KR102642881B1 - 네오아가로올리고당 제조를 위한 재조합 효모 사카로마이세스 보울라디 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 프로바이오틱 효모인 사카로마이세스 보울라디를 이용해 홍조류를 구성하는 대표적인 다당체인 아가로스로부터 네오아가로올리고당을 생산하는 균주, 이의 제조 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 프로바이오틱 균주를 이용한 프리바이오틱 물질 생산을 통해 신바이오틱스를 달성하고자 함과 동시에 장내 미생물 공장으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 홍조류를 구성하는 대표적인 다당체인 아가로스로부터 네오아가로올리고당을 생산하는 재조합 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
사카로마이세스 보울라디는 리치와 망고스틴의 껍질에서 처음 발견된 GRAS(Generally Recognized As Safe) 비병원성 효모이다. 사카로마이세스 보울라디는 낮은 pH와 열에 대한 내성이 높기 때문에 인간의 위장관에서 생존할 수 있다고 알려져있다(Douradinha B., et al. (2014) Bioengineered. 5, 21-29, Czerucka D., et al. (2007) Aliment. Pharmacol. Ther. 26(6), 767-78). 사카로마이세스 보울라디는 이중 맹검 연구에서 효과적인 것으로 밝혀진 유일한 프로바이오틱 효모이다.
비소화성 식이는 소화성 식이와 달리 대장에 도달하여 장내 미생물 군집에 의해 활용된다. 결과적으로 비소화성 식이는 장내 환경을 변화시키고 전반적인 인간의 건강에도 영향을 미치게 된다(Pistollato F., et al. (2016) Nutr Rev. 74, 624-634, Sonnenburg E.D., et al. (2014) Cell Metab. 20, 779-786). 홍조류를 구성하는 대표적인 다당체인 아가로스는 동아시아에서 흔히 볼 수 있는 비소화성 식이 중 하나이다(Kolb N., et al. (2004) Food Technol Biotechnol. 42, 57-61). 아가로스는 엔도 타입 베타-아가레이즈에 의해 네오아가로테트라오스 및 네오아가로바이오스와 같은 네오아가로올리고당으로 분해되는데, 상기 네오아가로올리고당은 항 비만, 항 당뇨, 항 염증, 항 종양 활성, 프리바이오틱 효과 등 다양한 생리적, 생물학적 기능을 가지고 있는 것으로 보고되었다(Torres M.D., et al. (2019) Mar Drugs. 17, 314, Hong S.J., et al. (2017) Mar Drugs. 15, 90, Lee M.H., et al. (2017) BMB Rep. 50, 263, Lin F., et al. (2019) Mar Drugs. 17, 154, Wang W., et al. (2017) Sci Rep. 7, 442-52, Kim M., et al. (2020) Biomaterials. 263, 120391, Hu G., et al. (2006) Anaerobe. 12, 260-266). 특히, 네오아가로올리고당의 한 종류인 사당류 네오아가로테트라오스 또한 항 염증, 항산화 활성, 프리바이오틱 효과 등 다양한 기능성을 가지는 물질로 밝혀졌다(Zhang N., et al. (2017) Food Agric Immunol. 28, 1408-1423, Xu X-Q., et al. (2018) Food Chem. 240, 330-337).
이 때, 장에서 직접 프리바이오틱스와 같은 유용한 단백질을 생산할 수 있는 장내 미생물 공장이 개발된다면, 장내 미생물이 건강에 끼치는 영향에 대한 더 정확한 연구가 가능해지고, 더 나아가 실제 질환의 치료에도 사용될 수 있을 것이다.
하지만 홍조류의 아가 또는 아가로스로부터 프리바이오틱스로 이용가능한 네오아가로올리고당을 진핵 세포이자 프로바이오틱스인 효모 사카로마이세스 보울라디에서 제조에 성공한 연구는 보고된 바가 없다.
본 발명의 목적은 프리바이오틱 물질을 장내에서 생산할 수 있는 프로바이오틱 재조합 효모를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 프로바이오틱 재조합 효모 및 기질을 포함하는 프리바이오틱을 제조용 조성물 및 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 프리바이오틱 물질을 대사공학 기술을 이용하여 프로바이오틱 효모로부터 생산하기 위해 박테로이데스 플레베이우스 유래 효소 BpGH16A 유전자를 효모인 사카로마이세스 보울라디에 도입하여 네오아가로테트라오스를 포함하는 네오아가로올리고당을 최초로 생산하고자 하였다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 네오아가로올리고당 정량 방법을 사용하여 사카로마이세스 보울라디를 아가로스와 함께 발효한 후 생산된 네오아가로올리고당을 정량하였고, 베타-아가레이즈인 BpGH16A를 발현하여 균주 밖으로 분비할 수 있는 프로바이오틱 효모인 사카로마이세스 보울라디를 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 따라, 본 발명은 베타-아가레이즈를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii)를 제공한다.
