KR20160050108A - 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 위생 증진용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 위생 증진용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 홍삼(Panax ginseng C. A. Meyer, 紅蔘), 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer, 甘草), 황련(Coptis japonica Makino, 黃連), 유백피(Ulmus macrocarpa Hance, 楡白皮), 박하(Mentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud, 薄荷), 계피(Cinnamomum cassia Blume, 桂皮), 녹차(Camellia sinensis, 綠茶) 잎의 개별추출물 혹은 이의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 위생 증진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 녹차 잎의 개별 추출물 또는 이들의 혼합추출물은 천연물추출물이 지니는 항염증작용, 항산화작용, 살균효과를 지님으로써 치아 및 잇몸질환을 예방하고 치유할 수 있는 천연물 유래 식, 음료 등 구강관리 제품을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 위생 증진용 조성물 및 이의 용도 {Compositions for Improving Oral Hygiene comprising extracts derived from natural materials and Uses Thereof}

본 발명은 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 위생 증진용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 홍삼(Panax ginseng C. A. Meyer, 紅蔘), 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer, 甘草), 황련(Coptis japonica Makino, 黃連), 유백피(Ulmus macrocarpa Hance, 楡白皮), 박하(Mentha arvensis Linne var. piperascens Malinvaud, 薄荷), 계피(Cinnamomum cassia Blume, 桂皮), 녹차(Camellia sinensis, 綠茶) 잎의 개별추출물 혹은 이들의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 위생 증진용 조성물에 관한 것이다.

구강건강은 오늘날 전신건강의 일부로 여겨지며 그 중요성이 더욱 커지고 있고 영양 섭취와 발음 등에 결정적인 역할을 함으로써 개인의 삶의 질에 밀접한 영향을 미친다. 그러나 아직까지 우리나라 국민의 대다수가 치아우식증과 치주질환을 경험하고, 상당수의 노인들은 이들 질환으로 인해 치아를 상실하는 등 외국의 다른 선진국들에 비하여 구강건강상태가 심각한 상황이며 구강질환으로 인한 국가적 손실이 연 5조원 이상으로 알려져 있어 사회, 국가적으로도 큰 문제가 되고 있다. 즉 현재, 세계에서 유래를 찾기 힘든 급속한 인구 고령화 현상을 겪고 있는 우리나라로서는 구강질환을 효과적으로 관리할 수 있는 방안이 절실할 수밖에 없다.

구강건강을 해치는 대표적인 치아우식증(충치), 풍치, 치은염, 치주염 등 질환의 원인은 다양한 세균에 의한 치면 세균막에 의함이 잘 알려져 있다. 사람의 구강 내에는 500여 종이 넘는 세균이 서식하며 온도와 습도 등 세균이 서식하기 아주 좋은 환경이 바로 구강 속이다. 치면 세균막은 음식을 먹고 난 뒤 치아 표면에 붙어 있는 미세한 음식물의 얇고 끈적끈적한 당단백질의 잔류물에 구강 내 세균들이 달라붙은 세균 덩어리의 막으로, 이것을 플랙(plaque)이라고 한다. 치면 세균막의 세균들은 치아 법랑질을 녹이게 되어 치아가 썩게 되는 치아우식증을 유발하고, 치아와 잇몸 사이의 틈새(치주낭)로 들어가거나 오랜 시간이 지나면 치석이 쌓여 잇몸질환의 원인이 될 수 있다. 치주질환에 의한 염증반응은 다양한 세포와 매개물질, 사이토카인들을 생산하게 함과 동시에 세균들은 혈관을 통해 다른 신체기관에 작용하게 됨으로써 심장질환, 당뇨병, 관절염, 알러지 등 다양한 전신 질환의 원인으로 작용할 수 있다. 이러한 구강질환은 단시간에 발병하기보단 대부분 저절로 낫지 않고 시간이 지나며 쌓여 가는 누진적인 질환이기 때문에 무엇보다 평소 구강질환을 예방하기 위한 습관과 조기 발견, 적절한 치료가 매우 중요하다.

