CA2956768A1 - Procede de production in vitro de progeniteurs adipocytaires et d'adipocytes - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de production in vitro de progéniteurs adipocytaires et d'adipocytesà partir de cellules souches pluripotentes, en particulier de cellules souches pluripotentes induites, ainsi que l'utilisation à des fins thérapeutiques ou 10 de criblage des progéniteurs adipocytaires et adipocytesainsi obtenus.

Description

2 PCT/FR2015/052085 Procédé de production in vitro de progéniteurs adipocytaires et d'adipocytes La présente invention se rapporte à un nouveau procédé de production in vitro de progéniteurs adipocytaires et d'adipocytes, ainsi qu'aux utilisations thérapeutiques et méthodes de criblage utilisant les cellules ainsi produites.
ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
Les cellules souches sont définies comme des cellules ayant la capacité de s'auto-renouveler et de se différencier in vitro. Les cellules souches pluripotentes, constituées des cellules souches embryonnaires (ES) et des cellules souches induites à la pluripotence (iPS), ont la capacité de se multiplier en théorie à l'infini et permettent d'obtenir presque tous les types cellulaires in vitro.
Les cellules souches induites à la pluripotence ont été mises au point en 2007 à
partir de fibroblastes humains par l'équipe de Yamanaka (Takahashi et al, 2007). Ce type de cellules est obtenu par transfection des gènes de pluripotence (comme C-MYC, OCT3/4, SOX2 et KLF4) dans des cellules somatiques. Ces cellules sont ensuite sélectionnées pour leur capacité à exprimer OCT3/4, et NANOG, deux protéines impliquées dans la pluripotence (Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007). Les cellules iPS
possèdent les mêmes caractéristiques que les cellules ES au niveau de leur morphologie, de leur expression génique et de leur statut épigénétique. Elles ont la capacité de se différencier dans les trois feuillets embryonnaires, endoderme, ectoderme et mésoderme, in vitro et in vivo.
Les cellules iPS possèdent l'avantage de pouvoir récapituler les étapes précoces du développement, contrairement aux modèles existants issus de cultures primaires de cellules de patients. De plus, elles possèdent l'ensemble du patrimoine génétique du patient donneur, constituant donc un excellent modèle pour étudier la physiopathologie des maladies génétiques. En effet, les anomalies responsables de ces pathologies peuvent s'exprimer au niveau cellulaire à différents stades de la différenciation des cellules iPS in vitro. Enfin, les cellules iPS aux différents stades de différenciation permettent de tester de nouvelles molécules thérapeutiques in vitro (Yamanaka, 2010), et sont un espoir pour le développement de nouvelles thérapies cellulaires dans le cadre de la médecine régénérative.

En conséquence, ces cellules constituent une source quasi-infinie de matériel pour l'étude des fonctions cellulaires normales ou pathologiques. Cependant, l'obstacle principal pour la compréhension de ces mécanismes est la mise en place de protocoles robustes et efficaces permettant l'obtention de cellules matures d'intérêt.
L'adipocyte se définit comme l'unité fonctionnelle du tissu adipeux, organe spécialisé dans le stockage de l'énergie sous forme de triglycérides. Le tissu adipeux constitue la seule réserve d'énergie mobilisable à long terme et occupe de ce fait une place prépondérante dans le contrôle de la balance énergétique chez les mammifères.
En conséquence, un défaut de stockage des lipides au sein du tissu adipeux conduit à des désordres métaboliques importants, dont la prévalence en est constante augmentation. De plus, l'adipocyte est également une cellule endocrine qui produit de nombreux facteurs impliqués dans les régulations systémiques, comme celles de la sensibilité à
l'insuline, de l'inflammation, des fonctions immunes et de la pression artérielle.
Bien que l'obtention de tissu adipeux humain soit relativement aisée, une intervention invasive sur le patient est nécessaire. De plus, les adipocytes humains matures ainsi prélevés ne peuvent pas être amplifiés et peuvent donc uniquement être maintenus en culture quelques jours.
Différents groupes ont développé des modèles cellulaires humains pour l'étude de l'adipogenèse à partir de cellules souches mésenchymateuses issues de la moelle osseuse ou de cellules issues de la fraction stroma-vasculaire du tissu adipeux (Pittenger et al.
1999; Zuk et al. 2001). Cependant, ces systèmes cellulaires présentent certaines limites telles qu'une capacité de prolifération réduite, une diminution de la capacité
de différenciation au cours des passages et des potentiels de différenciation variables. Pour surmonter ces problèmes techniques, différentes méthodes de différenciation adipocytaire à partir d'iPS ont été mises au point. Il s'agit toutefois de protocoles longs et complexes étant donné qu'ils font appel à une étape préalable de différenciation en corps embryoïdes (structures en trois dimensions constituées des trois feuillets embryonnaires) ou en cellules mésenchymateuses qui présente une efficacité limitée (Taura et al., 2009 ; Xiong et al., 2013 ; Noguchi et al., 2013 ; Ahfeld et al., 2012). L'efficacité de la différenciation cellulaire peut être augmentée par l'expression ectopique de facteurs de transcriptions adipocytaires (Ahfeldt et al. 2012), mais un tel protocole ne permet pas l'étude des mécanismes physiologiques mis en jeu au cours de la différenciation adipocytaire.
3 Il apparaît donc nécessaire de développer un protocole simple, rapide et efficace permettant de récapituler la différenciation physiologique in vivo de l'adipocyte, c'est-à-dire à partir du mésoderme, en s'affranchissant de l'obtention préalable de corps embryoïdes ou de cellules souches mésenchymateuses.
RESUME DE L'INVENTION
L'objectif de la présente invention est de fournir un nouveau procédé de production in vitro de progéniteurs adipocytaires et d'adipocytes.
La présente invention concerne tout d'abord un procédé de production in vitro de progéniteurs adipocytaires comprenant - la mise en culture de cellules souches pluripotentes sur un système de culture adhérent et dans un milieu de culture sans sérum ;
- la mise en contact desdites cellules souches pluripotentes avec un milieu de différenciation mésodermique jusqu'à l'obtention de progéniteurs mésodermiques ; et - la mise en contact desdits progéniteurs mésodermiques avec un milieu de différenciation adipogénique jusqu'à l'obtention de progéniteurs adipocytaires, et optionnellement la récupération des progéniteurs adipocytaires ainsi obtenus.
Les cellules souches pluripotentes sont de préférence des cellules souches pluripotentes induites.
Le milieu de différenciation mésodermique est, de préférence, un milieu de culture sans sérum comprenant un ou plusieurs morphogènes appartenant à la superfamille du TGF-I3, en particulier sélectionnés dans le groupe constitué de l'activine A, l'activine B, la protéine BMP-4, la protéine BMP-2, le TGF-I31, le TGF-I32 et le TGF-I33, et une combinaison quelconque de ceux-ci. Selon un mode particulier, le milieu de différenciation mésodermique est un milieu de culture sans sérum comprenant (i) un morphogène sélectionné dans le groupe constitué de l'activine A et l'activine B, de préférence l'activine A; et (ii) un morphogène sélectionné dans le groupe constitué de la protéine BMP-4, la protéine BMP-2, le TGF-I31, le TGF-I32 et le TGF-I33, et une combinaison quelconque de ceux-ci, de préférence la protéine BMP-4.
Le milieu de culture sans sérum est de préférence un milieu adapté à la culture des cellules hématopoïétiques.
4 Les cellules souches pluripotentes sont de préférence mises en contact avec le milieu de différenciation mésodermique lorsque la culture présente une confluence d'environ 50 à environ 90%.
Selon un mode de réalisation, le milieu de différenciation adipogénique est un milieu de culture comprenant de l'insuline, l'un de ses analogues ou de l'IGF-1, un glucocorticoïde et un agent augmentant l'adénosine mono-phosphate cyclique (AMPc) intracellulaire, de préférence un milieu de culture comprenant de l'insuline, de la dexaméthasone et du 3-isobuty1-1-méthylxanthine. De préférence, le milieu de différenciation adipogénique comprend en outre de l'indométacine.
La présente invention concerne également un procédé de production in vitro d'adipocytes comprenant la mise en contact des progéniteurs adipocytaires obtenus par le procédé selon l'invention, avec un milieu de maturation adipocytaire jusqu'à
l'obtention d'adipocytes. Le milieu de maturation adipocytaire est de préférence un milieu de culture comprenant de l'insuline.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également des progéniteurs adipocytaires ou des adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention, pour une utilisation dans le traitement d'une lipodystrophie, d'une anomalie de la régulation glycémique, de préférence sélectionnée dans le groupe constitué de l'hyperglycémie à
jeun, l'intolérance au glucose, le diabète, notamment le diabète de type 2, et l'insulino-résistance, ou d'une dyslipidémie associées ou non à une obésité ou à un syndrome lipodystrophique.
Les progéniteurs adipocytaires et/ou adipocytes sont de préférence obtenus à
partir de cellules souches pluripotentes induites obtenues à partir de cellules somatiques, de préférence des fibroblastes, provenant du sujet à traiter.
La présente invention concerne également un kit pour produire in vitro des progéniteurs adipocytaires ou des adipocytes comprenant un récipient contenant un ou plusieurs morphogènes appartenant à la superfamille du TGF-I3, un récipient contenant de l'insuline, l'un de ses analogues ou de l'IGF-1, un glucocorticoïde et un agent augmentant l'adénosine mono-phosphate cyclique (AMPc) intracellulaire et optionnellement un récipient contenant de l'insuline.
En particulier, le kit peut comprendre un premier récipient contenant de l'activine A et/ou de la BMP-4, et un second récipient contenant de l'insuline, de la dexaméthasone et de l'IBMX, et optionnellement de l'indométacine.