본 발명의 재조합 사카로마이세스 보울라디는 최종적으로 아가로스를 기질로 하여 네오아가로올리고당을 제조하는데 이용하기 위함이 목적이다. 그러나, 사카로마이세스 보울라디는 기질인 아가로스를 균주 내로 흡수하여 대사하지 못하기 때문에 아가로스를 네오아가로올리고당으로 분해할 수 있는 베타-아가레이즈 효소를 균주 밖으로 분비시킬 수 있는 수단을 필요로 한다. 따라서, 본 발명의 재조합 사카로마이세스 보울라디는 상기 베타-아가레이즈를 균주 밖으로 분비시킬 수 있는 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자로 형질전환될 수 있다.
상기 시그널 펩타이드는 사카로마이세스 보울라디에서 베타-아가레이즈, 구체적으로 서열번호 1로 표시되는 BpGH16A 유전자로부터 발현된 효소를 분비시키는 역할을 하는 것으로, 치킨 리소자임 시그널 펩타이드 (CL), 사카로마이세스 세레비지애 유래의 α-결합 인자 시그널 펩타이드 (α-MF), 사카로마이세스 다이아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) 유래의 STA1 시그널 펩타이드 (STA1), 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 SED1 시그널 펩타이드 (SED1) 중 하나 이상일 수 있다. 구체적인 일 실시예에서, 시그널 펩타이드로 SED1를 사용하는 경우에 효소의 분비량 및 네오아가로올리고당의 생산량이 가장 우수함 확인할 수 있었다.
상기 치킨 리소자임 시그널 펩타이드 (CL)는 서열번호 2로 표시되고, 상기 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 α-결합 인자 시그널 펩타이드 (α-MF)는 서열번호 3으로 표시되고, 상기 사카로마이세스 다이아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) 유래의 STA1 시그널 펩타이드 (STA1)는 서열번호 4로 표시되고, 및 상기 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 SED1 시그널 펩타이드 (SED1)는 서열번호 5로 표시될 수 있다.
상기 베타-아가레이즈 및/또는 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자로 사카로마이세스 보울라디를 형질 전환시키는 것은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 또는 유전자 재조합 기술인 CRISPR-Cas9을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 사카로마이세스 보울라디의 형질 전환을 위해 플라스미드와 같은 재조합 벡터를 사용하는 경우, 영양 요구성 돌연변이, 예를 들면 HIS3, TRP1 및 URA3 유전자 중 하나 이상이 비활성화된 돌연변이 사카로마이세스 보울라디 균주를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 사카로마이세스 보울라디 및 기질인 아가로스를 포함하는 프리바이오틱 제조를 위한 조성물을 제공한다.
본 발명의 재조합 사카로마이세스 보울라디는 균주 밖으로 베타-아가레이즈를 분비하여 기질인 아가로스를 분해함으로써 프리바이오틱스를 제조할 수 있을 뿐 아니라 사카로마이세스 보울라디는 프로바이오틱스 균주에 해당하여 프리바이오틱스 및 프로바이오틱스를 동시에 제공할 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 상기 재조합 사카로마이세스 보울라디 및 기질인 아가로스를 포함하는 신바이오틱스 조성물을 제공한다.
상기 프리바이오틱스는 네오아가로올리고당일 수 있으며, 구체적으로, 아가로스의 분해를 통해 제조되는 네오아가로바이오스, 네오아가로테트라오스, 및 네오아가로헥사오스일 수 있다.
또한 상기 조성물은 사카로마이세스 보울라디 균주 이외에 다른 프로바이오틱스를 더 포함할 수 있고, 구체적으로, 락토바실러스 속, 비피도박테리움 속, 및 엔테로콕쿠스 속에 속하는 균주일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 네오아가로올리고당을 섭취하여 대사할 수 있는 프로바이오틱스 균주라면 제한없이 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명은 상기 재조합 사카로마이세스 보울라디의 배양액 또는 추출액을 기질인 아가로스와 반응시키는 단계; 및 상기 단계의 생성물로부터 네오아가로올리고당을 분리 정제하는 단계를 포함하는 네오아가로올리고당 제조 방법을 제공한다.
상기 재조합 사카로마이세스 보울라디 및 네오아가로올리고당에 관한 설명은 상술한 내용과 중복을 방지하기 위해 생략한다.
구체적으로, 본 발명의 재조합 사카로마이세스 보울라디로부터 베타-아가레이즈를 생산하기 위한 상기 균주의 배양 또는 발효는 20 내지 40℃, 바람직하게는 30 내지 40℃의 온도조건에서 1일 내지 7일, 바람직하게는 2일 내지 5일간 수행하는 것일 수 있다.
