KR101957404B1 - 골 형성 세포 시트 제작용 조성물 및 제작 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포, 골 형성 세포 배지 또는 젤라틴을 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 형성을 촉진하는 골형성 세포 시트 제작용 조성물 및 중간엽 줄기세포, 골 형성 세포 배지 또는 젤라틴을 유효성분으로 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 형성을 촉진하는 골 재생용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 골 재생용 조성물은 골 재생 촉진을 위한 세포치료제로서 사용이 가능하다.

Description

골 형성 세포 시트 제작용 조성물 및 제작 방법 {Compositions and method for producing bone forming cell sheets}

본 발명은 골 형성 세포 시트 제작용 조성물 및 제작 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 중간엽 줄기세포, 골 형성 세포 배지, 및 젤라틴을 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 형성을 촉진하는 물질로, 골형성 세포 시트 제작용 조성물 및 골 형성 세포 배지에 젤라틴을 첨가하여 젤라틴을 액상화하는 단계, 및 상기 골형성 세포 배지를 중간엽 줄기세포에 첨가하는 단계를 포함하는 골형성 세포 시트 제작 방법에 관한 것이다.

최근 들어 이식 세포의 생존율 및 체내 유지율을 극대화하기 위하여 세포 시트 기술 (Cell sheet technique)이 개발되고 있다. 세포 시트 기술이 가지는 가장 큰 장점은 살아있는 세포를 목적하는 부위에 효과적으로 전달할 수 있다는 점이다. 이와 같은 기술은 치주 조직, 각막, 식도, 및 심장과 같은 여러 장기들의 치료에 적용되어 왔다. 또한, 골 형성 분화 세포 시트 기술 (Osteogenically differentiated cell sheet technique)이 골 형성 (Osteogenesis) 및 골 치료 (Bone healing) 방법을 개선하는데 여러 방식으로 적용되어 왔는데, 여기에는 분절된 골 결손 부위에 상기 골 형성 세포 시트를 직접 이식을 하거나 체내에 피하 이식을 하는 방법 등이 존재한다.

아스코르브산의 안정된 내산화성 유도체 (Stable oxidation-resistant derivative)인 L-아스코르브산-2-포스페이트 (L-ascorbic acid 2-phosphate, Asc)가 세포외 매트릭스 (Extracellular Matrix Production, ECM)의 생산을 촉진시키는 보충물로 사용하는 것이 알려져 있지만, 상기 Asc 및 덱사메타손 (Dexamethason, Dex)을 동시에 사용하여 골 형성 분화 세포 시트를 제조하는 경우에는 형체를 가진 충분한 두께의 시트를 생산하기 위해서는 최소한 10일 이상의 장시간이 소요되는 문제점 외에, 장기간 배양을 통한 덱사메타손에 의한 골분화는 세포증식을 억제하는 효과가 존재하여 제조된 골 형성 세포 시트의 가장자리가 접히는 등의 시트의 품질 저하 문제도 발생하는 것으로 알려져있다.

이에, 본 발명자들은 골 형성 세포 시트를 체내에 치료 목적으로 활용 (in vivo application)하기 위해 필요한 양을 신속하게 생산하기 위해서 고형의 젤라틴이 용해된 액체 형태의 젤라틴을 사용하여 상기 골분화 배지에 젤라틴을 첨가한 결과 젤라틴이 세포 생장 및 세포외 기질 형성을 촉진하여 건실한 골 형성 세포 시트를 만들 수 있음을 확인하여 본 기술을 완성하였다.

본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell; MSC), 골 형성 세포 배지, 및 젤라틴을 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 (Extracellular matrix; ECM) 형성을 촉진하는 골형성 세포 시트 제작용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 골 형성 세포 배지에 젤라틴을 첨가하여 젤라틴을 액상화하는 단계, 및 상기 골형성 세포 배지를 중간엽 줄기세포에 첨가하는 단계를 포함하는 골형성 세포 시트 제작 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 골형성 세포 시트 제작 방법에 의해서 제조된 골 형성 세포 시트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 중간엽 줄기세포, 골 형성 세포 배지, 및 젤라틴을 유효성분으로 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 형성을 촉진하는 골 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명자들은 액상 젤라틴을 포함하는 골 형성 세포 배지상에서 중간엽 줄기세포를 배양하여 골형성 세포 시트가 생성되는 기술을 개발하였고, 이때 상기 액상 젤라틴은 중간엽 줄기세포의 생장 및 세포외 기질의 형성을 촉진하는 효과가 있었다.

본 발명의 일 예는 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell; MSC), 골 형성 세포 배지, 및 젤라틴을 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 (Extracellular matrix; ECM) 형성을 촉진하는 골형성 세포 시트 제작용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 골 형성 세포 배지에 젤라틴을 첨가하여 젤라틴을 액상화하는 단계, 및 상기 골형성 세포 배지를 중간엽 줄기세포에 첨가하는 단계를 포함하는 골형성 세포 시트 제작 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 상기 골형성 세포 시트 제작 방법에 의해서 제조된 골 형성 세포 시트에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일예는 중간엽 줄기세포, 골 형성 세포 배지, 및 젤라틴을 유효성분으로 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 형성을 촉진하는 골 재생용 조성물을 제공에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일례는 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell; MSC), 골 형성 세포 배지, 및 젤라틴을 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 (Extracellular matrix; 이하 ECM) 형성을 촉진하는 골형성 세포 시트 제작용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "줄기세포"란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로서, 배아 줄기세포 및 성체 줄기세포로 구분된다.

