KR20190011482A

KR20190011482A - 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20190011482A
Application number: KR1020170094083A
Authority: KR
Inventors: 최철희
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2017-07-25
Filing date: 2017-07-25
Publication date: 2019-02-07
Also published as: WO2019022482A3; CN111356468B; WO2019022482A2; KR101956620B1; CN111356468A

Abstract

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 항섬유화 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 황칠나무 추출물은 섬유화에 중요한 역할을 하는 TGF-β1의 신호전달 경로를 효과적으로 억제하는 활성이 있어 TGF-β1으로 유도되는 a-SMA, CTGF, FN-EDAM, 콜라겐과 같은 세포외기질 인자들의 발현 및 활성을 억제할 수 있으며 높은 항산화 활성이 있어, 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 섬유화 질환의 치료제 및 건강기능성 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for preventing or treating fibrotic diseases comprising dendropanax morbifera extracts}

본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

두릅나무과에 속하는 황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)는 우리나라의 남부 해안 지역과 제주도에서 자생하는 상록활엽교목으로 겨울에도 낙엽이 지지 않는 수종으로 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것을 황칠(黃漆)이라고 한다.

황칠은 삼국시대부터 황제의 갑옷, 투구, 기타 금속 장신구의 황금색을 발하는 진귀한 도료로 이용되어 왔으며, 고려시대에 쓰여진 고려사절요, 중국의 계림유사, 계림지, 해동역사에 황칠의 채취시기, 사용용도 등이 기록되어 있고, 그 이전인 백제의 특산품이었다는 것이 당나라 역사서인 책부원구, 통전에 남아있다. 또한, 황칠나무가 번열 제거, 안질치료, 황달치료, 화상치료 및 나병에 효과가 있으며 인체에 무해하다는 기록도 전해지고 있다(이시진, 본초강목, 중국문광도서, 1590).

한편, 대부분의 장기는 조직 손상 후 염증과 치유과정을 거치게 되는데 지속적인 손상이 있으면 치유과정에서 조직의 섬유화가 일어나게 된다. 섬유화 과정은 콜라겐이나 피브로넥틴(fibronectin) 등의 세포외기질(ECM)이 조직에 축척되어 정상구조를 파괴하여 기능의 장애를 가져온다. 대표적으로 간섬유화증, 신부전증, 폐섬유화증 및 동맥경화 등이 있다.

간섬유화는 간경변증의 전구병변으로 만성 간질환을 일으키는 심한 간손상의 결과로 여러 가지 사이토카인과 성장인자의 작용에 의해 시작된다. 일반적으로 간섬유증은 가역적이고 thin fibril로 구성되며 결절 형성이 없고 간손상 원인이 한시적인 경우 세포사멸(apoptosis) 과정과 matrix metalloproteinases(MMP)에 의해서 증가된 세포외기질(extracellular matrix, ECM)이 분해되어 정상 회복이 가능하나 간섬유증 과정이 반복적으로 지속되면 thick fibril을 형성하고 결절이 있는 간경변으로 진행하게 된다. 또한 다양한 염증 유발요인으로 인해 간세포가 손상되어 콜라겐을 포함한 비정상적인 세포외기질 단백질이 축적되는 간섬유증의 과정을 통하여 간경변증이 유발되며 간경변증의 발현 조절을 위해서는 세포외기질의 축적을 조절하는 것이 중요하다. 간세포가 손상되는 경우의 염증반응은 휴지기의 간성상세포를 활성화시켜 세포외 기질과 다양한 사이토카인(cytokine) 및 케모카인(chemokine)을 분비하며 그 중 TGF-β1은 강력한 성장억제제의 역할을 한다. TGF-β1은 25 kD의 물질로서 latent TGF-β1 binding protein과 결합하여 inactive latent 형태로 분비되고 1,4형 교원질, laminin 및 decorin 등의 세포외기질과 결합한 상태로 존재하여 여러 가지 자극에 의해 활성화된다. TGF-β1은 collagenase 생산을 감소하거나 collagenase 억제물질 생산을 증가하여 collagen 발현을 조절하며 대식세포에서 TNF-α, IL-1 및 PDGF 등의 생산을 증가시키며 섬유화 과정에 중요한 역할을 한다. 현재 TGF-β1은 섬유화가 진행된 곳에서만 발현되고 정상 간조직이나 비활동적인 곳에서는 발현되지 않아 간섬유화에서 TGF-β1이 중요한 역할을 담당하고 있는 것으로 알려져 있다.