시중에서 판매되고 있는 구강관리 제품들은 화학성분들에 의해 강한 활성을 가진 만큼 부작용이 생길 수 있다. 따라서 부작용이 없이 구강건강을 관리할 수 있는 구강 위생 증진용 제품들이 필요하다. 한약재를 이용한 천연물추출물은 인체에 무해하여 부작용이 없으면서도 약리학적으로 탁월한 효능을 지니고 있기 때문에 이를 이용한 구강건강을 관리할 수 있는 제품들에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다.

한편, 홍삼(紅蔘)은 한약의 일종으로, 인삼(두릅나무과 Araliaceae)의 뿌리를 찐 것이다. 항암효과뿐만 아니라 숙취제거, 노화방지, 항피로, 항스트레스 효과, 혈액순환, 면역기능, 골다공증 예방, 빈혈치료, 남성불임치료효과, 고혈압, 및 당뇨병 개선 등의 효과가 여러 실험을 통해 보고되고 있다.

감초(甘草)는 콩과에 속하는 여러해살이풀로 뿌리 및 뿌리줄기로서 그대로 또는 주피를 제거한 것이다. 생것은 맛이 달고 성질이 평하고, 구운 것은 맛이 달고 성질이 따뜻하며 비, 위, 폐, 심경에 작용한다. 감초는 뿌리와 줄기 밑 부분을 감미제와 위궤양·십이지장궤양의 치료제로 사용하고 다른 약의 작용을 순하게 하므로 한방에서 다양한 용도로 사용하고 있다.

황련(黃連)은 쌍떡잎식물 미나리아재비목 미나리아재비과의 상록 여러해살이풀로, 맛은 쓰고 성질은 차다. 한방에서는 11월경에 재식 5∼6년 된 황련, 왜황련의 뿌리를 채취하여 햇볕에 말린 것을 황련(黃連)이라 하며, 건위, 진정, 소염, 항균 등의 효능이 있어 소화불량, 위염, 장염, 복통, 구토, 이질, 심계(心悸), 번열(煩熱), 정신불안, 인후종통(咽喉腫痛), 토혈, 코피, 하혈, 화상 등의 치료에 처방한다.

유백피(楡白皮)는 왕느릅나무 Ulmus macrocarpa Hance (느릅나무과 Ulmaceae)의 주피를 제거한 수피로, 성질은 평(平)하고 맛이 달며[甘] 독이 없다. 산 속 곳곳에 있으며 음력 2월에 뿌리를 캐서 속껍질만을 벗겨 햇볕에 말려서 쓴다. 주로 소화기 질환과 부인병증을 다스리는데 사용하며, 최근에는 염증성 장 질환에도 효과가 있다고 보고되었다.

박하(薄荷)는 대표적인 허브 식물의 하나로 뿌리줄기를 가진 다년생 식물이다. 박하에는 다량의 멘솔이 함유되어 있어 특유의 향을 내므로 다양한 식, 음료, 담배 등에 이용된다. 한방에서는 박하 잎을 말려, 발한·해열·진통·건위·해독제나 초기 감기, 두통, 인후통, 피부병 등의 광범한 치료에 쓴다.

계피(桂皮)는 녹나무속(Cinnamomum) 중 몇 종의 나무껍질에서 나오는 향신료로, 조미료나 향신료, 생약 등으로 사용한다. 한방에서 계피는 몹시 열이 많이 나고, 달고, 매우며, 독이 조금 있다고 그 성질을 표현한다. 동의보감에서는 계피가 속을 따듯하게 하고, 혈맥을 잘 통하게 하고, 간이나 폐의 기를 고르게 하며, 온갖 약기운을 고루 잘 퍼지게 하면서도 부작용을 나타내지 않고 유산시킬 수 있는 약재로 소개되어 있다.

녹차(綠茶) 잎은 성질이 차고, 카페인, 탄닌, 테아닌, 세키세놀, 비타민 C, 비타민 B1, B2, 나이아신, 펜토텐산, 이노시톨, 루틴 등이 함유되어있다. 한방의 동의보감에서는 녹차에 대해 혈압 강하, 소화를 돕고 갈증을 없애고, 뱃속을 편안하게 하며, 머리와 눈을 맑게 하고, 식중독을 풀어주는 등의 효능이 있다고 소개되어 있다.

