KR20210108748A - 황칠 추출물을 포함하는 고요산혈증 개선용 조성물 - Google Patents
황칠 추출물을 포함하는 고요산혈증 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물로, 보다 구체적으로는 고요산혈증의 예방, 개선 및/또는 치료 효과를 갖는 의학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 기존 제품의 한계를 극복하고 크산틴 산화효소 저해 활성과 요산 배출 효과 2가지를 동시에 가지고 있는 새로운 차원의 천연소재 고요산혈증 개선용 기술을 얻을 수 있다.
또한, 국내고유 자원에 대한 약리효능, 활성성분의 분리정제, 안전성, 독성 연구 등 현대과학적 연구를 체계적으로 수행함으로써 인삼의 경우와 같이 우리나라 자생 생물자원을 국제적 유명 브랜드로 발전시킬 수 있는 기틀을 확보할 수 있다.
또한, 황칠추출물을 활용한 천연물의약소재, 및 건강기능식품으로의 활용도 등 다양한 산업분야로 활용범위를 확대할 수 있다.
본 발명에 의하면, 기존 제품의 한계를 극복하고 크산틴 산화효소 저해 활성과 요산 배출 효과 2가지를 동시에 가지고 있는 새로운 차원의 천연소재 고요산혈증 개선용 기술을 얻을 수 있다.
또한, 국내고유 자원에 대한 약리효능, 활성성분의 분리정제, 안전성, 독성 연구 등 현대과학적 연구를 체계적으로 수행함으로써 인삼의 경우와 같이 우리나라 자생 생물자원을 국제적 유명 브랜드로 발전시킬 수 있는 기틀을 확보할 수 있다.
또한, 황칠추출물을 활용한 천연물의약소재, 및 건강기능식품으로의 활용도 등 다양한 산업분야로 활용범위를 확대할 수 있다.
Description
본 발명은 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물로, 보다 구체적으로는 고요산혈증의 예방, 개선 및/또는 치료 효과를 갖는 의학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
요산(C5H4N4O3)은 생체내 퓨린 대사과정 중 하이포크산틴(hypoxanthine; C5H4N4O) 또는 크산틴으로부터 크산틴 산화효소(xanthine oxidase) 또는 크산틴 탈수효소(xanthine dehydrogenase)에 의해 생성되는 것으로서, 혈중 요산의 70% 가량은 세포의 턴오버(turn-over)에 따른 내인성 퓨린 대사에 의해 만들어지고, 30%는 음식으로 섭취된 퓨린으로부터 형성되어 대부분 신장을 통해 배설된다.
이러한 요산의 형성이 증가되거나 배설이 감소되는 상황에서는 혈중 요산 농도가 증가하게 되는데, 남성에서는 7.0 mg/dL 이상, 여성에서는 6.5 mg/dL 이상의 경우를 고요산혈증으로 정의한다. 요산 농도의 증가는 요산 결정(urate crystal)이 관절막에 침착되면서 염증반응을 유발하는 통풍(gout)의 원인이 되는 것으로 알려져 있으며, 최근 요산과 신장병, 고혈압을 포함한 심혈관계 질환 그리고 대사증후군 및 당뇨병의 발생/악화 사이의 연관에 대한 흥미로운 역학 또는 임상 연구가 발표되고 있다.
한편, 고요산혈증인 사람에게서 발생하는 대표적인 질환인 통풍은 여러 요인에 의해 생성된 요산 결정을 면역반응에 의해 백혈구가 탐식하면서 관절과 관절 주위 조직에 재발성 발작성 관절염을 일으키고, 요산의 과잉이 지속되는 경우에는 축적된 요산결절에 의해서 관절의 장애를 일으키는 만성 전신성 대사성 질환이다. 정리하자면, 퓨린 분해 과정 중 요산의 형성이 일어나는데 요산이 과잉생성되면 통풍의 원인으로 작용하게 된다.
통풍은 임상적으로는 급성 통풍 발작, 만성 관절염, 통풍 결절 등을 발생시키하며, 요산 요석, 만성 신장병증 등의 다양한 질환의 원인으로도 작용한다. 최근 고령화와 식생활의 서구화로 비만, 신장질환, 고혈압 증가 및 티아자이드(thiazide) 등의 이뇨제와 아스피린 사용 증가 등으로 고요산혈증 및 이로 인한 통풍의 발생률이 급속도로 증가하고 있다. 따라서 통풍환자는 대개 비만, 당뇨, 고혈압, 고지혈증, 대사성 증후군 등의 만성 질환을 동반하는 경우가 많으며 특히 심혈관 질환의 위험성이 높은 것으로 알려져 있다.
이러한 통풍은 관절의 윤활액이나 조직에서 다형핵백혈구에 탐식되어 있거나 조직에 축적되어 있는 요산 결정의 존재로 진단할 수 있으며 최근에는 이중에너지 전산화 단층촬영, 초음파 등을 진단에 이용하여 진단율이 향상되고 있다. 국내 통풍진료기록을 살펴보면 남성의 비율이 여성의 10배이며, 30대에서는 21배에 달하는 것으로 보고되고 있다.