본 발명은 아가로스를 분해하여 네오아가로올리고당을 생산할 수 있는 재조합 효모 제작 공정을 제시한다. 즉, 본 발명를 통해 제조된 사카로마이세스 보울라디를 이용해 아가로스를 기질로 하여 네오아가로올리고당을 생산할 수 있음을 규명하였다. 이는 프로바이오틱스 효모인 사카로마이세스 보울라디를 이용한 프리바오이틱스를 포함하는 장내 유용 물질 생산 및 재조합 효소 개발에 활용 가능하다.
도 1은 대사공학 기술을 이용하여 엔지니어링된 사카로마이세스 보울라디에 의한 네오아가로테트라오스 생산에 대한 전체적인 모식도이다. 베타-아가레이즈인 BpGH16A 유전자의 도입은 영양 요구성 마커가 있는 벡터 시스템과 CRISPR-Cas9 시스템의 두 가지 다른 시스템을 사용해 진행하였다.
도 2는 BpGH16A 유전자를 도입한 균주(SB-HTU_16A_C)를 이용한 발효 생성물을 HPLC를 이용해 확인한 결과이다. 2.5g/L 아가로스를 기질로 37℃에서 72시간 발효를 진행하였다. (A)는 대조군인 야생형 균주을 이용한 발효 생성물 분석 결과이고, (B)는 BpGH16A 유전자와 치킨 리소자임 시그널 펩타이드 서열을 도입한 균주(SB-HTU_16A_C)를 이용한 발효 생성물 분석 결과이다. 네오아가로테트라오스(NeoDP4)는 약 7.6분의 머무름 시간에서 피크로 검출되었다.
도 3은 사카로마이세스 보울라디에서 베타-아가레이즈인 BpGH16A 유전자 앞에 각기 다른 시그널 펩타이드 서열을 도입한 균주를 아가로오스와 함께 발효했을 때 생성된 네오아가로테트라오스(NeoDP4) 양을 비교한 결과이다. 2.5g/L 아가로스를 기질로 37℃에서 72시간 동안 발효를 진행했다. (A)는 발효 생성물을 TLC를 이용해 분석한 결과이고, (B)는 발효 생성물을 HPLC를 이용해 분석하고 농도를 계산한 결과이다.
도 4는 플라스미드를 기반으로 제작된 효모(SB-HTU_16A_D)를 이용해 아가로스를 기질로 제공하고 37℃에서 72시간 동안 발효를 진행했을 때 시간별로 생성된 물질 및 세포 생장을 확인한 결과이다. (A)는 TLC를 이용해 72시간 동안의 발효 생성물을 분석한 결과이다. (B)는 72시간 발효를 진행하는 동안 세포 밀도와 글루코오스, 에탄올, 아세트산 및 네오아가로테트라오스의 농도를 HPLC로 분석하고 정량한 결과이다.
도 5는 네오아가로올리고당을 생산할 수 있는 사카로마이세스 보울라디를 CRISPR-Cas9 기술을 이용해 제작하는 방법에 관한 것이다. (A)는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용해 베타-아가레이즈를 균주에 도입하는 공정에 대한 전체적인 모식도이다. (B)는 베타-아가레이즈를 CRISPR-Cas9 시스템을 이용해 균주에 도입한 후, 실제로 도입이 됐는지 콜로니 PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 조작된 사카로마이세스 보울라디(SB_16A_D)를 이용해 아가로스를 기질로 제공하고 72시간 동안 발효를 진행했을 때 시간별로 생성된 물질 및 세포 생장을 확인한 결과이다. (A)는 TLC를 이용해 72시간 동안의 발효 생성물을 분석한 결과이다. (B)는 72시간 발효를 진행하는 동안 세포 밀도와 글루코오스, 아세트산, 에탄올 및 네오아가로테트라오스의 농도를 HPLC로 분석한 결과이다.
도 2는 BpGH16A 유전자를 도입한 균주(SB-HTU_16A_C)를 이용한 발효 생성물을 HPLC를 이용해 확인한 결과이다. 2.5g/L 아가로스를 기질로 37℃에서 72시간 발효를 진행하였다. (A)는 대조군인 야생형 균주을 이용한 발효 생성물 분석 결과이고, (B)는 BpGH16A 유전자와 치킨 리소자임 시그널 펩타이드 서열을 도입한 균주(SB-HTU_16A_C)를 이용한 발효 생성물 분석 결과이다. 네오아가로테트라오스(NeoDP4)는 약 7.6분의 머무름 시간에서 피크로 검출되었다.
도 3은 사카로마이세스 보울라디에서 베타-아가레이즈인 BpGH16A 유전자 앞에 각기 다른 시그널 펩타이드 서열을 도입한 균주를 아가로오스와 함께 발효했을 때 생성된 네오아가로테트라오스(NeoDP4) 양을 비교한 결과이다. 2.5g/L 아가로스를 기질로 37℃에서 72시간 동안 발효를 진행했다. (A)는 발효 생성물을 TLC를 이용해 분석한 결과이고, (B)는 발효 생성물을 HPLC를 이용해 분석하고 농도를 계산한 결과이다.