또한, 폐섬유화(pulmonary fibrosis)는 폐포벽에 결합조직, 특히 콜라겐이 과도하게 참착되면서 호흡곤란을 일으키는 질환이다. 폐섬유화에서는 폐 조직이 딱딱하게 굳어가며, 말랑하고 탄력적이어야 할 폐 조직이 굳은 부위에서는 호흡을 위한 수축과 팽창이 자유롭지 못하기 때문에 호흡량이 줄게 되며, 병증이 진행될수록 상대적으로 남아있는 폐 용적이 줄면서 폐 기능이 감소되고 최악의 경우 호흡곤란 또는 호흡부전으로 인해 사망까지도 할 수 있는 위험한 병증이다. 폐 섬유화 예측마커로는 TGF-b(SMAD), a-SMA, endothelin-1 등이 있으며 페섬유화가 발생하면 이들 발현이 증가된다고 보고되고 있다.

이와 같은 간섬유화, 폐섬유화 등 섬유화 질환의 치료를 위한 방법으로는 현재 사용되고 있는 대부분의 치료제는 화학요법제로서 인체 각종 부작용을 초래하는 문제점이 있어, 보다 근본적인 치료 효과가 있으면서도 체내 안정한 천연물 유래의 새로운 항섬유증 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 황칠나무 추출물이 섬유화에 중요한 역할을 하는 TGF-β1 및 섬유화 관련 인자들의 발현과 활성을 조절하는 작용이 있음을 확인하였고 따라서 황칠나무 추출물을 섬유화 질환의 예방 및 치료용도로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 10-1734986

따라서 본 발명의 목적은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 황칠나무의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 사용하여 수득한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 극성용매 가용추출물은 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매를 사용하여 수득한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비극성용매 가용 추출물은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트를 사용하여 수득한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 TGF-β1 신호전달 경로를 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 섬유화 질환은 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 경피증, 골격근 섬유증 및 당뇨성 섬유증으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트으로 이루어진 군 중에서 선택되는 용매를 사용하여 수득한 추출물일 수 있다.

본 발명의 황칠나무 추출물은 섬유화에 중요한 역할을 하는 TGF-β1의 신호전달 경로를 효과적으로 억제하는 활성이 있어 TGF-β1으로 유도되는 a-SMA, CTGF, FN-EDAM, 콜라겐과 같은 세포외기질 인자들의 발현 및 활성을 억제할 수 있으며 높은 항산화 활성이 있어, 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 섬유화 질환의 치료제 및 건강기능성식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 황칠나무 추출물을 제조하는 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 HS27 및 HHStec 세포주를 대상으로 본 발명의 황칠나무 용매별 추출물 처리에 따른 TGF-β1로 유도된 a-SMA의 발현 정도를 RT-PCR 분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 HS27 및 HHStec 세포주를 대상으로 본 발명의 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 TGF-β1로 유도된 a-SMA의 발현 정도를 RT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 HS27 세포주에서 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 TGF-β1의 mRNA 발현양과 TGF-β1 생성량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HS27 및 HHStec 세포주에서 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 TGF-β1로 유도된 CTGF(connective tissue growth factor)의 발현변화를 RT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 HS27 및 HHStec 세포주에서 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 TGF-β1로 유도된 FN-EDA(fibronectin extra domain A)의 발현변화를 RT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 HS27 및 HHStec 세포주에서 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 콜라겐 I 및 III(ECM)의 발현변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 HS27 및 HHStec 세포주에서 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물 처리에 따른 용해성 콜라겐 분비량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 스크래치된 HS27 세포주에 농도별 황칠나무 헥산 분획추출물을 처리하고 24시간 배양 후, 세포이동 정도(회복력)를 현미경으로 관찰한 사진과 회복 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 용매별 황칠나무 추출물에 따른 항산화 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 HS27 세포주에 용매별 본 발명의 황칠나무 추출물을 처리한 후, DCFH-DA 소거능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 HS27 세포주에 본 발명의 황칠나무 헥산 분획추출물을 농도별 처리한 후, 섬유화 관련 인자인 MMP1, TNF-a 및 TIMP1의 mRNA 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 HS27 세포주에 본 발명의 황칠나무 헥산 분획추출물을 농도별 처리한 후, 섬유화 관련 인자인 MMP2 및 MMP9의 mRNA 발현정도를 자이모그래피 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 HHStec 세포주에 본 발명의 황칠나무 헥산 분획추출물을 농도별로 처리한 후, 섬유화 관련 인자인 MMP1 및 MMP2의 mRNA 발현정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"추출물"은 황칠나무의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

"조추출물"은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 메탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

"극성용매 가용 추출물"은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 메탄올, 보다 바람직하게는 메탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

"비극성용매 가용 추출물"은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는, 헥산 또는 에틸아세테이트 용매에 가용한 추출물을 포함한다.