또한, 요산의 과다는 요로결석(신장결석, 요관결석)을 일으킬 수도 있다. 요로결석은 소화 과정 중 요산 또는 칼슘 등의 여러 물질이 소변으로 적절히 배출되지 않고 콩팥 따위에 묵혀져 있다가 크게 결정화되어 장애증상이 나타나는 질환을 말하며, 일반적으로 요관이 길고 가늘어서 가장 빈번하게 막히므로 대부분은 요관결석이다. 고요산혈증에 의한 신장 질환은 신석증과 만성 요산 신장병증으로 나뉘며, 요산에 의한 신석증은 전체 요석증의 5~10%를 차지한다. 요산 요석의 80%는 요산결정만으로 구성되며 나머지는 요산결정 핵에 칼슘 옥살레이트나 칼슘 포스페이트가 더해져서 요석을 이룬다.
이러한 고요산혈증을 개선 또는 치료하기 위한 치료제로서는, 크산틴 산화효소 억제제(xanthine oxidase inhibitors), 요산 배설 촉진제(Uricosuric agents), 및 요산 분해제(Uricolytic drugs, urozyme) 등이 있다.
크산틴 산화효소 억제제는 요산 합성을 억제하는 것으로서, 이를 사용할 경우 요산 대사가 억제되고 혈중 요산 농도가 감소되어 고요산혈증 및 통풍을 치료할 수 있다. 요산 배설 촉진제는 신장의 근위세뇨관에 작용하여 요산의 재흡수를 억제함으로써 소변으로의 배설을 촉진하는 기능을 한다. 요산 분해제는 요산을 알라토닌(allantoin)으로 산화시키는 효소이고, 알라토닌은 요산에 비해 용해도가 높아 신장으로 배설되기 용이하다.
상술한 고요산혈증을 치료하기 위한 종래 기술에서는, 크산틴 산화효소 저해 활성과 요산배출 효과가 분리되어 있다. 혈중 요산수치를 낮추는 기전으로 작용하는 통풍 치료제의 하나인 페북소스타트(febuxostat)는 사망 위험이 논란이 되고 있다. 이에 따라, 부작용 없는 요산배출형 제품개발이 시급한 상황이다.
구체적으로는, 기존 제품의 한계를 극복하고 크산틴 산화효소 저해 활성과 요산 배출 효과 2가지를 동시에 가지고 있는 새로운 차원의 천연소재 고요산혈증 개선용 기술의 개발이 시급히 요구되고 있다.
또한, 요산 생성과정에 다량의 반응성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 형성되면서 염증과 조직손상을 초래하므로, 항산화 효능을 갖는 성분이 고요산혈증 환자의 증상과 치료에 도움이 되므로, 이러한 성분을 포함하는 제품의 개발이 유효하다.
상기한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 황칠나무 추출물을 포함하는 고요산혈증 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 크산틴 산화효소 저해 활성과 요산배출 기능을 동시에 수행할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 항산화 활성을 수행할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 고요산혈증에 의해 유래되는 통풍, 요로결석 및 신장질환의 예방, 개선 및/또는 치료 기능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 기능성 식품 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 물, 또는 물과 알코올의 혼합물에 의해 추출된 것일 수 있다.
본 발명에 의하면, 기존 제품의 한계를 극복하고 크산틴 산화효소 저해 활성과 요산 배출 효과 2가지를 동시에 가지고 있는 새로운 차원의 천연소재 고요산혈증 개선용 기술을 얻을 수 있다.
또한, 국내고유 자원에 대한 약리효능, 활성성분의 분리정제, 안전성, 독성 연구 등 현대과학적 연구를 체계적으로 수행함으로써 인삼의 경우와 같이 우리나라 자생 생물자원을 국제적 유명 브랜드로 발전시킬 수 있는 기틀을 확보할 수 있다.
또한, 황칠추출물을 활용한 천연물의약소재, 및 건강기능식품으로의 활용도 등 다양한 산업분야로 활용범위를 확대할 수 있다.
도 1은 황칠 추출물의 크산틴 산화효소(XO) 저해활성을 살펴본 결과 그래프이다. CGA는 지표성분 중 하나인 chlorogenic acid이다.
도 2은 동물실험에서 혈청 내 요산치 측정결과이다.
도 3은 동물실험에서 간 내 크산틴 산화효소(XO) 활성 측졍결과이다.
도 2은 동물실험에서 혈청 내 요산치 측정결과이다.
도 3은 동물실험에서 간 내 크산틴 산화효소(XO) 활성 측졍결과이다.
이하, 본원의 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 “상에”또는 “전에” 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우 뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.
본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “~ (하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
황칠나무(Dengropanas morbifera)는 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 상록활엽수림이며, 전남 서남해안 및 도서지방에서만 자생 및 재배되는 난대성 수종이다. 황칠의 수지는 황금색이고 내열, 내구, 내수성이 강하며 부착성 및 광택이 좋아 예로부터 전통공예품에 천연도료 및 민간 의약품 소재로 쓰여지고 있다. 또한, 황칠은 세스퀴테르펜 등의 정유 성분 뿐만 아니라, 아라키딕산, 팔미틱산, 아르기닌 등 다양한 성분을 함유하고 있으며, 동맥경화, 간기능 개선, 항산화 뼈 재생 촉진, 면역 증강, 항균, 항암 등의 효과가 보고되고 있다. 황칠은 식품의약품안전처의 식품공전에 식용가능 소재(잎, 줄기, 뿌리)로 등재되어 있어 산업적 활용에 제한이 없다.