도 4는 플라스미드를 기반으로 제작된 효모(SB-HTU_16A_D)를 이용해 아가로스를 기질로 제공하고 37℃에서 72시간 동안 발효를 진행했을 때 시간별로 생성된 물질 및 세포 생장을 확인한 결과이다. (A)는 TLC를 이용해 72시간 동안의 발효 생성물을 분석한 결과이다. (B)는 72시간 발효를 진행하는 동안 세포 밀도와 글루코오스, 에탄올, 아세트산 및 네오아가로테트라오스의 농도를 HPLC로 분석하고 정량한 결과이다.
도 5는 네오아가로올리고당을 생산할 수 있는 사카로마이세스 보울라디를 CRISPR-Cas9 기술을 이용해 제작하는 방법에 관한 것이다. (A)는 CRISPR-Cas9 시스템을 사용해 베타-아가레이즈를 균주에 도입하는 공정에 대한 전체적인 모식도이다. (B)는 베타-아가레이즈를 CRISPR-Cas9 시스템을 이용해 균주에 도입한 후, 실제로 도입이 됐는지 콜로니 PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 6은 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 조작된 사카로마이세스 보울라디(SB_16A_D)를 이용해 아가로스를 기질로 제공하고 72시간 동안 발효를 진행했을 때 시간별로 생성된 물질 및 세포 생장을 확인한 결과이다. (A)는 TLC를 이용해 72시간 동안의 발효 생성물을 분석한 결과이다. (B)는 72시간 발효를 진행하는 동안 세포 밀도와 글루코오스, 아세트산, 에탄올 및 네오아가로테트라오스의 농도를 HPLC로 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
플라스미드 및 균주 제작 방법
균주 제작 시 영양 요구성 마커를 사용하기 위해 비활성화된 HIS3, TRP1 및 URA3 유전자를 갖는 균주를 생성하였다. TRP1과 URA3가 비활성화된 균주 SB-TU(Liu J-J., et al. (2016) Appl Environ Microbiol. 82, 2280-2287)를 기반으로 HIS3 유전자를 비활성화하였다. HIS3 유전자는 프라이머 쌍 gHIS3_F 및 gHIS3_R을 사용하여 증폭하고(표 1), 생성된 PCR 생성물을 SacI 및 NotI에 의해 분해하고 pRS42H 벡터에 연결하여 플라스미드 p42H_gHIS3을 생성하였다(표 2). HIS3 불활성화 후 필요한 복구 DNA는 프라이머 dDNA_HIS3_F 및 dDNA_HIS3_R(표 1)을 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 효모 형질전환은 PEG-LiAc 방법으로 진행하였다(Gietz R.D., et al. (1995) Yeast. 11, 335-360). 효모 형질 전환 후 HIS3, TRP1, 그리고 URA3 유전자가 비활성화된 사카로마이세스 보울라디 균주 SB-HTU를 제작하여 실험에 사용하였다(표 3).
베타-아가레이즈 분비를 위한 최적의 시그널 펩타이드 선정을 위한 플라스미드 구축은 다음과 같이 수행하였다. BpGH16A를 코딩하는 유전자 BACPLE_01670을 pRS426GPD 플라스미드에 복제하였다. BpGH16A 유전자 단편은 박테로이데스 플레베이우스(Bacteroides plebeius) DSM 17135(DSMZ, Braunschweig, Germany) 게놈 DNA로부터 시그널 펩타이드의 유형에 따라 다른 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 통해 증폭되었다(표 1). BpGH16A의 N-말단에서 예측된 시그널 펩타이드 서열은 제거한 후 사용하였다. 치킨 리소자임 시그널 펩타이드 (CL), 사카로마이세스 세레비지애 유래의 α-결합 인자 시그널 펩타이드 (α-MF), 사카로마이세스 다이아스타티커스(Saccharomyces diastaticus) 유래의 STA1 시그널 펩타이드 (STA1), 그리고 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 SED1 시그널 펩타이드 (SED1) 등 총 4 가지의 시그널 펩타이드를 비교하였다(Liu J-J., et al. (2016) Appl Environ Microbiol. 82, 2280-2287, Inokuma K., et al. (2016) Biotechnol Bioeng. 113, 2358-2366, Yanagisawa M., et al. (2016) Enzyme Microb Technol. 85, 82-89). 또한, 시그널 펩타이드가 없는 대조군 균주의 구축을 위해 프라이머 쌍 16A_W/OSP_F_SpeI, 16A_W/OSP_R_XhoI를 사용하여 PCR을 수행하였다(표 1). p426_Bp_W/OSP, p426_Bp_CL, p426_Bp_αMF, p426_Bp_STA1 및 p426_Bp_SED1 등의 플라스미드를 생성하고 SB-HTU로의 효모 형질 전환은 PEG-LiAc 방법으로 수행하였다. 즉, 시그널 펩타이드 비교 실험을 위해 균주 SB-HTU_16A_C, SB-HTU_16A_A, SB-HTU_16A_S 및 SB-HTU_16A_D를 준비하였다(표 3). 대조군 균주로 BpGH16A와 시그널 펩타이드 없이 pRS426GPD 벡터만 포함하는 SB-HTU_E와 BpGH16A 유전자를 포함하지만 시그널 펩타이드는 없는 SB-HTU_W를 준비하여 사용하였다.