용어 "성체줄기세포 (adult stem cell)"는 제대혈 (탯줄혈액) 또는 성인의 골수, 혈액, 신경 등에서 추출해낸 줄기세포로, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다.　상기 성체줄기세포는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell), 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell), 신경줄기세포 (neural stem cell) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 성체줄기세포는 포유류, 예컨대 사람의 성체줄기세포일 수 있다. 성체줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 여러 종류의 성체줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 다양한 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있어서, 난치병/불치병 치료에 유리하게 적용될 수 있다.

용어 "중간엽 줄기세포"는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포의 한 종류로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 성체 줄기세포 중 조혈모세포는 주로 부유상태 (non-adherent)로 존재하지만 중간엽 줄기세포는 주로 부착성 세포들이다. 일 예에서, 중간엽 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 제대 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 근육 유래 중간엽 줄기세포, 신경 유래 중간엽 줄기세포, 피부 유래 중간엽 줄기세포, 양막 유래 중간엽 줄기세포, 태반 유래 중간엽 줄기세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 둔부 피하 지방의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포일 수 있다.

상기 중간엽 줄기 세포는 포유류, 예컨대 인간 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 적용되는 대상으로부터 유래하는 중간엽 줄기 세포 (자가 유래 중간엽 줄기세포), 또는 적용되는 대상과 동종 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다.

상기 둔부 피하 지방이란 둔부의 진피와 근막 사이에 존재하는 조직을 의미하는 것으로서, 상기 둔부 피하 지방의 지방 조직을 무균적으로 채취하고 배양하여 중간엽 줄기세포를 분리해 낼 수 있으나, 상기 분리 방법에 반드시 한정되는 것은 아니다.

상기 둔부 피하 지방의 지방 조직에서 분리해낸 중간엽 줄기세포는 골, 연골, 신경으로 분화가 가능하기 때문에 세포치료 하는데 사용될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 일 태양은 인간 또는 포유류 둔부 피하 지방의 지방 조직에서 분리한 중간엽 줄기 세포를 이용하는 것이다.

한편, 본 발명에 따른 중간엽 줄기 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 분리, 증식 및/또는 배양될 수 있다.

적절한 배지는 동물 세포 및 특히, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 이용 가능한 배지를 사용할 수 있다.

상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, 일반적으로 배양에 이용되는 기본 배지로는 MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium)이 있으며, 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지라면 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게는, α-MEM 배지(GIBCO), K-SFM 배지, DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), DMEM/F12 배지, PCM 배지, M199/F12(mixture)(GIBCO), 및 MSC 확장배지(Chemicon)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 이러한 기본 배지에, 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 비제한적인 예로서, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원이 첨가될 수 있다. 그러나 당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 다양한 조직 기원 유래 줄기세포에 가장 적합한 배지를 선택 또는 조합하여 공지의 방법으로 적절히 배양할 수 있음은 자명할 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 중간엽 줄기세포를 배양하기 위해서 10%의 FBS와 1%의 페니실린/스트렙토마이신 (HyClone)이 추가된 저 글루코스 DMEM (HyClone, Logan, UT, USA) 배지 (이하 기본배지)를 사용하였다. 줄기세포 배양용으로는 저 글루코스 배지가 적합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 이 분야의 통상의 지식에 기초하여 적합한 배양 환경, 시간, 온도 등의 조건을 조절하면서 배양할 수 있음은 자명하다.

본 발명에서 상기 중간엽 줄기세포에서 세포 시트를 형성하기 위해서 중간엽 줄기세포를 배양하는 배지 (이하 기본배지)를 아스코르브산 유도체, 및 덱사메타손을 포함하는 배지로 교체할 수 있으며, 상기 교체하는 배지는 FBS, 항생제, L-아스코르브산 2-포스페이트 (Asc; Sigma-Aldrich), 덱사메사손 (Dex; Sigma-Aldrich), 및 β-글리세로포스페이트 (Sigma-Aldrich)를 포함하는 고 글루코스 DMEM (HyClone, Logan, UT, USA) (이하 골 형성 세포 배지)일 수 있으며, 바람직하게는 상기 배지에 젤라틴을 첨가하여 액상 젤라틴이 된 것일 수 있다.

상기 골 형성 세포 배지는 다형성능을 가지는 줄기세포, 조골전구세포 (pre osteoblast), 또는 성체줄기세포를 골아세포 (Osteoblast)로 분화시키는 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, 상기 골 형성 세포 배지에는 골 세포 분화 촉진인자를 포함하고 있을 수 있다.

상기 골 세포 분화 촉진인자는 L-아스코르브산 2-포스페이트 (Asc), 덱사메사손 (Dex), 및 β-글리세로포스페이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 줄기세포를 분화시키기 위한 목적으로 고 글루코스 배지를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 β-글리세로포스페이트는 골분화 촉진을 위해서 덱사메타손과 같이 사용할 수 있으나, 덱사메타손만을 사용하여 골분화 촉진하는 것도 가능하다.

본 발명에서 중간엽 줄기세포에서 세포 시트를 형성하기 위해서 교체되는 배지에 첨가되는 젤라틴 (Gelatin)은 동물의 가죽 ·힘줄 ·연골 등을 구성하는 천연 단백질인 콜라겐을 뜨거운 물로 처리하면 얻어지는 유도 단백질의 일종으로서, 콜라겐으로부터 젤라틴으로의 변화는 펩티드 사슬의　가수분해에 의한다고도 하고, 펩티드 사슬 사이의 염류결합이나　수소결합의 개열에 의한다고도 한다.