황칠은 한국의 고유 수종이면서 한의서와 현대의학에서 혈행 개선(항동맥경화 효능), 간기능 개선, 경조직(뼈와 치아) 재생 효능, 항당뇨 효능, 항고혈압 효능, 항암 효능, 항산화효능, 피부조직 재생, 면역력 증진, 신경안정 효능, 항균활성 등이 밝혀져 고부가가치 식품 신소재로 적합하다. 그러나, 황칠에 대한 성분연구는 주로 도료로 사용하는 황칠 수액에 함유된 2개의 환 구조를 갖는 sesquiterpene에 속하는 β-selinene과capnellane-8-one 등의 정유 및 fatty acid 성분의 분석에 집중되어 있으며, 잎, 줄기, 껍질 등에 함유된 성분의 약리 효능 또는 기능성과의 관련성 혹은 유효성분의 측면에서 연구가 미비한 상태이다.
본 발명에서는 이러한 황칠나무 유래의 성분을 이용하는 고요산혈증 개선을 위한 조성물을 제공하는 것을 특징적인 기술로 하고 있다. 본 발명자들은 황칠나무 추출물이 크산틴 산화효소에 대한 저해작용, 및 항산화 효능을 확인하였고, 간이 임상시험을 통해 황칠나무 추출물의 혈중 요산수치 감소효과도 확인하였다. 또한, 동물모델을 이용하여 혈중 요산농도를 저하시키는 효과도 확인되었다. 이에 따라, 본 발명에서는 황칠나무 추출물의 크산틴 산화효소 저해효과, 요산 배출효과, 및 항산화 효과를 갖는 약학적 및/또는 기능 식품성 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 고요산혈증 개선용 조성물은 황칠의 나무 및 황칠의 잎 추출물(이하, ‘황칠 추출물’이라고도 함)을 포함할 수 있다. 본 발명에서 황칠의 나무는 황칠 나무의 껍질 등을 의미할 수 있다. 상기 황칠나무는 생 황칠나무의 잎 및/또는 줄기로서 그대로 이용할 수도 있으나, 황칠나무의 잎 및/또는 줄기를 건조한 건조 생약의 형태로 이용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 황칠의 나무 및 황칠의 잎 추출물의 용매는 물과 에탄올이 혼합된 혼합용매를 사용한 것일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 혼합용매는 물과 에탄올이 6:4 내지 8:2의 중량비로 혼합된 것일 수 있으며, 바람직하게는 7:3의 비로 혼합된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학제 제제로의 제형화 기준에 의거하여 제형화할 수 있다. 황칠 추출물 또는 황칠액 발효대사체는 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료 목적에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
상기 약학적 조성물은 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및 경비투여제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있으나, 바람직하게는 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다. 대표적으로 경구 투여용 제형으로 제제화시 상기 담체로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 및 항산화제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
상기 담체 및 첨가제는 약학적으로 허용 가능한 것은 모두 가능하며, 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 바람직하다.
또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다.
상기 약학적 조성물은 고요산혈증 개선 효과를 얻기 위해, 유효성분으로서 성인을 기준으로 1 일 총 투여량이 황칠 추출물로서 1 내지 100 g/kg, 황칠나무 생약으로서 0.01 내지 50 g/kg이 되도록 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다. 상기 투여량은 치료 또는 예방하고자 하는 질병의 종류, 질병의 진행 정도, 투여 경로, 성별, 나이, 체중 등에 따라 적절히 증감될 수 있다.
또 다른 일 측면에 있어서, 상기 본 발명에 따른 황칠나무 추출물을 포함한 기능성 식품을 제공한다. 본 발명에서 "기능성 식품" 이란 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미한다.
통상 건강 기능성 식품은 식품학적으로 허용 가능한 담체를 이용하여 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 기능성 식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 기능성 식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑스제 등으로 제조될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 일 실시형태에 따라 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
1. Xanthine oxidase (XO) 저해 활성
황칠 추출물 및 유효성분의 xanthine oxidase 효소의 저해활성 실험은 Stirpe와 Corte Della의 방법에 따라 수행하였다. 농도가 다른 추출물(0.5∼8.0 mg/mL) 0.1 mL와 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6 mL에 2 mM의 xanthine 기질액 0.2 mL를 첨가하여 xanthine oxidase(0.2 uint/mL) 0.1 mL를 가한 다음 37℃에서 15분간 반응시킨 후 1 N HCl 1 mL를 가하여 반응을 중지시킨 후, UV-VIS spectrophotometer(Optizen POP, CM Science, Busan, Korea)를 이용해 290 nm에서 흡광도를 측정해 반응액 중에 생성된 요산의 양을 계산하였다. 양성대조군으로 통증 치료에 이용되는 xanthine oxidase 저해제인 allopurinol을 사용하였으며, xanthine oxidase 저해활성(%)은 다음의 식에 의하여 산출한 후 IC50값으로 나타내었다.