La présente invention concerne également l'utilisation du kit selon l'invention pour la production in vitro de progéniteurs adipocytaires et/ou d' adipocytes selon les procédés de l'invention.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne également une méthode de
5 criblage de molécules stimulant l'activité thermogénique des adipocytes comprenant -la mise en contact d' adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention avec des molécules candidates, et - la sélection de molécules stimulant l'activité thermogénique des adipocytes.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
Figure 1: Représentation schématique d'un mode de réalisation de la méthode selon l'invention de différenciation adipocytaire en deux dimensions à partir d'iPS. La différentiation des iPS en précurseurs mésodermiques est induite de JO à J4 par un milieu de différenciation constitué de STEMPro34 (+ GlutaMAX + acide ascorbique) en présence d' activin A (25 ng/ml) et de BMP4 (1 Ong/ml). La différenciation en adipocytes est induite à J4 et J8 en cultivant les progéniteurs mésodermiques en DMEM/F12 10 %
SVF, insuline (10 lag/m1), isobutylméthylxanthine (0,5 mM), dexaméthasone (1 iaM) et indométacine (50 LM). Les adipocytes sont ensuite maintenus en DMEM/F12 10%
SVF
1iag/m1 insuline afin de permettre leur maturation.
Figure 2 : Caractère pluripotent des cellules iPS. (A) Image en contraste de phase d'une colonie d'iPS pluripotente (10x). (B) Photographie des colonies d'iPS
après marquage à la phosphatase alcaline en champ large (panneau de gauche) ou au grossissement x10 (panneau de droite). (C) Marquage en immunofluorescence des marqueurs de pluripotence NANOG, SOX2, OCT4, SSEA3/4, TRA-1-60 et TRA-1-81.
(D) Comparaison de l'expression génique des marqueurs de pluripotence OCT4, NANOG
et SOX2 entre les iPS et les cellules souches embryonnaires H9 (n=3).
Figure 3 : Différenciation des iPS en progéniteurs mésodermiques et adipocytaires. Niveau d'expression relative (unités arbitraires) mesuré par PCR
quantitative en temps réel de marqueurs spécifiques de la pluripotence NANOG, SOX2 et OCT4 (n=3) (A), du mésoderme, à savoir BRACHYURY (T BOX) et MESP1 (B), à 0, 2, 4 jours, et 6 jours de différenciation (n=3). Marquage en immunofluorescence des progéniteurs adipocytaires à l'aide des anticorps MESP1 et BRACHYURY (C).
Niveau
6 d'expression relative (unités arbitraires) mesuré par PCR quantitative en temps réel de BRACHYURY (T box) et MESP1 (D) au cours de la différenciation des iPS en cellules souches mésenchymateuses (n=3). Niveau d'expression relative (unités arbitraires) mesuré par PCR quantitative en temps réel de PDGFRa, LY6E, CD44, CD29 et CD24.
*p<0,05, p déterminé par le test non-paramétrique de Mann-Whitney avec le logiciel Prism GraphPad. (E) (n=3). Marquage en immunofluorescence des progéniteurs adipocytaires à l'aide des anticorps CD44, PDGFRa et CD29 et Ki67 (F).
Figure 4 : Différenciation des progéniteurs mésodermiques en adipocytes.
Niveau d'expression relative (unités arbitraires) mesuré par PCR quantitative en temps réel des quatre facteurs de transcription adipocytaires (A) C/EBPfl (n=3), (B) C/EBN
(n=3), (C) C/EBPa (n=3) et (D) PPARy (n=3), au cours de la différenciation adipocytaire.
Figure 5 : Caractérisation des adipocytes après 20 jours de différenciation.
(A) Photographie des adipocytes après coloration à l'Oil red 0 en champ large (gauche), 20x (milieu) ou 40x (droite). (B) Marquage en immunofluorescence des marqueurs C/EBPa (haut) et de GLUT4 (bas) dans les adipocytes à 20 jours de différenciation.
Les gouttelettes lipidiques sont marquées en Nile Red et les noyaux au DRAQ5. (C) Expression protéique de PPARyl et PPARy2, C/EBPa p30/42, la sous-unité f3 du récepteur de l'insuline (IR-I3), la perilipine 1 et la cavéoline 1 dans des cellules iPS à JO, J10 et J20. La I3-actine est utilisée comme contrôle. (n>3). (D) La phosphorylation de la sous-unité p du récepteur à l'insuline (IR-I3) et d'AKT/PKB a été évaluée suite à un court traitement à l'insuline dans des cellules iPS après 20 jours de différenciation en utilisant des anticorps phospho-spécifiques et totaux.
Figure 6 : Obtention d'adipocytes beiges. Expression génique relative des marqueurs d'adipocytes bruns classiques (A) PGCla (n....3), PRDM16 (n...3) et (n=3). (B) Détection de l'expression d'UCP1 par Western Blot aux jours 0, 10 et 20 de la différenciation. La I3-actine est présentée en contrôle de dépôt. (C) Expression génique relative des marqueurs spécifiques des adipocytes beiges IMEM26, (717EDI, CD1.37 et 110XC9 au cours de la différenciation. (n>3). *p<0,05 vs J4. (D) Marquage en immunofluorescence du marqueur d'adipocyte beige CITED1 dans les adipocytes à

