KR101731903B1 - 황칠나무 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

황칠나무 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 추출물 또는 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 또는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 황칠나무 추출물 또는 이의 활성 분획물은 난백알부민(ovalbumin)으로 유발된 마우스 천식모델에서 Th2 타입의 면역반응을 조절하고, 이로 인해 분비되는 사이토카인(cytokine)의 생성을 효과적으로 억제하며, 또한 폐 조직의 염증반응, 기관지 내 점액 과다생성 및 기도과민성을 유의적으로 감소시키므로, 효과적인 천식 및 염증성 질환의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

황칠나무 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for prevention or treatment of asthma comprising the extracts and fractions of Dendropanax morbifera as active ingredient}
본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 추출물 또는 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
천식(asthma)은 만성 기도 염증 및 기도과민성을 특징으로 하는 염증성 폐질환이다. 최근 서구화 및 식습관의 변화에 따라 천식의 유병률은 증가하고 있는 추세이며, 이에 따른 진료 및 치료비용 역시 증가하고 있다. 천식이 발병하는 기전은 매우 다양한 것으로 알려져 있으며, 이러한 요인 중 Th2(T helper type 2) 타입의 면역반응 증가는 천식 발병 및 진행에 있어 매우 중요한 원인으로 제기되고 있다. 신체가 다양한 자극물질에 노출되어 이로 인한 Th2 타입 면역반응이 증가되면 인터루킨-4, 5, 13 등이 증가되게 되며, 이는 특히 호산구를 비롯한 염증세포의 이주를 촉진하게 되어 폐 조직 내 염증반응을 유발하게 된다. 이러한 폐 조직 내 염증세포들은 전염증 인자(산화질소 등의 여러 사이토카인들), 화학주성 인자, 성장 인자 등과 같은 매개 인자들의 생성 및 방출을 촉진하여, 염증반응을 더욱 악화시키며, 기도 내 배상세포의 과형성 및 점액분비를 증가시키고, 기도과민성을 유발하게 된다. 이러한 일련의 반응에 있어, 많은 연구자들은 Th2 면역반응에 중점을 두고 이를 조절 할 수 있는 다양한 물질들을 개발해 오고 있다. 그러나 현재 사용되어지는 천식 치료 약물들은 여러 부작용으로 인하여 사용이 제한적이거나, 탁월한 천식치료효과를 나타내지 못하고 있다.
천식 치료에 사용되고 있는 약물은 기관지확장제를 비롯한 코티코스테로이드제, 항생제 등이 있다. 기관지확장제는 호흡곤란 등의 임상증상을 개선하고자 사용하는 약물이지만, 생체 내 주요 장기에 동일한 효과를 나타내기 때문에 사용이 제한적이며, 또한 코티코스테로이드제와 항생제는 과도한 면역반응과 염증반응을 억제하기 위하여 사용하고 있으나, 면역 및 골수 억압, 내성 등의 문제로 장기간의 치료에는 부적절하다. 따라서, 이러한 부작용이 없으며, 치료효과가 탁월한 천연물의 개발이 끊임없이 진행되고 있다.
종래의 황칠나무에 관한 관련 기술로는 한국 특허공개 제 2000-0004499에 항암활성을 가지는 황칠나무 추출물이 기재되어 있고, 한국 특허공개 제 2003-0079205에 간세포 보호효과를 갖는 황칠 추출물, 황칠 분획물 및 이들을 함유한 약학 조성물이 기재되어 있고, 한국 특허공개 제 2004-01077853에 에탄올 유발 간손상을 억제하는 황칠추출물이 기재되어 있고, 한국 특허공개 제 2004-0107852에 피부 미백 효과가 있는 황칠 추출물과 황칠 분획물이 기재되어 있으며 한국 특허공개 제 2005-0036093에 황칠나무 수액을 유효성분으로 하는 자외선 차단 화장품 조성물, 한국 특허공개 제 2006-0131360에 생리활성이 뛰어난 황칠나무의 종실추출물이 기재되어 있으나, 황칠나무의 추출물에 대한 천식질환 치료에 관한 기술은 없다.
이에, 본 발명자들은 난백알부민(ovalbumin)으로 유발된 마우스 천식모델을 이용하여 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물의 항 천식 효과를 규명하고자 노력한 결과, 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물이 Th2 타입의 면역반응을 조절하여, 이로 인해 분비되는 사이토카인(cytokine)의 생성을 효과적으로 억제하고, 폐 조직의 염증반응, 기관지 내 점액 과다생성, 기도과민성을 감소시키는 것을 확인하였고, 특히 현재 천식치료제로 시판되는 몬테루카스트와 유사한 항천식 활성을 나타내는 것을 확인함으로써 상기 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물을 인체에 안전한 천연물 유래의 항 천식 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 추출물 또는 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 및 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 추출물 또는 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 추출물 또는 이의 활성 분획물은 난백알부민(ovalbumin)으로 유발된 마우스 천식모델에서 Th2 타입의 면역반응을 조절하고, 이로 인해 분비되는 사이토카인(cytokine)의 생성을 효과적으로 억제하며, 폐 조직의 염증반응, 기관지 내 점액 과다생성 및 기도과민성을 유의적으로 감소시키므로 천식 또는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a은, 황칠나무(Dendropanax morbifera) 잎 메탄올 추출물을 MPLC(Medium pressure liquid chromatography)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는, 황칠나무 잎 추출물 및 활성 분획물 전체적인 과정을 나타내낸 도이다:
Fr. 1: 분획물 1;
Fr. 2: 분획물 2;
Fr. 3: 분획물 3;
Fr. 4: 분획물 4;
Fr. 5: 분획물 5;
Fr. 6: 분획물 6;
Fr. 7: 분획물 7;
Fr. 8: 분획물 8;
Fr. 9: 분획물 9;
Fr. 10: 분획물 10; 및
Fr. 11: 분획물 11.