Inhibition effect(%)=[1-(A-B)/C)]×100
(A: Xanthine 용액 (2 mM)에 추출물 시료와 효소액을 첨가하여 반응시킨 후의 흡광도
B: A에서 효소액 대신 증류수 0.1 mL를 첨가하여 반응시킨 후의 흡광도
C: A에서 추출물 시료 대신 증류수 0.1 mL를 첨가하여 반응시킨 후의 흡광도)
황칠나무 추출물 및 유효성분의 XO 저해 활성을 살펴본 결과를 도 1에 나타내었다. 황칠 열수 추출물과 농도별 주정 추출물을 비교한 결과, 주정의 농도가 높아질수록 XO 저해 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 황칠의 보관기간에 따른 XO 저해 활성을 비교해본 결과 채취한지 3개월 이내(New)의 황칠을 이용한 추출물이 채취 후 1년 이상(Old) 경과한 황칠을 이용한 추출물보다 약 2배정도 높은 XO 저해 활성을 보여줌으로써, 보관기간에 따라 활성의 차이가 나타나는 것으로 확인되었다. 황칠 추출물의 지표성분 중 하나인 chlorogenic acid의 XO 저해 활성을 확인해본 결과, 69.07μg/ml의 IC50값을 나타냄으로써 양성대조군인 allopurinol보다는 낮은 활성이었지만 황칠 추출물의 지표성분으로 설정하기에 무리가 없다고 판단되었다.
2. 항산화 효능
2-1. DPPH 소거 효능
DPPH 소거 활성 측정은 항산화 활성을 측정하는데 사용하는 실험이다. 물질의 환원력(항산화력)은, 불포화지방산 라디칼의 모델로 안정한 유리 라디칼인 2,2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl(DPPH)를 사용하여 일정량의 시료 용액과의 반응에 의하여 DPPH 라디칼이 감소되는 정도를 Spectrophotometer로 측정하여 간접적으로 시료의 항산화 능력을 측정한다. 즉 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)는 화학적으로 안정화된 수용성 자유라디칼로서 517nm에서 특징적인 광 흡수를 나타내는 보라색 화합물이며, 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며 항산화활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼(DPPH)이 소멸되어서 처음의 보라색 색깔에서 노란색으로 색깔이 변하게 되어 산화 활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있다. 대조군으로 잘 알려진 vitamin C(ascorbic acid)를 사용하여 비교하였으며, 샘플과 DPPH는 DMSO에 녹인 후, 메탄올에 희석하여 사용하였고, DPPH (100 μM) 90μl 와 샘플 10 μl를 96 웰 배양플레이트에 넣어 37℃ 에서 10 분간 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성능력은 IC50 값으로 나타내었다.
2-2. DCFH-DA 측정법을 이용한 항산화 효능의 측정
DCFH-DA 측정법은 세포내의 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 양이나, 특정 물질의 세포내의 ROS소거능을 측정할 때 쓰는 방법으로 세포투과가 가능한 형광을 내는 탐식자(probe)인 2’7’diacetate (DCFH-DA)를 이용한다. DCFH-DA 는 세포 내로 확산되어 들어가 세포내 esterase에 의해 2’7’(DCFH)로 전환되며 이 물질은 ROS에 의해 형광을 띄는 2’7’(DCF) 로 신속히 바뀌는 원리를 이용하여 세포 내의 항산화 실험을 할 때 사용하였다.
실험에 사용한 세포주는 catalase 활성을 상대적으로 적게 발현하고 있는 백혈병 세포 AML-2 의 doxorubicin 내성 세포주 AML-2/DX100을 사용한다. AML-2/DX100 세포를 1 x 105cells/ml의 세포를 PBS로 2번 세척을 한 후 각 well당 200 ㎕ 분주 하고, 분주한 세포에 농도 별로 시료를 미리 넣고, DCFH-DA가 1 μH202가 4 mM이 되도록 넣어 주어 활성산소를 유발시킨 후, 5% CO2, 37℃배양기에서 30분 반응 후. 형광의 정도를 (excitation 485 nm 및 emission wavelength 530 nm) 측정하였다. DCFH-DA 라디칼 소거능(%)의 표현은 H202에 의해 증가된 형광 값을 100으로 하였을 때 약물에 의해 소거시킨 형광 값을 백분율로 계산하였다.
2-3. 항산화 효능 측정실험 결과
DPPH 라디칼 제거능 IC50 (μg/ml) |
DCFH-DA 라디칼 제거능 (%) | ||
100 μg/ml | 50 μg/ml | ||
황칠 DW | 110 ±3.17 | 83 ±1.0 | 62 ±7.5 |
황칠 30% EtOH | 145 ±10.58 | 88 ±1.9 | 72 ±3.0 |
황칠 50% EtOH | 52 ±0.678 | 88 ±1.8 | 70 ±2.2 |
황칠 70% EtOH | 50 ±2.08 | 67 ±1.8 | 60 ±0.6 |
New 30% EtOH | 45 ±3.51 | 82 ±1.5 | 64 ±1.9 |
Old 30% EtOH | 98 ±6.48 | 78 ±3.2 | 58 ±0.9 |
Vit-C | 5.3 ±0.26 | 84 ±1.6 | 66 ±0.5 |
DW : 열수 추출물
EtOH : 주정 추출물
New : 채취 후 3개월 이내
Old : 채취 후 1년 이상 경과
DPPH 소거 효능과 DCFH-DA 측정법을 이용하여 확인한 황칠 추출물의 항산화 효능을 나타내었다 (표 1).