jours de différenciation. Les gouttelettes lipidiques sont marquées en Nile Red et les noyaux au DRAQ5. (E) Détection de l'expression d'UCP1 par Western Blot en conditions basales ou après 6h d'isoprotérenol 10-5M. La I3-actine est présentée en contrôle de dépôt. (F) Marquage d'adipocytes beiges au Mitotracker0 et en Bodipy en
7 condition basale (haut) et après 48h de 8-Br-AMPc (bas). (G) Expression génique des gènes impliqués dans la thermogenèse PGC 1 a, PPARa, PRDM16 et D102 des cellules iPS après 20 jours de différenciation en condition basale (non traitées) et après 48h de 8-Br-AMPc *p<0,05 vs Basal.
Figure 7 : Formation de tissu adipeux in vivo suite à la greffe des adipocytes dérivés de cellules iPS dans des souris nude. (A) Représentation schématique de la greffe des adipocytes dérivés de cellules iPS dans les souris nude. (B) Vue macroscopique du pannicule adipeux formé à partir des adipocytes dérivées des cellules iPS. (C) Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine du pannicule adipeux formé à partir des adipocytes dérivés des cellules iPS (gauche) et des MSC (droite). Barre d'échelle : 500itm. (D) Fort grossissement de la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine du pannicule adipeux formé
à partir des adipocytes dérivés des cellules iPS (gauche) et des MSC (droite), Barre d'échelle 200 ium (haut) et 100 ium (bas). Les flèches indiquent les vaisseaux sanguins.
(E) Marquage avec un anticorps anti-perilipine 1 du pannicule adipeux formé à
partir des adipocytes dérivés des cellules iPS (gauche) et à partir des MSCs (droite) à
différents grossissement. Barre d'échelle 200 ium (haut) et 100 ium (bas).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs ont développé un procédé simple, rapide et efficace permettant d'obtenir de grandes quantités d'adipocytes à partir de cellules souches pluripotentes, de préférence des cellules souches pluripotentes induites, en seulement 20 jours.
Ils ont en effet démontré qu'en présence d'un milieu comprenant des inducteurs de la différenciation mésodermique, les cellules souches étaient capables de se différencier directement, c'est-à-dire sans formation préalable de corps embryoïdes ou de cellules souches mésenchymateuses, en progéniteurs mésodermiques capables à leur tour de produire des progéniteurs adipocytaires et des adipocytes en présence d'un cocktail adipogénique.
Les inventeurs ont observé que les adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention exprimaient les marqueurs adipocytaires spécifiques et présentaient une morphologie caractéristique de ce type cellulaire. Ils ont également démontré
que les cellules obtenues présentaient les caractéristiques des adipocytes de type beige, pour lesquels aucun modèle humain n'a été décrit à ce jour.
8 Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de production in vitro de progéniteurs adipocytaires comprenant - la mise en culture de cellules souches pluripotentes dans un système de culture adhérent et dans un milieu de culture sans sérum ;
- la mise en contact desdites cellules souches pluripotentes avec un milieu de différenciation mésodermique jusqu'à l'obtention de progéniteurs mésodermiques ; et - la mise en contact desdits progéniteurs mésodermiques avec un milieu de différenciation adipogénique jusqu'à l'obtention de progéniteurs adipocytaires.
Tel qu'utilisé dans ce document, le terme cellules souches pluripotentes englobe des cellules souches embryonnaires et des cellules somatiques reprogrammées (ou cellules souches pluripotentes induites). De préférence, ce terme se réfère à des cellules provenant d'un mammifère, en particulier une souris, un rat ou un primate, et de manière tout particulièrement préférée, d'un humain.
Les cellules souches embryonnaires sont dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste et ont la capacité de conduire à la formation de tous les tissus de l'organisme (mésoderme, endoderme, ectoderme), y compris aux cellules de la lignée germinale. La pluripotente des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT3/4, NANOG et et les marqueurs de surface comme SSEA3/4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Cette pluripotence peut également être vérifiée in vivo par la formation de tératomes chez la souris (Rossant et al., 1982). Les cellules souches embryonnaires peuvent être obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues par exemple à l'aide de la technique décrite par Chung et al. (2008). Dans un mode de réalisation particulier, et pour des raisons légales ou éthiques, les cellules souches embryonnaires sont des cellules souches embryonnaires non humaines.
Tel qu'utilisé dans ce document, le terme cellules somatiques reprogrammées , cellules souches pluripotentes induites , CSPi ou iPS se réfère à des cellules pluripotentes obtenues par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées. Outre leur morphologie et leur potentiel d' autorenouvellement et de pluripotence similaires à ceux des cellules souches embryonnaires, les CSPi présentent également une reprogrammation épigénétique avec un profil global de méthylation des
9 histones et d'expression des gènes très proche de celui des cellules souches embryonnaires. Les CSPi sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, notamment la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA3/4.
Les procédés permettant l'obtention des CSPi sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits dans les articles de Yu, et al. (2007), Takahashi et al.
(2007) et Nakagawa et al., (2008). En particulier, les CSPi peuvent être obtenues à partir de cellules somatiques humaines transfectées avec les facteurs de transcription Oct3/4, Sox2, Klf4 et c-Myc (Takahashi et al., 2007), Oct3/4, Sox2, Nanog et Lin28 (Yu, et al., 2007) ou avec les gènes Oct3/4, Sox2 et Klf4 (Nakagawa et al., 2008). Les CSPi peuvent être obtenues à partir d'une large variété de cellules telles que les fibroblastes, les lymphocytes B, les kératinocytes ou les cellules de la membrane méningée (Patel et al., 2010). De préférence, les CSPi utilisées dans le procédé selon l'invention sont obtenues à partir de fibroblastes, en particulier des fibroblastes humains. Selon un mode particulier de réalisation, les CSPi sont obtenues à partir de fibroblastes d'un patient lipodystrophique.
Le procédé selon l'invention comprend une étape de mise en culture de cellules souches pluripotentes telles que définies ci-dessus, dans un système de culture adhérent et dans un milieu de culture sans sérum. Ces conditions de culture diffèrent de celles utilisées pour la formation de corps embryoïdes qui requiert l'utilisation de systèmes de culture non adhérents afin de permettre aux cellules souches de s'agréger.
Le système de culture adhérent susceptible d'être utilisé dans le procédé
selon l'invention peut être un système de culture en monocouche adhérente ou un système de culture sur cellules nourricières.
Le système de culture peut se présenter sous toute forme adaptée au procédé
selon l'invention, en particulier sous forme de flacon, plaque multipuits ou boite.
Selon un mode de réalisation, le système de culture adhérent est un système de culture sur cellules nourricières qui favorisent la prolifération et/ou contrôlent la différenciation des cellules avec lesquelles elles sont co-cultivées. De préférence, ces cellules nourricières stimulent la prolifération des cellules en culture sans induire leur différenciation. Elles sont fréquemment irradiées afin de prévenir leur prolifération et l'envahissement de la culture d'intérêt. Les cellules nourricières susceptibles d'être utilisées dans le procédé selon l'invention peuvent être aisément choisies par l'homme du métier parmi les différents types connus tels que les fibroblastes embryonnaires de souris (cellules MEF) ou des cellules humaines foreskin (cf. la demande de brevet EP
2182052).
5 Selon un mode de réalisation préféré, le système de culture adhérent est un système de culture en monocouche adhérente. Ce système comprend un support solide, par exemple du verre ou du plastique, généralement revêtu d'une matrice ou d'un substrat favorisant l'adhérence des cellules.
Le substrat peut être un substrat protéique constitué de facteurs d'attachement et
10 favorisant l'adhésion des cellules au support. Ces facteurs d'attachement peuvent notamment être choisis parmi la poly-L-lysine, le collagène, la fibronectine, la laminine ou la gélatine.
Les matrices mimant la matrice extracellulaire et susceptibles d'être utilisées dans le procédé selon l'invention, sont bien connues de l'homme du métier et de nombreuses variétés sont disponibles dans le commerce. Ces matrices comprennent, par exemple, les matrices de type MatrigelTM, Geltrex0 ou d'autres matrices comprenant une ou plusieurs protéines d'ancrage telles que le collagène, la laminine, la fibronectine, l'élastine, des protéoglycanes, des aminoglycanes ou la vitronectine. Les matrices 3D de type hydrogel peuvent également être utilisées. Selon un mode de réalisation préféré, la matrice est du type MatrigelTM.
Les cellules souches pluripotentes sont cultivées dans un milieu sans sérum permettant de propager et maintenir les cellules dans un état indifférencié.
De nombreux milieux de ce type sont disponibles dans le commerce et sont bien connus de l'homme du métier (voir par exemple l'article de Chen et al., 2011). Le milieu de culture sans sérum peut être, par exemple, le milieu mTESR1Tm (STEMCELL Technologies), le milieu (Life Technologies) ou le milieu hPSC (Promocell). Selon un mode préféré, le milieu de culture utilisé ne comprend pas de sérum d'origine animal.
Les cellules sont de préférence repiquées régulièrement afin d'empêcher la culture d'atteindre la confluence, c'est-à-dire de recouvrir l'ensemble de la surface disponible.
En effet, la confluence induit un arrêt de la prolifération et des changements métaboliques non souhaités. Les cellules peuvent être repiquées en utilisant des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Elles peuvent notamment être détachées de la
11 matrice ou du support par l'action d'enzymes telles que la collagénase IV ou par un passage mécanique au PBS ou tout autre solution sans enzyme contenant de l'EDTA (ex:
ReleSR (Stemcell technologies)) récupérées par centrifugation, dissociées mécaniquement et réensemencées dans un nouveau système de culture.
Dans le procédé selon l'invention, les cellules souches pluripotentes cultivées sur le système de culture adhérent et dans le milieu sans sérum, sont mises en contact avec un milieu de différenciation mésodermique jusqu'à l'obtention de progéniteurs mésodermiques.
Optionnellement, la confluence cellulaire peut être mesurée ou évaluée avant que les cellules souches ne soient mises en contact avec le milieu de différenciation mésodermique. De préférence, les cellules souches sont mises en contact avec le milieu de différenciation mésodermique lorsque la culture cellulaire présente une confluence d'environ 50 à environ 90%. L'homme du métier est familier avec la notion de confluence cellulaire, et est capable de l'évaluer par toute méthode connue. A titre d'exemple, le terme 90% de confluence peut être défini par la situation dans laquelle des colonies entrent en contact avec d'autres colonies, alors qu'un espace représentant environ 10%
de la surface totale, reste non occupé entre les colonies. Tel qu'utilisé ici, le terme environ fait référence à une plage de valeurs de 10% de la valeur spécifiée. Par exemple, environ 20 inclut les 10% de 20, ou de 18 à 22.
Selon un mode de réalisation particulier, les cellules souches sont mises en contact avec le milieu de différenciation mésodermique, un à trois jours, de préférence deux jours, après avoir été mises en culture sur le système de culture adhérent et dans le milieu sans sérum.
De manière préférée, la mise en contact est réalisée par simple changement du milieu de culture. De manière alternative, celle-ci peut être effectuée par repiquage dans un système de culture adhérent comme décrit précédemment et comprenant le milieu de différenciation mésodermique.
Selon un mode de réalisation, le système de culture adhérent est un système de culture sur cellules nourricières comme décrit précédemment. Les cellules nourricières susceptibles d'être utilisées peuvent être aisément choisies par l'homme du métier parmi les différents types connus tels que les fibroblastes embryonnaires de souris (cellules MEF) ou des cellules humaines foreskin (cf. la demande de brevet EP 2182052), de
12 préférence en présence d'un inhibiteur de la voie de signalisation FGF, tel que le composé
SU5402 (Mohammadi et al. 1997).
Les cellules peuvent être repiquées en utilisant des techniques classiques bien connues de l'homme du métier comme décrit précédemment, notamment être détachées de la matrice ou du support par l'action d'enzymes telles que la collagénase IV, par un passage mécanique au PBS ou tout autre solution sans enzyme contenant de l'EDTA (ex : ReleSR (Stemcell technologies) ou par l'action d'un milieu de détachement cellulaire commercial tel que TrypLETm Express (Life Technologies), récupérées par centrifugation, dissociées mécaniquement et réensemencées dans un nouveau système de culture.
De manière alternative, les cellules souches peuvent être mises en contact avec le milieu de différenciation mésodermique dès leur mise en culture sur le système de culture adhérent et durant environ 4 jours.
Le milieu de différenciation mésodermique est un milieu de culture permettant à
la fois la survie et la prolifération des cellules mais également induisant ou favorisant la différenciation des cellules en progéniteurs mésodermiques. De préférence, ce milieu prévient ou limite la différenciation des cellules en d'autres types cellulaires, notamment en progéniteurs de l'endoderme ou de l'ectoderme.
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de différenciation mésodermique est un milieu de culture de base sans sérum comprenant un ou plusieurs morphogènes appartenant à la superfamille du TGF-I3.
De préférence, le milieu de culture de base sans sérum est un milieu de culture adapté à la prolifération des cellules humaines hématopoïétiques (CD34+). Ce milieu peut être un milieu minimum comprenant notamment les sels minéraux, les acides aminés, les vitamines et une source de carbone indispensables aux cellules ; un système tampon pour réguler le pH. De manière préférée, ce milieu comprend en outre de l'albumine sérique bovine ; de la transferrine ou du fer; du sélénium ; de l'insuline ou un analogue de celle-ci ; et/ou un glucocorticoïde tel que l'hydrocortisone ou la déxaméthasone.
Les milieux susceptibles d'être utilisés dans le procédé selon l'invention comprennent par exemple, sans y être limités, le milieu StemPro-34 (Invitrogen) ou tout autre milieu décrit dans la demande de brevet WO 97/033978, le milieu TeSRTm-
13 (StemCellTM technologies), les milieux décrits dans le brevet US 5,945,337, ou le milieu MethoCultTM (StemCellTM technologies).
Selon le milieu utilisé, il peut être nécessaire ou souhaitable d'ajouter de la glutamine (cet acide aminé est instable et doit souvent être ajouté
extemporanément), de la vitamine C (qui s'oxyde rapidement) et/ou un ou plusieurs antibiotiques.
Le ou les morphogènes appartenant à la superfamille du TGF-I3 sont de préférence sélectionnés dans le groupe constitué de l'activine A, l'activine B, la protéine BMP-4, la protéine BMP-2, le TGF-I31, le TGF-I32 et le TGF-I33, et une combinaison quelconque de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation, le milieu de différenciation mésodermique comprend (i) un morphogène sélectionné dans le groupe constitué de l'activine A et l'activine B ; et (ii) un morphogène sélectionné dans le groupe constitué de la protéine BMP-4, la protéine BMP-2, le TGF-I31, le TGF-I32 et le TGF-I33, et une combinaison quelconque de ceux-ci.
Selon un autre mode de réalisation, le milieu de différenciation mésodermique comprend de l'activine A et la protéine BMP-4.
De préférence, le milieu comprend entre 1 et 25 ng/mL de BMP-4, de manière plus particulièrement préférée environ 10 ng/mL de BMP-4.
De préférence, le milieu comprend entre 5 et 100 ng/mL d'activine A, de manière plus particulièrement préférée environ 25 ng/mL d' activine A.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le milieu de différenciation mésodermique comprend environ 10 ng/mL de BMP-4 et environ 25 ng/mL d'activine A.
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de différenciation mésodermique comprend le milieu sans sérum StemPro-34 complet (Invitrogen) enrichi en glutamine, ou un milieu de culture équivalent, de la BMP-4, de préférence environ 10 ng/mL, de l'activine A, de préférence environ 25 ng/mL, et optionnellement de l'acide ascorbique.
Les cellules souches pluripotentes sont maintenues dans le milieu de différenciation jusqu'à l'obtention de progéniteurs mésodermiques. Durant cette période,
14 et de manière classique, le milieu de culture peut être changé régulièrement, de préférence tous les jours ou tous les deux jours.
Tel qu'utilisé dans ce document, le terme progéniteurs mésodermiques ou précurseurs mésodermiques se réfère à des cellules, de préférence des cellules humaines, capables de se différencier (sans dédifférenciation ou reprogrammation préalable) en la majorité des tissus du mésoderme, notamment en cellules endothéliales, adipocytes, cardiomyocytes, cellules ostéogéniques, chondrocytes, cellules mésenchymateuses et cellules hématopoïétiques. Ces cellules se caractérisent par l'expression des gènes BRACHYURY (T BOX) (Gene ID : 6862) et MESP1 (Gene ID :
55897), deux gènes spécifiques du mésoderme précoce. Cette caractéristique les différencie des cellules souches mésenchymateuses ou des cellules issues de la fraction stroma-vasculaires du tissu adipeux qui n'expriment pas les gènes BRACHYURY et MESP1 (Figure 3D).
L'apparition de progéniteurs mésodermiques peut être aisément détectée par l'homme du métier par le suivi de l'expression des gènes BRACHYURY et MESP1.
En effet, comme illustré dans la partie expérimentale et la figure 3B, ces gènes ne sont pas exprimés dans les cellules souches pluripotentes. Cette expression est également corrélée avec une diminution de l'expression des marqueurs de pluripotence NANOG et (figure 3A).
L'expression protéique de BRACHYURY et MESP1 peut être aisément mesurée par l'homme du métier par une méthode d'immunofluorescence comme illustrée dans la partie expérimentale et la figure 3C.
Ainsi, optionnellement, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape additionnelle consistant à mesurer ou évaluer l'expression du gène BRACHYURY
et/ou du gène MESP1. L'expression de ces marqueurs peut être suivie par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par PCR quantitative en temps réel.
Selon un mode de réalisation particulier, les cellules souches pluripotentes sont mises en contact avec le milieu de différenciation mésodermique durant 2 à 5 jours, de préférence durant 3 à 4 jours, et de manière tout particulièrement préférée durant 4 jours.
Les progéniteurs mésodermiques ainsi obtenus sont ensuite mis en contact avec un milieu de différenciation adipogénique jusqu'à l'obtention de progéniteurs adipocytaires.