도 1c 및 1d는, 황칠나무 잎의 야생(wild) 및 재배종(cultivar)으로부터 TLC(Thin-layer chromatography) 및 UPLC를 사용하여 MS로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a 내지 2c는, 황칠나무 잎 에탄올 추출물 및 분획물을 UPLC(Ultraperformance Liquid Chromatography)를 사용하여 PDA(Photodiode-Array detection)로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2d 내지 2f는, 황칠나무 잎 에탄올 추출물 및 분획물을 UPLC를 사용하여 MS(Mass Spectrometry)로 분석한 결과를 나타낸 도이다:
DM_Total: 황칠나무 잎 추출물;
DM_Fr01: 분획물 1;
DM_Fr02: 분획물 2;
DM_Fr03: 분획물 3;
DM_Fr04: 분획물 4;
DM_Fr05: 분획물 5;
DM_Fr06: 분획물 6;
DM_Fr07: 분획물 7;
DM_Fr08: 분획물 8;
DM_Fr09: 분획물 9;
DM_Fr010: 분획물 10; 및
DM_Fr011: 분획물 11.
도 3은, 기도과민성에 대한 황칠나무 추출물 및 분획물의 효과를 나타낸 도이다:
NC: 정상대조군;
OVA: 천식유도군;
Mon: 양성대조군;
Total: 황칠나무 추출물 투여군;
Fr8: 분획물 8 투여군;
Fr9: 분획물 8 투여군;
Fr10: 분획물 8 투여군; 및
Fr11: 분획물 8 투여군.
도 4는, 기관지 주위 염증세포의 침윤을 확인한 도이다:
NC: 정상대조군;
OVA: 천식유도군;
Mon: 양성대조군;
Total: 황칠나무 추출물 투여군;
Fr8: 분획물 8 투여군;
Fr9: 분획물 8 투여군;
Fr10: 분획물 8 투여군; 및
Fr11: 분획물 8 투여군.
도 5는, 기관지 내 점액분비를 확인한 도이다:
NC: 정상대조군;
OVA: 천식유도군;
Mon: 양성대조군;
Total: 황칠나무 추출물 투여군;
Fr8: 분획물 8 투여군;
Fr9: 분획물 8 투여군;
Fr10: 분획물 8 투여군; 및
Fr11: 분획물 8 투여군.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera) 추출물 또는 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 Th2(T helper type 2) 타입 사이토카인의 생성을 억제하는 것이 바람직하며, 난백알부민 특이 IgE 생성을 억제하는 것이 바람직하다.
상기 황칠나무 추출물 또는 이의 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 황칠나무에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 황칠나무의 추출물을 제조하는 단계; 및
4) 단계 3)의 황칠나무 추출물에 추가적으로 유기용매로 추출하여 황칠나무 분획물을 제조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 황칠나무는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 황칠나무는 잎, 줄기 또는 뿌리가 모두 이용가능하고, 잎인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 추출용매를 건조된 황칠나무 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 2 내지 3배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하고, 20℃ 내지 40℃인 것이 더욱 바람직하고, 실온인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간인 것이 바람직하며, 15 내지 30시간인 것이 더욱 바람직하고, 24시간인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3 내지 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 3회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 4)의 유기용매는 노르말-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 부탄올인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 분획물은 황칠나무 추출물을 물에 현탁시킨 후 노르말-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 노르말-부탄올 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 노르말-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며, 메탄올 분획물임이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 분획물은 상기 황칠나무 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 활성 분획물은 분획물로부터 보다 높은 생리활성 등을 가지는 분획을 분리한 것으로, 활성분획 또는 유효 분획물이라고도 한다. 계통분획과 같은 통상의 분획과정을 통해 수득한 여러 성분이 혼합되어 있는 분획물 가운데 농도구배 컬럼 크로마토그래피 등을 통하여 활성성분의 성질에 따라 분리해냄으로써 보다 강한 활성을 갖는 특정 활성 분획물을 제조할 수 있다.