DPPH 라디칼 소거 효능의 경우 XO 저해 활성의 결과와 비슷한 양상을 보여주며 주정의 함량이 높아질수록, 저장기간이 짧을수록 높은 활성을 보여주는 것으로 확인되었다. 하지만 DCFH-DA 라디칼 제거능에서는 70% 주정 추출물에서 오히려 활성이 낮아지는 것으로 확인되어졌으며, 저장기간이 짧을수록 높은 활성을 보여주는 것은 비슷한 양상인 것으로 확인되었다.
3. 지표물질분석
황칠 추출물의 유효성분 함량을 확인하기 위하여 HPLC-MS/MS를 이용하여 chlorogenic acid (CGA)와 rutin의 함량을 분석한 결과를 나타내었다(표 2).
Chlorogenic acid (CGA)의 함량이 주정의 농도가 올라갈수록 높은 함량을 보여줌으로써 지표물질로 설정한 CGA의 함량이 높아짐으로 인해 XO 저해 활성 및 항산화효능이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 채취한지 3개월 이내(New)의 황칠을 이용한 추출물이 채취 후 1년 이상(Old) 경과한 황칠을 이용한 추출물보다 2배 이상 높은 CGA 함량을 보여줌으로써 황칠을 채취한 후 오랜 기간 저장하면 유용 성분들의 변성 혹은 소실이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 황칠의 유효성분인 rutin의 함량도 CGA 함량과 비슷한 양상을 나타내었다.
Chlorogenic acid 함량 (μg/g) | Rutin 함량 (μg/g) | |
황칠 DW | 6,424 ±208 | 10,391 ±59 |
황칠 30% EtOH | 13,253 ±237 | 16,392 ±218 |
황칠 50% EtOH | 17,419 ±297 | 23,737 ±308 |
황칠 70% EtOH | 21,464 ±119 | 29,524 ±139 |
New 30% EtOH | 14,566 ±375 | 33,963 ±369 |
Old 30% EtOH | 3,7913 ±91 | 8,954 ±44 |
4. 동물실험
시험물질 I: 황칠나무 (잎, 줄기) 30% 에탄올 추출물
시험물질 II: 황칠나무 (잎, 줄기) 열수 추출물
대조물질 I: Probenecid
대조물질 II: Allopurinol
부형제: 멸균주사용수 (Distilled water)
유도물질: Potassium oxonate
4-1. 동물정보
종 및 계통 | 특정병원체 부재(SPF) Sprague Dawley 랫드, Cri:DC(SD) | |
생산자 및 공급원 | 오리엔트바이오 ㈜ (경기도 성남시 중원구 갈마치로 322) | |
선정사유 |
본 시험에 사용하는 SD 랫드는 약효시험에 널리 사용되고 있고, 풍부한 시험기초자료가 축적되어 있으며, 시험결과의 해석 및 평가에 이러한 자료를 이용할 수 있다. | |
성별 | 수컷 | |
동물 수 | 입수 시 | 76 |
투여 시 | 64 | |
주령 | 입수 시 | 5 |
투여 시 | 6 | |
입수 시 체중범위 | 125.14 - 151.88 g | |
투여 시 체중범위 | 210.88 - 248.42 g | |
잔여동물의 처리 | 안락사 |
- 동물은 입수 후 8 일간 시험을 실시하는 동물실내에서 순화시키고, 매일 1 회 이상 일반증상을 관찰하였다.
- 동물은 순화기간에는 적색 유성매직을 이용한 미부표식법을 사용하여 식별하였다. 투여 및 관찰기간에는 흑색 유성매직을 이용한 미부표식법을 사용하여 식별하였다.
- 사육상자에는 색으로 용량을 구별하는 개체식별카드를 부착하고, 사육상자대는 고유번호를 부여하였다.
- 사육실 입구에는 시험식별기록지를 부착하였다.
- 동물실험 윤리규정은 ㈜ 켐온의 실험동물운영위원회에 의해 승인되었다. (심의번호: 2019-10-001)
4-2. 사육환경
- 동물은 온도 23±3℃, 상대습도 55±15%, 환기횟수 10-20 회/hr, 조명시간 12 시간(오전 8 시 점등 - 오후 8 시 소등) 및 조도 150-300 Lux로 유지되는 경기바이오센터 동물사육구역 4 호실에서 사육하였다.
- 온도와 상대습도는 매시간 컴퓨터 시스템을 이용하여 측정하였고, 환기횟수 및 조도는 정기적으로 측정하였다.