Comme précédemment, cette mise en contact peut être réalisée par simple changement du milieu de culture ou par repiquage dans un système de culture adhérent et comprenant le milieu de différenciation adipogénique.
Selon un mode de réalisation, le système de culture adhérent est un système de 5 culture sur cellules nourricières comme décrit ci-dessus. Les cellules nourricières susceptibles d'être utilisées peuvent être aisément choisies par l'homme du métier parmi les différents types connus tels que les fibroblastes embryonnaires de souris (cellules MEF) ou des cellules humaines foreskin (cf. la demande de brevet EP 2182052), de préférence en présence d'un inhibiteur de la voie de signalisation FGF, tel que le composé
10 5U5402 (Mohammadi et al. 1997).
Les cellules peuvent être repiquées en utilisant des techniques classiques bien connues de l'homme du métier comme décrites ci-dessus, notamment être détachées de la matrice ou du support par l'action d'enzymes telles que la collagénase IV, par un passage mécanique au PBS ou tout autre solution sans enzyme contenant de l'EDTA (ex:
15 ReleSR (Stemcell technologies) ou par l'action d'un milieu de détachement cellulaire commercial tel que TrypLETm Express (Life Technologies), récupérées par centrifugation, dissociées mécaniquement et réensemencées dans un nouveau système de culture. De préférence, les progéniteurs mésodermiques sont mis en contact avec un milieu de différenciation adipogénique par simple changement du milieu de culture.
Le milieu de différenciation adipogénique également appelé milieu de différenciation adipocytaire est un milieu de culture permettant à la fois la survie et la prolifération des progéniteurs mésodermiques mais également induisant ou favorisant la différenciation de ces cellules en progéniteurs adipocytaires.
Selon un mode de réalisation, le milieu de différenciation adipogénique est un milieu de culture comprenant de l'insuline, l'un de ses analogues ou de l'IGF-1, un glucocorticoïde et un agent augmentant l'adénosine mono-phosphate cyclique (AMPc) intracellulaire. De préférence, le milieu de différenciation adipogénique comprend de l'insuline ou l'un de ses analogues, un glucocorticoïde et un agent augmentant l'adénosine mono-phosphate cyclique (AMPc) intracellulaire.
Les analogues de l'insuline peuvent être sélectionnés par exemple dans le groupe constitué de l'insuline NPH (Eh Lilly), la lispro (Eh i Lilly), l'aspart (Novo Nordisk) et la glulisine (Sanofi-Aventis).
16 Le glucocorticoïde peut être sélectionné par exemple dans le groupe constitué
de la dexaméthasone, la bétaméthasone, le cortivazol et l'hydrocortisone. De préférence, le glucocorticoïde est la dexaméthasone.
L'agent augmentant l'adénosine mono-phosphate cyclique (AMPc) intracellulaire peut être tout composé connu pour augmenter la concentration intracellulaire d'APMc.
Cet agent peut notamment être sélectionné dans le groupe constitué des inhibiteurs de phosphodiestérases, des activateurs directs de la protéine kinase A (ou protéine kinase cAMP dépendante) et des activateurs de l'adénylate cyclase.
Les inhibiteurs de phosphodiestérase comprennent, sans y être limités, des xanthines méthylés et leurs dérivés tels que le 3-isobuty1-1-méthylxanthine (IBMX), la caféine, l'aminophylline, la paraxanthine, la pentoxifylline, la théobromine et la théophylline.
Les activateurs directs de la protéine kinase A comprennent, sans y être limités, le belinostat (PXD101), l'adrénaline, le glucagon, et les analogues de l'AMPc tels que le 8-Bromo-cAMP .
Les activateurs de l'adénylate cyclase comprennent, sans y être limités, la forskoline, le glucagon, les prostaglandines D2, El, et 12, la carbacycline, la dopamine, l'endothéline 1, la L-épinéphrine et l'hormone parathyroïde.
Selon un mode de réalisation préféré, le milieu de différenciation adipogénique est un milieu de culture comprenant de l'insuline, de la dexaméthasone et du 3-isobutyl-1 -méthylxanthine .
De préférence, le milieu comprend entre 1 et 20 ng/mL d'insuline, de manière plus particulièrement préférée environ lOng/mL d'insuline.
De préférence, le milieu comprend entre 0,0001 et 500 mM d'IBMX, de manière plus particulièrement préférée entre 0,01 et 10 mM d'IBMX, et de manière tout particulièrement préférée entre 0,1 et 1 mM d'IBMX. Selon un mode de réalisation particulier, le milieu comprend entre environ 0,1 mM et environ 0,5 mM d'IBMX, de préférence environ 0,5 mM d'IBMX.
De préférence le milieu comprend entre 0,25 et 100 ILLM de dexaméthasone, de manière plus particulièrement préférée environ 1 ILLM de dexaméthasone.
Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de différenciation adipogénique est un milieu de culture comprenant environ 10 ng/mL d'insuline, environ 1 ILLM de dexaméthasone et environ 0,5 mM d'IBMX.
17 De manière optionnelle, le milieu de différenciation peut également comprendre un ou plusieurs composés additionnels favorisant la différenciation adipocytaire tels que l'indométacine, un composé de la famille des thiazolidinediones tel que la pioglitazone ou la rosiglitazone, le facteur de croissance FGF21, l'irisine, la triiodothyronine, l'acide rétinoïque, le BMP7 et/ou le BMP8, en particulier l'indométacine, un composé
de la famille des thiazolidinediones tel que le pioglitazone ou le rosiglitazone, le facteur de croissance FGF21, l'irisine, la triiodothyronine et/ou l'acide rétinoïque. De préférence, le milieu de différenciation comprend en outre de l'indométacine, de préférence 0,01 à 0,5 mM d'indométacine, et de manière plus particulièrement préférée environ 0,1 mM
d'indométacine. Selon un mode de réalisation particulier, le milieu de différenciation comprend en outre de 50 ILLM d'indométacine. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, le milieu de différenciation adipogénique est un milieu de culture comprenant de l'insuline, de préférence environ 10 iLtg/mL, de la dexaméthasone, de préférence environ 1 itM, de l'IBMX, de préférence environ 0,5 mM, et de l'indométacine, de préférence environ 0,1 mM. Selon un autre mode de réalisation préféré, le milieu de différenciation adipogénique est un milieu de culture comprenant de l'insuline, de préférence environ 10 iLtg/mL, de la dexaméthasone, de préférence environ 1 ILLM, de l'IBMX, de préférence environ 0,5 mM, et de l'indométacine, de préférence environ 0,05 mM.
Le milieu de culture de base utilisé dans le milieu de différenciation adipocytaire est, de préférence, un milieu minimum synthétique de base comprenant notamment les sels minéraux, les acides aminés, les vitamines et une source de carbone indispensables aux cellules, et un système tampon pour réguler le pH. Les milieux susceptibles d'être utilisés dans le procédé selon l'invention comprennent par exemple, sans y être limités, le milieu DMEM/F12, le milieu DMEM, le milieu RPMI, le milieu HAM'S F12, le milieu IMDM, et le milieu KnockoutTM DMEM (Life Technologies).
Le milieu est de préférence complémenté avec 2 à 20%, de préférence 5 à 15%, de sérum, en particulier de sérum de veau foetal.
Les progéniteurs mésodermiques sont maintenus dans le milieu de différenciation adipocytaires jusqu'à l'obtention de progéniteurs adipocytaires. Durant cette période, et de manière classique, le milieu de culture peut être changé régulièrement, de préférence tous les deux ou trois jours.
18 Tel qu'utilisé dans ce document, le terme progéniteurs adipocytaires , pré-adipocytaires ou cellules souches adipocytaires se réfère à des cellules prolifératives, c'est-à-dire exprimant un marqueur de prolifération cellulaire, de préférence Ki67, qui expriment les marqueurs des cellules souches du tissu adipeux dont CD44 (Gene ID :
960), CD29 (Gene ID : 3688), PDGFRa (Gene ID : 5156) et LY6E (Gene ID : 4061) (Zuk, 2013). De préférence, ces cellules sont négatives pour les antigènes CD31 (Gene ID : 5175) et CD34 (Gene ID : 947). En présence d'un cocktail adipogénique, ces cellules sont capables de se différencier (sans dédifférenciation ou reprogrammation préalable) en adipocytes.
L'apparition de progéniteurs adipocytaires peut être aisément détectée par l'homme du métier par le suivi de l'expression des marqueurs des cellules souches du tissu adipeux tels que CD44, CD29, PDGFRa et LY6E. En effet, comme illustré
dans la partie expérimentale et la figure 3E et F, ces marqueurs ne sont que très faiblement exprimés dans les progéniteurs mésodermiques. La différence d'expression est notamment très importante pour le marqueur PDGFRa qui présente un niveau d'expression dans les progéniteurs adipocytaires environ 8 fois plus important que dans les progéniteurs mésodermiques. L'expression de ces marqueurs peut être suivie par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par PCR quantitative en temps réel.
Ainsi, optionnellement, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape additionnelle consistant à mesurer ou évaluer l'expression d'un ou plusieurs des marqueurs CD44, CD29, PDGFRa et LY6E.
Selon un mode de réalisation particulier, les progéniteurs mésodermiques sont mis en contact avec le milieu de différenciation adipocytaire durant 2 à 5 jours, de préférence durant 3 à 4 jours, et de manière tout particulièrement préférée durant 4 jours.
Le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de récupération des progéniteurs adipocytaires obtenus. Cette récupération peut être réalisée à
l'aide de techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Les progéniteurs peuvent notamment être détachées de la matrice ou du support par l'action d'enzymes telles que la collagénase IV ou une solution de détachement cellulaire commerciale telle que TryPLETm express (Life Technologies). Ceux-ci peuvent ensuite être isolés sur la base de différents marqueurs comme par exemple CD44 ou CD29.
19 Les progéniteurs adipocytaires peuvent ensuite être réensemencés sur des matrices mimant la matrice extracellulaire telles que décrites ci-dessus et bien connues de l'homme du métier. De nombreuses variétés sont disponibles dans le commerce. Ces matrices peuvent comprendre des cellules nourricières telles que des fibroblastes embryonnaires de souris (cellules MEF) ou des cellules humaines foreskin (cf la demande de brevet EP
2182052) de préférence en présence d'un inhibiteur de la voie de signalisation FGF, tel que le composé SU5402 (Mohammadi et al. 1997). Le système de culture utilisé
est de préférence un système de culture en monocouche adhérente. Ce système comprend un support solide, par exemple du verre ou du plastique, généralement revêtu d'une matrice ou d'un substrat favorisant l'adhérence des cellules. Le substrat peut être un substrat protéique constitué de facteurs d'attachement et favorisant l'adhésion des cellules au support. Ces facteurs d'attachement peuvent notamment être choisis parmi la poly-L-lysine, le collagène, la fibronectine, la laminine ou la gélatine.
Alternativement, les progéniteurs adipocytaires obtenus par le procédé selon l'invention peuvent être mis en contact avec un milieu de maturation adipocytaire jusqu'à
l'obtention d' adipocytes.
La présente invention concerne donc également un procédé de production in vitro d'adipocytes comprenant la mise en contact des progéniteurs adipocytaires obtenus par le procédé selon l'invention, avec un milieu de maturation adipocytaire jusqu'à
l'obtention d' adipocytes.
Comme précédemment, cette mise en contact peut être réalisée par simple changement du milieu de culture ou par repiquage dans un système de culture adhérent comme décrit précédemment et comprenant le milieu de maturation adipocytaire.
De préférence les progéniteurs adipocytaires sont mis en contact avec un milieu de maturation adipocytaire par simple changement du milieu de culture.
Le milieu de maturation adipocytaire est un milieu de culture permettant à la fois la survie et la prolifération des progéniteurs adipocytaires mais également induisant ou favorisant la différenciation de ces cellules en adipocytes.
Le milieu de culture de base utilisé dans le milieu de maturation adipocytaire peut être le même milieu de culture de base que celui utilisé dans le milieu de différenciation adipocytaire. De manière alternative, il peut être différent.