BpGH16A의 안정적인 발현을 위해 BpGH16A 유전자를 사카로마이세스 보울라디의 게놈에 통합하기 위해 가이드 RNA 플라스미드 p42K_CS5를 사용하였다(표 2). p42K_CS5는 프라이머 쌍 gRNA_CS5_F, gRNA_CS5_R을 사용하여 가이드 RNA 서열을 포함하는 pRS42K 플라스미드의 역 PCR에 의해 생성되었다(표 1). 가이드 RNA의 20-bp 표적화 서열은 염색체 XV (CS5)의 빈 유전자 자리에서 PAM 서열 (NGG)의 전면에 결합한다. BpGH16A 및 SED1 시그널 펩타이드는 다른 유전자의 기능에 영향을 주지 않고 상동성 재조합에 의해 통합되었다. 상동성 재조합을 위해, 플라스미드 p426_16A_D는 CRISPR-Cas9에 기초한 게놈 통합을 위한 공여자 DNA로 dDNA-CS5-F 및 dDNA-CS5-R 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되었다(표 1). 게놈 통합과 관련된 비 효율성을 극복하기 위해, 프라이머 쌍 dDNA-CS5-F 및 dDNA-CS5-R을 사용하여 구축된 PCR 생성물을 프라이머 쌍 CS5+60_F 및 CS5+60_R을 사용하여 PCR에 의해 다시 한번 증폭하여 상동 영역을 120-bp까지 증가시켰다(표 1). 효모 형질 전환 과정에서 Cas9-NAT 1μg, 16A-D-CS5 20μg, p42K_CS5 2μg을 사카로마이세스 보울라디에 첨가하여 PEG-LiAc 방법으로 형질 전환하였다. 게놈 통합의 검증은 프라이머 쌍 Conf-CS5-F 및 Conf-CS5-R을 사용한 효모 콜로니 PCR에 의해 수행되었다(표 1).
| Primer | Sequence (5’→3’, restriction sites are underlined) |
| gHIS3_F | TCCACCTAGCGGATGACTCT(서열번호 6) |
| gHIS3_R | TGCATTACCTTGTCATCTTC(서열번호 7) |
| dDNA_HIS3_F | GTAAAGCGTATTACAAATGAAACCAAGATTCAGATTGCGATCTCTTTAAAGGGTTAACCC(서열번호 8) |
| dDNA_HIS3_R | TTCTGGGAAGATCGAGTGCTCTATCGCTAGGGGTTAACCCTTTAAAGAGATCGCAATCTG(서열번호 9) |
| 16A_W/OSP_F_SpeI | ATA ACTAGTGCAGAAAATTTAAATAATAAATCATACGAGTG(서열번호 10) |
| 16A_W/OSP_R_XhoI | ATA CTCGAGTTCTTCTGGGACCAGTGTATAAAC(서열번호 11) |
| 16A_CL_F_SpeI | ATA ACTAGTATGAGGTCTTTGCTAATCTTGGTGCTTTGCTTCCTGCCCCTGGCTGCTCTGGGGGCAGAAAATTTAAATAATAAATCATAC(서열번호 12) |
| 16A_CL_R_XhoI | ATA CTCGAGTTCTTCTGGGACCAGT(서열번호 13) |
| αMF_F_SpeI | ATA ACTAGTATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG(서열번호 14) |
| αMF_R_16A | GCA GAA AAT TTA AAT AAT AAA GCT TCA GCC TCT CTT TTC T(서열번호 15) |
| 16A_F_ αMF | GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GCA GAA AAT TTA AAT AAT AAA TCA TAC G(서열번호 16) |
| 16A_R_αMF_BamHI | ATA GGATCCTTCTTCTGGGACCAGTGTAT(서열번호 17) |
| STA1_F_EcoRI | ATA GAATTCATGGTAGGCCTCAAAAATC(서열번호 18) |
| STA1_16A_ R | GCA GAA AAT TTA AAT AAT AAA TCA TAC GAG TTT TTT CTG TCG CTG GAG C(서열번호 19) |
| 16A_STA1_ F | GGC TCC AGC GAC AGA AAA AAG CAG AAA ATT TAA ATA ATA AAT CAT ACG AG(서열번호 20) |
| 16A_ R_XhoI | ATA CTCGAGTTCTTCTGGGACCAGTGTAT(서열번호 21) |
| 16A_SED1_F_SpeI | ATA ACTAGTATGAAATTATCAACTGTCCTATTATCTGCCGGTTTAGCCTCGACTACTTTGGCCCAAGCAGAAAATTTAAATAATAAATCA(서열번호 22) |
| 16A_SED1_R_XhoI | ATA CTCGAGTTCTTCTGGGACCAG(서열번호 23) |
| dDNA-CS5-F | AAA AGA GAA GAA AAA AGA GAA GAA ATG AAT TCT ATT ATG ATA GCG AAT GCA ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA(서열번호 24) |
| dDNA-CS5-R | TGC TGG TTG CCT TAT TAA TTT ATA TGG AAG ACG AGA TAA TTC ATT AAT TAG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC(서열번호 25) |
| dDNA-CS5+60_F | ATG GTA CAC GCT CTT GGC AAC ATT GAA ATT ACA GCT CTC ATA TAT AAA AAA TGG AAA GAA AAA AGA GAA GAA AAA AGA GAA GAA ATG AAT(서열번호 26) |