본 발명자들은, 부작용없이 구강건강에 도움을 주는 천연물추출물의 효능을 검증하기 위해 항산화, 항염증, 살균력측정 연구를 수행한 결과, 천연물 유래 조성물이 구강건강에 도움을 줄 수 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은, 홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 및 녹차 잎의 개별 추출물 또는 이들의 혼합추출물을 치아 및 구강건강에 효과가 있는 식, 음료품 등 구강 건강 관리제품을 위한 조성물의 유효성분으로 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 및 녹차 잎으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 구강 위생 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예로, 상기 추출물은 물, 탄소 수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현 예로, 상기 추출물은 항산화, 항염증 효능을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 및 녹차 잎으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 구강 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예로, 상기 구강질환은 대장균(E. coli), 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주에 의해 유발되는 질환인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 구강 질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 상기 조성물의 구강 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 녹차 잎의 개별 추출물 또는 이들의 혼합추출물은 천연물추출물이 지니는 항산화작용, 항염증작용, 살균효과를 지님으로써 치아 및 잇몸질환을 예방하고 치유할 수 있는 천연물 유래 식, 음료 등 구강관리 제품을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은, 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에서 고려홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피 및 녹차 잎의 각종 개별 천연물추출물에 의한 세포독성을 알아보기 위하여 MTS assay를 수행한 결과이다.
도 2는, RAW 264.7 세포에서 상기 개별추출물을 다른 비율로 배합한 혼합추출물에 의한 세포독성을 알아보고자 MTS assay를 수행한 결과이다.
도 3은, 7종의 개별추출물에 의한 항산화효과를 확인하기 위하여 DPPH 라디칼 소거활성 측정을 수행하여 전자 공여증을 비교한 결과이다.
도 4는, 각종 혼합추출물에 의한 항산화효과를 확인하기 위하여 DPPH 라디칼 소거활성 측정을 수행하여 전자 공여증을 비교한 결과이다.
도 5는, 7종의 개별추출물에 의한 항산화효과를 확인하기 위하여 대표적 활성산소 중 하나인 Superoxide anions의 소거활성을 비교한 결과이다.
도 6은, 각종 혼합추출물에 의한 항산화효과를 확인하기 위하여 대표적 활성산소 중 하나인 Superoxide anions의 소거활성을 비교한 결과이다.
도 7은, 7종의 개별추출물에 의한 항산화효과를 확인하기 위한 또 다른 활성산소 중 하나인 Nitric oxide (NO)의 소거활성 정도를 비교한 결과이다.
도 8은, 각종 혼합추출물에 의한 항산화효과를 확인하기 위한 또 다른 활성산소 중 하나인 Nitric oxide (NO)의 소거활성 정도를 비교한 결과이다.
도 9는, RAW 264.7 세포에서 개별추출물에 의한 항염증효과를 확인하기 위하여 Nitric Oxide (NO)의 생성량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 10은, RAW 264.7 세포에서 각종 혼합추출물에 의한 항염증효과를 확인하기 위하여 Nitric Oxide (NO)의 생성량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 11은, RAW 264.7 세포에서 개별추출물에 의한 항염증효과를 확인하기 위하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 12는, RAW 264.7 세포에서 혼합추출물에 의한 항염증효과를 확인하기 위하여 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성량에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 13은, 홍삼추출물의 살균력을 측정하기 위해 E. coli와 S. aureus에 대해 초기 세균수에 대한 세균 감소율을 확인한 결과이다.
도 14는, 감초추출물의 살균력을 측정하기 위해 E. coli와 S. aureus에 대해 초기 세균수에 대한 세균 감소율을 확인한 결과이다.
도 15는, 황련추출물의 살균력을 측정하기 위해 E. coli와 S. aureus에 대해 초기 세균수에 대한 세균 감소율을 확인한 결과이다.
도 16은, 유백피추출물의 살균력을 측정하기 위해 E. coli와 S. aureus에 대해 초기 세균수에 대한 세균 감소율을 확인한 결과이다.
도 17은, 박하추출물의 살균력을 측정하기 위해 E. coli와 S. aureus에 대해 초기 세균수에 대한 세균 감소율을 확인한 결과이다.
도 18은, 계피추출물의 살균력을 측정하기 위해 E. coli와 S. aureus에 대해 초기 세균수에 대한 세균 감소율을 확인한 결과이다.
도 19는, 녹차추출물의 살균력을 측정하기 위해 E. coli와 S. aureus에 대해 초기 세균수에 대한 세균 감소율을 확인한 결과이다.

