WO2018208092A1 - 인간 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 위축증 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 및 근육 기능 개선용 조성물 - Google Patents

인간 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 위축증 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 및 근육 기능 개선용 조성물 Download PDF

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WO2018208092A1
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muscle
composition
placenta extract
muscle function
pharmaceutical composition
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오창택
김점용
한혜정
박선규
이종훈
김수애
김범준
박동호
임송이
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(주)녹십자웰빙
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    • A23V2250/20—Natural extracts
    • A23V2250/204—Animal extracts

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating muscular dystrophy or sarcopenia and improving muscle function, including human placenta extract as an active ingredient.
  • Muscle cells that make up muscle are composed of muscle filaments, which cause the cells to change size, causing contractions. When muscle tissue contracts, tension occurs, which is called muscle strength.
  • the muscle is a body organ that is responsible for the movement of the individual, maintaining posture, and secretion of fluid through such muscle strength.
  • Muscle disease is a progressive disease caused by a gradual decrease in muscle strength, usually caused by chromosomal abnormalities, and has various causes such as mutations, inflammation, metabolic abnormalities, impaired endocrine function, and toxicity. Muscle diseases caused by these causes include muscular dystrophy, myotonia, muscular atrophy and sarcopenia.
  • Human placenta extract contains various growth factors, cytokines and other physiologically active substances, and is widely used for fatigue, antioxidant, and the like (Lee KK, et al ., Evid) . Based Complement Alternat. Med., vol . 2012, (2012) p.130875).
  • human placenta extract is known to induce liver function improvement through liver regeneration in animal studies and to affect wound healing by producing TGF- ⁇ and VEGF.
  • TGF- ⁇ and VEGF VEGF
  • the present inventors have been working to research and develop a substance capable of preventing or treating muscle diseases, and by confirming the cell protective action against oxidative stress by treating human placenta extract to C2C12 myoblast cells.
  • the invention has been completed.
  • Another object of the present invention to provide a composition for improving muscle function comprising the placenta extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of muscular atrophy or sarcopenia comprising the placental extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition or food composition for improving muscle function comprising the placenta extract as an active ingredient.
  • composition according to the present invention can increase the proliferation of muscle cells in the oxidative stress situation, reduce the amount of free radicals in the cell, and increase mitochondrial synthesis by increasing the expression level of PGC1-alpha, a master protein of mitochondrial synthesis.
  • the composition of the present invention can be useful for activating autophagy and increasing muscle volume in the muscle atrophy model to prevent or treat muscular atrophy or sarcopenia, and improve muscle function.
  • FIG. 1A is a graph confirming cell viability using CCK-8 solution after 24 hours after H 2 O 2 is treated with a final concentration of 500 uM at a maximum concentration of 1/2 u dilution up to 128 fold.
  • 1B is a graph confirming cell viability after 24 hours after treating 10% of lyneck to the highest concentration of 128 times diluted to 1/2 dilution.
  • Figure 1C is a graph showing cell viability after 4 hours after Lyneneck (5%) and H 2 O 2 (250 uM) treatment.
  • Figure 1d is a microplate reader through ROS staining of the cytoplasm using a ROS probe (H2-DCF, DCF / thermo / D339 / 15 uM) after lyneck (5%) and H 2 O 2 (250 uM) treatment It is a graph showing that the amount of fluorescence was measured.
  • Figure 2a shows that after lyneck (5%) and H 2 O 2 (250 uM) to C2C12 cells to obtain a lysate of cells to compare the amount of protein expression using Western blot.
  • Figure 2b is after lyneck (5%) and H 2 O 2 (250 uM) C2C12 cells, mitochondria stained using a mito-tracker, using a microplate to measure the amount of fluorescence compared to the control (Con) Relative values are shown.
  • Figure 3 shows the comparison of protein expression through Western blot to secure the lysate of cells after treatment with Lyneneck (5%) and H 2 O 2 (250 uM) C2C12 cells.
  • 4A and 4B are graphs confirming EMG changes of a total of three groups, Normal, Botox (BTX) treated group, and BTX and Ryeneck treated group, using the EMG monitoring device at the initial and last days of observation.
  • FIG. 5A is a visual evaluation of the gastrocnemius muscle of the right hind limb using a stereoscopic microscope after sacrifice of mice of the control group, BTX treated group, BTX and Ryneneck treated group.
  • FIG. 5B shows the mass of the right hind limb gastrocnemius of mice belonging to the control group, BTX treated group, BTX and Ryneneck treated group using PRIMOS LITE Software (PRIMOS LITE Vesrsion 5.8E).
  • Figure 5c shows the right leg gastrocnemius muscle of each group of mice scanned using PRIMOS LITE , the volume is measured and graphed the value. The result is the average of the three measurements per mouse.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of muscular atrophy or sarcopenia comprising the placenta extract as an active ingredient.
  • “Placenta extract” in the present invention is an extract obtained from the placenta of a human or animal.
  • the extract can be obtained by treating the placenta with an acid and / or an enzyme.
  • the acid may be hydrochloric acid and the enzyme may be pepsin.
  • the animal may be derived from a mammal, specifically, a human, a cow, a horse, a sheep, or a pig.