상기 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, LH-20, ODS 겔, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성분획물을 분리 및 정제할 수 있고, 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 크로마토그래피를 사용함에 있어 용출용매, 용출 속도 및 용출시간은 당업계에서 일반적으로 사용하는 용매, 속도 또는 시간을 적용할 수 있으나, 구체적으로 1 내지 100%의 물 및/또는 메탄올을 용출용매로 사용하여, 30 내지 50 ㎖/분의 속도로 1분 내지 200분간 용출시키는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 천식 발생에 의한 기도과민성을 측정하기 위해 one chamber plethysmography(All Medicus, Korea)를 이용하여 기도 저항의 정도를 enhaced pause(Pehn)을 측정하기위해 난백알부민으로 천식을 유발시켰으며 메타콜린(methylcholine, A2251, Sigma-Aldrich)을 12, 25, 50 mg/mL의 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후 Penh 값을 측정하였다. 그 결과, 천식유도군(OVA)은 메타콜린(methylcholine) 농도가 증가함에 따라 정상대조군에 비하여 기도과민성이 크게 증가하였고, 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물 투여군에서 메타콜린 농도가 증가함에 따라 천식유도군(OVA)에 비해 기도과민성의 감소가 관찰되었으며, 이러한 효과는 황칠나무 분획물 8 및 분획물 11 투여군에서 현저하게 나타나는 것을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 각 개체에서 분리한 혈청 내 난백알부민 특이 IgE의 측정을 위해 후대정맥을 통하여 수득한 혈액은 상온에서 30분간 반응시킨 후, 원심분리(3000 rpm, 15 min) 하여 혈청을 얻었으며 그 결과, 혈청 내 난백알부민 특이 IgE는 천식유도군에서 정상대조군에 비해 크게 증가하였으며, 반면 양성대조군인 몬테루카스트 투여군은 천식유도군에 비해 현저하게 감소된 것을 확인하였다. 또한, 황칠나무 분획물 9를 제외한 모든 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군은 혈청 내 난백알부민 특이 IgE가 천식유도군에 비해 크게 감소하는 것을 확인하였다(표 6 참조).
또한, 본 발명자들은 각 개체에서 분리한 기관지 조직의 기도 염증 및 기관지 내 점액분비를 확인하기 위해 분리한 폐 조직 내 염증을 관찰하기 위하여 Hematoxylin & Eosin 염색을, 기관지 내 점액분비를 관찰하기 위하여 periodic acid Schiff(PAS, IMEB Inc., USA) 염색을 수행하였으며 광학현미경을 이용하여 폐 조직의 병리학적 변화를 검정하였다. 그 결과, 난백알부민으로 유발된 천식유도군은 정상군에 비해 기관지 주위의 염증세포의 침윤이 크게 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 양성대조군인 몬테루카스트 투여군은 천식유도군에 비해 염증세포의 침윤이 감소되었으며, 황칠나무 추출물을 비롯한 모든 활성 분획물에서 염증세포 침윤의 감소가 관찰되는 것을 확인하였다(도 4 참조). 또한, 난백알부민으로 유발된 천식유도군은 기관지 내 점액분비가 정상군에 비해 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 반면 양성대조군인 몬테루카스트 투여군은 천식유도군에 비해 점액분비가 감소하였으며, 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군은 천식유도군에 비해 점액분비가 감소되는 것을 확인하였다(도 5 참조).
따라서, 본 발명의 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물은 난백알부민(ovalbumin)으로 유발된 마우스 천식모델에서 기관지 내 점액 과다생성 및 기도과민성을 유의적으로 감소시키므로 천식 예방 및 치료제로써 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 이의 활성 분획물을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 혼합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 본 발명의 혼합 추출물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 천식 또는 염증성 질환 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물은 난백알부민(ovalbumin)으로 유발된 마우스 천식모델에서 기관지 내 점액 과다생성 및 기도과민성을 유의적으로 감소시키므로 천식 예방 및 건강기능식품으로써 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 Th2(T helper type 2) 타입 사이토카인의 생성을 억제하는 것이 바람직하며, 난백알부민 특이 IgE 생성을 억제하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 천식 발생에 의한 호산구 및 염증세포의 분석을 위해 난백알부민으로 천식을 유발시켰으며 펜토바비탈(50 mg/kg, Entobal, Hanil, Korea)를 복강투여하여 마취시킨 후 기관지 절개를 실시하여 각 개체의 기관지 폐포세척액은 회수된 다음 호산구를 비롯한 그 외 염증세포를 현미경을 통해 검경한 결과, 천식유도군에서는 호산구를 비롯한 염증세포의 수가 크게 증가하는 것을 확인하였고, 황칠나무 추출물 투여군에서는 염증세포의 현저한 감소가 관찰되었으며, 이러한 감소는 모든 황칠나무 분획물 투여군에서 크게 나타나는 것을 확인하였다(표 4 참조).
또한, 본 발명자들은 각 개체에서 분리한 기관지 폐포세척액에서 인터루킨(Interleukin)-4, -5, -13의 생성량을 분석하였으며 그 결과, Th2(T helper type 2) 타입 사이토카인인 IL-4은 천식유도군에서 정상대조군에 비해 현저하게 증가되는 것을 확인하였다. 반면 양성대조군인 몬테루카스트 투여군과 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군은 IL-4의 생성 천식유도군에 비해 크게 억제되었으며, 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군과 양성대조군의 억제량은 거의 유사하게 나타났다. IL-5 및 IL-13의 생성 또한 천식유도군에서 정상대조군에 비해 현저하게 증가되었으며, IL-5의 경우 황칠나무 분획물 9 및 분획물 10 투여군을 제외한 모든 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군에서 유의성 있는 감소가 관찰되었고, IL-13은 황칠나무 분획물 9 투여군을 제외한 모든 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군에서 유의성 있게 감소되는 것을 확인하였다(표 5 참조).