"약학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 본 발명의 황칠나무 추출물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다.

"담체(carrier)"는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

"희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출 가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

"치료하는"이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.

"기능성 식품"이란, 일반 식품에 본 발명의 황칠나무 추출물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다. 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 추출물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이고, 본 발명은 이러한 향상된 기능의 식품을 포괄적으로 '기능성 식품'이라 정의한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명은 황칠나무 추출물의 항섬유화 용도에 관한 것으로, 황칠나무 추출물이 내포하고 있는 특정 생리활성 및 기능의 발휘에 관한 것이다.

황칠나무(Dendropanox morbifera LEV.)는 두릅나무에 속하는 상록 활엽교목으로 우리나라의 제주도와 완도, 보길도, 해남 등 남ㆍ서해안 일대에 자생하고 있는 우리나라 특산 수종이다. 황칠나무에 함유된 정향성분은 소량의 터펜(Terpene)류와 다량의 세스퀴터펜(Sesquiterpene)류가 포함되어 있는데, 채취시기나 장소에 따라서 차이가 있지만 germacrene-d, β-selinene,α-amorphene, α-selinene, δ-cadinene,γ-cadinene, T-muurolol, β-elemene, bicyclo [4,4,0] dec- 1 -en - 2 - isopropyl - 5 - methyl - 9-methylene, β-cadinene, germacrene-B, α-copaene, α-humulene, α-cadinene과 소량의 linalool L, α-terpinene, α-cubebene, α-ylangene,(+)-calarene, 3,7-guaiadine, (-)-isoledene, β-cubebene, limonene, aromadendrene, cadina-1,4-diene 등이 함유되어 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 황칠나무의 부위는 잎, 줄기, 수피 등 제한이 없으나, 바람직하게는 잎을 사용할 수 있다.

황칠나무 추출물은 당업계에 알려진 방법, 이의 변형된 방법 또는 본 발명에 의한 방법으로 제조하여 사용할 수 있다. 일 구체예로서, 이하와 같은 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명의 황칠나무 추출물 또는 조추출물은 황칠나무 중량의 약 1 내지 30배 부피량, 바람직하게는 2 내지 15배 부피 량 (w/v%)의 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물 및 메탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 50~100% 메탄올을 가하여, 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 실온에서 10 내지 60 시간, 바람직하게는 30 내지 50 시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 또는 가열추출법 등의 추출방법으로 황칠나무 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 50~100% 메탄올 조추출물 중량의 약 1 내지 150배, 바람직하게는 5 내지 100배 부피(w/v%)의 물을 분산시킨 후, 헥산, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 물의 약 1 내지 10배, 바람직하게는 1 내지 5배의 부피를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 본 발명의 극성 용매 및 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다. 바람직하게는 헥산 추출물을 수득하여 사용할 수 있다.

상기 추출물들의 농축액을 -80℃ 동결건조 혹은 50℃ 진공감압을 통하여 분말상태로도 얻을 수 있다.

본 발명은 상기 황칠나무 추출물을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 제조방법은 그것의 예시적인 방법에 지나지 않으며, 당해 분야의 기술에 근간한 다양한 방법들에 의해 적절히 변형시켜 사용할 수 있다.예를 들면, 본 발명에 따른 비-예시된 추출방법은 당 분야의 숙련가에게 명백한 변형에 의해 성공적으로 수행될 수 있다.

본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 본 발명에 따른 황칠나무 추출물의 제조를 위한 구체적인 반응조건 등을 추후 설명하는 실시예들을 통해 확인할 수 있으므로, 그에 대한 자세한 설명은 생략한다.

본 발명은 황칠나무 추출물의 새로운 용도, 즉 섬유화 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 활성이 있음을 최초로 규명한 점에 특징이 있다.

섬유화(섬유증) 진행에서 핵심적인 역할을 담당하는 인자는 TGF-β1 으로 알려져 있으며, TGF-β1에 의한 신호전달 체계를 억제하면 섬유화를 억제할 수 있다.