본 발명은 홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 및 녹차 잎으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 위생 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 천연물로부터 추출물을 추출하는 방법은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 본 발명에서, 천연물 추출물은 물, 탄소 수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 또한, 천연물로부터 추출물을 추출하는 방법은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 초음파 추출 등의 다양한 방법을 통하여 추출할 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 혼합추출물을 제조하는 경우, 혼합추출물은 홍삼과 감초 : 황련과 녹차 잎: 박하와 계피 : 유백피를 동량으로 배합하거나, 2:1:1:1, 1:2:1:1, 1:1:2:1, 1:1:1:2, 또는 감초, 유백피, 홍삼 : 박하, 계피, 녹차 잎 : 황련의 10:5:2의 중량비로 배합하는 것이 바람직하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 구강 위생 증진용 조성물은 홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피 및 녹차 잎의 개별추출물, 또는 이들의 혼합추출물을 유효성분으로 포함하여, 자유라디칼 억제 활성, NO 억제 활성, 프로스타글란딘(PGE2) 생성 억제 등의 효능을 나타낼 수 있는바, 구강 위생을 증진시키는 약제 또는 구강건강보조제품인 식, 음료 등에 다양하게 사용될 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 7종의 개별추출물 및 이들의 혼합추출물의 항산화효능을 확인하기 위해 DPPH radical, Superoxide anions, 및 Nitric oxide (NO)의 소거활성 실험을 수행하였다. DPPH radical 소거활성 측정결과, 개별 추출물 중 홍삼, 황련, 박하, 녹차 잎 추출물에서 뛰어난 효능이 관찰되었고, 혼합추출물은 대체로 좋은 효능을 보인 가운데 모든 천연물을 1대1로 배합한 동비율 조합이 가장 좋은 효과를 나타내었다. Superoxide anions 소거활성 실험에서는 개별추출물의 경우 홍삼과 유백피에서 뛰어난 소거능력이 나타났고, 혼합추출물의 경우 감초와 홍삼을 2배로 증량한 보기 조합이 가장 좋은 효과를 나타내었다. NO 소거활성의 경우, 개별추출물 중 홍삼과 박하가 소거능력이 뛰어났고, 혼합추출물의 경우 역시 모든 조합이 뛰어난 효과를 나타내었다 (실시예 3 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 7종의 개별추출물 및 이들의 혼합추출물의 항염증 효능을 확인하기 위해 NO 및 PGE2의 생성 억제 효능 실험을 수행하였다. 그 결과, 개별추출물의 경우 홍삼, 감초, 황련, 녹차 잎의 경우 NO의 생성억제 효능이 뛰어났으며, 혼합추출물의 경우 감초와 홍삼을 2배로 증량한 보기 조합이 가장 뛰어난 효능을 나타내었다. 또한, PGE2 생성량 측정 결과, 홍삼, 감초, 황련이 PGE2 생성억제 효과가 가장 뛰어났으며, 혼합추출물의 경우 역시 보기 조합이 가장 좋은 효과를 나타냄을 확인하였다 (실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 7종의 개별추출물의 대장균 (E. coli)과 황색포도상구균 (S. aureus)에 대한 살균 효능을 확인하였다. 그 결과 7종의 개별추출물 모두 두 가지 균에 대하여 99.9%이상의 살균능력을 나타냄을 확인하였다 (실시예 5 참조).

이에, 본 발명은 홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 및 녹차 잎으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 보다 구체적으로 상기 약학적 조성물은 대장균(E. coli), 및 황색포도상구균(S. aureus)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주에 의해 유발되는 구강 질환을 예방 또는 치료할 수 있으며, 상기 구강 질환은 예컨대, 구취, 플랙 형성, 충치, 치주질환 등일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 구강 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 구강 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 경고제, 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 정제, 캅셀제, 크림제 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 가장 바람직하게는 경구용 제제로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1㎏ 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 실험방법