  • the "placenta” is an organ that is produced with pregnancy, the supply of nutrients and enzymes from the mother to the fetus, the discharge of waste and carbon dioxide gas from the fetus into the mother, the migration of foreign substances pathogens or drugs in the living body to the fetus And endocrine adjustment of the fetus.
  • the placenta contains amino acids, proteins, sugars, nucleic acids, lipids, minerals, enzymes, hormones and the like.
  • the amino acids include aspartic acid, glutamic acid, leucine, lysine, glycine, alanine, serine, threonine, phenylalanine, tyrosine, methionine, histidine and the like.
  • Proteins and enzymes include albumin, globulin, acidic and alkaline phosphatase, halongidases and the like.
  • Sugars include glucose, galactose, ribose and the like.
  • Nucleic acids include uracil, xanthine, hypoxanthine, and the like, and lipids include lauric acid, palmitic acid, linoleic acid, and the like.
  • Minerals include Na, K, Ca, P, Fe, Cl, etc.
  • hormones include gonadothrombin, lactogen, steroid hormones.
  • the prophylactic and therapeutic effects on muscular dystrophy and muscular dystrophy in the muscular atrophy model were observed.
  • muscle atrophy is a disease in which muscles are contracted, and the limb muscles are gradually contracted symmetrically.
  • muscular dystrophy There are many types of muscular dystrophy, the most common ones being amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and spinal progressive muscular atrophy.
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Muscular atrophic lateral sclerosis also called Lou Gehrig's disease, is a degenerative disease caused by invasion of the cerebral cortex and the motor neuron along with lower motor neuron cells in the brain stem and spinal cord. The muscles around the limbs and around the face gradually become dry and weak, and stiffness occurs when you move your limbs. However, there are no numb or painful sensory symptoms, conscious clarity, no eye movement disorders or defecation and urination disorders. Most people develop between 0.4 and 2 per 100,000 people per year at age 40-70, with slightly more male patients than women, and most die from respiratory paralysis within 2-5 years of onset. Muscular atrophic lateral sclerosis may have a family history and other causes are not yet known. There is no specific way to prevent or treat the disease.
  • Spinal progressive muscular dystrophy is a disease that causes muscle atrophy and atrophy of the whole body by degeneration of motor neurons in the spinal cord and soft water. Muscle atrophy begins in the limbs and gradually goes up, invading the muscles of the neck and the muscles of the torso. The tendon reflexes of the upper and lower limbs are weakened, and the voice of the voices appears in the reflections of Wabinski. It occurs in any age group after 3 years, takes a long course, and does not die prematurely. However, the appearance of the disease in newborn babies is called “Wertnich-Hoffmann's disease,” which can cause death within a few years. There is no special way to prevent or treat myeloprogressive muscular dystrophy.
  • the term "muscleiopathy” means that as the aging progresses, the muscle density decreases and the function is gradually weakened, thereby decreasing the muscle.
  • the disease is also known as age-related sarcopenia due to the decrease in muscle due to aging.
  • Muscular dystrophy develops in people with low physical activity with aging, but in addition to the decrease in nerve cells that signal muscles to move the body in the brain, decreases growth hormones and male hormones, and decreases the ability of protein synthesis in the body. Due to onset. Treatments include strength training, drug treatment, hormone replacement therapy, and long-term hormone replacement therapy can cause cancer or other health problems.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for improving muscle function comprising the placenta extract as an active ingredient.
  • muscle function means the ability to exert a force by contraction of muscles, muscle strength, which is the ability of the muscles to exert maximum contraction to withstand resistance, how long or how many times a muscle has a given weight It includes muscle endurance, which is an ability to repeat burn contraction and relaxation, and quickness, an ability to exert a strong force in a short time. This strength function is dominated by the liver and is proportional to muscle mass. In addition, the term “improving muscle function” means improving muscle function better.
  • the muscle may be skeletal muscle.
  • Skeletal muscle is soft tissue that attaches to bones or tendons and contracts voluntarily to create movement or force. Muscles can only contract, so they only pull the tendons and bones together, but they can do a variety of movements depending on the location or direction they are attached to, and can produce varying degrees of strength depending on the degree of contraction. Skeletal muscles, unlike other muscles, can be controlled voluntarily so that we can do what we want.
  • the placenta extract according to the present invention increases the proliferation and survival rate of muscle cells in oxidative stress situation, decreases the amount of free radicals in cells, and greatly increases muscle volume, thereby preventing or treating muscular atrophy or sarcopenia, and muscle function. It can be usefully used for improvement.
  • formulations of the pharmaceutical compositions according to the invention may be in the form of injections or external preparations for skin, such as injections, creams, gels, patches, sprays, ointments, warnings, lotions, microneedles, rollers, and combinations thereof. It may be a form selected from the group consisting of.
  • composition of the present invention may be formulated in a topical skin preparation suitable for direct administration to a treatment site, in which case it may further comprise a physiologically acceptable carrier or diluent suitable for topical administration to the skin.
  • physiologically acceptable carriers or diluents may include, but are not limited to, water, physiological saline, creams, lotions, gels and short chain alcohols and glycols (eg, ethyl alcohol and propylene glycol) in various forms. .
  • the present invention provides a food composition for improving muscle function comprising the placenta extract as an active ingredient.
  • the food composition according to the present invention is any one formulation selected from the group consisting of functional food, nutritional supplement, health food, food additives, feed, and combinations thereof.