따라서, 본 발명의 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물은 난백알부민으로 유발된 마우스 천식모델에서 Th2 타입의 면역반응을 조절하여, 이로 인해 분비되는 사이토카인의 생성을 효과적으로 억제하고, 폐 조직의 염증반응을 감소시키는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물은 효과적인 염증성 질환의 예방 및 치료제로써 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물은 난백알부민으로 유발된 마우스 천식모델에서 Th2 타입의 면역반응을 조절하여, 이로 인해 분비되는 사이토카인의 생성을 효과적으로 억제하고, 폐 조직의 염증반응, 기관지 내 점액 과다생성 및 기도과민성을 감소시키는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 황칠나무 추출물 및 이의 활성 분획물은 효과적인 염증성 질환의 예방 및 건강기능식품으로써 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 황칠나무( Dendropanax morbifera ) 추출물 및 활성 분획물의 제조
<1-1> 황칠나무 추출물의 제조
본 발명자들은 황칠나무의 추출물을 제조하기 위해 전남 해남 보길도에서 황칠나무를 확보하여 건조시켰다.
구체적으로, 황칠나무 잎(40 g)을 건조기(50-55℃)를 사용하여 자연건조(음건)하여 수분을 제거한 후 약 1 cm의 크기로 분쇄하였다. 분쇄된 분말시료의 건조 중량을 기준으로 메탄올 1 ℓ를 가한 후 상온에서 추출하였다. 그런 다음 여과 및 감압농축 후, 메탄올 추출물 5.5 g을 수득하였다.
<1-2> 황칠나무 활성 분획물의 제조
상기 실시예 <1-1>의 황칠나무 잎 추출물로부터 활성 분획물을 분리 및 제조하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, MPLC(Medium pressure liquid chromatography) 기기(Sepbox 2D 5000)에 칼럼(20 mm × 250 mm; Resin: Grace C18, 10 ㎛)을 장착한 후 상기 황칠나무 메탄올 추출물을 5 g의 양으로 반복 로딩하였다. 이때, 용매로는 물/메탄올[10:90→100:0 (v/v)]를 사용하고, 용리 속도는 40 ㎖/분이었으며, UV 200-400 ㎚의 파장에서 검출하였다. 분석 시간은 190분으로 하여 각각, 11개의 활성 분획물(DM Fr. 1-11)을 수득하였고(표 1 및 도 1a, b), 또한 1차 야생시료 및 2차 재배 및 야생시료의 각 추출물들을 TLC(Merck사 순상 및 역상 plate)를 사용하여 순상 조건에서 전개용매 헥산:에틸아세테이트 = 7:1 조건에서 전개하였다(도 1c). 이 중 활성 분획물 8-11번(DM Fr. 8-11)의 활성이 우수함을 확인하였다(도 1).
수득한 황칠나무 잎 분획물
황칠나무 잎 분석시간(min) 무게(mg) 조건
DM Fr.1 분획물 1 0-13 924


0 - 5 min 20% MeOH
5 - 55 min 60% MeOH
55 - 125 min 100% MeOH
125 - 185 min 100% MeOH
DM Fr.2 분획물 2 14-58 607.3
DM Fr.3 분획물 3 59-62 86.8
DM Fr.4 분획물 4 63-69 188.7
DM Fr.5 분획물 5 70-72 50.1
DM Fr.6 분획물 6 73-79 188.3
DM Fr.7 분획물 7 80-97 145.6
DM Fr.8 분획물 8 98-108 44.6
DM Fr.9 분획물 9 109-118 223.9
DM Fr.10 분획물 10 119-130 222.7
DM Fr.11 분획물 11 131-190 432.4
<1-3> 황칠나무 추출물 및 분획물의 분석
상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>에서 수득한 황칠나무 잎 메탄올 추출물 및 이의 분획물의 활성분획을 조사하기 위하여 이들을 액체 크로마토그래피인 UPLC(ultra performance liquid chromatography)로 분석하였다.
구체적으로, UPLC 분석을 위해 상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>에서 수득한 황칠나무 잎 메탄올 추출물 5.5 g 및 분획물을 UPLC용 0.25 mm 멤브레인 필터로 1회 여과하였다. UPLC 기기(Waters UPLC-QTOF-MS)에 칼럼(Waters BEH C18 column, 2.1 × 100 mm, 1.7 ㎛m)을 장착한 후 여과된 각각의 분획물을 5 ㎕ 양으로 로딩하였다. 이때, 용매로는 아세토니트릴 + 0.1% 포름산/물 + 0.1% 포름산 [10:90→100:0 (v/v)]을 사용하고, 용리 속도는 0.4 ㎖/분이었으며, UV 254 nm의 파장과 MS(Mass Spectrometry)에서 검출하였다(도 1d 및 도 2a 내지 도 2f).