피부 조직으로부터 파생된 변성 콜라겐인 젤라틴 (Gelatin)은 생체 적합성이나 생물 분해성이 높은 특성이 있음이 알려져 있다. 젤라틴은 세포와 주변 ECM 사이의 관계를 안정화하는데 중요한 아르기닌-글리신-아스파르트산 (RGD) 시퀀스 (Sequence)를 포함한다. 또한, 상기 RGD 시퀀스는 인테그린과의 상호작용을 통해 세포 부착을 향상시킨다.

상기 골 형성 세포 배지에 첨가하는 젤라틴은 분말 상태이거나 액상의 젤라틴일 수 있고, 분말 젤라틴을 배지에 첨가할 경우 상기 배지에 첨가되어 액상 형태의 젤라틴이 된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 (Extracellular matrix; ECM) 형성을 촉진하는 역할을 할 뿐, 젤폼을 형성하여 스캐폴드 기능 (세포 지지체)을 하는 것은 아니다.

상기 젤라틴의 농도는 1 내지 200 mg/mL, 5 내지 200 mg/mL, 또는 10 내지 100 mg/mL일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 100 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 젤라틴의 농도가 본 발명에서 사용한 농도와 달리 너무 높으면, 젤라틴 자체가 세포 생장 및 세포외 기질의 형성을 촉진하는 역할을 할 수 없을 수 있다.

반면, 상기 젤라틴을 글루탈알데하이드로 교차결합시키고 수화시키면 젤화되어 세포 지지체로서 역할을 하게 되므로, 저농도의 젤라틴을 사용하더라도 젤화된 형태의 젤라틴은 본 발명에서와 같이 세포 생장 및 세포외 기질 형성을 촉진하는 역할을 할 수는 없다.

또한, 젤라틴이 본 발명과 다르게 세포 지지체로 역할을 수행하기 위해서는, 일반적으로 젤라틴 단독으로 사용되는 것이 아니라, 키토산, 피브린 글루, 히알루론산, 콜라겐, 셀루로오스 및 펙틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 성분과 함께 젤라틴이 사용된다.

본 발명에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 기본배지를 젤라틴을 포함하는 골 형성 세포 배지로 교체하여 골 형성 세포 시트를 형성할 수 있으며, 상기 골 형성 세포 배지에 젤라틴을 첨가함으로써 세포 생장이 촉진되고 세포외 기질의 형성이 촉진될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 세포 시트를 형성하기 위해서 교체하는 배지는 상기 중간엽 줄기세포가 배양 접시 (Dish)에 꽉차서 성장을 멈추기 전 (컨프루언시가 100%가 되기전)에 기본배지와 대체하여 주입할 수 있고, 바람직하게는 상기 중간엽 줄기세포의 컨플루언시 (confluency)가 50 내지 90%일 때 주입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일례는 골 형성 세포 배지에 젤라틴을 첨가하여 젤라틴을 액상화하는 단계, 및 상기 골 형성 세포 배지를 중간엽 줄기세포에 첨가하는 단계를 포함하는 골 형성 세포 시트 제작 방법에 관한 것이다.

상기 골 형성 세포 시트 형성을 유도하기 전에 중간엽 줄기세포는 상기 기본배지하에서 배양하고, 상기 골 형성 세포 시트 형성을 유도하기 위해서 상기 기본배지상에서 배양하는 중간엽 줄기세포의 컨플루언시가 100%가 되기 전에 상기 기본배지를 FBS, 항생제, L-아스코르브산 2-포스페이트 (Asc; Sigma-Aldrich), 덱사메사손 (Dex; Sigma-Aldrich), 및 β-글리세로포스페이트 (Sigma-Aldrich)를 포함하는 고 글루코스 DMEM (제조사, 카탈로그 넘버) 배지 (이하 골 형성 세포 배지)로 교체할 수 있으며, 상기 고 글루코스 DMEM에는 분말 상태이거나 액상의 젤라틴이 첨가된 것일 수 있다.

상기 골 형성 세포 시트 형성을 유도하기 위해서 사용하는 골 형성 세포 배지에 젤라틴을 첨가하는 단계는 골 형성 세포 배지를 중간엽 줄기세포에 첨가하는 단계와 동시 또는 이시에 수행되는 것 일수 있다.