  • the placenta extract used in the following experiment was used as an injection formulation of Laennec provided by Green Cross wellness, which was prepared by the following method.
  • Zahager human placenta
  • acetone treatment was degreased by acetone treatment, and then hydrolyzed sufficiently with pepsin and hydrochloric acid to prevent incomplete hydrolyzate.
  • the lean neck of the injection formulation was used diluted in basal medium at v / v%.
  • DMEM Dulbeco's Modified Eagle's Media
  • Cell counting kit-8 (CCK-8) analysis technique and fluorescence probe H2DCFDA were used to determine the effect of placental extract on muscle cells under oxidative stress.
  • C2C12 cells suspended in single cells were seeded with 1 ⁇ 10 4 cells per well in 96-well plates, and then cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours. After incubation, each was treated as follows: i) 500 ⁇ M of H 2 O 2 was set at the highest concentration and treated in C2C12 medium for 24 hours until the final 128-fold dilution with half dilution; ii) 10% of Linek was set to the highest concentration and treated with C2C12 medium for 24 hours until the final 128-fold dilution with half dilution; iii) a license after the neck 5% for 24 hours, H 2 O 2 in the C2C12 culture medium was treated for 4 hours. Then, the CCK-8 solution was diluted at a ratio of 1:10 with H 2 O 2 treated C2C12 medium at each concentration, and then incubated in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 1 hour.
  • step iii) C2C12 medium was treated with Lyneneck 5% and H 2 O 2 , followed by ROS (reactive oxygen species) probe 20,70-dichlorodihydroflurescein (H2DCFDA) for 30 minutes to ROS stain the cytoplasm in the cells It was. Subsequently, the intracellular H 2 O 2 (cytosolic H 2 O 2 ) was measured by measuring the amount of intracellular hydrogen peroxide through a flow cytometer and measuring the amount of fluorescence at a wavelength of 495 nm and 525 nm using a microplate reader (Molecular Devices, USA). The mass was measured. The results are shown in Figure 1d.
  • ROS reactive oxygen species
  • C2C12 cells were seeded in 96-well plates with 1 ⁇ 10 4 cells per well, followed by Lyneneck 5% for 24 hours and H 2 O 2 for 4 hours to induce oxidative stress. Then, after washing out all the medium containing the reagent, the cultured cells were collected using a cell scraper. The collected cells were mixed with PRO-PREP protein extraction solution (Intron Biotechnology, South Korea) containing phosphatase inhibitors. The mixed solution was incubated for 30 minutes on ice and then centrifuged for 20 minutes at 12,000 rpm. Then, after obtaining the supernatant containing the protein, the protein was quantified using a BCA protein analysis kit (Thermo Fisher Scientific, USA).
  • the mitochondria of C2C12 cells treated with the Lyneneck 5% or H 2 O 2 were fluorescently stained using a mito-tracker. Thereafter, the amount of fluorescence was measured using a microplate and expressed as a relative value compared to the control. The results are shown in Figure 2b.
  • the effect of placental extract on autophagy regulation of cells was determined by measuring the expression level of autophagy marker protein using Western blot analysis technique.
  • EMG changes were identified at the beginning and end of the observations by using neuromuscular governance testing to identify the effects of the effects on muscle volume on recovery of neuromuscular blockade.
  • mice Sixteen week-old hairless mice (Central experimental animals, Seoul, Korea) were purchased and divided into normal, BTX-treated groups, and BTX and Ryeneck-treated groups. At this time, 18 hairless mice were randomly selected and assigned to each group. After 7 days of observation, 0.5 unit of botulinum toxin (Allergan, USA) diluted with 30 ⁇ l saline was injected into the right hind limb gastrocnemius of hairless mice treated with BTX and BTX and Ryneneck treated groups using an insulin syringe.
  • botulinum toxin Allergan, USA
  • the botulinum toxin-injected BTX treated group and the BTX and Ryeneck treated group confirmed the far less muscle control than the control (Normal), no difference was found between the two groups. Through this, it can be confirmed that the difference in muscle volume is caused by placental extract, not made of nerve domination.

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Abstract

본 발명은 인간 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 및 근육 기능 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 산화스트레스 상황에 있는 근육세포의 증식을 증가시키고 세포 내 활성산소량을 감소시키며, 미토콘드리아 합성의 마스터 단백질인 PGC1-alpha의 발현량을 증가시켜 미토콘드리아 합성을 증가시킨다. 또한, 본 발명의 조성물은 오토파지를 활성화 시키고, 근 위축 모델에서 근 볼륨을 증가시킨다. 따라서, 상기 인간 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 근 위축증 또는 근육감소증의 예방 또는 치료, 및 근육 기능 개선에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

인간 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 위축증 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 및 근육 기능 개선용 조성물
본 발명은 인간 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 위축증 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 및 근육 기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
근육을 형성하는 근육세포는 근필라멘트로 구성되어 있는데, 이는 세포의 크기를 변하도록 하여 수축을 유발한다. 근육 조직이 수축할 때 장력이 발생하게 되는데, 이를 근력이라고 한다. 근육은 이러한 근력을 통하여 개체의 이동, 자세 유지, 체액분비 등을 담당하는 신체기관이다.