Selon un mode de réalisation, le milieu de culture de base utilisé dans le milieu de maturation adipocytaire est un milieu minimum synthétique de base comprenant notamment les sels minéraux, les acides aminés, les vitamines et une source de carbone indispensables aux cellules, et un système tampon pour réguler le pH. Les milieux susceptibles d'être utilisés dans le procédé selon l'invention comprennent par exemple, sans y être limités, le milieu DMEM/F12, le milieu DMEM, le milieu RPMI, le milieu HAM' S F12, le milieu IMDM, et le milieu KnockoutTM DMEM (Life Technologies).
Ce milieu est de préférence complémenté avec 2 à 20%, de préférence 5 à 15%, de sérum, en particulier de sérum de veau foetal.
10 Selon un mode de réalisation préféré, le milieu de maturation adipocytaire comprend, ou consiste essentiellement en, un milieu de culture de base complémenté par de l'insuline, et optionnellement avec du sérum. De préférence, le milieu comprend 0,1 à
5 itg/mL d'insuline, de manière plus particulièrement préférée environ 1 iLtg/mL
d'insuline.
Les progéniteurs adipocytaires sont maintenus dans le milieu de maturation adipocytaire jusqu'à l'obtention d'adipocytes. Durant cette période, et de manière classique, le milieu de culture peut être changé régulièrement, de préférence tous les deux ou trois jours.
Tel qu'utilisé dans ce document, le terme adipocytes se réfère à des cellules caractérisées par l'expression génique de C/EBPfl (Gene ID : 1051), C/EBN
(Gene ID :
1052), C/EBPa (Gene ID: 1050) et PPARy (Gene ID : 5468) et par une accumulation de lipides neutres sous forme de gouttelettes lipidiques détectables par une coloration à
l'huile rouge. Les adipocytes peuvent être également caractérisés par l'expression du récepteur à l'insuline (Gene ID : 3667), de la périlipine 1 (Gene ID 5346), de la cavéoline 1 (Gene ID : 857) ou du transporteur au glucose GLUT4 (Gene ID : 442992).
Par ailleurs, les inventeurs ont observé que les adipocytes obtenus par le procédé
selon l'invention exprimaient également les marqueurs des adipocytes bruns tels que les gènes PGC1 (Gene ID : 10891), PRDM16 (Gene ID : 63976) et UCP1 (Gene ID :
7350) mais également les marqueurs spécifiques des adipocytes beiges tels que TMEM26 (Gene ID : 219623), CITED1 (Gene ID : 4435), CD137 (GeneID : 3604) et HOXC9 (Gene ID:
3225).

L'apparition des adipocytes peut être aisément détectée par l'homme du métier par le suivi de l'expression des marqueurs spécifiques des adipocytes, des adipocytes bruns et des adipocytes beiges tels que définis ci-dessus, de préférence par le suivi des marqueurs C/EBN, PPARy, CITED1 et PGC1 a. L'expression de ces marqueurs peut être suivie par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par PCR
quantitative en temps réel. De manière alternative, l'apparition des adipocytes peut être aisément détectée par une coloration des cellules à l'huile rouge.
Ainsi, optionnellement, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape additionnelle consistant à mesurer ou évaluer l'expression d'un ou plusieurs des marqueurs C/EBN, PPARy, CITED1 et PGCla et/ou à suivre l'apparition des adipocytes par coloration des cellules à l'huile rouge.
Selon un mode de réalisation particulier, les progéniteurs adipocytaires sont mis en contact avec le milieu de maturation adipocytaire durant 5 à 20 jours ou durant 5 à 15 jours, de préférence durant 10 à 12 jours, et de manière tout particulièrement préférée durant 12 jours.
La présente invention concerne également les progéniteurs adipocytaires et les adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention.
Elle concerne également une composition pharmaceutique comprenant des progéniteurs adipocytaires et/ou des adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention, et un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
Les excipients pharmaceutiquement acceptables doivent être compatibles avec les cellules et peuvent être, par exemple, un milieu de culture, une solution tampon ou une solution saline. En particulier, la composition peut comprendre du MatrigelTM
ou un excipient équivalent.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique est appropriée pour une administration parentérale, de préférence par voie sous-cutanée, en particulier pour une administration directement dans le tissu adipeux. La composition pharmaceutique peut être formulée conformément aux pratiques pharmaceutiques standards connues par l'homme de l'art.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique comprend des progéniteurs adipocytaires et/ou des adipocytes obtenus par le procédé
selon l'invention, encapsulés dans une matrice biocompatible. De nombreuses technologies d'encapsulation peuvent être utilisées notamment celles décrites dans le document WO 91/10425.
La composition pharmaceutique peut également comprendre un ou plusieurs composés actifs supplémentaires, par exemple, des composés connus pour améliorer la survie des cellules, la prolifération ou de prévenir toute contamination.
Selon encore un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation thérapeutique des progéniteurs adipocytaires et/ou adipocytes obtenus par le procédé
selon l'invention, en particulier pour le traitement des lipodystrophies ou de troubles métaboliques.
La présente invention concerne donc les progéniteurs adipocytaires et/ou les adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention, pour une utilisation dans le traitement d'une lipodystrophie ou de troubles métaboliques. Elle concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention pour une utilisation dans le traitement d'une lipodystrophie ou de troubles métaboliques.
La présente invention concerne également l'utilisation de progéniteurs adipocytaires et/ou d'adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une lipodystrophie ou de troubles métaboliques La présente invention concerne en outre une méthode de traitement d'une lipodystrophie ou d'un trouble métabolique comprenant l'administration au sujet à traiter d'une quantité thérapeutiquement efficace de progéniteurs adipocytaires et/ou adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention. De préférence, le sujet à traiter est humain.
Tel qu'utilisé ici, le terme trouble métabolique se réfère à des anomalies de la régulation glycémique, notamment l'hyperglycémie à jeun, l'intolérance au glucose, le diabète, notamment le diabète de type 2, ou l'insulino-résistance, ou à une dyslipidémie associées ou non à une obésité ou à un syndrome lipodystrophique. Un patient peut être considéré comme obèse lorsque son indice de masse corporelle est supérieur à
25, de préférence supérieur à 28, et de manière plus particulièrement préférée supérieur à 30.
Les lipodystrophies sont des troubles caractérisés par une perte sélective de tissu adipeux à partir de diverses régions du corps. L'ampleur de la perte de graisse peut aller de très petites zones à l'absence quasi-totale de tissu adipeux sur l'ensemble du corps. Les problèmes rencontrés par les patients peuvent être purement esthétiques ou mener à des complications métaboliques sévères, globalement proportionnelles à
l'importance de la perte adipeuse.
Les lipodystrophies sont classées selon le caractère généralisé ou partiel de la perte adipeuse, et la participation ou non de facteurs génétiques connus. Les lipodystrophies d'origine génétique sont des maladies monogéniques, soit congénitales, soit d'apparition retardée. Plusieurs gènes responsables de lipodystrophies héréditaires ont été
identifiés tels que par exemple, les gènes codant pour les lamines de type A, 1'AGPAT2, la cavéoline-1, la cavine-1, la seipine, PPARg, la périlipine, CIDEC, ou Akt2 (Guénantin et al. 2014). Les lipodystrophies acquises peuvent être la conséquence de traitements médicamenteux (notamment des thérapies antivirales ou des injections d'insuline ou d'autres médicaments) ou de maladies le plus souvent dysimmunitaires (par exemple les syndromes de Lawrence et de Barraquer-Simons).
Les principales lipodystrophies conduisant à des troubles métaboliques (représentant des syndromes lipodystrophiques) sont les lipodystrophies généralisées d'origine génétique appelées CGL pour congenital generalized lipodystrophy ou syndrome de Berardinelli-Seip; les lipodystrophies partielles d'origine génétique (FPLD
pour familial partial lipodystrophy ); le syndrome de lipodystrophie généralisée acquise type Lawrence, le syndrome de lipodystrophie partielle de Barraquer-Simons, la lipodystrophie liée à l'infection par le VIH et aux thérapies antirétrovirales ; des syndromes multi-systémiques comportant une lipodystrophie tels que les syndromes auto-inflammatoires type CANDLE (JASP, JMP, ou syndrome de Nakajo) liés à des mutations du gène PSMB8, la progeria de Hutchinson-Gilford et autres syndromes progéroïdes dont la dysplasie acro-mandibulaire, liés aux mutations des lamines A/C ou de ZMPSTE24, la progeria type Werner lié aux mutations de la protéine WRN, le nanisme syndromique avec lipoatrophie associée aux mutations de PCYT1A (phosphate cytidylyltransferase 1 alpha), le nanisme microcéphalique asssocié aux mutations de NSMCE2, et d'autres syndromes comportant une lipodystrophie de cause encore inconnue.
Selon un mode de réalisation, des cellules somatiques, de préférence des fibroblastes, provenant du patient à traiter, sont reprogrammées afin d'obtenir des CSPi.
Des progéniteurs adipocytaires et/ou adipocytes sont ensuite obtenus par le procédé selon l'invention, à partir de ces CSPi, avant d'être administrés au patient, de préférence par injection sous-cutanée. Selon un mode de réalisation particulier, la méthode de traitement selon l'invention comprend donc la production de progéniteurs adipocytaires et/ou d'adipocytes à partir de cellules pluripotentes induites obtenues à partir de cellules somatiques du patient à traiter, et l'administration des progéniteurs adipocytaires et/ou adipocytes ainsi obtenus audit patient.
Dans le cas de lipodystrophies causées par une mutation génétique, en particulier pour les lipodystrophies congénitales, la mutation à l'origine de la lipodystrophie peut être détectée et corrigée selon des méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple par recombinaison homologue ou par des méthodes d'ingénierie génétique basées sur ZFN, TALEN, ou CRISPR/Cas (Gaj et al., 2013). Cette correction est de préférence réalisée avant la prolifération et la différenciation des CSPi. Les progéniteurs adipocytaires et/ou adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention à
partir de ces CSPi corrigées sont ensuite administrés au patient.
Les progéniteurs adipocytaires et/ou adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention, peuvent être utilisés dans le traitement des lipodystrophies pour combler les zones corporelles creusées par la perte de tissu adipeux. Dans ce cas, les progéniteurs adipocytaires et/ou adipocytes sont de préférence injectés par voie sous-cutanée directement dans la zone à combler.
Lorsque les progéniteurs adipocytaires et/ou adipocytes obtenus par le procédé

selon l'invention, sont utilisés dans le traitement de troubles métaboliques, ceux-ci sont de préférence injectés par voie sous-cutanée, en particulier directement dans le tissu adipeux, afin d'augmenter la proportion d'adipocytes présentant une activité
thermogénique ou susceptible de présenter cette activité, par exemple après induction par un stimulus thermogénique.
La présente invention concerne également une méthode de traitement d'une lipodystrophie ou d'un trouble métabolique comprenant l'administration à un sujet, de préférence humain, d'une quantité thérapeutiquement efficace de progéniteurs adipocytaires et/ou d'adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention.
Le terme traitement tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une amélioration ou disparition des symptômes, un ralentissement de la progression de la maladie, un arrêt de l'évolution de la maladie ou une disparition de la maladie. Ce terme englobe aussi bien le traitement préventif que curatif.

Le terme quantité thérapeutiquement efficace tel qu'utilisé ici, se réfère à une quantité suffisante pour avoir un effet sur au moins un symptôme esthétique (comblement) ou métabolique de la lipodystrophie ou du trouble métabolique (restauration de l'activité métabolique du tissu adipeux).