상기 골 형성 세포 배지에 젤라틴을 첨가하여 젤라틴을 액상화하는 단계, 및 상기 골형성 세포 배지를 중간엽 줄기세포에 첨가하는 단계를 동시에 수행하는 것은 중간엽 줄기세포의 기본배지를 제거하고 골 형성 세포 배지와 젤라틴을 동시에 첨가하는것을 의미하고, 상기 골 형성 세포 배지에 젤라틴을 첨가하여 젤라틴을 액상화하는 단계, 및 상기 골형성 세포 배지를 중간엽 줄기세포에 첨가하는 단계를 이시에 수행하는 것은 중간엽 줄기세포를 기본배지에 배양하는 동안 젤라틴을 골 형성 세포 배지에 주입하여 완전히 액상화 시킨 배지를 만든 후에, 중간엽 줄기세포의 기본배지를 제거하고 상기 젤라틴이 액상화된 골 형성 세포 배지를 첨가하는 것을 의미하거나 중간엽 줄기세포의 기본배지를 제거하고 젤라틴이 포함되지 않은 골 형성 세포 배지로 배지를 교체하여 배양한 후에 젤라틴을 첨가하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 배지에 첨가하는 젤라틴은 분말 상태이거나 액상의 젤라틴일 수 있고, 분말 젤라틴을 골 형성 세포 배지에 첨가할 경우 상기 배지에 첨가되어 액상 형태의 젤라틴이 된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 젤라틴의 농도는 1 내지 200 mg/mL, 5 내지 200 mg/mL, 또는 10 내지 100 mg/mL일 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 100 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일례는 상기 골 형성 세포 시트 제작 방법에 의해서 제조된 골 형성 세포 시트에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "세포 시트 (Cell sheet)"는 세포 배양 접시에 단일층으로 자라는 것이 아닌, 다층의 세포가 세포 접합부 및 세포 외 기질 (ECM)을 갖는 형태로 자라는 것을 의미하여, 상기 세포 시트는 안구 표면, 치주 인대, 심장 패치, 방광 확대, 및 골 재생 등을 포함한 다양한 조직 재건을 위해 사용될 수 있음이 알려져 있으며, 본 발명에서는 골 형성 효과가 있기 때문에 골 형성 세포 시트라고 사용한다.

본 발명에서는 상기 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell; MSC), 골 형성 세포 배지, 및 젤라틴을 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 (Extracellular matrix; ECM) 형성을 촉진하는 골형성 세포 시트 제작용 조성물을 사용하고, 상기 골 형성 세포 배지에 젤라틴을 첨가하여 젤라틴을 액상화하는 단계, 및 상기 골형성 세포 배지를 중간엽 줄기세포에 첨가하는 단계를 포함하는 골형성 세포 시트 제작 방법을 통해 골 형성 세포 시트를 제작하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일례는 중간엽 줄기세포, 골 형성 세포 배지, 및 젤라틴, 및 상기 골형성 세포 시트 제작 방법에 의해서 제조된 골 형성 세포 시트중 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 형성을 촉진하는 골 재생용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 중간엽 줄기세포, 골 형성 세포 배지 또는 젤라틴을 유효성분으로 포함하는 조성물이 골 형성 효과가 있음을 골 형성 마커의 발현 분석 및 알리자린 레드 S 염색 결과로 확인하였다 (실험예 4 내지 5).

상기 골 재생용 조성물은 골 형성 효과가 있어 골절 질환, 골다공증, 또는 허혈성 골질환의 예방 또는 치료 효과가 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 중간엽 줄기세포, 골 형성 세포 배지, 및 젤라틴을 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 형성을 촉진하는 골형성 세포 시트 제작용 조성물 및 중간엽 줄기세포, 골 형성 세포 배지, 및 젤라틴을 유효성분으로 포함하고 상기 젤라틴은 세포 생장 및 세포외 기질 형성을 촉진하는 골 재생용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 골 재생용 조성물은 골 재생 촉진을 위한 세포치료제로서 사용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라 개 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포를 다양한 배지에서 배양했을 때의 세포 형태 차이를 관찰한 결과이다. 상단 (A, B, C)은 40배 배율, 하단 (D, E, F)은 100배 배율로 위상차 현미경으로 관찰한 것으로서, A, 및 D는 UC를 기본 배지에서 배양한 것, B, 및 E는 GSC를 유도하는 배지에서 배양한 것, C, 및 F는 OCS를 유도하는 배지에서 배양한 것을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 GCS (A) 또는 OCS (B)를 H&E로 염색을 하고 현미경으로 관찰한 결과이다. 스케일바는 200 um를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 GCS 또는 OCS에서의 세포 증식 속도를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 GCS 및 OCS의 1, 3, 5, 7, 및 10일에서 골 형성 유전자 마커의 발현을 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 GSC 및 OCS를 알리자린 레드 S로 염색하여 골 형성을 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 . 통계 분석

모든 측정값들은 SPSS 버전 23.0 (SPSS Inc., Chigaco, IL, USA)를 사용하여 분석하였다. 그룹 간의 차이를 분석하는데 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하였고, 상기 차이점들을 확인하는 것은 Mann-Whitney U 테스트를 사용하였다. 통계적으로 유의한 값은 p < 0.05로 정의되었다. 데이터들은 평균 ± 표준 편차로 제시되었다.

실시예 1. 젤라틴이 있는 배지상에서 골형성 세포 시트의 제작

1-1. 중간엽 줄기세포의 배양

골형성 세포 시트를 제작하기 위해서 하기와 같은 방법으로 중간엽 줄기세포를 배양하였다.

구체적으로, 중간엽 중기세포를 채취하기 위해서, 3년령의 비글 견의 둔부 피하 지방에서 지방 조직을 무균적으로 채취하였다. 대략 1 g의 지방 조직을 DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline; Gibco, Grand Island, NY, USA)로 세척하고, 잘게 다진 후, 1 mg/ml의 콜라겐 분해 효소 I형 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo. USA) 으로 37℃에서 2시간 동안 분해했다. 상기 분해한 샘플을 DPBS로 세척하고 10분간 980 x g로 원심분리하였다. 기질 혈관 분획 펠렛 (Stromal vascular fraction pellets)을 DPBS로 재부유시키고 100 um 나일론 메시를 통해 여과하였다. 샘플을 37℃, 5% CO2 가습 조건에서 10% (v/v)의 FBS (fetal bovine serum; HyClone)가 추가된 저 글루코스 (1000mg/dl) DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium; HyClone, Logan, UT, USA)에서 밤새 배양하였다. 24시간 후, 잔여 적혈구와 부착되지 않은 세포를 DPBS로 제거하였다. 목표하는 컨플루언시 (confluency)에 도달하였을 때, 배양액을 갈아주면서 48시간 간격으로 90% 컨플루언시를 갖도록 계대배양하였다. 3계대째 중간엽 줄기세포를 실험에 사용하였다.