1-1. 개별 추출물의 제조

본 실험에 사용한 한약재들은 (주) 휴먼허브 (경북, 경산)에서 구입하였고, 구입한 약재는 동국대학교 한의과대학 방제학교실에서 정선하여 사용하였다. 추출물의 제조 방법은 다음과 같다. 환류냉각관을 장착한 플라스크에 약재(홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 및 녹차 잎)를 각각 넣고 8배수 (w/w)의 증류수를 가하여 4시간 동안 100℃에서 추출하였다. 추출액을 wattman paper로 여과 후 rotary evaporator를 이용하여 용매를 증발시킨 후, -85℃에서 1시간 동안 냉동하였다. 동결건조기를 이용하여 충분히 동결건조 한 후 75%의 에탄올을 가하여 실온에서 24시간동안 추출하였다. 추출액을 위와 같은 방법으로 여과, 동결건조 후 역시 같은 방법으로 85%, 95% 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 동안 추출 후 마지막으로 여과 및 동결 건조하여 시료로 사용하였다. 분말 화 된 추출물은 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 용해한 후 0.20um filter로 여과하여 사용하였다.

1-2. 세포 배양 및 시약

실험에 사용한 세포는 마우스에서 분리한 대식세포의 세포주인 RAW264.7을 사용하였으며 fetal bovine serum(FBS)와 penicillin-streptomycin이 함유된 dulbecco’s modified eagle medium(DMEM)에서 배양하였고 배양 배지들은 모두 Gibco BRL사(Grand Island, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 DMSO는 Amresco사 (Solon, USA)에서, ethanol은 Samchun Chemicals사(Pyungtack, Republic of Korea)에서 구입하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 4,5-diaminofluorecein(DAF-2), lipopolysaccharide(LPS), sodium nitroprusside(SNP), sodium phosphate, sodium chloride, potassium chloride, hypoxanthine, NBT, xanthine oxidase, EDTA 는 sigma사(St.Louis, USA)에서 구입하였다. PGE2 측정을 위한 commercial competitive enzyme immunoassay kit는 R&D systems (Minneapolis, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.

1-3. 혼합추출물 제조

고려홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 및 녹차 잎의 혼합추출물에 대한 효능도 확인하기 위하여, 하기와 같이 혼합추출물을 제조하였다. 먼저, 고려홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 녹차 잎 모두 한의학에서 쓰이는 천연물로, 먼저 한의학적인 이론 및 효능을 바탕으로 분류를 하였다. 홍삼과 감초는 한의학적으로 보기약(補氣藥) 에 속한다. 이는 보기(精氣)를 보익하고 허약을 보충하여 신체허약으로 인한 쇠약 증후를 해소시키는 약물이다. 그 효능은 일반적으로 인체의 생리기능과 체력을 현저하게 증강시킨다. 황련과 녹차 잎은 청열약 (淸熱藥)에 속하는데, 청열약 (淸熱藥)은 한의학적으로 인체의 열 (熱)을 제거하는 효능이 있는 약이다. 이는 인체의 발열 증상을 제거시키는 약물로 항염증 효과와 관련이 깊다. 박하와 계피는 해표약 (解表藥)에 속한다. 해표약 (解表藥)은 표사 (表邪)를 발산 (發散)하여 표증 (表證)을 없애는 작용을 하는 약물로, 땀을 내는 작용이 있다. 유백피는 이수약 (利水藥)으로 수도 (水道)를 통리 (通利)시켜 수습 (水濕)을 제거시키는 약의 일종으로 수습 (水濕)이 체내에 정체되어 일어난 증에 사용한다. 이뇨작용이 있어서 수종 (水腫)이나 황달 (黃疸)등에 사용되며 과도한 염분 및 수분을 제거하는 작용이 있다.

이렇게 7종의 천연물을 각각의 효능에 따라 4가지 그룹으로 나눈 후, 각각의 그룹을 주요 용량으로 하는 몇 가지 배합비를 나누어 총 4가지의 혼합추출물을 제조하였으며, 각 혼합추출물의 배합비는 하기의 표 1에 나타내었다.