La présente invention concerne également un kit pour produire in vitro des progéniteurs adipocytaires ou des adipocytes.
Ce kit comprend :
- un premier récipient contenant un ou plusieurs composés présents dans le milieu 10 de différenciation mésodermique tel que décrit ci-dessus, de préférence un ou plusieurs morphogènes appartenant à la superfamille TGF-I3, en particulier un ou plusieurs morphogènes sélectionnés dans le groupe constitué de l'activine A, l'activine B, la protéine BMP-4, la protéine BMP-2, le TGF-I31, le TGF-I32, le TGF-I33 et une combinaison quelconque de ceux-ci, 15 - un second récipient contenant un ou plusieurs composés présent dans le milieu de différenciation adipogénique tel que décrit ci-dessus, de préférence de l'insuline, un de ses analogues ou de l'IGF-1, un glucocorticoïde et un agent augmentant l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) intracellulaire, et de manière plus particulièrement préférée de l'insuline, de la dexaméthasone, du 3-isobuty1-1-méthylxanthine, et
20 optionnellement de l'indométacine; et - optionnellement un troisième récipient contenant un ou plusieurs composés présents dans le milieu de maturation adipogénique tel que décrit ci-dessus, de préférence de l'insuline.
De préférence, le kit comprend des récipients contenant chacun un ou plusieurs 25 composés à une concentration ou dans une quantité qui facilite la reconstitution et/ou l'utilisation du milieu de différenciation et/ou de maturation et la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.
Le kit selon l'invention peut également comprendre un récipient contenant un milieu de base utilisé dans le milieu de différenciation mésodermique tel que décrit ci-dessus, un récipient contenant un milieu de base utilisé dans le milieu de différenciation adipogénique tel que décrit ci-dessus ou un récipient contenant du milieu de culture de base utilisé dans le milieu de maturation adipocytaire tel que décrit ci-dessus.

Dans un mode particulier, le kit comprend un récipient contenant un milieu de différenciation mésodermique tel que décrit ci-dessus, un récipient contenant un milieu de différenciation adipogénique tel que décrit ci-dessus et optionnellement un récipient contenant un milieu de maturation adipocytaire tel que décrit ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le kit comprend - un premier récipient contenant de l'activine A et/ou la protéine BMP-4, et optionnellement un milieu de culture de base sans sérum, de préférence adapté
à la prolifération des cellules humaines hématopoïétiques;
- un second récipient contenant de l'insuline, de la dexaméthasone et de l'IBMX, et optionnellement un milieu de culture de base, de préférence un milieu minimum synthétique de base avec ou sans sérum ; et - optionnellement un troisième récipient contenant de l'insuline et optionnellement un milieu de culture de base, de préférence un milieu minimum synthétique de base avec ou sans sérum.
Le second récipient peut en outre comprendre de l'indométacine.
Le kit selon l'invention peut également comprendre un système de culture adhérent, en particulier sous forme de flacon, de plaque multipuits ou de boites.
Le kit peut contenir également une notice d'instructions indiquant les modalités de préparation et/ou d'utilisation des milieux de différenciation ou de maturation pour produire in vitro des progéniteurs adipocytaires ou des adipocytes selon le procédé de l'invention.
La présente invention concerne également l'utilisation du kit selon l'invention pour la production in vitro de progéniteurs adipocytaires et/ou d'adipocytes selon les procédés de l'invention.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation des progéniteurs adipocytaires et/ou adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention pour le criblage de molécules d'intérêt thérapeutique.
Les molécules d'intérêt thérapeutique peuvent être notamment des molécules activant le phénotype beige des adipocytes, et plus particulièrement des molécules augmentant l'activité thermogénique des tissus adipeux. Ces molécules peuvent notamment être utilisables dans le traitement ou la prévention de troubles métaboliques tels que décrits ci-dessus.

La présente invention concerne donc une méthode de criblage de molécules d'intérêt comprenant -la mise en contact de progéniteurs adipocytaires et/ou d'adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention, avec les molécules candidates, et - la sélection de molécules présentant l'activité recherchée.
La présente invention concerne en particulier une méthode de criblage de molécules stimulant l'activité thermogénique des adipocytes comprenant -la mise en contact d'adipocytes obtenus par le procédé selon l'invention, avec une ou plusieurs molécules candidates, et - la sélection des molécules stimulant l'activité thermogénique des adipocytes.
L'activité thermogénique des adipocytes peut être évaluée par des techniques bien connues de l'homme du métier, telles que, par exemple, des méthodes d'évaluation indirectes comprenant la mesure de la consommation en oxygène des cellules (technologies Oxoplate0 ou Seahorse).
Selon la nature des molécules recherchées, les cellules souches pluripotentes utilisées pour obtenir les progéniteurs adipocytaires et/ou adipocytes, peuvent être obtenues à partir d'un sujet sain ou à partir d'un sujet présentant une pathologie définie, par exemple un sujet atteint d'un trouble métabolique tel que défini ci-dessus.
Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par référence dans la présente demande. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.
EXEMPLES
Matériel et méthodes Culture des cellules souches humaines à pluripotence induite (iPS) La technique de reprogrammation des fibroblastes humains en iPS utilisée est celle issue du protocole publié par Yamanaka et al (Takahashi et al, 2007), modifié par l'utilisation d'un vecteur viral (virus Sendaï). Les cellules iPS issues de sujets témoins ont été cultivées sur MatrigelTM (hESC Matrigel BD Biosciences Cat n 3542777) et le milieu de propagation mTESR1Tm (STEMCELLTm Technologies Cat n 05850) a été changé
quotidiennement. Les cellules ont été soumises tous les 4 jours à la collagénase de type IV (Gibco) (45 min ¨ 37 C) à la concentration de 1 mg/mi puis centrifugées à
800 rpm pendant 4 min. Les cellules ont ensuite été resuspendues en milieu mTESR1Tm et les clones ont été isolés mécaniquement à l'aide d'une pipette de 5 mL. Des amas d'une vingtaine de cellules ont ensuite été ensemencés sur une boite préalablement incubée avec du MatrigelTM.
Différenciation adipocytaire Une représentation schématique d'un mode de réalisation selon l'invention est présentée dans la Figure 1.
Après décollement enzymatique et dissociation mécanique, les cellules iPS ont été
ensemencées sur MatrigelTM. Après un ou deux jours de culture en mTESR1Tm, permettant d'obtenir 70% de confluence cellulaire, les cellules ont été
placées, au temps défini comme JO, en milieu de différenciation permettant l'obtention de progéniteurs mésodermiques : STEMPro34 complet (Life technologies; Cat#10639011) enrichi en GlutaMAX à 2mM (Invitrogen; Cat#35050061), acide ascorbique à 10 iLtg/mL
(Sigma;
Cat#A4403), BMP4 à 10 ng/ml (R&D systems; Cat#314-BP) et activine A à 25 ng/ml (R&D systems; Cat#338-AC). Ce milieu d'induction mésodermique a été renouvelé
à J2.
A J4, la différenciation adipocytaire des progéniteurs mésodermiques a été
induite par l'utilisation du milieu de différenciation DMEM/F12 10% SVF supplémenté
par 10 ltg/ml d'insuline (Sigma Cat#I9278), 0,5 mM d'isobutylméthylxanthine (SIGMA, Cat#I5879), 1 1.1M de dexaméthasone (Sigma Cat#D4902) et 50 1.1M
d'indométacine (SIGMA Cat#I7378). A J7, le milieu de culture a été renouvelé à l'identique.
Ensuite, afin de permettre la maturation des adipocytes, les cellules ont été cultivées en 10% SVF supplémenté par 1iag/m1 d'insuline jusqu'à J20.
Immunofluorescence Les cellules ont été fixées avec du PFA 3 % pendant 15 minutes à température ambiante. Les sites non spécifiques ont été bloqués en incubant les cellules dans du PBS-BSA 3%. La préparation cellulaire a été incubée en présence d'un anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique de la protéine d'intérêt (Tableau 1 ci-dessous), dilué dans une solution de PBS, 0.1 % Triton X100 ou 0,1% saponine, 3% BSA 3 %. Le complexe protéine-anticorps ainsi formé a été détecté en incubant les cellules 1 heure à température ambiante à l'abri de la lumière avec un anticorps secondaire qui est couplé de manière covalente à un fluorochrome et dilué dans une solution de PBS, 0.01% triton X100 ou de saponine, 3% BSA. Les anticorps secondaires anti-IgG de lapin, ou anti-IgG de souris ont été couplés à l'Alexa 488 (Invitrogen, 1/1000eme). La préparation a ensuite été incubée 15 minutes avec 25 ng/mL de Nile Red (Molecular Probes - N-1142) puis rincée 3 fois au PBS avant d'être incubée 5 minutes dans du DAPI (4'-6 diamidino-2-phénylindole, VWR). Après dépôt du liquide de montage (Fluoromount-GTM, Southern Biotech), les cellules ont été observées grâce à un microscope confocal (Leica).
Tableau 1 : Anticorps utilisés Anticorps Référence OCT4 Bovision 3576 SOX2 Milipore AB5603 NANOG Cell signaling D73G4 SSEA3/4 R&D MAB1435 TRA-1-60 MAB4360 ¨ Millipore TRA-1-81 MAB4381 ¨ Millipore MESP1 Abcam Ab77013 T BOX R&D AF2085 CD29 BD Biosciences PE 555443 CD44 BD Biosciences PE 550989 PDGFRA Cell signaling D 1E1E
KI67 AbCam Ab15580 C/EBPA Santa Cruz 14A4 GLUT4 Santa Cruz H61 PPARg Santa Cruz 7273 IRB Santa Cruz 29B4 PERILIPIN1 Progen GP29 CAVEOLIN1 BD Biosciences 610059 P-PY Santa Cruz PY99 P-AKT Santa Cruz Ser473 AKT Santa Cruz H136 UCP1 Abcam 23841 CITED1 Cell signaling 5H6 BACTIN Sigma A5441 Coloration à l'alcaline phosphatase Les cellules ont été fixées avec de l'éthanol 95% pendant 15 minutes à
température ambiante. Après 3 rinçages au PBS les cellules ont ensuite été
incubées pendant 5 minutes à 37% - 5% CO2 avec une solution de SIGMAFASTTm BCPIO/NBT
5 (Cat#B5655).
Coloration des lipides neutres à l'huile rouge La coloration à l'huile rouge a été effectuée sur des adipocytes après 20 jours de différenciation. Après rinçage au PBS 1X, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde 4% (m/v) pendant lh puis incubées pendant 2 h dans une solution d' 10 Oil red 0 (Sigma) diluée dans l'isopropanol. Les cellules ont ensuite été rincées 4 fois à l'eau du robinet.
PCR quantitative en temps réel Les ARNs totaux ont été extraits à l'aide du kit Nucleospin RNA (Macherey Nagel) selon les recommandations du fabricant. La concentration des ARNs totaux 15 extraits ainsi que leur contamination par des solvants ou des sels ont été évaluées par microspectrophotométrie (Nanodrop). La transcription inverse a été réalisée à
l'aide du kit High capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystem). La PCR
quantitative a ensuite été réalisée en ajoutant 2 iaL d'ADNc dilués 10 fois, 10 iaL de mix de PCR SYBR Green I (Roche Diagnostics, incluant l'ADN polymérase, les dNTPs, 20 mM de MgC12 et la sonde fluorescente SYBR Green), 0,2 iaM d'amorce sens et 0,2 iaM
d'amorce anti-sens (Tableau 2 ci-dessous). Le gène de référence GAPDH a été
utilisé
pour normaliser l'expression des gènes d'intérêt.