- 실험기간 동안 시험 결과에 영향을 줄만한 이상은 없었다.
- 사료는 설치류용 고형사료(Teklad certified irradiated global 18 % protein rodent diet; 2918C; ENVIGO, UK)를 자유섭취 하도록 하였다.
- 물은 자외선 살균기 및 미세여과장치로 소독한 상수도수를 폴리카보네이트제 음수병에 넣고 자유섭취 하도록 하였다. 수질검사는 경기도보건환경연구원 (경기도 수원시 장안구 파장천로 95)에서 수행하였고, 먹는물 수질기준에 적합하였다.
- 깔개는 고압증기멸균 후 사용하였다.
- 오염물질 검사 확인 결과, 해당 시험에 시험 결과에 영향을 줄만한 이상은 없었다.
- 스테인레스제 망 사육상자(W 235 x L 380 x H 175 mm)에서 순화, 투여 및 관찰기간에 4 마리/사육상자로 수용하였다.
- 사육상자 및 물병은 주 1 회 이상 교환하였다.
4-3. 시험군 구성, 투여량 설정, 군분리 및 투여
군 | 성 별 | 동물수 | 동 물 번 호 |
투여량 (mg/kg/day) | 투여액량 (mL/kg/day) | 투여물질 |
G1 | M | 8 | 1-8 | - | 10 | 부형제 |
G2 | M | 8 | 9-16 | - | 10 | 부형제 |
G3 | M | 8 | 17-24 | 50 | 10 | Probenecid |
G4 | M | 8 | 25-32 | 50 | 10 | Allopurinol |
G5 | M | 8 | 33-40 | 50 | 10 | |
G6 | M | 8 | 41-48 | 100 | 10 | 황칠나무 (잎, 줄기) 30% 에탄올 추출물 |
G7 | M | 8 | 49-56 | 200 | 10 | |
G8 | M | 8 | 57-64 | 200 | 10 | 황칠나무 (잎, 줄기) 열수 추출물 |
G1: 정상군 (Distilled water, n=8)
G2: 부형제 대조군 (Distilled water, n=8)
G3: 대조물질 I 투여군 (Probenecid, 50 mg/kg, n=8)
G4: 대조물질 II 투여군 (Allopurinol, 50 mg/kg, n=8)
G5: 시험물질 I 투여군 (DM30EE, 50 mg/kg, n=7)
G6: 시험물질 I 투여군 (DM30EE, 100 mg/kg, n=7 or 8)
G7: 시험물질 I 투여군 (DM30EE, 200 mg/kg, n=8)
G8: 시험물질 II 투여군 (DMWE, 200 mg/kg, n=7 or 8)
G2-G8: 고요산혈증 유발군,
- 시험물질의 투여량은 시험의뢰자 측에서 제공한 정보를 바탕으로 설정하였다.
- 동물의 군분리는 다음과 같이 실시하였다. 평균체중에 가까운 동물들을 필요한 수만큼 선택하여 순위화한 체중에 따라 각 군의 평균체중이 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하여 '시험군 구성'표에 지정된 수가 되도록 하였다.
- 투여 프로파일은 아래와 같다.
투여경로 및 선택이유 | 경구투여, 임상예정경로를 적용하였다. |
투여횟수 및 기간 | 1 회/일, 7 일간 투여하며, 유발물질을 투여하는 날은 유발물질 투여 1 시간 뒤에 투여를 실시하였다. |
투여액량 산출 | 최근 측정한 체중을 기준으로 10 mL/kg으로 산출하였다. |
투여방법 | 동물의 경배부를 고정하고 존데를 장착한 주사기를 이용하여 위 내에 직접 투여하였다. |
4-4. 관찰 및 검사
- 투여 및 관찰기간 동안 사망여부, 일반증상의 종류, 발현일 및 증상의 정도를 1 일 1 회 관찰하고, 개체별로 기록하였다.
- 체중은 입수 시, 군분리 투여개시일 및 계획부검일에 측정하였다.
- Potassium oxonate (0.5 % sodium carboxymethylcellulose with 0.1 M sodium acetate pH 5) 250 mg/kg를 Day 1, 3, 5 및 7에 복강 내 투여하여 고요산혈증을 유발시켰다.
4-5. 부검 및 측정 항목
- Day 7에 Potassium oxonate 투여 1 시간 후 시험물질을 투여하고 동물을 대사케이지로 옮겼다.
- 시험물질 투여 후 2 시간 동안 소변을 수집하고 부검을 실시하였다.
- 후대정맥에서 채혈을 실시하였다.
- Saline으로 관류를 실시하여 간을 적출하였다.
- 간 조직과 혈청은 분석 실시 전까지 deep freezer에 보관하였다.
- Uric acid의 측정은 혈청 및 소변으로 kit (Bio Vision, K608)를 이용하여 실시하였다.
- Xanthine oxidase 저해 활성 측정은 부검 시 적출한 간 조직 및 혈청으로 kit (Sigma-Aldrich, MAK078)를 이용하여 측정을 실시하였다.