근육질환은 점진적인 근력감소로 인해 발생하는 진행성 질환으로, 대개 염색체 이상으로 발생하며 돌연변이, 염증, 신진대사의 이상, 내분비 기능의 장애, 독성 등 다양한 원인이 있다. 이러한 원인들로 인해 발생하는 근육 질환으로는 근이영양증(muscular dystrophy), 근육긴장증(myotonia), 근 위축증(muscular atrophy), 근육감소증(sarcopenia)등이 있다.
한편, 인간 태반 추출물(Human placenta extract, HPE)은 다양한 성장인자, 사이토카인 및 기타 생리활성물질을 포함하며, 피로의 경감, 항산화 등의 용도로 널리 이용되고 있다(Lee KK, et al., Evid Based Complement Alternat . Med ., vol. 2012,(2012) p.130875). 또한, 인간 태반 추출물은 동물을 이용한 연구에서 간 재생을 통해 간 기능 향상을 유도하고, TGF-β 및 VEGF를 생산함으로써 상처 치료에 영향을 미친다고 알려져 있다. 그러나, 인간 태반 추출물에 대한 많은 관심에도 불구하고 인간 태반 추출물의 기능에 대해서는 아직 완전히 연구되지 않았으며, 특히 근 질환에 대한 연구는 진행된 바 없다.
이에, 본 발명자는 근육 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 연구, 개발하기 위하여 노력하던 중, 인간 태반 추출물을 C2C12 근아세포(myoblast cell)에 처리함에 따라 산화스트레스에 대한 세포 보호작용을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 기능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 위축증(muscular atrophy) 또는 근육감소증(sarcopenia)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 기능 개선용 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 산화스트레스 상황에 있는 근육세포의 증식을 증가시키고 세포 내 활성산소량을 감소시키며, 미토콘드리아 합성의 마스터 단백질인 PGC1-alpha의 발현량을 증가시켜 미토콘드리아 합성을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 오토파지를 활성화 시키고, 근 위축 모델에서 근 볼륨을 증가시킴으로써 근 위축증 또는 근육감소증의 예방 또는 치료, 및 근육 기능 개선에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a는 H2O2 500 uM을 최고 농도로 정하여 1/2 희석으로 최종 128배 희석한 농도까지 처리한 후, 24시간 뒤 CCK-8 solution을 이용하여 세포 생존율을 확인한 그래프이다.
도 1b는 라이넥 10%를 최고농도로 정하여 1/2 희석으로 최종 128배 희석한 농도까지 처리한 후, 24시간 뒤 세포 생존율을 확인한 그래프이다.
도 1c는 라이넥(5%) 및 H2O2(250 uM) 처리 후, 4시간 뒤 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 1d는 라이넥(5%) 및 H2O2(250 uM) 처리 후, ROS probe (H2-DCF, DCF/thermo/ D339/15 uM)를 사용하여 세포질의 ROS 염색을 통해 microplate reader기를 이용하여 형광량을 측정한 것을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 C2C12 세포에 라이넥(5%) 및 H2O2(250 uM) 처리 후, 세포의 용해물을 확보하여 웨스턴블롯을 이용하여 단백질 발현량을 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 2b는 C2C12 세포에 라이넥(5%) 및 H2O2(250 uM) 처리 후, mito-tracker를 이용하여 미토콘드리아를 염색하고, 마이크로 플레이트를 이용하여 형광량을 측정하여 대조군(Con) 대비 상대값을 나타낸 것이다.
도 3은 C2C12 세포에 라이넥(5%) 및 H2O2(250 uM) 처리 후, 세포의 용해물을 확보하여 웨스턴블롯을 통해 단백질 발현량을 비교하여 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 EMG 모니터링 장치를 이용하여 Normal, 보톡스(BTX) 처리군 및 BTX와 라이넥 처리군, 총 3개 집단의 근전도 변화를 관찰 초기 및 마지막 날짜에 확인한 그래프이다.
도 5a는 대조군, BTX 처리군, BTX 및 라이넥 처리군의 마우스를 희생시킨 다음 우측 뒷다리의 비복근을 실체현미경(Stereoscopic microscope)을 이용하여 육안으로 평가한 것이다.
도 5b는 PRIMOSLITE 소프트웨어(PRIMOSLITE Vesrsion 5.8E)를 이용하여 대조군, BTX 처리군, BTX 및 라이넥 처리군에 속하는 마우스의 우측 뒷다리 비복근의 질량을 분석하여 나타낸 것이다.
도 5c는 각 집단의 마우스의 우측 다리 비복근을 PRIMOSLITE를 이용하여 스캔한 후, 볼륨을 측정하여 값을 그래프로 나타낸 것이다. 이때, 결과값은 마우스 한 마리 당 3번 측정한 값의 평균이다.
본 발명은 일 측면으로, 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 위축증(muscular atrophy) 또는 근육감소증(sarcopenia)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "태반 추출물(placenta extract)"은 인간 또는 동물의 태반에서 수득된 추출물이다. 상기 추출물은 태반에 산 및/또는 효소를 처리하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 상기 산은 염산일 수 있고, 상기 효소는 펩신일 수 있다. 이때, 동물은 포유동물, 구체적으로 인간, 소, 말, 양, 또는 돼지 등의 유래일 수 있다.