또한, 간장 또는 췌장의 섬유화를 억제하는 유효한 수단으로서 성상세포가 중요한 표적 후보가 되고 있다. 섬유화 과정 중, 성상세포는 쿠퍼 세포(Kupffer cell)나 침윤 세포로부터의 사이토카인에 의해 활성화되고 활성화 세포로 형질 전환되어 세포 외 매트릭스(ECM)를 매우 분명하게 생산한다. 성상세포는 비타민 A의 저장 세포로서 알려져 있고, 줄기섬유아세포 패밀리에 속한다. 한편, 성상세포는 매트릭스 분해 효소(MMP), 그 억제 인자(TIMP), TGF－β, PDGF 등의 사이토카인 및 HGF 등의 증식 인자를 생산하고, 간 섬유화에 있어서 중심적인 역할을 완수한다. 활성화된 성상세포는 수축능이 항진하여 혈류의 조절에 관여하는 것 외에, 각종 사이토카인 수용체의 발현을 증가시켜 사이토카인에 대해서 고감수성이 된다.

본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 섬유화 질환을 예방, 개선 및 치료할 수 있는지를 확인하기 위해, 먼저 각 용매를 이용하여 수득한 황칠나무 추출물에 대해 TGF-β1로 유도된 α-SMA, CTGF, FN-EDA 및 콜라겐의 발현 변화 영향을 분석하였다.

그 결과, TGF-β1로 증가된α-SMA, CTGF, FN-EDA 및 콜라겐의 발현수준을 본 발명의 황칠나무 추출물이 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

또한 본 발명의 다른 일실시예에서는 간의 커퍼세포(kupffer cell)로부터 전-섬유화 사이토카인의 생성을 자극할 뿐만 아니라 간성상세포의 활성화를 통한 섬유증 초기 유발인자인 반응성 활성산소종(ROS)에 대한 황칠나무 추출물의 활성 억제 여부를 확인한 결과, 본 발명의 황칠나무 추출물은 활성산소종(ROS)을 효과적으로 억제하는 활성이 있는 것으로 나타났다.

상기 CTGF(connective tissue growth factor)는 간성상세포에서 주로 분비되는 물질로서 간성상세포의 증식과, 생존 및 collagen 생산을 자극함으로써 간섬유화를 유발시키는 것으로 알려져 있고, α-SMA 및 콜라겐은 섬유화 유발 시 증가되는 것으로 알려져 있다.

또한, ECM의 성분들 중에서 FN(fibronectin) 및 이의 다양한 이성질체인 FN-EDA(fibronectin extra domain A)은 상처 치유와 같은 비정상적인 상태에서 생산되며, 이들 역시 TGF-β1에 의해 발현이 증가되며 섬유화를 유발시키는 요인이다.

따라서 본 발명의 황칠나무 추출물은 섬유화 유발 원인 및 인자들의 발현을 효과적으로 억제하는 활성이 있어, 궁극적으로 섬유화 질환의 예방, 개선 및 치료를 위한 의약품과 건강기능성 식품의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

그러므로 본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 다른 관점에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에 유효량의 황칠나무 추출물을 투여하여 TGF-β1의 신호전달을 차단하는 방법을 제공함으로써, 황칠나무 추출물을 사용한 섬유화 질환의 치료 및 예방하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료하는"이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "치료"란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.

본 발명의 황칠나무 추출물을 함유하는 섬유화 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 황칠나무 추출물을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 황칠나무 추출물을 포함하는 조성물은 이미 사용되고 있는 스테로이드성 약물, 항히스타민제, 소염진통제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 황칠나무 추출물을 함유하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제,캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 특히, 창상 치유와 관련하여서는 피부 외용제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제,감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

한편, 본 발명은 다른 관점에서 상기 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 섬유화 질환의 예방 및 개선용 기능성 조성물에 관한 것이다. 이러한 기능성 조성물로는 예를 들어, 건강 기능식품 조성물을 들 수 있다.

기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 황칠나무 추출물을 첨가할 경우, 해당 조성물의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이다.

예를 들어, 본 발명의 황칠나무 추출물의 분자적 메커니즘을 이용하여 섬유화 질환의 예방 및 개선용 기능성 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 황칠나무 추출물은 다양한 기능성 식품 제조시 주성분 또는 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다. 일 구체예로서, 기능성 조성물 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 전체 조성물 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 상기 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물 또는 화장료 조성물의 제조방법에 따라 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.

또한, 여러 가지 영양성분, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜 등을 적절히 함유할 수 있다.

본 발명의 황칠나무 추출물 함유 조성물은 천연 식물성 성분이기 때 문에, 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용하는 경우에도 안심하고 사용할 수 있다.