| dDNA-CS5+60_R | GGC ATA ACA ATA GCG CAC AGA TCC GCA GGT TTC GTA ATA CGC TTA ACA ATA GGC GTC TCC TGC TGG TTG CCT TAT TAA TTT ATA TGG AAG(서열번호 27) |
| gCS5_F | CTG GTA GTT GCA CAG AAA GAG TTT TAG AGC TAG AAA TAG CAA G(서열번호 28) |
| gCS5_R | TCT TTC TGT GCA ACT ACC AGC GAT CAT TTA TCT TTC ACT GCG(서열번호 29) |
| Conf-CS5-F | AAT GAA TTC TAT TAT GAT AGC GAA TGC(서열번호 30) |
| Conf-CS5-R | CAC AGG ATT TAC GAA GAC C(서열번호 31) |
| Plasmid | Description | Reference |
| pRS42H | 2 μ origin | EUROSCARF |
| p42H_gHIS3 | pRS42H carrying HIS3 disruption gRNA cassette | This study |
| pRS426GPD | URA3, GPD promoter, CYC1 terminator, 2 μ origin, and Amp | (Mumberg et al., 1995) |
| p426_Bp_W/OSP | pRS426GPD harboring BpGH16A from B. plebeius, deletion signal peptide | This study |
| p426_Bp_CL | pRS426GPD harboring BpGH16A and chicken lysozyme signal peptide | This study |
| p426_Bp_αMF | pRS426GPD harboring BpGH16A and α-mating factor signal peptide | This study |
| p426_Bp_STA1 | pRS426GPD harboring BpGH16A and STA1 signal peptide | This study |
| p426_Bp_SED1 | pRS426GPD harboring BpGH16A and SED1 signal peptide | This study |
| Cas9-NAT | p414-TEF1p-Cas9-CYC1t-NAT1 | (Zhang et al., 2014) |
| pRS42K | 2μ origin, KanMX | (Taxis & Knop, 2006) |
| p42K_CS5 | pRS42K, gRNA cassette targeting the intergenic site on Chr XV | This study |
| 16A-D-CS5 | BpGH16A, SED1 signal peptide, donor DNA for CS5 site integration | This study |
| Strain | Description | Reference |
| S. boulardii | ATCC MYA-796 | ATCC |
| SB-TU | S. boulardii; TRP1 and URA3 disruption | (Liu et al., 2016) |
| SB-HTU | S. boulardii; HIS3, TRP1, and URA3 disruption | This study |
| SB-HTU_16A_E | SB-HTU; pRS426GPD | This study |
| SB-HTU_16A_W | SB-HTU; BpGH16A, deletion signal peptide, pRS426GPD | This study |
| SB-HTU_16A_C | SB-HTU; BpGH16A, chicken lysozyme signal peptide, pRS426GPD | This study |
| SB-HTU_16A_A | SB-HTU; BpGH16A, α-mating factor signal peptide, pRS426GPD | This study |
| SB-HTU_16A_S | SB-HTU; BpGH16A, STA1 signal peptide, pRS426GPD | This study |
| SB-HTU_16A_D | SB-HTU; BpGH16A, SED1 signal peptide, pRS426GPD | This study |
| SB_16A_D | S. boulardii; BpGH16A, SED1 signal peptide | This study |
세포 배양 조건
실시예 1에 따라 제작한 균주 사카로마이세스 보울라디에서 네오아가로올리고당을 생산하기 위해, 온도 37℃에서 2.5g/L 아가로스를 기질로 주고 72시간 동안 125-mL 플라스크에서 200rpm으로 발효를 진행하였다. 발효가 진행되는 동안 아가로스의 응고를 방지하기 위해 낮은 겔화 온도의 아가로스(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 먼저, 균주 SB-HTU_16A_C, SB-HTU_16A_A, SB-HTU_16A_S 및 SB-HTU_16A_D를 효모 합성 완전(yeast synthetic complete, YSC) 배지에서 37℃ 및 200rpm 조건에서 배양하였다. 전 배양된 세포를 10,170xg에서 10분간 원심 분리 및 멸균 증류수로 2회 세척하고, 수확된 세포를 50 mM KHP 완충액(pH 5.5)에서 20g/L 글루코오스 및 2.5g/L 아가로스를 함유하는 20mL의 YSC 배지에 접종하였다. 초기 셀 밀도는 광학 밀도 600 nm (OD600)1.0으로 맞춰 접종하였다. 대조군으로 SB-HTU_16A_E 및 SB-HTU_16A_W 균주의 발효도 동일한 조건에서 수행되었다.