상기 "태반"은 임신과 함께 생성되는 장기로서, 모체에서 태아로 영양물과 효소의 공급, 태아에서 생기는 노폐물과 탄산가스 등을 모체로 배출, 생체에 있어서 이물질인 병원균이나 약물의 태아로의 이행저지 및 태아의 내분비조정 등의 기능을 한다.
태반에는 아미노산류, 단백질류, 당류, 핵산류, 지질류, 무기물, 효소류, 호르몬류 등을 함유한다. 이때, 아미노산류는 아스파라긴산, 글루타민산, 루이신, 라이신, 글리신, 알라닌, 세린, 스레오닌, 페닐알라닌, 타이로신, 메치오닌, 히스티딘 등이 있다. 단백질 및 효소류는 알부민, 글로불린, 산성 및 알칼리성 포스파타제, 하알로니다제 등을 포함한다. 당류는 글루코스, 갈락토스, 리보스 등을 포함한다. 핵산류는 우라실, 크산틴, 히포크산틴 등을 포함하며, 지질류는 라우린산, 팔미틸산, 리놀레인산 등이 있다. 무기물은 Na, K, Ca, P, Fe, Cl 등을 포함하며, 호르몬류에는 고나도트롬빈, 락토겐, 스테로이드 호르몬 등이 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 인간 태반 추출물로서 녹십자웰빙에서 제조한 라이넥주(Laennec Inj.)를 사용하여 근 위축 모델에서 근 위축증 및 근육감소증에 대한 예방 및 치료 효과를 관찰하였다.
본 발명에서 용어 "근 위축증"이란 근육이 위축되는 질환으로서, 팔다리 근육이 좌우대칭적으로 점점 위축되어가는 질환이다. 근 위축증에는 여러 종류가 있으며, 가장 많이 발생하는 질환으로는 근 위축성 측색경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 척수성진행성 근 위축증(spinal progressive muscular atrophy)이 있다.
근 위축성 측색경화증은 루게릭병(Lou Gehrig's disease)이라고도 불리우며, 뇌간과 척수에 있는 하운동신경원세포와 함께 대뇌피질과 상운동신경계를 침범하여 생기는 퇴행성 질환이다. 팔다리와 얼굴 주위의 근육이 점차적으로 마르고 힘이 없어지며, 팔다리를 움직일 때 뻣뻣해지는 증세가 나타난다. 그러나, 저리거나 아픈 감각 증상이 없으며, 의식이 명료하고, 안구운동 장애 또는 배변 및 배뇨 장애가 없다. 대부분 40-70세에 연간 인구 10만 명당 0.4 내지 2명 정도로 발병하며, 남성 환자 수가 여성 환자 수보다 약간 많고, 대부분 발병한지 2-5년 이내에 호흡마비로 목숨을 잃는다. 근 위축성 측색경화증은 가족력이 있을 수 있고, 이 외에 원인이 아직 밝혀져 있지 않다. 상기 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 특별한 방법이 아직 없다.
척수성진행성 근 위축증은 척수 및 연수의 운동신경세포의 변성에 의하여 전신의 근 위축과 탈력을 일으키는 질환이다. 근육 위축이 손발에서 시작하여 점차 상행하여 목의 근육과 몸통의 근육이 침해된다. 상하지의 힘줄 반사가 약해지고 바빈스키 반사에는 음성이 나타난다. 3세 이후의 어느 연령층에서나 발병하며 긴 경과를 취하고, 조기에 사망하는 일이 없다. 그러나, 갓난 아기에서 상기 질병이 나타나는 것을 "베르트니히-호프만병"이라고 하며, 이 경우 수년 이내에 사망할 수 있다. 척수성진행성 근 위축증을 예방 또는 치료할 수 있는 특별한 방법이 아직 없는 실정이다.
본 발명에서 용어 "근육감소증"이란 노화가 진행됨에 따라 근육의 밀도가 감소하고 기능이 점차적으로 약화되어 근육이 감소되는 것을 의미한다. 상기 질환은 노화로 인해 근육이 감소하여, 노인 근육감소증(age-related sarcopenia)라고도 한다. 근육감소증은 노화와 함께 신체활동이 적은 사람에게 발병하지만 이 외에도 뇌에서 몸이 움직이도록 근육에 신호를 보내는 신경 세포의 감소, 성장호르몬, 남성호르몬 등의 감소, 체내 단백질 합성 능력의 감소 등의 원인으로 인해 발병한다. 치료법으로는 근력운동, 약물치료, 호르몬 대체치료 등이 있으며, 호르몬 대체치료를 장기간 진행할 경우 암이나 그 외에 건강상의 문제를 일으킬 수 있다.
본 발명은 다른 측면으로, 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 기능 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 용어 "근육 기능"이란, 근육의 수축에 의해 힘을 발휘하는 능력을 의미하며, 근육이 저항을 이겨내기 위하여 최대한으로 수축력을 발휘할 수 있는 능력인 근력, 근육이 주어진 중량에 얼마나 오랫동안 또는 얼마나 여러 번 수축과 이완을 반복할 수 있는지를 나타내는 능력인 근지구력, 단시간 내에 강한 힘을 발휘하는 능력인 순발력을 포함한다. 이러한 근력 기능은 간이 주관하며, 근육량에 비례한다. 또한, 상기 용어 "근육 기능 개선"은 근육 기능을 더 좋게 향상시키는 것을 의미한다.