< 실시예 >

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다

<재료 및 실험방법>

<1> 황칠나무 추출물의 제조

한국 무안에 위치한 곡우 농장에서 황칠 나무(Dendropanax morbifera)의 잎을 수거한 후 건조시켰다. 건조된 잎들을 상온에서 메탄올로 추출하였다. 메탄올을 이용한 황칠나무 추출물을 Whatman No. 1 filter paper로 여과하고 회전식 증발농축기로 진공에서 농축시켰다. 이후 메탄올 추출물을 물로 현탁시킨 다음, n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 극성에 따라 순차적으로 분획하였다. 각 용매를 이용하여 황칠나무 추출물을 수득한 공정 및 각 용매 분획에 따른 수율은 도 1에 나타내었다.

<2> 세포배양

정상 인간 각질세포주인 HS27세포는 10 % 열불활성 소태아 혈청(FBS)과 100 ㎍/㎖ 항생제가 함유된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s media)를 이용하여 5% 이산화탄소 및 37℃의 온도에서 배양하였다. 이들 세포들은 단층 배양이 유지되도록 하였고, 배양된 세포들이 포화가 되면 서브 배양을 수행하였다.

<3> 실시간 정량 PCR

총 RNA는 자동핵산 추출시스템인 MFX-2100 (Toyobo, Osaka, Japan)의 MagExtractor^®을 이용하여 제품 사양에 의한 방법으로 수득하였다. 이후 RNA (1 ㎍)을 200 units의 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(Invitrogen, USA) 및 oligo (dT) 프라이머를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 수행하였다. 실시간 PCR은 Taqman Master Mix (Roche)의 Light Cycler 2.0 기기(Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 수행하였는데, 4 μl의 5배 희석된 cDNA,10 pmol의 각 프라이머 및 프로브, 4 μl의 Master Mix 함유 버퍼, dNTPs, MgCl₂ 및 Tag polymerase가 함유된 총 20 μl의 반응액으로 수행하였고, 데이터 분석은 Light Cycler software version 4.0 (Roche)을 이용하여 분석하였다.

총 세포질 RNA는 TRI 시약(RNAiso Plus, Takara, Japan)을 이용하여 추출하였고, 추출된 RNA는 reverse transcriptionPCR (Invitrogen, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 상기 반응은 4 ㎕의 1:5로 희석한 cDNA, 4 mM MgCl₂, 10 pmol 각 프라이머, 4 ㎕의 Fast Starter Mix 버퍼(dNTPs, SYBR Green dye and Tag polymerase)가 혼합된 반응액을 가지고 수행하였다. 각 샘플 RNAs는 Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(Invitrogen, USA) 및 oligo (dT) 프라이머를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 역전사 반응을 수행하였고 합성된 cDNA는 물을 이용하여 1:5로 희석한 후, 2.5 units의 Taq polymerase (Promega, USA) 및 10 pmol 각 프라이머를 가지고 GeneAmp PCR9600 (Perkin-Elmer-Cetus, USA)기기를 사용하여 증폭시켰다.

상기 본 실험의 PCR 반응에서 사용된 프라이머, 프보르 및 PCR 조건은 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.

<4> 웨스턴블럿

단백질 농도를 Bradford (Schleicher and Wieland, 1978) 분석법에 의해 측정하였다. 표준 곡선을 BSA(bovine serum albumin)의 연속적 희석을 이용하여 준비하고, BioRad 단백질 분석 염색 시약을 수 중 1:4의 비율로 희석하였다. 4 μl의 표준 및 샘플들을 1 mL의 희석된 염색 시약에 첨가하고 흡광도를 595nm에서 측정하였다. 샘플 단백질 농도를 BSA로 준비한 표준곡선으로부터 결정하였다.

세포들은 PBS(phosphate-buffered saline)으로 세척하고 50 mM Tris-Cl (pH 7.4), 250 mM NaCl, 0.5 % Triton X100, 10 % glycerol, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 및 protease inhibitor cocktail(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)을 이용하여 용해시켰다. 세포용해물은 원심분리 후, SDS-PAGE로 전기영동하고 웨스턴 블럿을 수행하였다. 세포내 단백질들이 부착되어 있는 막(membrane)은 α-SMA (ACAM, USA), CTGF (ABCAM, USA), FN-EDA (Santa Cruz, USA) 및 GAPDH (Santa Cruz, USA)에 대한 1차 rabbit polyclonal 항체들과 1시간 반응시키고, 이후 horseradish peroxidase-conjugated 2차 항체와 상온에서 2시간 반응시킨 다음, ECL 검출키트(Amersham, USA)를 이용하여 분석하였다.