세포 성장 측정 및 HPLC 분석을 통한 네오아가로올리고당의 정량 방법
UV가시분광광도계(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 OD600을 측정하면서 세포 성장을 측정하였다. 네오아가로테트라오스, 글루코오스, 아세트산 및 에탄올을 포함하는 사카로마이세스 보울라디와 아가로스의 반응 생성물을 분석하고 정량화 하기 위해 HPLC 분석을 수행하였다. 분석 시 사용한 컬럼은 Aminex HPX-87H 컬럼(Bio-Rad)이며, 굴절률 (RI) 검출기가 장착되었다. 컬럼 및 RI 검출기 온도는 각각 65℃ 및 55℃로 설정되었으며, 컬럼은 0.5 mL/min의 유속에서 0.005 M 황산을 이동상으로 사용하였다.
TLC 분석을 통한 발효 산물 확인법
발효 중 아가로스의 가수 분해 생성물을 확인하기 위해 얇은층 크로마토그래피(TLC) 분석을 수행하였다. 발효동안 각 시점(0, 12, 24, 36, 48, 72-h)에 대해 발효 산물을 포함하는 1mL의 세포 배양물을 얻었다. 정확한 측정을 위해, 얻어진 세포 배양액을 끓여 추가적인 효소 반응을 종료하였다. 온도 4℃에서 15분 동안 16,609xg에서 원심분리한 후, 각 상등액 1μL을 실리카겔 60 플레이트(Merck, Damstadt, Germany)에 로딩하였다. TLC 플레이트를 건조한 후, 에탄올 중 10%(v/v) 황산 및 에탄올 중 0.2% (w/v) 나프토레소르시놀(naphthoresorcinol) 용액을 차례로 사용해 시각화하였다(Yun E.J., et al. (2013) Appl Microbiol Biotechnol. 97, 2961-2970).
사카로마이세스 보울라디를 이용한 네오아가로테트라오스 생산 확인
조작된 효모를 이용해 네오아가로테트라오스를 생산하기 위해서는 효모에서 아가로스 분해를 가능하게 하는 베타-아가레이즈의 분비가 필요하다. 따라서, 사카로마이세스 보울라디에 의한 엔도 타임 베타-아가레이즈 BpGH16A의 발현 및 분비가 먼저 테스트되었다. 테스트를 위해, 이전에 사카로마이세스 보울라디에서 작동하는 것으로 입증된 치킨 리소자임 시그널 펩타이드(CL)를 도입한 균주 SB-HTU_16A_C를 사용하였다(Liu J-J., et al. (2016) Appl Environ Microbiol. 82, 2280-2287). SB-HTU_16A_C 발효 생성물의 HPLC 분석에서 네오아가로테트라오스에 해당하는 머무름 시간 7.6분에서 피크가 검출되었다 (도 2). 대조적으로, 공벡터를 포함하는 대조군 균주 SB-HTU_16A_E의 생성물에서는 피크가 검출되지 않았다. 따라서 이러한 결과를 통해 BpGH16A가 기능적으로 발현되고 사카로마이세스 보울라디에서 분비되며 아가로스를 가수분해하여 네오아가로테트라오스를 생산함을 확인하였다.