상기 근육은 골격근육(skeletal muscle)일 수 있다. 골격근육은 뼈나 힘줄에 붙어서 수의적으로 수축하여 움직임이나 힘을 만드는 연부 조직이다. 근육은 수축만 가능해서 붙어 있는 힘줄이나 뼈를 서로 끌어 당기는 역할만 하지만 뼈에 붙어 있는 위치나 방향에 따라 다양한 동작이 가능하고, 수축하는 정도에 따라 다양한 강도의 힘을 낼 수 있다. 골격근육은 다른 근육과 달리 수의적으로 조절할 수 있어 우리가 원하는 동작을 할 수 있게 한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 태반 추출물인 라이넥의 농도가 증가할수록, 산화 스트레스 상황에서 근세포의 생존율이 증가함을 확인하였다(도 1b). 또한, 라이넥을 처리한 군에서, 처리하지 않은 군에 비해 근 볼륨이 크게 유지됨을 확인하였다(도 5a 내지 도 5c). 따라서, 본 발명에 따른 태반 추출물은 산화 스트레스 상황에 있는 근육세포의 증식 및 생존율을 증가시키고 세포 내 활성산소량을 감소시키며, 근 볼륨을 크게 증가시킴으로써 근 위축증 또는 근육감소증의 예방 또는 치료, 및 근육 기능 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 주사제, 또는 피부 외용제의 형태, 예를 들면 주사제, 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 마이크로니들, 롤러, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 치료 부위에 직접 투여하기에 적합한 피부 외용제 형태로 제제화될 수 있으며, 이 경우 피부에 국소 투여하기 적합한 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제로는 물, 생리 식염수, 크림, 로션, 각종 형태의 겔 및 단쇄 알코올 및 글리콜(예: 에틸 알코올 및 프로필렌 글리콜) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 다른 측면으로, 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 식품 첨가제(food additives), 사료, 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 태반 추출물의 제조
하기 실험에서 사용된 태반 추출물은 녹십자웰빙에서 제공되는 라이넥(Laennec)의 주사 제형을 사용하였으며, 상기 라이넥은 하기의 방법으로 제조하였다. 먼저, 자하거(인간 태반)를 아세톤 처리하여 탈지한 후, 불완전 가수분해물이 생성되지 않도록 펩신 및 염산 처리로 충분히 가수분해하여 태반 추출물인 라이넥을 제조하였다. 상기 라이넥을 적용하기 위하여, 주사 제형의 라이넥을 v/v%로 기본 배지에 희석하여 사용하였다. 이때, 배지는 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Media) 배지를 사용하였고, 1% 페니실린을 첨가하여 사용하였다.
실험예 1. 산화 스트레스 상황에서 근육 세포에 대한 태반 추출물의 효과 확인
세포 생존율 측정 방법 중 하나인 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석 기법 및 형광 프로브 H2DCFDA를 사용하여 산화 스트레스 상황에서 근육 세포에 대한 태반 추출물의 효과를 확인하였다.
단일 세포로 현탁 되어있는 C2C12 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 1x104개의 세포를 시딩(seeding)한 후, 37℃에서 24시간동안 CO2 배양기 안에서 배양하였다. 배양 후, 각각 다음과 같이 처리하였다: i) H2O2 500 uM를 최고 농도로 설정하여 1/2 희석으로 최종 128배 희석한 농도까지 C2C12 배지에 24시간동안 처리하였다; ii) 라이넥 10%를 최고 농도로 설정하여 1/2 희석으로 최종 128배 희석한 농도까지 C2C12 배지에 24시간동안 처리하였다; iii) C2C12 배지에 라이넥 5%를 24시간동안 처리한 후, H2O2를 4시간동안 처리하였다. 그 다음, CCK-8 용액을 각각의 농도로 H2O2 처리된 C2C12 배지와 1:10 비율로 희석한 뒤 37℃에서 1시간동안 CO2 배양기 안에서 배양하였다.
이후, 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, reference는 450 nm로 하였다. 각 군의 세포 생존율은 대조군(Con)과 비교하여 백분율(%)로 계산하였다. 그 결과를 도 1a 내지 도 1c에 나타내었다.
상기 단계 iii)에서 C2C12 배지에 라이넥 5% 및 H2O2를 처리한 후, ROS(reactive oxygen species) 프로브인 20,70-dichlorodihydroflurescein(H2DCFDA)를 30분동안 처리하여 세포 내의 세포질을 ROS 염색하였다. 이후, 유세포 분석기를 통해 세포 내 과산화수소량을 측정하여 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices, USA)를 이용하여 495 nm 및 525 nm 파장에서 형광량을 측정함으로써 세포질 내 H2O2(cytosolic H2O2) 질량을 측정하였다. 그 결과를 도 1d에 나타내었다.
산화 스트레스에 의한 C2C12 세포의 사멸을 측정한 결과, 농도가 증가할수록 세포 생존율이 감소하는 것을 확인하였고, 이는 산화 스트레스가 세포에 대해 세포 독성을 보이는 것을 의미한다. 또한, 각각의 해당 농도를 24시간동안 처리한 후 세포 생존율의 절반에 해당하는 농도는 250 uM임을 알 수 있었다. 상기 농도를 이후 실험에 적용하였다 (도 1a). 인간 태반 추출물이 C2C12 세포 독성 및 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 실시한 실험에서, 라이넥의 농도가 증가할수록 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였고, 이는 라이넥이 농도 10%까지는 세포에 대한 독성이 없고, 세포 성장 효과를 가지는 것을 의미한다 (도 1b).
