는 351bp, 베타-엑틴(β-actin)은 588bp로 확인되었으며, MDC의 경우, PE의 처리 농도 의존적으로 전사 억제효과가 증가하였음을 알 수 있었다.

2-2. DNCB와 PE 처리 시 마우스 피부변화 확인

동물실험은 KGLP의 가이드라인을 준수하면서 실험을 하였다. 7주령 암컷 무모(hairless) 마우스(HOS:HR-1; SLC, 일본)을 약 일주일간 순화시켜서 안정시킨 후, 각 군당 7 마리를 사용하여 실험하였다. 마우스 사육은 온도 22±1℃, 습도 55±5%, 환기회수 12회/일, 명암주기 12시간/일로 설정된 환경에서 케이지당 1마리씩 수용하여 마우스용 분말사료(샘타코社, 경기도 오산)를 물과 함께 섭취시키는 것으로 이루어졌다.

대조군(A), 무모 마우스의 등 부분에 피부염 유발제인 DNCB(dinitrochlolrobenzene)를 1%의 농도로 도포하여 염증을 유발시킨 실험군(B), 무모 마우스의 등 부분에 피부염 유발제인 DNCB를 1%의 농도로 도포하고 1%(0.01㎎/㎖) PE를 도포한 실험군(C) 및 무모 마우스의 등 부분에 피부염 유발제인 DNCB를 1%의 농도로 도포하고 5%(0.05㎎/㎖) PE를 도포한 실험군(D)으로 나누어 실험하였으며 도포하고 각각 4일, 42일 경과 후의 피부변화를 확인하였다 (A : DNCB (-), B : DNCB (+), C : DNCB-1% PE, D : DNCB-5% PE).

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, DNCB를 도포한 군(B)과 도포하지 않은 군(A)을 육안상으로 비교했을 때, 도포한 부위의 피부가 붉은 색을 띄고 각질이 심하게 일어났으며, 피부가 두꺼워지고 주름 등이 발생한 것을 관찰할 수 있었다. 이에 반해 DNCB를 도포하고 PE를 각각 1%, 5%로 도포한 군인 (C), (D)군은 DNCB를 도포한 군(B)에 비해 각질이 감소하고 피부의 전반적인 붉은 색이 줄어들었음을 확인할 수 있었다.

2-3. DNCB와 PE 처리 시 마우스 진피두께 및 염증세포 침윤 확인

대조군(A), 무모 마우스의 귀 부분에 피부염 유발제인 DNCB를 1%의 농도로 도포하여 염증을 유발시킨 실험군(B), 무모 마우스의 귀 부분에 피부염 유발제인 DNCB를 1%의 농도로 도포하고 1% PE를 도포한 실험군(C) 및 무모 마우스의 귀 부분에 피부염 유발제인 DNCB를 1%의 농도로 도포하고 5% PE를 도포한 실험군(D)으로 나누어 실험하였으며 도포하고 각각 4일, 42일 경과 후의 피부변화를 확인하였다 (A : DNCB (-), B : DNCB (+), C : DNCB-1% PE, D : DNCB-5% PE).

각각의 실험군에 대한 조직학적인 변화를 H&E(헤마톡실린-에오신) 염색법으로 확인한 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, DNCB를 도포하지 않은 군(A)에 비하여 도포군(B)에서는 진피내로 많은 양의 염증세포가 침윤되고 표피가 두꺼워진 것을 관찰할 수 있었으며, DNCB 도포 + 5% PE 도포군(D)에서는 진피내로 침윤된 염증 세포의 수가 상당히 감소된 것을 확인할 수 있었다.

2-4. DNCB와 PE 처리 시 마우스 비만세포 분포 확인

염증부위 내 세포 이주에 영향을 미치는 비만세포(mast cell)의 분포와 형태변화를 조사하기 위하여 톨루디엔 블루(toluidine blue) 염색법을 실시한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, DNCB 도포군(B)에 비해 DNCB를 도포하고 PE를 각각 1, 5% 도포한 실험군인 (C)군 및 (D)군에서 비만세포의 수가 줄어든 것을 확인할 수 있었다.

2-5. DNCB와 PE 처리 시 마우스 피부두께 측정

DNCB와 PE 도포에 따른 귀 부분 피부두께 변화를 켈리퍼를 이용하여 시간 경과에 따라 측정하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 실험종료일인 42일째를 살펴보면 DNCB를 도포하지 않은 군(A)은 피부두께 변화가 거의 없었지만 초기보다 피부두께가 미미하게 증가하였음을 알 수 있었고 DNCB를 도포하고 PE를 각각 1, 5% 도포한 실험군인 (C)군 및 (D)군은 실험개시 후 4일째보다 피부두께가 약간 감소한 것을 확인할 수 있었으며, DNCB를 도포한 군(B)의 피부두께가 가장 두꺼움을 알 수 있었다.