상기 방법으로 얻은 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal Stem Cells; 이하 MSC) (5x105 cells)를 100-mm 배양 접시 위에서 5% CO2 가습 조건에서 10%의 FBS와 1% (w/v)의 페니실린/스트렙토마이신 (HyClone)이 추가된 저 글루코스 (1000mg/dl) DMEM (HyClone, Logan, UT, USA)로 구성된 기본배지로 배양하였다. 줄기세포가 70-80% 컨플루언시에 도달하였을 때, 기본배지를 실험 조건에 따라 하기 배지로 교체하였다. 다만, 미분화된 중간엽 줄기세포 (Undifferentiated Mesenchymal stem cells; 이하 UCs)를 배양하는 경우에는 상기 기본배지에서 줄기세포가 100% 컨플루언시에 도달할 때까지 배양하였다.

1-2. 액상 젤라틴을 첨가하여 세포 시트의 형성 유도

젤라틴에 의해서 유도된 세포 시트 (Gelatin-induced cell sheet; 이하 GCS)를 형성하기 위해서, 상기 줄기세포가 70-80% 컨플루언시에 도달하였을 때 상기 기본배지를 10% (v/v)의 FBS, 1% (w/v)의 페니실린/스트렙토마이신 (HyClone), 15 ug/ml의 L-아스코르브산 2-포스페이트 (Asc; Sigma-Aldrich), 0.1 μM의 덱사메사손 (Dex; Sigma-Aldrich), 10 mM의 β-글리세로포스페이트 (Sigma-Aldrich), 및 0.02 g/ml의 젤라틴 (Sigma-Aldrich)을 함유하는 고 글루코스 (4500mg/dl) DMEM (HyClone, Logan, UT, USA)에 배양하였다.

다만, 상기 기본배지를 젤라틴 등을 함유한 고 글루코스 DMEM으로 교체하기 전에 상기 젤라틴 분말을 상기 고 글루코스 DMEM에 0.02 g/mL 농도가 되도록 첨가했고, 37℃ 배양기 (water bath)에 용해시켜 젤라틴 분말이 상기 고 글루코스 DMEM에 완전히 녹아 액상 젤라틴이 되도록 만든 후에, 상기 액상 젤라틴 등을 함유한 고 글루코스 DMEM로 상기 기본배지를 교체했다.

상기와 같이 줄기세포를 액상 젤라틴 등을 함유한 고 글루코스 DMEM로 교체한 후 1일, 3일, 5일, 7일 및 10일째가 되었을 때 골 형성 세포 시트의 형성 여부를을 확인하였고, 상기 고 글루코스 DMEM로 교체한 후 3일째부터 골 형성 세포 시트가 형성됨을 확일 할 수 있었다.

비교예 1. 젤라틴이 없는 배지상에서 골 형성 세포 시트의 제작

젤라틴의 첨가 없이 골 형성 세포 시트 (Osteogenic Cell Sheet; 이하 OCS)를 형성하기 위해서 하기와 같은 방법으로 중간엽 줄기세포를 배양하였다.

구체적으로, 실시예 1과 같은 방법으로 중간엽 줄기세포를 배양하고, 상기 줄기세포가 70-80% 컨플루언시에 도달하였을 때 기본배지를 10%의 FBS, 1%의 페니실린/스트렙토마이신 (HyClone), 50 ug/ml의 L-아스코르브산 2-포스페이트 (Asc; Sigma-Aldrich) 및 0.1 uM의 덱사메사손 (Dex; Sigma-Aldrich)을 함유하는 고 글루코스 DMEM 배지로 교체하였다. 상기 배지 교체 후 1일, 3일, 5일, 7일 및 10일째가 되었을 때 골 형성 세포 시트의 형성을 확인하였고, 상기 배지 교체 후 5일째부터 골 형성 세포 시트가 형성됨을 확인 할 수 있었다.

실험예 1. OCSs / GCSs의 형태학적 차이 확인

미분화된 중간엽 줄기세포 (Undifferentiated Mesenchymal stem cells; UCs)가 골 형성 세포 시트 (Osteogenic Cell Sheet, OCS) 또는 젤라틴에 의해서 유도된 세포 시트 (Gelatin-induced cell sheet; GCS)로 분화할 때 형태학상의 변화를 확인하기 위해서 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.

실시예 1과 같은 방법으로 개 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포 (Mesenchymal stem cell; MSC)를 분리하여 UC를 얻어 배양하고, 배지를 교체하여 UC에서 GCS로 분화시키거나, 비교예 1과 같은 방법으로 개 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포를 분리하여 UC를 얻어 배양하고, 배지를 교체하여 UC에서 OCS로 분화시켰다. 상기 방법으로 UC에서 GCS 또는 OCS로 분화시키는 배양 동안의 세포의 형태 변화는 제조사 프로토콜을 사용하여 위상차 현미경 (Evos, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 모니터하고 이미지화하였다.