<5> 세포 이동 분석

HS27 세포주를 6-웰 플레이트에 1×10⁵cells/well로 분주하고 플레이트에 세포가 가득 채워질 때까지 배양시켰다. 이후 20 ㎕의 엘로팁으로 스크래치를 내고 PBS 버퍼를 이용하여 플레이트를 세척하여 스크래치에 의해 떨어져 나간 세포를 제거하였다. 이후 50 ㎍의 본 발명에 따른 황칠나무 추출물을 함유한 배지로 세포를 24시간 동안 배양하였고, 세포가 없는 부위로의 세포 이동속도를 확인하였다.

<6> DPPH 활성 소거능 분석

DPPH를 이용하여 라디칼 소거능을 분석하였다. 본 발명의 각 황칠나무 추출물을 메탄올에 다시 용해시켰는데, 3.98 ㎖ 메탄올, 20 ㎕ 각각의 추출물 및 1㎖ DPPH (0.15 mM 농도로 메탄올로 용해)가 함유된 5ml의 반응액을 30분 동안 상온에서 방치한 후, 517nm에서 spectrophotometer(UV-1800, Shimadzu, Japan)를 이용하여 흡광도의 감소 정도를 측정하였다. 각 실험은 3회 반복 수행하였고, IC₅₀ (50 % inhibition of DPPH radicals)은 각 추출물 처리 농도별 라디칼 소거능으로 계산하였다. 이때 양성 대조군으로는 항산화 활성을 갖는 것으로 알려진 Silymarin 및 ascorbic acid을 이용하였다.

<7> DCFH -DA 분석

AML-2/DX100 세포주 및 HS27 세포주 (1 × 10⁵ cells/㎖)를 PBS 버퍼로 현탁시킨 후, 농도별 각각의 시료(황칠나무 추출물)를 세포에 처리하고 30분 동안 반응시켰다. 이후 1 μM DCFH-DA 및 4 mM 과산화수소를 첨가하여 2시간 동안 반응시킨 다음, DCF의 양을 spectrofluometer (Perkinelmer,USA)을 이용하여 485nm 및 530nm에서 측정하였다.

본 발명의 실험에서 분석한 모든 실험결과는 3번 반복 실험하였고, 결과수치는 means ± SE으로 나타내었으며, 통계학적 의미는 paired Student's t test으로 결정하였으며, P values < 0.05를 유의미한 것으로 판단하였다.

< 실시예 1>

TGF - β1에 의한 α- SMA mRNA 과발현에 미치는 황칠나무 추출물의 영향분석

섬유화 과정에서 TGF-β1이 활성화되면 세포 내에서 콜라겐의 생성과 축적이 증가하여 섬유화가 진행되고 조직과 기관의 기능이 상실하게 된다. 또한, 섬유화에 의한 세포 또는 조직이 손상될 때 세포내의 지방과 레티노이드 성분을 잃고 a-SMA(알파 민무늬근육액틴)의 발현이 증가되며 세포의 변화가 초래된다. 따라서 연구자들은 간섬유화 방지를 위한 방법으로 TGF-β1의 발현과 활성을 억제하기 위한 연구가 행해지고 있다.

이에 본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 섬유화 유도에 작용하는 TGF-β1에 의한 a-SMA의 발현에 영향을 미치는지 여부를 분석하였다. 이를 위해 인간 각질세포주인 HS27 세포주 및 인간 간성상세포주인 HHStec(human hepatic stellate cell)에 TGF-β1을 처리한 후, 황칠나무 추출물을 각각 처리한 다음, 세포 내에서 a-SMA의 발현정도를 PCR 및 웨스턴블럿으로 분석하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, TGF-β1 처리 시 HS27 세포주 및 HHStec 세포주 모두에서 현저하게 증가된 a-SMA의 발현정도가 본 발명의 황칠나무 추출물 처리에 의해 효과적으로 억제되는 것으로 나타났으며, 특히 헥산 추출물이 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물 추출물(분획물)에 비해 우수한 억제 효과가 있는 것으로 나타났다.

또한 본 발명자들은 황칠나무의 헥산추출물 처리 농도를 다양하게 하여 HS27 세포주 및 인간 간성상세포주인 HHStec(human hepatic stellate cell)에 처리한 후, TGF-β1에 의해 증가된 a-SMA의 발현정도를 어느 정도 억제하는 효과가 있는지 PCR 및 웨스턴블럿으로 분석하였고, 나아가 TGF-β1 자체의 발현에도 영향을 미치는지 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 2가지 세포주 모두에서 처리 농도 의존적으로 TGF-β1에 의해 증가된 a-SMA의 발현이 현저하게 억제되는 것으로 나타났으며, TGF-β1의 발현도 추출물의 처리 농도 의존적으로 억제되는 것으로 나타났다(도 4 참조).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 전-섬유화 사이토카인인 TGF-β1 및 TGF-β1에 의해 촉진되는 섬유화 관련 인자들의 발현 및 활성을 억제할 수 있음을 알 수 있었고, 특히 황칠나무의 헥산분획물이 가장 강한 항섬유화 활성을 갖는다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