2-6. DNCB와 PE 처리 시 마우스 피부수분함량 측정

DNCB와 PE 도포에 따른 귀 부분 피부표면의 수분함량 변화를 수분측정기 (scalar, Japan)를 이용하여 시간 경과에 따라 측정하였다. 그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, DNCB 도포에 의하여 4일째에는 피부표면의 수분이 감소하였는데 24일째에는 다시 정상에 가깝게 돌아왔으며, DNCB 도포 + 5% PE 도포군(D)의 경우, DNCB 도포군(B)에 비해 수분함량이 약간 높은 것으로 나타났다.

이하, PE를 포함하는 약학 조성물 제형의 예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아니라 구체적으로 설명하고자 함이다.

제형예 1. 산제의 제조

PE 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제형예 2. 정제의 제조

PE 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제형예 3. 캅셀제의 제조

PE 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제형예 4. 주사제의 제조

PE 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄· 12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조 방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제형예 5. 액제의 제조

PE 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조 방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 사람피부섬유아세포에 PE와 H₂O₂를 처리하였을 때 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.

도 2는 사람피부섬유아세포에 PE와 H₂O₂를 처리하였을 때 카탈라제(catalase) 효소 활성에 미치는 영향을 분석한 그래프이다.

도 3은 사람피부섬유아세포에 PE와 H₂O₂를 처리하였을 때 세포생존 및 모양 변화를 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

도 4는 사람폐섬유아세포에 PE와 H₂O₂를 처리하였을 때 세포생존 및 모양변화를 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

도 5는 사람폐섬유아세포에 PE와 H₂O₂를 처리하였을 때 생존한 세포수를 나타낸 그래프이다.

도 6은 PE와 H₂O₂를 처리한 사람폐섬유아세포를 유전자 코메트 분석한 결과를 형광현미경으로 관찰한 사진이다.

도 7은 사람각질세포에 인터페론 감마(hIFN-γ; interferon-γ)와 PE를 처리하였을 때 MDC 및 TARC 유전자 발현양 변화를 나타낸 그래프이다.

도 8은 무모(hairless) 마우스에 DNCB(dinitrochlolrobenzene)와 PE를 처리하였을 때 피부변화를 관찰한 사진이다 (A : DNCB (-), B : DNCB (+), C : DNCB-1% PE, D : DNCB-5% PE).

도 9는 무모 마우스에 DNCB와 PE를 처리하였을 때 피부의 각질두께 변화 및 염증세포 분포를 H&E 염색을 통해 형광현미경으로 관찰한 사진이다 (A : DNCB (-), B : DNCB (+), C : DNCB-1% PE, D : DNCB-5% PE).

도 10은 무모 마우스에 DNCB와 PE를 처리하였을 때 피부에 비만세포(mast cell)가 침윤된 것을 톨루디엔 블루(toluidine blue) 염색을 통해 형광현미경으로 관찰한 사진 및 그래프이다 (A : DNCB (-), B : DNCB (+), C : DNCB-1% PE, D : DNCB-5% PE).

도 11은 무모 마우스에 DNCB와 PE를 처리하였을 때 피부 두께를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 12는 무모 마우스에 DNCB와 PE를 처리하였을 때 피부 수분함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

<110> Jeju Hi-Tech Industry Development Institute HYUN, Hak Song <120> Composition Containing Sus Domesticus Placenta Extract <130> P08-B082 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for MDC <400> 1 gcatggctcg cctacagact 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for MDC <400> 2 gcagggaggg aggcagagga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for TARC <400> 3 atggccccac tgaagatgct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for TARC <400> 4 tgaacaccaa cggtggaggt 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for beta-actin <400> 5 atgggtcaga aggattccta tg 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for beta-actin <400> 6 cagctcgtag ctcttctcca 20

Claims (5)

1. 돼지태반(Sus Domesticus Placenta) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 약학조성물.
2. 돼지태반(Sus Domesticus Placenta) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학조성물.
3. 돼지태반(Sus Domesticus Placenta) 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피성 피부염 치료용 약학조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돼지태반(Sus Domesticus Placenta) 추출물은 phosphate buffer solution, Tris buffer solution 및 물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 추출용매로 추출된 것을 특징으로 하는 약학조성물.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 돼지태반(Sus Domesticus Placenta) 추출물은 다음 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 약학조성물:

   (a) 돼지태반을 동결건조한 다음, 분말화하는 단계;

   (b) 상기 분말화된 태반을 phosphate buffer solution, Tris buffer solution 및 물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 추출용매로 초음파 추출하는단계; 및

   (c) 상기 추출물을 원심분리한 다음, 상층액을 동결건조하여 건조분말을 수득하는 단계.

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