4-6. 통계 분석
측정결과는 SPSS Statistics 12.0K for Medical Science를 사용하여 분석하였으며, 정상군(G1), 대조물질 투여군(G3-G4) 및 시험물질 투여군(G5-G8)은 부형제 대조군(G2)과의 유의성을 검정하였다. 시험물질 I 투여군(G5-G7)은 ONE-WAY ANOVA를 이용하여 유의성을 검정하였고, 대조물질 투여군(G3-G4) 및 시험물질 II 투여군(G8)은 Student’t-test를 이용하여 유의성을 검정하였다. P<0.05인 경우 통계학적으로 유의하다고 판정하였다.
4-7. 동물실험 결과
i) 일반증상
시험물질에 의한 이상 증상 및 사망은 관찰되지 않았다.
ii) 요산 측정 결과
혈청 요산(uric acid) 측정 결과, 부형제 대조군(G2)은 정상군(G1)과 비교하여 통계학적으로 유의한 uric acid 증가가 관찰되었다(P<0.01). 황칠나무(잎, 줄기) 30% 에탄올 추출물 50, 100 및 200 mg/kg 투여군(G5-G7)은 부형제 대조군(G2)과 비교하여 각각 15.30 %, 17.68 %, 21.71 % 의 혈청 uric acid의 감소가 관찰되었고, 황칠나무(잎, 줄기) 열수 추출물 200 mg/kg 투여군(G8)은 부형제 대조군(G2)과 비교하여 통계학적으로 유의한 26.92 %의 혈청 uric acid 감소가 관찰되었다(P<0.05). Probenecid 50 mg/kg 투여군(G3)은 부형제 대조군(G2)과 비교하여 혈청 uric acid의 변화는 보이지 않았으나, Allopurinol 50 mg/kg 투여군(G4)은 통계학적으로 유의한 혈청 uric acid 감소가 관찰되었다(P<0.01).
소변 uric acid 측정 결과, 부형제 대조군(G2)은 정상군(G1)에 비해 통계학적으로 유의한 소변 uric acid 감소가 관찰되었다(P<0.05). 황칠나무(잎, 줄기) 30% 에탄올 추출물 및 황칠나무(잎, 줄기) 열수 추출물 투여군(G5-G8)은 모두 부형제 대조군(G2)과 비교하여 통계학적으로 유의한 변화는 관찰되지 않았으나 소변 uric acid가 감소되는 경향을 보였다. Probenecid 50 mg/kg 투여군(G3)은 부형제 대조군(G2)과 비교하여 소변 uric acid의 통계학적으로 유의한 차이는 보이지 않았으나 감소 경향을 보였고, Allopurinol 50 mg/kg 투여군(G4)은 통계학적으로 유의한 소변 uric acid 감소가 관찰되었다(P<0.05).
측정 결과는 도 2에 나타내었다.
GROUPS | URIC ACID LEVELS (MALE) | |
SERUM (mg/dL) | URINE (mg/dL) | |
G1 | 1.99±0.14 | 8.82±1.21 |
G2 | 3.87±0.36++ | 4.60±1.41+ |
G3 | 4.24±0.22 | 2.10±0.47 |
G4 | 0.52±0.08** | 0.89±0.14* |
G5 | 3.28±0.12 | 1.47±0.26 |
G6 | 3.19±0.21 | 1.20±0.23 |
G7 | 3.03±0.23 | 2.29±0.63 |
G8 | 2.83±0.22* | 1.44±0.33 |
실험 결과는 [평균±표준편차] 형식으로 표시하였다. 통계 분석은 Box-plot, ONE-WAY ANOVA 및 Student's t-test로 실시하였다.
+: G1과 매우 큰 차이, P<0.05
++: G1과 매우 큰 차이, P<0.01
*: G2와 매우 큰 차이, P<0.05
**: G2와 매우 큰 차이, P<0.01
ii) 크산틴 산화효소 활성(Xanthine oxidase activity) 측정 결과
혈청 xanthine oxidase activity 측정 결과, 부형제 대조군(G2)은 정상군(G1)과 비교하여 통계학적으로 유의한 변화는 없었다. 황칠나무(잎, 줄기) 30% 에탄올 추출물 및 황칠나무(잎, 줄기) 열수 추출물 투여군(G5-G8)은 부형제 대조군(G2)과 비교하여 통계학적으로 유의한 혈청 xanthine oxidase activity 변화는 관찰되지 않았다. Probenecid 50 mg/kg 투여군(G3)은 부형제 대조군(G2)과 비교하여 통계학적으로 유의한 혈청 xanthine oxidase activity의 변화는 보이지 않았으나, Allopurinol 50 mg/kg 투여군(G4)은 통계학적으로 유의한 혈청 xanthine oxidase activity 감소가 관찰되었다(P<0.01).
간 내 xanthine oxidase activity 측정 결과, 부형제 대조군(G2)은 정상군(G1)과 비교하여 통계학적으로 유의한 변화는 없었다. 황칠나무(잎, 줄기) 30% 에탄올 추출물 200 mg/kg 및 황칠나무(잎, 줄기) 열수 추출물 200 mg/kg 투여군(G7, G8)은 부형제 대조군(G2)과 비교하여 통계학적으로 유의한 간 내 xanthine oxidase activity 감소가 관찰되었다(P<0.05 or P<0.01). Probenecid 50 mg/kg 투여군(G3)은 부형제 대조군(G2)과 비교하여 소변 uric acid의 통계학적으로 유의한 변화는 보이지 않았으나, Allopurinol 50 mg/kg 투여군(G4)은 통계학적으로 유의한 간 내 xanthine oxidase activity 감소가 관찰되었다(P<0.01).