	홍삼, 감초	황련, 녹차 잎	박하, 계피	유백피
補氣 sample	2	1	1	1
淸熱 sample	1	2	1	1
解表 sample	1	1	2	1
利水 sample	1	1	1	2

실시예 2: 세포독성 측정 ( MTS assay )

천연물 추출물에 의한 항산화, 항염증 효능측정은 세포단위에서 수행되는 실험이므로 본 실험에 앞서 각각의 천연물추출물에 의한 세포독성 정도를 측정하는 것이 중요하다. 해당 천연물이 효능이 뛰어나다 하더라도 세포에 독성이 있다면 직접 음용을 해야 하는 구강 건강 제품의 특성상 독성이 없는 범위 내에서 실험을 수행해야 한다. 따라서 MTS assay를 통해 RAW 264.7 세포주에 대한 세포 독성 시험을 수행하여 해당 천연물추출물의 독성이 나타나지 않는 농도를 알아보고자 하였다.

2-1. 개별 천연물추출물에 의한 세포독성 측정

마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 대해 개별 천연물 추출물에 의한 세포독성을 알아보기 위하여 MTS assay를 수행하였다. 이는 각 천연물 추출물의 독성범위 이내에서 혼합비를 정하고자 수행한 것이다.

96well plate에 RAW 264.7 세포를 1X10⁴ cells/well로 분주하고, 각각의 개별추출물을 농도별 (0, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 ug/mL)로 처리하였다. 18시간 후, 하나의 well 당 20ul의 MTS 용액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 감초, 유백피, 홍삼 추출물은 500μg/mL농도로 처리한 경우 세포 생존능 (Cell viability)이 80% 미만으로 감소하였다. 박하, 계피, 녹차 잎 추출물은 750μg/mL 농도에서, 황련은 250 μg/mL 농도를 처리한 군에서 cell viability가 80% 미만으로 감소하였다. 따라서 이후 실험에서는 각각의 추출물을 그 미만의 농도로 처리하여 실험을 진행하였고, 세포 생존능이 80% 이상으로 유지되는 농도를 기준으로 하여 각 추출물의 혼합비를 하기 표 2에 기재된 비율로 조정한 혼합 추출물 (이하 ‘Via’라 함)을 제조하였다.

	비율
감초 유백피 홍삼	10
박하 계피 녹차 잎	5
황련	2

2-2. 혼합 천연물추출물에 의한 세포독성 측정

마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 대해 혼합 천연물 추출물에 의한 세포독성을 알아보기 위하여 MTS assay를 수행하였다.

상기 실시예 2-1의 방법과 마찬가지로, 96well plate에 RAW 264.7 세포를 1X10⁴ cells/well로 분주하고, 혼합 추출물 즉 실시예 1-3에서 제조된 보기, 청열, 이수, 해표, 실시예 2-1에서 제조된 Via 및 각 추출물을 동일한 비율(1:1)로 혼합한 혼합추출물(이하‘동비율’이라 함)을 농도별 (0, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 ug/mL)로 처리하였다. 18시간 후, 하나의 well 당 20ul의 MTS 용액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader (DYNEX, Opsys MR, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 녹차 잎과 황련을 2배로 한 청열 샘플을 제외한 모든 혼합추출물 샘플의 750μg/mL 농도에서 세포 생존능이 80% 미만으로 감소하였고, 청열 샘플에서는 500μg/mL 농도에서 80% 미만으로 감소하였다. 즉, 청열 샘플의 세포 독성이 다른 샘플에 비해서 높다고 보여 진다.

실시예 3: 항산화효과 확인( Free radical 소거활성 측정)

3-1. DPPH radical 소거활성 측정

고려홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피 및 녹차 잎의 개별추출물 및 그 혼합추출물의 항산화효과를 확인하기 위하여, 다음과 같은 방법으로 DPPH radical 소거활성 측정을 수행하여 전자 공여증을 비교하였다.

DPPH radical에 대한 소거활성은 Gyamfi 등의 방법에 따라 측정하였다. 먼저 7종의 개별 추출물 또는 혼합추출물(보기, 청열, 이수, 해표, Via 및 동비율) 50㎕에 0.1mM DPPH 용액 1㎖과 50mM Tris-Hcl buffer (pH 7.4) 450㎕를 가하여 잘 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30분간 반응시킨 다음, microplate reader (VersaMax, Molecular Devices, USA)를 이용하여 파장 517nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 개별 추출물을 가지고 활성을 측정한 경우 홍삼, 황련, 박하, 녹차 잎 추출물에서 뛰어난 DPPH radical 소거능력이 관찰되었다. 혼합 추출물의 경우, 도 4에 나타낸 바와 같이, IC50값이 45.18±5.95에서 59.89±3.70(μg/mL) 정도를 나타내어 큰 차이가 없다고 보여졌으나, 그 중에서도 모든 천연물을 1대1로 조합한 동비율 조합이 가장 좋은 효과를 나타내었다.