또한, 산화 스트레스에 의한 C2C12 세포 사멸에 대하여 인간 태반 추출물의 보호 작용을 확인한 결과, 라이넥을 전처리한 집단에서 H2O2 단독 처리군에 비해 비교군 대비 유의하게 생존율이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 인간 태반 추출물이 산화 스트레스로부터 세포를 보호하는 것을 의미한다 (도 1c). 또한, 인간 태반 추출물의 C2C12 세포의 세포질 내의 ROS 제거 능력을 확인하기 위해 실시한 실험에서, 라이넥을 전처리한 스트레스 유도 집단의 세포질 내 ROS가 스트레스 단독 유도 집단에 비하여 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. 이는 인간 태반 추출물이 세포 내 ROS를 감소하는 기능을 가지고 있음을 의미한다 (도 1d).
실험예 2. 세포 내 미토콘드리아 합성과 태반 추출물의 상관관계
웨스턴블롯 분석 기법(western blot analysis)을 사용하여 세포 내 미토콘드리아 합성에 관여하는 단백질의 발현량을 측정함으로써 산화 스트레스 상황에서 태반 추출물의 역할을 확인하였다.
C2C12 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 1x104 세포를 시딩한 후, 라이넥 5%를 24시간동안 처리하였고 산화적 스트레스를 유도하기 위해 H2O2를 4시간동안 처리하였다. 이후, 시약이 포함된 모든 배지를 워시 아웃 한 후, 세포 스크래퍼를 이용하여 배양된 세포를 수집하였다. 수집된 세포를 포스파타제 억제제가 포함된 PRO-PREP 단백질 추출 용액(Intron Biotechnology, South korea)와 혼합하였다. 상기 혼합 용액을 얼음 위에서 30분간 인큐베이션한 후, 12,000 rpm으로 20분동안 원심 분리하였다. 이후, 단백질이 포함된 상층액을 수득한 후, BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 단백질을 정량하였다.
30 ㎍의 단백질들을 100℃에서 5분동안 가열하였고, 환원제가 포함된 12% 아크릴아마이드 겔을 이용하여 SDS-PAGE 분석(sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis assay)을 통해 가열된 각 단백질들을 전기영동 하였다. 전기영동을 통해 아크릴아마이드겔 상에서 크기 별로 분리된 단백질들을 웨스턴블롯 기법을 사용하여 PVDF(poly-vinyl difluoride) membrane으로 이동시켰다. 이후, membrane이 다른 단백질로 오염되는 것을 막기 위해, 5% 탈지유(skim milk)를 사용하여 블로킹(blocking)하였다. 화학발광 이미지 시스템(chemiluminescence imaging system)을 이용하여 membrane을 관찰하였고, Image J 1.38 버전 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다. 그 결과를 도 2a에 나타내었다.
또한, 미토콘드리아의 질량을 측정하기 위해, mito-tracker를 사용하여 상기 라이넥 5% 또는 H2O2를 처리한 C2C12 세포의 미토콘드리아를 형광 염색하였다. 이후, 마이크로 플레이트를 사용하여 형광량을 측정하였고, 대조군 대비 상대 값으로 표기하였다. 그 결과를 도 2b에 나타내었다.
도 2a에 나타난 바와 같이, 미토콘드리아 신생합성의 핵심인자로 밝혀진 SIRT1, P-AMPK, PGC1-alpha 단백질의 발현량이 라이넥을 처리한 두 집단에서 처리하지 않은 두 집단에 비해 증가함을 확인하였다. 이는 인간 태반 추출물이 미토콘드리아 신생합성의 마스터 단백질인 PGC1-alpha의 발현량을 AMPK에 의존하여 증가시킨다는 것을 의미한다. 또한, 도 2b에 나타난 바와 같이, mito-tracker를 이용하여 각 집단의 미토콘드리아 질량을 비교한 결과, 라이넥을 처리한 두 집단에서 처리하지 않은 두 집단에 비해 증가함을 확인하였다. 이는 마스터 단백질인 PGC1-alpha의 발현량이 미토콘드리아 질량과 직접적인 상관관계가 있음을 의미한다.
실험예 3. 세포의 오토파지(autophagy) 조절에 태반 추출물이 미치는 영향
웨스턴블롯 분석 기법을 사용하여 오토파지 마커 단백질의 발현량을 측정함으로써 태반 추출물이 세포의 오토파지 조절에 미치는 영향을 확인하였다.