< 실시예 2> 대식세포에서 황칠나무추출물 및 분획물의 항염증 효과 확인
<2-1> 대식세포 생존율에 미치는 영향 확인
본 발명의 황칠나무 추출물 및 분획물의 처리에 의한 대식세포의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 생쥐의 대식세포인 Raw264.7 세포(ATCC, Rockwille, MD)를 소태아혈청(Fetal Bovine Serum) 10%를 첨가한 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco)로 유지를 하고, 세포생존율 평가에서는 5% 소태아혈청을 첨가한 DMEM배지에 1x105/㎖의 농도로 현탁하여 100 ㎕씩 96 웰 플레이트에 접종하여 부착하였다. 4시간 후, 본 발명의 황칠나무 추출물 및 분획물을 10μg/㎖ 을 처리하였으며 20시간 동안 배양한 후, 5 mg/㎖의 MTT 용액을 웰당 10 ㎕씩 첨가한 후 4시간 더 배양한 후, 상등액을 제거하여 DMSO를 100 ㎕씩 첨가하고 10분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 측정기로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 DMSO를 0.15% 처리한 음성대조군을 100%로 하여 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
[수학식 1]
Figure 112014089051563-pat00001
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 황칠나무 추출물 및 분획물 9, 10, 11에서 대식세포의 생존률이 가장 낮은 것을 확인하였다(표 2)
황칠나무 추출물 및 분획물 처리에 의한 대식세포의 생존률
시료 μg/㎖ 세포생존율 (%, Ave±SD)
음성대조군 0 100 ± 4.07
황칠나무 추출물 10 67.84 ± 0.42
황칠나무 분획물1 10 90.04 ± 6.07
황칠나무 분획물2 10 96.17 ± 2.93
황칠나무 분획물3 10 90.28 ± 0
황칠나무 분획물4 10 90.36 ± 0.03
황칠나무 분획물5 10 91.23 ± 1.26
황칠나무 분획물6 10 94.77 ± 11.35
황칠나무 분획물7 10 86.95 ± 3.39
황칠나무 분획물8 10 81.95 ± 1.95
황칠나무 분획물9 10 32.44 ± 5.13
황칠나무 분획물10 10 40.4 ± 4.08
황칠나무 분획물11 10 97.67 ± 2.9
<2-2> 염증 억제 효과 확인
본 발명의 황칠나무 추출물 및 분획물의 처리를 통해 대식세포에서 염증 유도에 의한 산화질소(NO) 생성량 및 TNF-alpha 생성량을 확인하기 위해 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 대식세포에 염증을 유도하기 위해서, 1x105/㎖의 농도로 세포를 현탁하여 96 웰 플레이트에 접종하여 4시간 동안 부착시킨 후, 시료를 처리하여 1시간 배양한 다음, 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS, Sigma)를 0.5㎍/㎖의 농도로 처리하여 20시간 더 배양하였다. 또한, 염증에 의해 생성된 산화질소 생성량을 확인하기 위하여, 세포 상층액 100 ㎕와 그리스 시약 I과 II를 각각 1:1의 비율로 혼합한 용액 100 ㎕ 를 새로운 96 웰 플레이트에 넣고, 빛을 차단하여 상온에서 10분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 측정기(microplate reader, Bio-Rad)로 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 아질산나트륨(sodium nitrite)을 이용하여 검량선을 작성하고, 이를 기준으로 배양액 내의 산화질소 생성량을 구하였으며, LPS를 처리한 군의 산화질소 생성량을 100%로 하여 각 시료의 저해율을 퍼센트로 나타내었다.
또한, 염증에 의해 생성된 TNF-alpha의 생성량을 확인하기 위하여 효소면역학적 분석키트(mouse TNF-alpha ELISA Set II, BD OptEIATM , 미국)를 이용하였다. 수득한 세포 상층액 100 ㎕를 마우스 면역글로불린을 코팅한 96웰 플레이트에 분주하여 2시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 세척용액으로 3회 세척하였다. 그 후, 항체(Biotinylated-Anti-TNF-alpha) 100 ㎕와 1시간 동안 반응시켰다. 다시 세척한 후, 효소용액(Enzyme Reagent; Streptavidine-horseradish peroxidase conjugate)을 넣어 30분간 반응시키고 세척한 후, 기질(TMB Substrate reagent set, BD Pharmingen, 미국) 100 ㎕와 30분간 발색반응 후, 황산용액으로 반응을 중지하였다. 발색 정도는 마이크로플레이트 측정기로 450nm에서 측정하였으며, 기준 TNF-alpha를 이용하여 검량선을 작성하고, 이를 기준으로 배양액 내의 사이토카인 생성량을 계산하였으며, LPS 처리군의 사이토카인 생성량을 100%로 하여 각 시료의 저해율을 퍼센트로 계산하였다.
그 결과, 표 3에서 나타난 바와 같이 산화질소 생성량은 LPS 처리군에 비하여 황칠나무 추출물(43.08±1.13%)과 분획물 8번(49.46±3.38%), 11번(51.06±5.64%)에서 높은 저해율을 나타내었다. 또한, TNF-alpha 생성량도 LPS 처리군에 비하여 황칠나무 추출물(36.12±0.51%), 분획물 8번(54.72±0.51%) 및 11번(70.10±9.10%)에서 높은 저해율을 나타내었다(표 3). 황칠나무 분획물 9번, 10번도 높은 저해율을 나타내었으나, 동시에 낮은 세포생존율을 나타내었다.