그 결과 도 1의 A, 및 D에서 확인할 수 있는 바와 같이, 미분화된 중간엽 줄기세포 (Undifferentiated Mesenchymal stem cells; UCs)들이 명확히 정의된 세포 주변부를 갖는 방추형 (spindle-shaped) 형태를 보였다. 반면, 방추형 UC들이 70% 컨플루언시에 도달한 후 실시예 1 또는 비교예 1과 같은 방법으로 기본배지를 다른 배지로 교체하고, 현미경으로 관찰했을 때 처음에는 방추형 모양으로 관찰된 세포들이 점차 입방형 형태로 형태가 점차 변형됨을 확인하였다.

또한, 도 1의 B, E, C, 및 F에서 확인할 수 있는 바와 같이 GCS 또는 OCS를 형성한 MSC들은 서로 붙어있어서 세포 간 경계를 구분하기가 어려웠다. GCS를 형성한 세포의 대부분은 입방형 세포 형태를 보이며 (도 1B, E), OCS를 형성한 세포들은 입방형과 방추형 세포가 혼합된 형태를 보였다 (도 1C, F). 상기와 같은 세포 시트 구조를 형성한 후에도, 실험 기간 동안 OCS 및 GCS는 상기와 같은 매트릭스 형태를 계속 유지함을 확인하였다.

실험예 2. OCSs / GCSs의 조직학적 분석

실시예 1 및 비교예 2의 방법으로 형성된 세포 시트를 하기와 같은 방법으로 조직학적으로 분석하였다.

구체적으로, 실시예 1 및 비교예 1과 같은 방법으로 줄기세포를 배양하여 UC에서 분화한 GCS 및 OCS를 얻었다. 상기 GCS 및 OCS는 배양 플레이트로부터 쉽게 분리할 수 있다. 배양 10일 째 세포 스크래퍼를 사용하여 세포 시트를 배양 플레이트에서 벗겨내고, 파라핀 포매 조직 분석 (Paraffin-embedded histological analysis)을 위해 시트를 4% (v/v)의 파라포름알데히드 (Wako, Tokyo, Japan)에서 고정시켰다. 단면을 세포 시트의 직각으로 5 um의 두께가 되게 절단하고, 재수화하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E, Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 세포를 배양하는 동안의 형태 변화와 H&E염색 후의 시트 형태는 현미경 (Evos, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 모니터하고 이미지화하였다.

그 결과 도 2의 A에서 볼 수 있는 바와 같이, GCS를 H&E로 염색을 하면 세포 사이에 ECM이 풍부하게 형성된 3층 내지 4층의 MSC이 관찰되었으나, 도 2의 B에서 볼 수 있는 바와 같이, OCS를 H&E로 염색을 하면 1층 내지 2층의 MSC이 관찰되었다. 즉, OCS는 GCS의 층에 비해 훨씬 얇았다.

상기 결과를 통해 GSC에서 형성된 ECM의 두께는 OSC에서 형성된 ECM의 두께에 비해서 2배 가량 두꺼움을 확인 할 수 있었다.

실험예 3. OCSs / GCSs의 세포 증식 속도의 차이

OCS와 비교해서 GSC는 ECM이 풍부한 다층의 MSC가 관찰되었으므로, OCS에 비해서 GSC의 세포 증식이 보다 활발한지 확인하기 위해서 하기와 같은 방법으로 OCS 및 GCS에서 세포 증식을 측정하여 비교하였다.

MSC 시트의 특성을 고려하여, 세포 증식율을 평가하기 위한 DNA 정량법을 선택하였다. 실시예 1 및 비교예 1과 같은 방법을 사용하여 개의 MSC를 OSC 및 GCS 배지의 6-웰 플레이트에 배양하였다. DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 제조사 프로토콜에 따라 사용하여 모든 이중가닥 DNA를 분리하였다. 0일, 3일, 5일, 7일 및 10일 째, 나노포토미터 (모델 1443, Implen, Munich, Germany)를 제조사 프로토콜에 따라 사용하여 DNA 함량을 측정하였다. 총 DNA 농도는 총 세포 수에 비례하였다.

그 결과 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 각 웰에 시딩된 세포의 숫자가 0일째에는 동일했음에도 불구하고 GCS에서의 세포 증식이 OCS에서의 증식보다 현저히 높음을 확인할 수 있었다. 0일째와 비교하여, GCS 및 OCS 둘 다에서 첫 3일 동안에 세포 수가 현저히 증가하였다 (*, p < 0.05). 또한, GCS의 세포 수는 3일 째 이후에도 급격하게 증가하는데 반면, OCS의 세포 수는 3일 째 이후에는 일정하게 유지되었다. 각 관찰 날짜에서 GCS의 세포 수가 OCS의 세포 수 보다 현저히 많았다 (#, p < 0.05).

상기 결과를 통해 GSC의 세포 증식 속도가 OSC에 비해서 2배 가량 높음을 확인 할 수 있었다.

실험예 4. 세포 시트에서의 골 형성 마커의 발현

GCS가 OCS에 비해서 풍부한 다층의 MSC가 관찰되고, 증식 속도가 향상됨을 확인하였으므로, GCS가 OCS에 비해서 골 형성 활성이 높은지 확인해 보기 위해서 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하여 골 형성 마커 유전자의 발현 (TGF-β (Transforming Growth Factor-β), Runx2 (Runt-related Transcription Factor 2), Axin (Axis Inhibition Protein), β-catenin, BMP-7 (Bone Morphogenic Protein 7), ALP (Alkaline Phosphatase), OPN (Osteopontin), 및 OCN (Osteocalcin))을 측정하였다.