3-2. Superoxide anions 소거활성 측정

7종의 개별추출물 및 그 혼합추출물 (보기, 청열, 이수, 해표, Via 및 동비율)의 항산화효과를 확인하기 위하여, 대표적인 활성산소 (ROS)의 하나인 Superoxide anions의 소거활성 측정을 수행하였다. 먼저 각각의 개별추출물 또는 혼합추출물 30㎕에 30mM EDTA (pH 7.4) 100㎕, 30 mM hypoxanthine 10㎕ 그리고 1.42mM NBT 200㎕를 가하고 실온에서 3분 동안 반응시킨 후, 0.5U/㎖ xanthine oxidase l00㎕를 첨가하고 50mM phosphate buffer (pH 7.4)로 총 용량을 3㎖로 맞추었다. 이후 반응용액을 실온에서 20분간 배양시킨 후, 560nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 개별 추출물을 가지고 활성을 측정한 경우 홍삼과 유백피에서 뛰어난 Superoxide anions 소거 능력이 확인되었다. 혼합 추출물의 경우, 도 6에 나타낸 바와 같이, 감초와 홍삼을 2배로 증량한 보기 조합의 IC50값이 63.13±2.91 (μg/mL)으로 가장 좋은 효과를 나타내었다.

3-3. Nitric oxide 소거활성 측정

항산화 효과를 확인하기 위해 또 다른 활성산소인 Nitric oxide (NO)의 소거활성 정도를 측정하였다. Sodium nitroprusside(SNP)를 사용하여 NO의 생성을 유도하고, 이로 인해 생성되는 diaminofluorescein(DAF-2)의 형광강도를 측정하였다.

먼저, 1mg의 DAF-2를 0.55㎖의 DMSO에 용해시키고, 이를 다시 50mM phosphate buffer를 사용하여 400배로 희석하여 DAF-2 용액을 제조하였다. 7종의 개별 추출물 또는 혼합추출물 (보기, 청열, 이수, 해표, Via 및 동비율) 10㎕를 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) 130㎕와 혼합한 다음, 40 mM SNP 10 ㎕ 및 DAF-2 용액 50㎕를 첨가하였다. 반응용액을 실온에서 10분간 배양한 다음, DAF-2와 NO의 반응에 의해 생성되는 triazolofluorescein의 형광강도를 fluorescence microplate reader(SPECTRA MAX GEMINI EM, Molecular Devices Corp., USA)를 사용하여 excitation 파장 495 nm 및 emission 파장 515 nm에서 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 개별추출물의 경우 홍삼과 박하가 NO 소거능력이 뛰어났고, 유백피를 제외한 모든 천연물이 좋은 효과를 보였다. 혼합추출물의 경우, 도 8에 나타낸 바와 같이, 모두 뛰어난 효과를 나타내었다.

실시예 4: 항염증 효과 확인

4-1. NO 억제효과 측정

고려홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피 및 녹차 잎의 개별추출물 및 그 혼합추출물(보기, 청열, 이수, 해표, Via 및 동비율)의 항염증효과를 확인하기 위하여, RAW 264.7 세포에서 Nitric Oxide의 생성량에 미치는 영향을 확인하였다.

RAW264.7 세포에 각각의 개별 추출물 또는 혼합 추출물을 농도별로 전처리하고 1시간 후 1㎍/㎖의 Lipopolysaccharide(LPS)를 처리하여 18시간 배양하였다. 이후에 배양액 50㎕와 같은 양의 Griess Reagent를 넣어주고 10분간 상온에서 반응 시킨 다음 ELISA reader로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 및 Sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 계산하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 개별 천연물 다수에서 농도 의존적으로 NO의 생성을 감소시키는 효과가 있었다. 그 중 홍삼, 감초, 황련, 녹차 잎의 효능이 뛰어났다. 혼합 추출물의 경우, 도 10에 나타낸 바와 같이, 감초와 홍삼을 2배로 증량한 보기의 경우 RAW 264.7 세포에 대한 Nitric Oxide 억제 효과가 가장 뛰어났다.