황칠나무 추출물 및 분획물의 산화질소 및 TNF-alpha 생성량 저해 효과
시료 μg/㎖ 산화질소 생성량
(μM, Ave±SD)		 TNF-alpha 생성량
(pg/ml, Ave±SD)
대조군 0 4.23 ± 0.06 -23.25 ± 11.79
LPS처리군 0 21.99 ± 1.12 178.00 ± 11.20
황칠나무 추출물 + LPS처리군 10 12.52 ± 0.25 130.50 ± 10.02
황칠나무 분획물1 + LPS처리군 10 22.69 ± 0.62 193.83 ± 14.73
황칠나무 분획물2 + LPS처리군 10 24.27 ± 0.74 253.42 ± 60.10
황칠나무 분획물3 + LPS처리군 10 22.21 ± 0.19 178.83 ±21.80
황칠나무 분획물4 + LPS처리군 10 23.44 ± 0.06 245.50 ± 58.34
황칠나무 분획물5 + LPS처리군 10 23.70 ± 0.43 163.83 ± 13.55
황칠나무 분획물6 + LPS처리군 10 22.21 ± 1.55 205.50 ± 10.02
황칠나무 분획물7 + LPS처리군 10 21.25 ± 0.06 61.75 ± 2.36
황칠나무 분획물8 + LPS처리군 10 11.11 ± 0.74 95.08 ± 14.14
황칠나무 분획물9 + LPS처리군 10 2.69 ± 0.62 70.08 ± 10.61
황칠나무 분획물10+ LPS처리군 10 2.34 ± 0.12 56.33 ± 27.70
황칠나무 분획물11+ LPS처리군 10 10.76 ± 1.24 118.42 ± 4.71
< 실시예 3> 난백알부민 유도 천식 실험 동물 모델의 준비
<3-1> 실험 동물의 준비
암컷 6 주령의 SPF(specific pathogen-free) Balb/c 생쥐 (20 g)는 샘타코 (Samtako, Korea)사에서 공급받았다. 동물은 실험 당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 온도 22℃, 습도 55±5%, 12 시간 (light-dark cycle)의 환경에서 1 주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
<3-2> 난백알부민을 이용한 천식 유도 및 시료의 투여
난백알부민을 이용하여 상기 실시예 <3-1>의 실험 동물에 천식을 유발시키기 위해 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 1주간의 순화기간을 거친 생쥐에게 2주 간격으로 2 mg 수산화알루미늄(A8222, Sigma-Aldrich, MO, USA)과 난백알부민 20 ug(A5503, Sigma-Aldrich)을 현탁한 인산완충용액(PBS) 200 uL을 복강에 주입하여 감작시켰다. 첫 번째 난백알부민 복강투여 후 21일부터 23일까지 1% 난백알부민을 초음파분무기(NE-U12, Omron Corp., Japan)를 이용하여 30 분간 흡입시켰다. 마지막 난백알부민 노출 후 24시간 뒤, 기도과민성을 측정하였고, 48시간 뒤에 펜토바비탈(50 mg/kg, Entobal, Hanil, Korea)를 복강투여하여 마취시킨 후 복대정맥을 통하여 혈액을 채취하였고, 기관지 절개를 실시하여 총 1.4 mL의 PBS로 기관지폐포 세척을 실시하여 검체를 수거하였다.
실험군은 정상대조군(NC, 난백알부민의 투여 및 흡입을 하지 않는 군), 천식유도군(OVA, 난백알부민의 투여 및 흡입한 군), 양성대조군(Mon, 몬테루카스트(montelukast) 30 mg/kg 투여 + 난백알부민의 투여 및 흡입한 군) 및 시료투여군(황칠나무 추출물, 황칠나무 분획물 8, 황칠나무 분획물 9, 황칠나무 분획물 10 또는 황칠나무 분획물 11을 30 mg/kg 투여 + 난백알부민의 투여 및 흡입한 군)으로 설정하여 진행되었다. 약물 및 시료는 첫 번째 난백알부민의 투여 후 21일부터 23일까지 경구투여하였으며 각 군당 7 두의 생쥐를 사용하였다.
여러 변수에 따른 평균값과 표준편차 (mean±SD)로 계산하였고 각 집단 간의 비교는 SPSS 10.0을 이용하여 one-way ANOVA를 실시하였고, 사후검정으로 Dunnett's multiple comparison test를 이용하여, 각 그룹간 유의성을 검증하였다. 통계적으로 p 값이 0.05 미만인 경우에 유의적 차이가 있다고 판정하였다.
< 실시예 4> 기도과민성 ( Airway hyperresponsiveness ) 확인
천식에 있어 기도과민성은 주요 증상 중에 하나이다. 천식 발생에 의한 기도과민성을 측정하기 위해 one chamber plethysmography(All Medicus, Korea)를 이용하였다. 기도 저항의 정도는 enhaced pause(Pehn)을 측정하여 평가하였다.
구체적으로, 실시예 <3-2>에 나타낸 바와 같이 실험군에 난백알부민을 복강투여하였으며, 마지막 난백알부민 노출 후 24시간 뒤 Pehn의 측정은 정상 호흡 상태에서 기저값을 측정한 후 PBS를 초음파분무기를 이용하여 3분간 흡입시킨 후 3분간 측정하였다. 이후 메타콜린(methylcholine, A2251, Sigma-Aldrich)을 12, 25, 50 mg/mL의 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후 Penh 값을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 본 발명에서 천식유도군(OVA)은 메타콜린(methylcholine) 농도가 증가함에 따라 정상대조군에 비하여 기도과민성이 크게 증가하였다. 반면, 양성대조군인 몬테루카스트(montelukast) 투여군(Mon)은 천식유도군(OVA)에 비해 메타콜린 농도가 증가함에 따라 기도과민성이 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 황칠나무 추출물 투여군에서 메타콜린 농도가 증가함에 따라 천식유도군(OVA)에 비해 기도과민성의 감소가 관찰되었으며, 이러한 효과는 황칠나무 분획물 8 및 분획물 11 투여군에서 현저하게 나타나는 것을 확인하였다(도 3).