실시예 1 및 비교예 1과 같은 방법을 사용하여 개의 MSC를 OSC 및 GCS 배지에 배양하였다. Hybrid-R RNA 추출 키트 (GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 1000 ng의 총 RNA를 템플레이트로 하여, PrimeScript II First-strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Otsu, Japan)을 사용하여 단일 풀의 상보적 DNA를 합성하였다. Real-time PCR은 ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)을 사용하여 수행하였다. 유전자 발현을 감지하는데는 Ampigene qPCR Green Mix (Enzo Life Science, Farmingdale, NY, USA)를 사용하였다. 각 유전자의 mRNA 발현 정도를 레퍼런스 유전자인 GAPDH 발현 정도로 표준화하였다. 발현 정도는 Ct 방법을 사용하여 결정하였다. 타켓 유전자의 프라이머 시퀀스가 표 1에 제시되어 있는데, 다음을 포함한다: TGF-β (Transforming Growth Factor-β), Runx2 (Runt-related Transcription Factor 2), Axin (Axis Inhibition Protein), β-catenin, BMP-7 (Bone Morphogenic Protein 7), ALP (Alkaline Phosphatase), OPN (Osteopontin), 및 OCN (Osteocalcin). GCS 및 OCS로부터의 모든 PCR 결과를 UC의 결과와 비교하였다 (*, p < 0.05).

명명	서열 (5'>3')	서열번호
GAPDH_f	CATTGCCCTCAATGACCACT	1
GAPDH_r	TCCTTGGAGGCCATGTAGAC	2
TGF-β_f	CTCAGTGCCCACTGTTCCTG	3
TGF-β_r	TCCGTGGAGCTGAAGCAGTA	4
Runx2-f	TGTCATGGCGGGTAACGAT	5
Runx2_r	TCCGGCCCACAAATCTCA	6
Axin_f	ACGGATTCAGGCAGATGAAC	7
Axin_r	CTCAGTCTGTGCCTGGTCAA	8
β-catenin_f	TACTGAGCCTGCCATCTGTG	9
β-catenin_r	ACGCAGAGGTGCATGATTTG	10
BMP-7_f	TCGTGGAGCATGACAAAGAG	11
BMP-7_r	GCTCCCGAATGTAGTCCTTG	12
ALP_f	TCCGAGATGGTGGAAATAGC	13
ALP_r	GGGCCAGACCAAAGATAGAG	14
OPN_f	GATGATGGAGACGATGTGGATA	15
OPN_r	TGGAATGTCAGTGGGAAAATC	16
OCN_f	CTGGTCCAGCAGATGCAAAG	17
OCN_r	GGTCAGCCAGCTCGTCACAGTT	18

그 결과 도 4의 A에 나타난 것과 같이, GCS 및 UC 사이의 TGF-β mRNA 발현에는 눈에 띌만한 차이점이 없었으나, 배양 7일 째 이후 OCS에서 TGF-β 발현의 상향 조절이 확인되었다 (p < 0.05). 유사하게 도 4의 B에 나타난 것과 같이, GCS내 Runx2 mRNA 발현도 통계적으로는 다르지 않으나, UC와 비교하여, 배양 3일째부터 OCS에서 Runx2가 점진적으로 상향 조절됨이 관찰되었다 (p < 0.05). 또한, 도 4의 C에서와 같이, GCS 및 OCS 둘 다에서 배양 3일째부터 Axin2 mRNA가 현저히 증가하여 발현됨이 관찰되었다 (p < 0.05).

그러나, 각 관찰 날짜에서 Axin2 수치가 OCS와 비교하여 GCS에서 훨씬 높았다 (p < 0.05). 도 4의 D에 나타난 것과 같이, GCS 및 OCS 둘 다에서, UC와 비교할 때, 관찰 날짜 3일째부터 β-카테닌 mRNA의 발현이 상향조절되었다 (p < 0.05). 5일 째 GCS내 β-카테닌 발현이 최고조에 도달한 반면, OCS의 경우에는 7일 째에 최고조에 도달했다. 도 4의 E에 나타난 것과 같이, GCS 및 OCS내 ALP mRNA 발현의 상향 조절이 배양 3일째부터 관찰되었다 (p < 0.05). 도 4의 F에 나타난 것과 같이, GCS 및 OCS에서의 BMP-7 mRNA 발현이 UC와 비교하여 배양 1일째부터 상향 조절되었으며, 그 이후부터 지속적으로 증가하였다. GCS의 BMP-7의 발현이 5일째부터 급격하게 증가하였고, 3일째부터 그 수치가 OCS 수치와 비교하여 현저히 높았다 (p < 0.05). 도 4의 G에 나타난 것과 같이, GCS 및 OCS 둘 다에서 3일째부터 OCN 발현이 증가되었다 (p < 0.05). 마지막으로 도 4의 H에서 나타난 것과 같이, UC와 비교하여, OPN mRNA의 발현이 GCS에서는 3일째부터, OCS에서 5일째부터 상향 조절되었다 (p < 0.05, 도 4H).

상기와 같은 결과를 통해 GCS에서의 골 형성 활성이 OCS에 비해서 현저하게 높음을 알 수 있다.