4-2. PGE2 생성량 측정

7종의 개별추출물 및 그 혼합추출물 (보기, 청열, 이수, 해표, Via 및 동비율)의 항염증효과를 확인하기 위하여, RAW 264.7 세포에서 Prostaglandin E2 (PGE2) 생성량에 미치는 영향을 확인하였다.

세포 배양액 내의 PGE2 양을 측정하기 위해 commercial competitive enzyme immunoassay kit를 R&D systems (Minneapolis, USA)에서 구입하여 실험하였다. RAW 264.7 세포에 시료를 전처리하고 1시간 후 1ug/ml의 LPS를 처리하였다. 18 시간 후 세포 배양액을 얻어 goat anti-mouse로 코팅된 96 well plate에 각각 100μl씩 넣고, 여기에 primary antibody solution 50μl와 PGE2 conjugate를 50μl씩 첨가하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. Washing buffer로 4회 세척하고 substrate solution을 200μl씩 처리하여 5∼20분간 반응시킨 후, 50μl의 stop solution을 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 개별추출물의 경우 홍삼, 감초, 황련의 PGE2 생성 억제 효과가 뛰어났다. 혼합추출물의 경우에는 도 12에 나타낸 바와 같이, 앞선 결과와 마찬가지로 감초와 홍삼을 2배로 증량한 보기 조합에서 PGE2 생성 억제 효과가 가장 뛰어났다.

실시예 5: 살균력 측정

7종의 개별 천연물의 살균 및 향균 효력을 확인하기 위하여 구강 내에 서식하는 그람 음성균인 E. coli와 그람 양성균인 S. aureus을 이용하여 살균력을 측정하였다.

고려홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피 및 녹차 잎의 개별 추출물은 각각의 재료 약 10g에 물 3L를 넣고 100℃에서 1시간 정도 끓여 추출하고 약 3회 반복하여 실험에 사용할 추출물을 준비하였다. 실험에 사용한 균주는 대장균 및 황색포도상구균을 Brain Heart Broth (DIFCO)에 배양 시킨 후 배양된 세균을 희석하여 초기 세균수가 10⁵~10⁶ CFU/mL이 되도록 조정하여 실험에 사용하였다. 이후 개별 추출물 원액 20mL에 시험 균액을 첨가하고 혼합한 후 상온에서 1시간 동안 방치하였을 때 세균수를 측정하여 초기 세균 수에 대한 살균감소율을 알아보았다. 생리식염수를 대조로 하여 세균수를 측정한 것을 초기 세균수로 표시하였다. 단, 이때 모든 실험의 최초 희석 단계에서는 D/E Neutralizing Broth (DIFCO)를 이용하여 중화시키는 과정을 거쳐 시험을 실시하였으며 배지에서 세균이 증식한 경우, 배지상의 균수에 희석 배수를 곱하여 산출하였다. 배지에서 세균이 증식하지 않은 경우에는 중화단계에서 이루어진 희석배수를 곱하여 산출하였으며, 『10미만 (<10)』으로 표시하였다. 생균수 계산은 아래 [수학식 1]에 따라 측정하였고 살균감소율은 아래 [수학식 2]에 따라 결정하였다.

[수학식 1]

N= C × D

N:생균수

C:집락수 (2매의 집락 수 평균치)

D:희석배수 (희석액의 희석배수)

[수학식 2]

R(%) = [(A-B)/A] × 100

R: 살균감소율

A: 초기 세균수

B : 일정시간 후 세균수

도 13 내지 19에 나타낸 바와 같이, 홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 및 녹차 잎 추출물을 처리하였을 때, 7종의 개별천연물 모두 1시간 후 E. coli에 대하여 99.9%이상, S. aureus에 대해서도 99.9% 이상의 살균력을 나타내었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능 하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (6)

1. 홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 및 녹차 잎으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 구강 위생 증진용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소 수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 항산화 효능을 가지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 항염증 효능을 가지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 홍삼, 감초, 황련, 유백피, 박하, 계피, 및 녹차 잎으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 구강 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 구강 질환은 대장균(E. coli), 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주에 의해 유발되는 질환인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.

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