< 실시예 5> 기관지 폐포세척액( Bronchoalveolar lavage fluid , BALF ) 분리 및 염증세포 수 확인
호산구증가증은 천식에 있어 주요한 특징 중에 하나이다. 천식 발생에 의한 호산구 및 염증세포의 분석을 위해 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 실시예 <3-2>에 나타낸 바와 같이 실험군에 난백알부민을 복강투여하였으며, 마지막 난백알부민 노출 후 48시간 뒤에 펜토바비탈(50 mg/kg, Entobal, Hanil, Korea)를 복강투여하여 마취시킨 후 기관지 절개를 실시하여 총 1.4 mL의 PBS로 기관지 폐포 세척을 실시하여 검체를 수거하였다. 각 개체의 기관지 폐포세척액은 회수된 다음 Cytospin(Hanil, Korea)을 이용하여 세포를 슬라이드에 부착시킨 후, Diff-Quik 염색(Sysmex, Switzerland)을 실시하여 호산구를 비롯한 그 외 염증세포를 현미경을 통해 검경한 후, 400배 배율에서 각 샘플당 4곳의 현미경 사진촬영을 하였고, 이에 따른 각 샘플당 염증세포 수를 개수하였다.
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 천식유도군에서는 정상대조군에 비해 호산구를 비롯한 염증세포의 수가 크게 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 황칠나무 추출물 투여군에서는 염증세포의 현저한 감소가 관찰되었으며, 이러한 감소는 모든 황칠나무 분획물 투여군에서 크게 나타났고, 이는 양성대조군인 몬테루카스트 투여군에서 유사하게 나타나는 것을 확인하였다(표 4).
기관지 폐포세척액 내 염증세포 수에 미치는 영향
Group 호산구 대식구 림프구 호중구 총 염증세포
정상대조군(NC) 0±0 26.5±6.3 0.2±0.2 2.0±1.3 28.6±6.9
천식유도군(OVA) 138.8±15.5# 138.4±22.4# 23.0±3.0# 5.6±6.8 305.9±18.3#
양성대조군(Mon) 66.6±36.4* 86.5±22.4* 9.5±3.1* 4.8±3.6 167.4±44.0*
황칠나무 추출물 92.5±39.6 80.8±28.8* 15.3±7.3* 3.5±2.0 192.1±65.1*
황칠나무 분획물 8 79.1±25.8* 65.4±19.4* 10.3±3.7* 3.4±1.3 158.1±46.8*
황칠나무 분획물 9 80.9±39.9* 69.8±26.5* 1.8±1.7* 3.7±1.1 156.1±61.2*
황칠나무 분획물 10 64.1±13.7* 76.7±20.6* 2.2±2.3* 9.7±7.0 152.7±31.9*
황칠나무 분획물 11 79.2±6.7* 74.9±18.4* 2.6±2.0* 6.1±3.2 162.7±23.8*
< 실시예 6> 기관지 폐포세척액 내 사이토카인( cytokine ) 확인
각 개체에서 분리한 기관지 폐포세척액에서 인터루킨(Interleukin)-4, -5, -13의 생성량을 분석하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 5>와 같이 기관지 폐포세척액을 분리하였으며, 인터루킨(Interleukin)-4, -5, -13은 시판용 효소면역분석(Enzyme-liked immunosorbent assay, ELISA) 키트(R&D System, USA)를 이용하여 측정하였다. 각 사이토카인(cytokine) 분석은 제조사의 실험방법에 따라 실시하였으며, ELISA reader(Molecular Devices, USA)를 통해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이 Th2(T helper type 2) 타입 사이토카인인 IL-4은 천식유도군에서 정상대조군에 비해 현저하게 증가되는 것을 확인하였다. 반면 양성대조군인 몬테루카스트 투여군과 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군은 IL-4의 생성 천식유도군에 비해 크게 억제되었으며, 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군과 양성대조군의 억제량은 거의 유사하게 나타났다. IL-5 및 IL-13의 생성 또한 천식유도군에서 정상대조군에 비해 현저하게 증가되었으며, IL-5의 경우 황칠나무 분획물 9 및 분획물 10 투여군을 제외한 모든 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군에서 유의성 있는 감소가 관찰되었고, IL-13은 황칠나무 분획물 9 투여군을 제외한 모든 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군에서 유의성 있게 감소되는 것을 확인하였다(표 5).