CTGF 및 FN -EDA에 대한 황칠나무 추출물의 영향분석

TGF-β1은 CTGF의 생산, 작용 및 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, CTGF의 과발현은 ECM의 축적을 유발시키고 간성상세포의 증식과 생존 및 콜라겐 생산을 자극하여 간섬유화를 유발하는 것으로 알려져 있다. ECM의 성분들 중에서 FN(fibronectin) 및 이의 다양한 이성질체인 FN-EDA(fibronectin extra domain A)은 상처 치유와 같은 비정상적인 상태에서 생산되며, 이들 역시 TGF-β1에 의해 발현이 증가된다.

이에 본 발명자들은 이러한 CTGF 및 FN-EDA이 황칠나무 추출물 처리 시 TGF-β1에 의한 발현증가가 억제되는 효과가 있는지 확인하기 위해, HS27 세포주 및 인간 간성상세포주인 HHStec(human hepatic stellate cell)에 황칠나무 추출물을 농도별로 처리한 후 세포내에서 CTGF 및 FN-EDA의 발현 정도를 PCR 및 웨스턴블럿으로 분석하였다.

분석 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 황칠나무 추출물은 TGF-β1에 의한 CTGF 및 FN-EDA 발현증가를 효과적으로 억제하는 활성이 있는 것으로 나타났으며, 특히 헥산추출물의 경우 HS27 세포주에서 CTGF의 억제효과는 2ug/ml의 농도에서 5배 억제를 나타냈고, 10ug/ml의 농도에서는 7배, 50ug/ml의 농도에서는 14배의 억제 효과를 나타냈으며, HHStec 세포주에서는 2ug/ml 농도에서 9배의 억제 효과를, 10ug/ml 농도에서 18배의 억제 효과를 보이는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명의 황칠나무 헥산추출물은 HS27 및 HHStec 세포주에 FN-EDA를 모두 효과적으로 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

콜라겐 발현에 미치는 황칠나무 추출물의 영향분석

TGF-β1은 ECM 행성을 위한 주요 자극제로 알려져 있고, TGF-β1 siRNA 으로 TGF-β1의 발현을 억제할 경우, 섬유세포의 활성을 억제하고 간에서는 콜라겐의 축적과 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 콜라겐 IA1 및 3A의 발현을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, HS27 세포주 및 HHStec 세포주에 대해 TGF-β1 및 각 농도별 황칠나무 추출물을 처리하고 세포 내에서 발현되는 콜라겐 타입I 및 타입3의 mRNA 발현양을 분석하였으며, 또한 생성된 콜라겐의 양을 분석하였다.

그 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 황칠나무 헥산 추출물은 처리 농도 의존적으로 콜라겐 타입I 및 타입3의 발현을 모두 효과적으로 억제할 수 있는 것으로 나타났고, TGF-β1에 의해 유도되는 용해성 콜라겐의 생성 및 분비도 억제하는 것으로 나타났다.

< 실시예 4>

세포 이동에 미치는 황칠나무 추출물의 영향분석

본 발명의 황칠나무 추출물이 세포이동에 영향을 주는지 확인하기 위해, 상기 기술된 세포 이동 분석에 따라 실험을 수행하였다.

분석 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 황칠나무 추출물은 스크래치에 의한 상처를 세포 이동을 통해 회복되어지는 것으로 나타났으며, 헥산추출물 50ug/ml 농도 처리 시 약 50%정도 회복력을 보이는 것으로 나타났다.

< 실시예 5>

황칠나무 추출물의 간섬유화 초기 발생 억제효과

반응성 활성산소종(ROS)은 간의 커퍼세포(kupffer cell)로부터 전-섬유화 사이토카인의 생성을 자극할 뿐만 아니라 간성상세포의 활성화를 통한 섬유증을 초기 유발시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 항산화 활성은 간 섬유증의 초기유발과 진행을 억제할 수 있다.