상기 실시예 2의 실험과 동일한 방법으로 C2C12 세포에 라이넥 5% 및 H2O2를 처리한 후, 세포를 용해시켜 세포의 용해물을 수득하였고, 인간 태반 추출물이 오토파지 조절에 미치는 영향을 확인하기 위해 웨스턴블롯 분석 기법을 사용하여 오토파지 마커인 LC3 및 Beclin-1 단백질의 발현량을 비교하였다. 또한, 노인성 근 감소증 환자의 경우 오토파지가 적절치 않게 조절되어 근육 세포 내의 p62 단백질이 축적된다는 이전 연구에 근거하여, 인간 태반 추출물이 스트레스 상황에서 플럭스 조절에 미치는 영향을 확인하기 위해 p62 단백질의 발현량을 평가하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 라이넥 5%를 전처리한 집단에서 처리하지 않은 집단에 비해 오토파지 마커인 LC3 및 Beclin-1 두 단백질 모두 발현량이 증가한 것을 확인하였다. 또한, 스트레스 환경(H2O2 처리 집단)에서 LC3 II 밴드가 I 밴드에 비해 발현량이 증가한 것을 확인하였다. 이는 인간 태반 추출물이 오토파지를 상향조절 할 뿐만 아니라, 스트레스 상황에서 플럭스를 원활하게 조절한다는 것을 의미한다. 결과적으로, 인간 태반 추출물이 스트레스 상황에서 오토파지 플럭스를 적절하게 조절하여 p62 단백질의 축적을 감소시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 근지배력에 대한 태반 추출물의 효과 확인
근육 볼륨에 미치는 영향이 신경근 차단의 회복에 의하여 일어날 수 있는 변수를 확인하기 위하여 신경근 지배 시험법을 사용함으로써 관찰 초기와 마지막 날짜에 근전도 변화를 확인하였다.
생후 6주된 무모생쥐(중앙실험동물, 서울, 한국) 18마리를 구입하여 Normal, BTX 처리군 및 BTX와 라이넥 처리군으로 나누어 실험을 진행하였다. 이때, 18마리의 무모생쥐는 각 군에 대해 무작위로 선택하여 배정하였다. 총 관찰기간 중 7일 후, 30 μl의 식염수로 희석한 보툴리눔 톡신(Allergan, USA) 0.5 단위를 인슐린 실린지를 이용하여 BTX 처리군 및 BTX와 라이넥 처리군 무모생쥐의 우측 뒷다리 비복근에 주입하였다. 본 실험에서 음식과 물은 자율식이로 진행하였으며, 독성 유발 7일 전부터 16일 후까지 3.6 ml/kg의 태반 추출물을 주 3회 우측 뒷다리 비복근에 피하주사 하였다. 이후, EMG(electromyography) 모니터링 장치를 이용하여 관찰 5일차 및 16일차에 근전도를 측정하였다. 이때, EMG 측정은 다리 근육을 조절하는 척추 신경을 전기적으로 자극한 후, 활성 신호를 받은 전극으로부터 전극의 반응 크기를 측정하여 수행하였다. 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.
도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, 보툴리눔 톡신을 주입한 BTX 처리군 및 BTX와 라이넥 처리군 모두 대조군(Normal)에 비해 떨어진 근 지배력을 확인하였고, 두 군간의 차이는 발견되지 않았다. 이를 통해, 근 볼륨이 차이가 나는 것은 신경 재지배로 이루어지는 것이 아닌, 태반 추출물에 의하여 발생하는 것임을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 근 위축 모델에서 태반 추출물의 효과
실체현미경과 PRIMOSLITE 5.8E 버전 소프트웨어를 사용하여 무모생쥐의 비복근을 육안적으로 평가하고 3차원적인 부피를 비교하여 측정함으로써 근 위축에 대한 태반 추출물의 보호효과를 확인하였다.
상기 실험예 4에서 근전도 변화를 관찰한 후, 관찰 마지막 날에 각 집단의 무모생쥐를 희생하여 우측 뒷다리에서 피부를 떼어내고 실체현미경을 이용하여 비복근을 육안적으로 평가함으로써 근육 부피를 비교하였다. 그 결과를 도 5a에 나타내었다. 또한, 각 집단의 무모생쥐 우측 뒷다리의 비복근을 잘라 PRIMOSLITE 소프트웨어를 이용하여 스캔함으로써 비복근의 질량 및 볼륨을 측정하였다. 이때, 볼륨 측정은 자동적으로 '0'으로 설정되도록 하여 평가를 진행하였으며, 생쥐 한 마리당 3번씩 측정하여 평균을 결과값으로 나타내었다. 그 결과를 도 5b 및 도 5c에 나타내었다.
도 5a 내지 도 5c에 나타난 바와 같이, 라이넥을 처리한 집단에서 처리하지 않은 집단에 비해 근 볼륨이 크게 유지됨을 확인하였다.

Claims (12)

  1. 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 위축증(muscular atrophy) 또는 근육감소증(sarcopenia)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 태반 추출물이 인간 또는 동물의 태반에서 수득된 것을 특징으로 하는, 근 위축증 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 동물이 소, 말, 양, 또는 돼지인 것을 특징으로 하는, 근 위축증 또는 근육감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 기능 개선용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 근육이 골격근육인 것을 특징으로 하는, 근육 기능 개선용 약학적 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 약학적 조성물의 제형이 주사제, 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 마이크로니들, 롤러, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 근육 기능 개선용 약학적 조성물.
  7. 태반 추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 기능 개선용 식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 식품 조성물이 기능성 식품, 영양 보조제, 건강식품, 식품 첨가제, 사료, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는, 근육 기능 개선용 식품 조성물.
  9. 근 위축증 또는 근육 감소증을 예방 또는 치료하기 위한 태반추출물의 용도.
  10. 근육 기능 개선을 위한 태반추출물의 용도.
  11. 태반추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근 위축증 또는 근육 감소증의 예방 또는 치료 방법.
  12. 태반추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근육 기능 개선 방법.
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