측정 결과는 도 3에 나타내었다.
GROUPS | XANTHINE OXIDASE ACTIVITIES(MALE) | |
SERUM (mU/mL) | LIVER (mU/mg protein) | |
G1 | 1.04±0.03 | 0.048±0.003 |
G2 | 0.96±0.02 | 0.046±0.002 |
G3 | 0.94±0.02 | 0.046±0.002 |
G4 | 0.35±0.00** | 0.023±0.001** |
G5 | 0.99±0.02 | 0.043±0.001 |
G6 | 0.93±0.02 | 0.042±0.002 |
G7 | 0.94±0.03 | 0.037±0.002* |
G8 | 0.96±0.01 | 0.035±0.003** |
실험 결과는 [평균±표준편차] 형식으로 표시하였다. 통계 분석은 Box-plot, ONE-WAY ANOVA 및 Student's t-test로 실시하였다.
*: G2와 매우 큰 차이, P<0.05
**: G2와 매우 큰 차이, P<0.01
5. 간이 임상시험
간이 임상시험에서 황칠나무 추출물을 복용하였을 때 혈청에서의 요산수치를 확인한 결과 황칠나무 추출물을 섭취한 기간이 2개월 미만일 경우에는 요산수치의 변화가 없거나, 오히려 초기보다 높아지는 경향을 보여주었다. 하지만 3개월이 경과한 이후에는 초기보다 요산수치가 낮아지는 경향을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 미루어보아 황칠 추출물을 이용하여 통풍에 대한 치료효과를 확인하기 위해서는 3개월 이상의 장기복용이 필요할 것으로 판단되어진다.
초기 요산수치와 3개월 경과 후 요산수치의 변화율을 확인한 결과, -33.33 ~ 33.33의 변화율을 보여주었으며, 평균을 확인한 결과 15.75%로 황칠나무 추출물을 복용함으로써 요산수치가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
초기 | 1개월 경과 | 2개월 경과 | 3개월 경과 | 변화율 (초기-3개월) |
|
이*성 | 5.7 | 8 | 6.1 | 7.6 | -33.33 |
신*숙 | 6.9 | 7 | 6 | 5.9 | 14.49 |
신*솔 | 8.8 | 8.3 | 9.9 | 7.2 | 18.18 |
손*열 | 6 | 6.4 | 5.6 | 4.5 | 25.00 |
손*곤 | 6.8 | 8.3 | 5.7 | 5.6 | 17.65 |
박*호 | 7.4 | 8.5 | 7.4 | 5.8 | 21.62 |
김*용 | 5.4 | 6.2 | 6.5 | 5 | 7.41 |
이*규 | 7.2 | 7.6 | 5.9 | 5.4 | 25.00 |
김*석 | 6 | 6.9 | 3.7 | 4 | 33.33 |
김*욱 | 10.4 | 10.8 | 9.3 | 7.1 | 31.73 |
이*근 | 6.6 | 7.3 | 6.2 | 5.8 | 12.12 |
본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (7)
- 황칠나무 추출물을 포함하는 고요산혈증 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
크산틴 산화효소 저해 활성과 요산배출 기능을 동시에 수행할 수 있는 것을 특징으로 하는 고요산혈증 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물. - 제 1 항에 있어서,
항산화 활성을 수행할 수 있는 것을 특징으로 하는 고요산혈증 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물. - 제 1 항에 있어서,
고요산혈증에 의해 유래되는 통풍, 요로결석 및 신장질환의 예방, 개선 및/또는 치료 기능을 나타내는 것을 특징으로 하는 고요산혈증 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물. - 제 1 항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 물, 또는 물과 알코올의 혼합물에 의해 추출된 것을 특징으로 하는 고요산혈증 예방, 개선 및/또는 치료용 조성물. - 황칠나무 추출물을 포함하는 고요산혈증 개선용 기능성 식품 조성물.
- 제 6 항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 물, 또는 물과 알코올의 혼합물에 의해 추출된 것을 특징으로 하는 고요산혈증 개선용 기능성 식품 조성물.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200023744A KR20210108748A (ko) | 2020-02-26 | 2020-02-26 | 황칠 추출물을 포함하는 고요산혈증 개선용 조성물 |
PCT/KR2020/012420 WO2021172678A1 (ko) | 2020-02-26 | 2020-09-15 | 황칠 추출물을 포함하는 고요산혈증 개선용 조성물 |
CN202080097581.9A CN115135333A (zh) | 2020-02-26 | 2020-09-15 | 包含黄漆提取物的高尿酸血症改善用组合物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020200023744A KR20210108748A (ko) | 2020-02-26 | 2020-02-26 | 황칠 추출물을 포함하는 고요산혈증 개선용 조성물 |
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