기관지 폐포세척액 내 Th2(T helper type 2) 타입 사이토카인에 미치는 영향
Groups IL-4 (pg/mL) IL-5 (pg/mL) IL-13 (pg/mL)
정상대조군(NC) 9.49±4.53 10.30±0.36 29.12±3.58
천식유도군(OVA) 51.88±16.44# 20.96±2.39# 87.51±17.20#
양성대조군(Mon) 22.69±7.56* 14.37±1.73* 52.99±11.03*
황칠나무 추출물 31.45±8.89* 15.26±3.04* 58.22±11.04*
황칠나무 분획물 8 26.69±6.81* 16.39±2.24* 67.39±8.98*
황칠나무 분획물 9 32.93±14.24* 16.79±4.30 91.97±42.04
황칠나무 분획물 10 30.70±12.14* 16.29±3.86 61.69±8.12*
황칠나무 분획물 11 19.20±9.21* 15.86±4.08* 77.36±18.98
< 실시예 7> 혈청 내 난백알부민 특이 IgE 확인
각 개체에서 분리한 혈청 내 난백알부민 특이 IgE의 측정을 위해 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-2>와 같이 48시간 뒤에 펜토바비탈(50 mg/kg, Entobal, Hanil, Korea)를 복강투여하여 마취시킨 후, 후대정맥을 통하여 수득한 혈액은 상온에서 30분간 반응시킨 후, 원심분리(3000 rpm, 15 min) 하여 혈청을 얻었다. 혈청 내 난백알부민 특이 IgE의 측정을 위하여 ELISA법을 이용하였다. 난백알부민 특이 IgE는 시판되는 IgE(Biolegend Ins., USA)를 사용하여 측정하였으며, 난백알부민 특이 IgE는 96-well flat bottom ELISA plate에 난백알부민을 20 ug/mL의 농도로 0.1 M NAHCO3 완충액(pH 8.3)에 녹여 4℃에서 16시간 반응시켰다. 그 후 1% bovine serum albumin이 함유된 PBS로 비특이 반응을 억제시켰다. 혈청 검체는 1:400으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 0.05% Tween 20이 함유된 PBS로 세척하였다. 퍼옥시다아제(peroxidase)가 결합된 HRP-conjugated goat anti-rat IgG polyclonal A를 4000 배 희석하여 실온에서 1시간 반응시킨 후, 발색은 3,3'5,5'-tetramethylbenzidine을 기질로 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 혈청 내 난백알부민 특이 IgE는 천식유도군에서 정상대조군에 비해 크게 증가하였으며, 반면 양성대조군인 몬테루카스트 투여군은 천식유도군에 비해 현저하게 감소된 것을 확인하였다. 또한, 황칠나무 분획물 9를 제외한 모든 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군은 혈청 내 난백알부민 특이 IgE가 천식유도군에 비해 크게 감소하는 것을 확인하였다(표 6).
혈청 내 천식유도군(OVA) 특이적 IgE에 미치는 영향
Groups 난백알부민 특이 IgE (ng/mL)
정상대조군(NC) -
천식유도군(OVA) 165.17±30.09#
양성대조군(Mon) 65.40±32.87*
황칠나무 추출물 60.04±21.29*
황칠나무 분획물 8 93.63±30.83*
황칠나무 분획물 9 155.67±56.67
황칠나무 분획물 10 95.03±57.59*
황칠나무 분획물 11 78.58±29.60*
< 실시예 8> 기관지 조직의 염증세포 침윤 및 점액분비 확인
각 개체에서 분리한 기관지 조직의 기도 염증 및 기관지 내 점액분비를 확인하기 위해 하기와 같이 실험하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 5>와 같이 분리한 폐를 떼어내어 즉시 10% formaldehyde 용액에 고정한 후 세절하여 흐르는 물에 8 시간 수세한 다음, epoxy에 포매하고, 이것을 microtome으로 절편을 만들어 표준방법에 의하여 폐 조직 내 염증을 관찰하기 위하여 Hematoxylin & Eosin 염색을, 기관지 내 점액분비를 관찰하기 위하여 periodic acid Schiff(PAS, IMEB Inc., USA) 염색을 수행하였다. 또한, 광학현미경을 이용하여 폐 조직의 병리학적 변화를 검정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 난백알부민으로 유발된 천식유도군은 정상군에 비해 기관지 주위의 염증세포의 침윤이 크게 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 양성대조군인 몬테루카스트 투여군은 천식유도군에 비해 염증세포의 침윤이 감소되었으며, 황칠나무 추출물을 비롯한 모든 분획물에서 염증세포 침윤의 감소가 관찰되는 것을 확인하였다(도 4).
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이 난백알부민으로 유발된 천식유도군은 기관지내 점액분비가 정상군에 비해 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 반면 양성대조군인 몬테루카스트 투여군은 천식유도군에 비해 점액분비가 감소하였으며, 황칠나무 추출물 및 분획물 투여군은 천식유도군에 비해 점액분비가 감소되는 것을 확인하였다(도 5).

Claims (11)

  1. 황칠나무(Dendropanax morbifera)의 잎 추출물 또는 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 활성 분획물은 황칠나무 추출물을 컬럼크로마토그래피에 10 내지 100% 메탄올로 1 내지 200분 분획한 것을 특징으로 하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 Th2(T helper type 2) 타입 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 난백알부민 특이 IgE 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  8. 황칠나무의 잎 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 천식 예방 및 개선용 건강 기능 식품.
  9. 황칠나무의 잎 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  11. 황칠나무의 잎 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 개선용 건강 기능 식품.
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