실험예 5. 세포 시트에서의 골 형성 측정 (알리자린 레드 S (Alizarin Red S; ARS) 염색)

알리자린 레드 S (Alizarin Red S; ARS)는 금속이온과 결합하는 성질이 있기 때문에 체내의　칼슘염 심착부를 염색하는데 사용된다. 하기와 같은 방법으로 GCS 및 OCS의 골 형성 정도를 비교하기 위해서 알리자린 레드 S의 염색을 수행하였다.

이런 이유로　생화학　분야에서 사용되고 있다. 예를 들면 뼈조직의 석회화를　비색정량할 때 사용된다. 정상인 뼈에서는　세포외기질이 형성된다

실시예 1 및 비교예 1과 같은 방법을 사용하여 개의 MSC를 OSC 및 GCS 배지의 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 6-웰 플레이트에서 배양한 샘플을 DPBS로 세척하고 4% 포름알데하이드 (Wako)에서 실온에서 10분간 고정시켰다. 이후, 이 샘플들을 증류수로 세척하고 2% ARS (pH 4.2)를 각 웰에 넣었다. 이후 플레이트를 가볍게 흔들면서 20분 동안 배양하였다. 염료를 흡입시킨 후, 웰을 증류수로 세척하였다.

그 결과 도 5에서 나타난 것과 같이, OCS 또는 GCS 모두에서 배양 10일 째에는 ARS 염색이 감지되지 않았다. 배양 21일째에서 ARS 반응성이 GCS에서만 관찰되었다.

상기 결과를 통해서, OCS에 비해서 GCS에서 골 형성 반응이 현저하게 일어남을 알 수 있다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Compositions and method for producing bone forming cell sheets <130> DPP20164556KR <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_f <400> 1 cattgccctc aatgaccact 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_r <400> 2 tccttggagg ccatgtagac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta_f <400> 3 ctcagtgccc actgttcctg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-beta_r <400> 4 tccgtggagc tgaagcagta 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx2-f <400> 5 tgtcatggcg ggtaacgat 19 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx2-r <400> 6 tccggcccac aaatctca 18 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Axin_f <400> 7 acggattcag gcagatgaac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Axin_r <400> 8 ctcagtctgt gcctggtcaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin_f <400> 9 tactgagcct gccatctgtg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-catenin_r <400> 10 acgcagaggt gcatgatttg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-7_f <400> 11 tcgtggagca tgacaaagag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-7_r <400> 12 gctcccgaat gtagtccttg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP_f <400> 13 tccgagatgg tggaaatagc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALP_r <400> 14 gggccagacc aaagatagag 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN_f <400> 15 gatgatggag acgatgtgga ta 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OPN_r <400> 16 tggaatgtca gtgggaaaat c 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN_f <400> 17 ctggtccagc agatgcaaag 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OCN_r <400> 18 ggtcagccag ctcgtcacag tt 22

Claims (19)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 골 형성 세포배지에 중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell; MSC)를 첨가하는 단계; 상기 골 형성 세포 배지에 젤라틴을 첨가하는 단계; 및 상기 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 골 형성 세포 시트 제작 방법으로서,
   상기 젤라틴은 1 내지 200mg/ml의 농도로 첨가되고, 교차결합 또는 수화가 되지 않은 미젤화 젤라틴이며, 세포 생장 및 세포 외 기질 형성을 촉진하나 세포 지지체가 아니며,
   상기 골 형성 세포 시트에서 배양된 중간엽 줄기세포는, 젤라틴이 첨가되지 않은 골 형성 세포 시트 대비, 2배 이상의 증식 속도를 가지는 것인,
   골 형성 세포 시트의 제작 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 젤라틴의 농도는 5 내지 100 mg/mL 인, 제작 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 젤라틴의 첨가는, 골 형성 세포 배지에 중간엽 줄기세포를 첨가하는 단계와 동시 또는 이시에 수행되는 것인, 제작 방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 젤라틴의 첨가는, 분말 젤라틴을 첨가하여 액상화하거나, 또는 액상 젤라틴을 첨가하여 수행하는 것인, 제작 방법.
10. 제6항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기 세포, 지방 유래 중간엽 줄기 세포, 근육 유래 중간엽 줄기 세포, 신경 유래 중간엽 줄기 세포, 피부 유래 중간엽 줄기 세포, 양막 유래 중간엽 줄기 세포, 및 태반 유래 중간엽 줄기 세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 인, 제작 방법.
11. 제6항에 있어서, 상기 골 형성 세포 배지는 골 세포 분화 촉진인자를 포함하고 있는 것인, 제작 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 골 세포 분화 촉진인자는 L-아스코르브산 2-포스페이트 (Asc), 덱사메사손 (Dex), 및 β-글리세로포스페이트로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 제작 방법.
13. 제6항 내지 제12항중 어느 한 항에 따라 골형성 세포 시트 제작 방법에 의해서 제조되며, 상기 골 형성 세포 시트에서 배양된 중간엽 줄기세포는, 젤라틴이 첨가되지 않은 골 형성 세포 시트 대비, 2배 이상의 증식 속도를 가지는 것인, 골 형성 세포 시트.
14. 제6항 내지 제12항중 어느 한 항에 따라 골형성 세포 시트 제작 방법에 의해서 제조된 골 형성 세포 시트를 포함하는, 골절질환, 골다공증 또는 허혈성 골질환의 예방 또는 치료용 조성물.
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