(1717 : 01\1 ai ôas) (17 : 01\1 ai ôas) LICED
ToloolâmeTerolool opoo'eueopporielor (Z17 : 01\1 ai ôas) (It : 01\1 ai ôas) VIdd ooporproomoromol meroporp000elow (Or: 01\1 ai ôas) (6 : 01\1 CR ôas) HCEdVD
oomerooeoper000 opoenolooluoroor (8 : 01\1 ai ôas) (L : 01\1 ai ôas) 9zwavu oopâTelloilEeloT ep000eee00E04 (9 : 01\1 CR ôas) (s : 01\1 ai ôas) ICULID
oreeeporoomenD earoiâeigoeoor (17 : 01\1 ai ôas) ( : 01\1 ai ôas) IdDfl oloreeep000le reneen000polo (Z : 01\1 ai ôas) (je: 01\1 ai ôas) vamp Toepo'n000'neE0 ei,E121,E00E0opei (o : 01\1 ai ôas) (6z : 01\1 CR ôas) 9IIAlifild Topoiâoopoiâoppormeme poloeloigoloi, (8Z : 01\1 ai ôas) (Li: 01\1 ai ôas) nIDOd 4ol000ropoienue 'n'eporpooeei (9Z : 01\1 CR ôas) (sz : 01\1 ai ôas) eaeooiâooloo Teerom000l (17Z : 01\1 ai ôas) (z : 01\1 ai ôas) ou'elooporoopor enuoluoTrooleD
(ZZ : 01\1 ai ôas) (jz : 01\1 ai ôas) a9K1 opoinoporearo reeepoolopoinoo (Or: 01\1 ai ôas) (61 : 01\1 CR ôas) n2119CM
reepooenerolgol iâileei2eloo1oo (81 : 01\1 ai ôas) (LI : 01\1 ai ôas) 4IVdd Tellolopeolmo eneoloiâleeno (91 : 01\1 CR ôas) (st : 01\1 ai ôas) dela/D
oi2i,oei,olol000 orierlopol00000poo (171 : 01\1 ai ôas) (1 : 01\1 ai ôas) 9dSa/D
reeprooeui:noe reeprooeui:noe (Z1 : 01\1 ai ôas) (tt : 01\1 ai ôas) ncISTD
eporeloi,o oi:eopl000poi:noro (0I : 01\1 ai ôas) (6 : UNICE' ôas) Idsaw 0E012400012epoiâo oielooeei,121,0 (8 : 01\1 ai ôas) (L : 01\1 ai ôas) XOS I
repoiâleeepoluo oorp000repoello (9 : ON1 CR ôas) (s : 01\1 ai ôas) Trom000lier i,o'n'elino'neepoigo (17 : 01\1 ai ôas) ( : 01\1 ai ôas) zxos E00E1200E10010EEE0 ETE1211,00eTEE
(z : 01\1 ai ôas) (I : 01\1 ai ôas) oureeloolâTono 12ToeeoporolooTe suaslluy suas aaimuy aua9 so?sHpn somouly : z __________________________________ maigri I
S8OZSO/SIOZHI/IDd HOXC9 gcagcaagcacaaagagga cgtctggtacttggtgtaggg (SEQ ID NO : 45) (SEQ ID NO : 46) PPARa gcactggaactggatgacag tttagaaggccaggacgatct (SEQ ID NO : 47) (SEQ ID NO : 48) DIO2 cctcctcgatgcctacaaac gctggcaaagtcaagaaggt (SEQ ID NO : 49) (SEQ ID NO : 50) MYF5 ctatagcctgccgggaca tggaccagacaggactgttacat (SEQ ID NO : 51) (SEQ ID NO : 52) PAX7 gaaaacccaggcatgttcag gcggctaatcgaactcactaa (SEQ ID NO : 53) (SEQ ID NO : 54) CD24 tgaagaacatgtgagaggtttgac gaaaactgaatctccattccacaa (SEQ ID NO : 55) (SEQ ID NO : 56) Différenciation des iPS en cellules souches mésenchymateuses (MSCs) Les iPS ont été passées mécaniquement puis ensemencées sur gélatine (Sigma) dans un milieu de différenciation composé de Knock Out DMEM (Invitrogen), 20%
SVF, 1% d'acides aminés non essentiels, 1% Glutamax (Invitrogen), 50 iaM f3-Mercaptoethanol (Sigma), FGF2 10 ng/ml (Peprotech), Aa2P 1mM (Sigma) (PO). Après 10 à 15 jours de culture, les cellules ont été passées à la trypsine (Gibco) et diluées au 1/2 (P1). Lorsque 90% de confluence ont été atteints, les cellules ont été passées et diluées au 1/3 (P2). Pour les passages suivants, les cellules ont été ensemencées sur gélatine à raison de 8000 cellules par cm2. Après 6 à 7 passages, une population homogène et stable de MSCs a été
obtenue.
Stimulation fi-adrénergique des adipocytes Les adipocytes ont été traités ou non pendant 6h à l'isoprotérenol 10 -5 M
(Sigma), puis les échantillons protéiques ont été récoltés. Pour une stimulation plus longue, les adipocytes ont été traités par un analogue non métabolisable de l'APMc, le 8-Br-AMPc (Sigma) pendant 48h.
Marquages des adipocytes au Mitotracker Les cellules vivantes à J20 de différentiation ont été incubées avec 1 iaM de MitoTracker0 Red CMXRos (Life technologies ) pendant 45min à l'obscurité à 37 C -5% de CO2. Après 2 rinçages au PBS, les cellules ont été fixées au PFA 3 %
pendant 15 minutes à température ambiante. La préparation a ensuite été incubée 15 minutes avec lng/mL de Bodipy 493/503 (Molecular Probes - D-3922) puis rincée 3 fois au PBS
avant d'être incubée 5 minutes dans du DAPI (4'-6 diamidino-2-phénylindole, VWR).
Après dépôt du liquide de montage (Fluoromount-GTM, Southem Biotech), les cellules ont été observées grâce à un microscope à confocal (Leica).
Western Blot Les adipocytes ont été lysés dans un volume approprié de tampon de lyse (50 mM

Tris pH 7,4, 0,27 M saccharose, 1 mM Na-orthovanadate pH10, 1 mM EDTA, 1 mM
EGTA, 10 mM 13-glycérophosphate, 50 mM NaF, 5 mM pyrophosphate, 1% (w/v) Triton X-100, 0,1 % (w/v) 2-13mecaptoéthanol, et inhibiteurs de protéases). Les lysats totaux ont été centrifugés (15 000g, 4 C pendant 10 mn) puis stockés à -80 C jusqu'à
utilisation.
Les concentrations en protéines ont été déterminées selon la méthode de Bradford avec l'albumine bovine pour standard. Les échantillons ont migré en SDS/PAGE sur des gels de polyacrylamide, ont été transférés sur des membranes de nitrocellulose (Amersham Biosciences), bloqués 2 h à température ambiante dans du tampon TBS-T (50mM
Tris-HC1 pH 7.6, 150mM NaC10.1% (v/v) Tween-20) additionné de 5% (m/v) de lait écrémé
ou BSA et incubés avec les différents anticorps spécifiques de la protéine d'intérêt (Tableau 1 ci-dessus).
Les membranes de nitrocellulose ont été rincées 3 fois 5 mn dans le tampon TBS-T avant d'être incubées avec l'anticorps secondaire couplé à la peroxydase.
Les signaux ont été révélés en chemiluminescence (Pierce-Perbio Biotechnologies) par exposition sur des films autoradiographiques (Kodak).
Caryotypage standard Les caryotypes ont été obtenus selon les méthodes classiques de caryotypage des Bandes G et des Bandes R .
Greffe d'adipocytes in vivo A 18 jours de culture, les cellules ont été récoltées avec du TrypLE Express (#12604021 Life Technologie) et resuspendues dans du milieu DMEM/F12/Matrigel comprenant 10 iLtg/mL d'insuline, 500 uM d'IBMX, 1 uM de dexaméthasone et 50 uM
d'indométacine. 107 cellules ont été injectées en sous-cutanée dans le dos de souris Nude FoxN1Nu (Taconic) âgées de 6 semaines. Ces souris ont également été injectées au niveau du sternum avec 3.107 cellules souches mésenchymateuses (CSM) dérivées de cellules iPS ou du Matrigel seul comme contrôle. Les souris sont euthanasiées 30 jours après la greffe.
Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) Les pannicules adipeux humains néoformés sont excisés, fixés dans 4% PFA, inclus en paraffine, puis coupés en sections de 4itm. Après déparaffinage, les lames sont colorées dans des automates. Les lames sont incubées 5 min dans l'hématoxyline, rincées à l'eau courante, incubées 2 min dans une solution d'éosine, rincées à l'eau courante, plongées dans deux bains successifs d'alcool absolu puis dans le toluène avant leur montage avec une résine.
Immunomarquage avec anticorps anti-perilipinel : Immunohistochimie Après déparaffinage, les sites antigéniques sont démasqués en fonction de l'anticorps primaire par chauffage (15 min à 95 C) au bain-marie dans du tampon EDTA
pH 8 ou pH9 ou au micro-onde dans du tampon citrate pH6. Une incubation de 5 min en présence de peroxyde d'hydrogène (3%) permet l'inhibition des peroxydases endogènes.
Le blocage des sites non spécifiques est réalisé par incubation des lames 20 min dans du sérum universel DAKO.
L'anticorps primaire (anti-perilipinel Progen Mab to Perilipin/PLIN1 ¨ Cat #651156), dilution 1/500 dans du Bond Primary Antibody Diluent (Dako), est incubé
pendant une heure à température ambiante. Après plusieurs rinçages successifs dans du tampon de lavage Dako, les lames sont incubées 30 min avec un anticorps secondaire HRP (anti-guinea pig, 1/100 dans du Diluent Antibody). Le marquage immunohistochimique est révélé par 3 incubations de 5 min avec du réactif AEC
après rinçage des lames (3-amino-9-ethylcarbazole, kit Vector Laboratories). La révélation est arrêtée en plongeant les lames dans de l'eau courante. Les lames sont ensuite contre-colorées avec de l'Hemalun et montées sur lamelles en milieu de montage aqueux (Glycergel mounting medium, Dako).