이에 본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 ROS를 억제하는 기능이 있는지 확인하기 위해 항산화 활성여부 실험을 상기 기술된 <6> DPPH 활성 소거능 분석 및 <7> DCFH-DA 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 황칠나무 추출물은 우수한 항산화 활성을 갖는 것으로 나타났고, 특히 에틸아세테이트 분획물과 부탄올 분획물은 매우 강한 DPPH 소거능을 가지는 것으로 확인되었으며, 에틸아세테이트 분획물은 가장 강력한 DCFH-DA 소거능을 보였으며, 이러한 소거능은 비타민 C와 Silymarin에 비해 월등히 우수한 것으로 나타났다. Silymarin은 알콜성 간질환, 간강화, 간독성과 같은 간질환의 치료제로 알려져 있으며, 항산화, 항섬유, 항염증 및 간재생 효과를 갖는 것으로 알려져 있는데, 본 발명의 황칠나무 추출물은 이러한 Silymarin 보다 더 우수한 항산화 활성을 나타내고 있어, 기존 약물에 비해 더 월등한 간섬유증 예방, 치료 및 개선 효과가 있을 수 있다.

< 실시예 6>

황칠나무 추출물의 섬유화 관련 인자들의 발현에 미치는 영향분석

<6-1> 인간진피 섬유아세포(HS27)에서 MMP1 , MMP2 , MMP9 , TNF -a, TIMP1의 발현에 미치는 황칠나무 추출물의 영향분석

HS27 세포주에 TGF-β1을 처리한 후, 본 발명의 황칠나무 추출물을 처리한 다음, 상기 세포주에서 발현되는 MMP1, MMP2, MMP9, TNF-a, TIMP1의 발현양을 RT-PCR을 통해 분석하였는데, 이때 MMP2 및 MMP9는 자이모그래피 분석을 수행하여 분석하였다.

상기 MMP1은 TGF-β1의 타겟 유전자로서 TGF-β1에 의해 하향 조절되는 인자로서 간섬유증 치료제 타겟이 되는 분자로 알려져 있다. TNF-a는 섬유화조직의 resolution에 관여하여 세포사멸을 초래하는 인자로 알려져 있으며 TGF-β1에 의해 발현이 억제되는 것으로 알려져 있다. 따라서 이들 인자의 발현 및 활성을 촉진시키게 되면 TGF-β1에 의한 섬유화 진행을 억제할 수 있다. 간성상세포의 활성화에 영향을 주는 TIMP1의 발현을 억제할 경우, 간섬유화 진행을 억제할 수 있어, 본 발명의 황칠나무 추출물의 TIMP1 발현에 미치는 영향도 분석하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 본 발명의 황칠나무 헥산분획 추출물은 TGF-β1에 의해 발현이 감소된 MMP1 및 TNF-a의 발현을 증가시키는 작용이 있는 것으로 나타났고, TGF-β1에 의해 발현이 증가된 TIMP1은 억제하는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명자들은 섬유화 촉진인자인 MMP2 및 MMP9의 발현에 대한 황칠추출물의 활성을 분석한 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 TGF-β1에 의해 발현이 증가된 MMP2 및 MMP9을 농도 의존적으로 발현 억제시키는 것으로 나타났다.

<6-2> 인간 간성상세포(HHstec)에서 MMP1 및 MMP2의 발현에 미치는 황칠나무 추출물의 영향분석

상기 <6-1>의 실험에서 실험대상 세포주를 인간 간성상세포(HHsteC)로 하였고 분석실험을 동일하게 수행하였다.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, MMP1의 발현은 본 발명의 황칠나무 헥산분획 추출물의 처리 농도 의존적으로 발현이 증가하는 것으로 나타났고, 발현 증가 정도는 양성대조군인 Silymarin 처리 군에 비해 더 우수한 것으로 나타났다. 또한, MMP2 발현 분석에서는 본 발명의 황칠나무 헥산분획 추출물 처리군이 TGF-β1에 의해 증가된 MMP2의 발현을 억제하는 것으로 나타났으며, 특히 10ug/ml 농도 처리 시 가장 효과적인 억제율을 보였다.

이러한 결과를 통해, 본 발명자들은 본 발명의 황칠나무 추출물이 섬유화에 관여된 인자들의 발현 및 활성을 조절하여 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 황칠나무의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 사용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 극성용매 가용추출물은 물, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매를 사용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 비극성용매 가용 추출물은 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트를 사용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 TGF-β1 신호전달 경로를 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 섬유화 질환은 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 경피증, 골격근 섬유증 및 당뇨성 섬유증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는, 섬유화 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품.
제8항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트으로 이루어진 군 중에서 선택되는 용매를 사용하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 건강기능성 식품.
제8항에 있어서,
상기 섬유화 질환은 간 섬유증, 폐 섬유증, 심장 섬유증, 경피증, 골격근 섬유증 및 당뇨성 섬유증으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 건강기능성 식품.