Résultats Caractère slurisotent de la li= née d'iPS utilisée La figure 2 montre que les cellules iPS utilisées présentent les caractères de pluripotence attendus. Les cellules sont organisées en colonies serrées aux contours bien 5 définis (Fig. 2A, 2B). Elles sont positives pour les marqueurs de pluripotence comme la coloration à la phosphatase alcaline (fig. 2B) et expriment les protéines NANOG, SOX2, OCT4, TRA-1-60, TRA-1-81 et SSEA3/4 (fig. 2C). De plus, ces cellules expriment les gènes OCT4, NANOG et SOX2 à un niveau comparable à celui des cellules souches embryonnaires de la lignée H9, attestant de leur caractère pluripotent (fig.
2D).
10 Obtention de progéniteurs mésodermiques et adipocytaires La figure 3 montre la chute de l'expression de marqueurs de pluripotence OCT4, NANOG et SOX2 au cours de la différenciation (fig. 3A) et l'induction de l'expression génique de BRACHYURY et MESP1, deux gènes caractérisant le mésoderme précoce, lorsque les cellules iPS sont soumises au milieu spécifique de différenciation 15 mésodermique (fig. 3B). L'expression génique de BRACHYURY (T BOX) et de est augmentée de 75 fois après 4 jours de différenciation, montrant la production effective de progéniteurs mésodermiques. L'expression protéique de ces marqueurs a été
confirmée par immunofluorescence (fig. 3C). Comme attendu, l'expression de ces gènes diminue après induction de la différenciation adipocytaire (J6) (fig. 3B).
Afin d'attester 20 du caractère spécifique de l'expression de BRACHYURY et MESP1 dans les progéniteurs mésodermiques, l'expression de ces mêmes marqueurs a été analysée au cours de la différenciation de cellules iPS en cellules souches mésenchymateuses (MSC) (fig. 3D).
Ces marqueurs ne sont pas exprimés dans les MSC et les progéniteurs mésodermiques obtenus par la méthode selon l'invention sont différents des MSC.
25 Ces progéniteurs mésodermiques se différencient ensuite en progéniteurs adipocytaires exprimant certains marqueurs décrits pour les cellules souches du tissu adipeux humain. En effet, entre 4 et 12 jours de différenciation, l'expression des gènes PDGFRa, LY6E, CD44 et CD29 augmente (fig. 3E). En parallèle, l'expression de diminue au cours de la différenciation en concordance avec l'engagement vers la voie 30 adipocytaire (fig. 3E). Les marqueurs CD44, CD29, et PDGFRa sont coexprimés au niveau protéique à J12 (fig. 3F). De plus, ces mêmes cellules sont positives pour le marqueur Ki67 (fig. 3F), signant la présence d'une population progénitrice proliférative.
Différenciation adipocytaire L'expression des gènes adipocytaires spécifiques est mesurée au cours de la différenciation. La figure 4 montre que les expressions géniques de C/EBPa, C/EBPfl, C/EBN et PPARy, facteurs de transcription induits au cours de la différenciation adipocytaire, augmentent progressivement entre J8 et J12, après l'addition du cocktail de différenciation adipogénique (J4). Ce niveau d'expression élevé est maintenu à
J20. De la même manière l'expression protéique de l'isoforme adipo-spécifique PPARy2 et de C/EBPa p30/42 est observée à partir du dixième jour de différenciation (fig.
5B et 5C).
La figure 5C montre que l'expression de protéines jouant un rôle majeur dans l'adipocyte tel que le récepteur de l'insuline (IR : insulin Receptor), les protéines associées aux gouttelettes lipidiques telles que la Périlipinel et la Cavéolinel (fig. 5C) et le transporteur de glucose GLUT4 (fig. 5B) est induite lors de la différenciation des cellules adipocytaire.
Obtention d'adipocytes La figure 5A montre une coloration à l'huile rouge des adipocytes à différents grossissements. L'accumulation de lipides est homogène sur l'ensemble de la boite de culture. Les cellules sont organisées en clusters , présentent une forme arrondie et contiennent plusieurs gouttelettes lipidiques. Ces cellules présentent donc une morphologie caractéristique de l'adipocyte in vitro.
La figure 5B présente une autre méthode de marquage des lipides neutres, avec marquage concomitant du noyau. Les images permettent d'observer le noyau excentré de l'adipocyte, et l'organisation caractéristique des gouttelettes lipidiques.
Efficacité de la différenciation La figure 5A montre des champs larges d'adipocytes dont les gouttelettes lipidiques ont été marquées par un colorant des lipides neutres. Ces images permettent d'évaluer l'efficacité de la différenciation comme étant supérieure à 60%.

En effet, après 20 jours de différenciation, 62% ( 2% SEM) des cellules expriment à leur noyau le marqueur adipocytaire C/EBPa. Les adipocytes obtenus sont alors capables de répondre à un court traitement à l'insuline en induisant une forte phosphorylation de la sous-unité a du récepteur à l'insuline (IR) et de sa cible AKT/PK
(fig. 5D).
Obtention d'adipocytes beiges La figure 6A montre que les adipocytes obtenus expriment des gènes du brun classique comme PGCla, PRDM16 et UCP1, mais n'expriment pas les gènes spécifiques de progéniteurs et d'adipocytes bruns matures tels que MYF5 et Z/C/.
L'expression protéique d'UCP1 peut-être détectée à partir de J10 (fig. 6B).
Ces cellules expriment aussi des gènes spécifiques des adipocytes beiges (ou brite ) comme TMEM26, CITED1, CD137 et HOXC9 (fig. 6C). L'expression protéique de CITED1 peut être observée dans les adipocytes différenciés (fig. 6D). De plus, on observe une forte induction protéique d'UCP1 après stimulation f3-adrénergique. Cette forte induction est une des principales caractéristiques des adipocytes beiges (fig. 6E). En accord avec ce résultat, une stimulation avec le 8-Br-AMPc montre une augmentation du nombre de mitochondries dans les adipocytes beiges après 48h (fig. 6F) et de l'expression des gènes impliqués dans la thermogenèse tels que PGC1 a, PRDM16, PPARa et D102 (fig.
6G).
Ainsi, tous ces résultats montrent que les adipocytes dérivés des cellules humaines iPS
ont un phénotype de type beige.
Formation de tissu adipeux in vivo Après 18 jours de culture sur MatrigelTM en présence en présence d'un milieu de différenciation adipogénique, 107 cellules sont injectées en sous-cutané dans le dos de souris immunodéficientes âgées de six semaines (fig. 7A). Des MSC ou du MatrigelTM
seul sont injectés au niveau du sternum des mêmes souris comme contrôle (n=3).
Après jours, un pannicule adipeux apparait au niveau du site d'injection des cellules et non au niveau du site d'injection du MatrigelTM. L'analyse histologique des pannicules adipeux obtenus après injection des adipocytes dérivés des cellules iPS
humaines révèle un tissu adipeux complètement différencié, organisé et vascularisé (fig. 7C, D). En 30 revanche, les tissus obtenus suite à l'injection par des cellules souches mésenchymateuses (MSC) dérivées de cellules iPS, présentent une composition hétérogène avec de larges zones de cellules de type fibroblastique et un nombre réduit d'adipocytes (fig. 7C, D).
Les cellules qui composent le pannicule adipeux formé à partir des adipocytes ou des MSC dérivés des cellules iPS présentent des gouttelettes lipidiques révélées par le marquage à la perilipinel (fig. 7E). L'ensemble de ces résultats montrent ainsi que les adipocytes obtenus selon l'invention sont capables de former du tissu adipeux in vivo.
Conclusion La différenciation de cellules souches pluripotentes en deux dimensions permet l'obtention de progéniteurs mésodermiques ayant la capacité de se différencier en progéniteurs adipocytaires puis en adipocytes lorsqu'ils sont soumis à un cocktail adipogénique. Les adipocytes obtenus par la méthode selon l'invention expriment les facteurs de transcriptions caractéristiques de ce type cellulaire et accumulent des lipides sous forme de triglycérides. Ces adipocytes une fois greffés sont capables de former des pannicules adipeux in vivo. De plus, les inventeurs ont démontré que cette méthode permet d'obtenir des adipocytes humain de type beige jusqu'alors non décrits in vitro.
Enfin, cette méthode permet d'obtenir des adipocytes en grande quantité en seulement vingt jours à partir de la souche pluripotente indifférenciée.
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Claims (18)

REVENDICATIONS
1. Procédé de production in vitro de progéniteurs adipocytaires comprenant - la mise en culture de cellules souches pluripotentes sur un système de culture adhérent et dans un milieu de culture sans sérum ;
- la mise en contact desdites cellules souches pluripotentes avec un milieu de différenciation mésodermique jusqu'à l'obtention de progéniteurs mésodermiques ; et - la mise en contact desdits progéniteurs mésodermiques avec un milieu de différenciation adipogénique jusqu'à l'obtention de progéniteurs adipocytaires, et optionnellement la récupération des progéniteurs adipocytaires ainsi obtenus.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les cellules souches pluripotentes sont des cellules souches pluripotentes induites.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le milieu de différenciation mésodermique est un milieu de culture sans sérum comprenant un ou plusieurs morphogènes appartenant à la superfamille du TGF-.beta., de préférence sélectionnés dans le groupe constitué de l'activine A, l'activine B, la protéine BMP-4, la protéine BMP-2, le TGF-.beta.1, le TGF-.beta.2 et le TGF-.beta.3, et une combinaison quelconque de ceux-ci.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel le milieu de différenciation mésodermique est un milieu de culture sans sérum comprenant (i) un morphogène sélectionné dans le groupe constitué de l'activine A et l'activine B, de préférence l'activine A ; et (ii) un morphogène sélectionné dans le groupe constitué de la protéine BMP-4, la protéine BMP-2, le TGF-.beta.1, le TGF-.beta.2 et le TGF-.beta.3, et une combinaison quelconque de ceux-ci, de préférence la protéine BMP-4.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le milieu de culture sans sérum est un milieu adapté à la culture des cellules hématopoïétiques.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les cellules souches pluripotentes sont mises en contact avec le milieu de différenciation mésodermique lorsque la culture présente une confluence d'environ 50 à environ 90%.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le milieu de différenciation adipogénique est un milieu de culture comprenant de l'insuline, l'un de ses analogues ou de l'IGF-1, un glucocorticoïde et un agent augmentant l'adénosine mono-phosphate cyclique (AMPc) intracellulaire.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le milieu de différenciation adipogénique comprend de l'insuline, de la dexaméthasone et du isobutyl-1 -méthylxanthine .
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, dans lequel le milieu de différenciation adipogénique comprend en outre de l'indométacine.
10. Procédé de production in vitro d'adipocytes comprenant la mise en contact des progéniteurs adipocytaires obtenus par le procédé selon les revendications 1 à
9, avec un milieu de maturation adipocytaire jusqu'à l'obtention d'adipocytes.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le milieu de maturation adipocytaire est un milieu de culture comprenant de l'insuline.
12. Progéniteurs adipocytaires obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou adipocytes obtenus par le procédé selon la revendication 10 ou 11, pour une utilisation dans le traitement d'une lipodystrophie.
13. Progéniteurs adipocytaires obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou adipocytes obtenus par le procédé selon la revendication 10 ou 11, pour une utilisation dans le traitement d'une anomalie de la régulation glycémique, de préférence sélectionnée dans le groupe constitué de l'hyperglycémie à jeun, l'intolérance au glucose, le diabète, notamment le diabète de type 2, et l'insulino-résistance, ou dans le traitement d'une dyslipidémie associées ou non à une obésité ou à
un syndrome lipodystrophique.
14. Progéniteurs adipocytaires obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou adipocytes obtenus par le procédé selon la revendication 10 ou 11, pour une utilisation selon la revendication 12 ou 13, où les cellules souches pluripotentes utilisées pour la production in vitro des progéniteurs adipocytaires ou des adipocytes sont des cellules souches pluripotentes induites obtenues à partir de cellules somatiques, de préférence des fibroblastes, provenant du sujet à traiter.
15. Kit pour produire in vitro des progéniteurs adipocytaires ou des adipocytes comprenant :
- un premier récipient contenant un ou plusieurs morphogènes appartenant à
la superfamille du TGF-.beta.;
- un second récipient contenant (i) de l'insuline, l'un de ses analogues ou de l'IGF-1, (ii) un glucocorticoïde et (iii) un agent augmentant l'adénosine mono-phosphate cyclique (AMPc) intracellulaire et - optionnellement un troisième récipient contenant de l'insuline.
16. Kit selon la revendication 15, dans lequel - le premier récipient contient de l'activine A et/ou de la BMP-4, et - le second récipient contient de l'insuline, de la dexaméthasone et de l'IBMX, et optionnellement de l'indométacine.
17. Utilisation du kit selon la revendication 15 ou 16 pour la production in vitro de progéniteurs adipocytaires par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à
9 ou d'adipocytes par le procédé selon la revendication 10 ou 11.
18. Méthode de criblage de molécules stimulant l'activité thermogénique des adipocytes comprenant -la mise en contact d'adipocytes obtenus par le procédé selon la revendication 10 ou 11, avec une ou plusieurs molécules candidates, et - la sélection de molécules stimulant l'activité thermogénique des adipocytes.
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