네오아가로테트라오스를 생산하기 위한 최적 시그널 펩타이드 선정
효소 BpGH16A가 사카로마이세스 보울라디에서 발현되고 분비되는 것이 확인되었으므로, 다음 단계는 네오아가로테트라오스 생산을 증가시키기 위한 최적의 시그널 펩타이드를 찾는 것이었다. CL, α-MF, STA1 및 SED1의 총 4가지 유형의 시그널 펩타이드를 테스트하였다. 각 시그널 펩타이드는 BpGH16A 서열 앞에 고정되었고, 네오아가로테트라오스를 가장 많이 생산하는 시그널 펩타이드를 찾기 위해 SB-HTU 균주에 도입되었다. 조작된 효모에 의한 네오아가로테트라오스의 생산은 72시간 배양 후 TLC 분석에 의해 확인되었다 (도 3a). 그 결과 네오아가로테트라오스는 CL과 SED1이 있는 균주에 의해 눈에 띄게 생성되었고, STA1이 있는 균주에 의해 약간 생성되었으며, α-MF가 있는 균주에서 약하게 검출되었다. 각각의 조작된 효모에 의해 생성된 네오아가로테트라오스의 양을 정확하게 비교하기 위해, HPLC 분석을 진행했다 (도 3b). 그 결과, 네오아가로테트라오스는 각 균주 별로 72시간 배양이 진행되면서 점진적으로 증가하는 것으로 나타났으며, SED1이 포함된 균주가 가장 많은 양의 네오아가로테트라오스를 생산하였다. 72시간 발효 후 생성된 네오아가로테트라오스의 양은 시그널 펩타이드, 즉 CL, α-MF, STA1, SED1을 각각 사용했을 때 1.73, 0.95, 0.99, 1.86 g/L이었다. 따라서 네오아가로테트라오스의 생산량이 가장 많은 사카로마이세스 세레비지애 유래 SED1이 네오아가로테트라오스 생산을 위한 최적 시그널 펩타이드로 선정되었다.
네오아가로테트라오스는 시그널 펩타이드가 부착된 모든 그룹에서 생성된 반면, 두 대조군에서는 생성되지 않았다(도 3). 특히 음성 대조군 중 하나로 사용된 SB-HTU_16A_W는 BpGH16A의 세포 외 활성이 세포 용해가 아닌 이종 발현된 시그널 펩타이드에 의한 분비에서 유래함을 확인하기 위해 제작된 균주이다. SB-HTU_16A_W의 배양액에서는 네오아가로테트라오스가 검출되지 않았기 때문에, 세포 밖으로 분비된 BpGH16A에 의해 아가로스가 네오아가로테트라오스로 분해되는 것이 확인되었다. 지금까지 사카로마이세스 보울라디에서 시그널 펩타이드 비교에 대한 보고가 없었기 때문에, 본 발명이 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii)에 의한 단백질 생산 및 분비 분야에 활용될 가능성이 있다.
개량된 균주를 이용해 네오아가로테트라오스를 생산하기 위한 발효 진행
시그널 펩타이드 선정 결과를 바탕으로 SED1 시그널 펩타이드를 포함하는 균주 SB-HTU_16A_D를 배양하였다. 2.5 g/L의 아가로스를 함유하고 유라실이 없는 YSC 배지에서 72시간 동안 발효를 수행하였다. 네오아가로테트라오스 생산은 TLC 분석에 의해 확인되었다 (도 4a). 초기에 첨가된 글루코스는 36시간 후에 고갈된 것으로 확인되었다. 각 시점의 발효 산물을 HPLC로 분석한 결과, 72시간 발효 후 1.86 g/L의 네오아가로테트라오스가 생성되었다 (도 4b). 세포 성장은 24시간부터 정지기에 접어 들어 72시간 후 OD600=6.7까지 도달하였다. 에탄올과 아세트산은 모두 4.8 g/L 축적되었다. 결론적으로, 네오아가로테트라오스는 조작된 효모 SB-HTU_16A_D에 의해 표적 주요 생성물로 생산되었다.
CRISPR-Cas9 기술을 이용한 균주 제작 및 발효 진행
CRISPR-Cas9 시스템과 같은 게놈 통합 기술을 사용하면 플라스미드를 사용할 때 복잡한 장 환경에서 발생할 수 있는 문제를 피할 수 있다. 이러한 문제에는 선택적 압력이 없을 때 플라스미드 불안정성, 다른 미생물로의 잠재적인 확산, 다중 복제 플라스미드의 유지와 관련된 대사 부담 증가 등이 있다(Durmusoglu D., et al. (2020) bioRxiv. 915389). 본 발명에서는 효소의 안정적인 발현을 위해 SED1과 함께 BpGH16A를 사카로마이세스 보울라디의 게놈에 도입하였다. BpGH16A 유전자 삽입은 CRISPR-Cas9을 기반한 상동 재조합에 의해 수행되었다(도 5a). 효모 형질 전환 후 BpGH16A 유전자가 성공적으로 삽입되었는지는 효모 콜로니 PCR에 의해 확인되었다. 프라이머 쌍 Conf-CS5-F 및 Conf-CS5-R은 유전자가 삽입되었을 때 2.4-kb, 유전자가 삽입되지 않았을 때 0.5-kb가되도록 설계 및 사용되었다(표 2). BpGH16A와 SED1의 사카로마이세스 보울라디로의 성공적인 통합은 효모 콜로니 PCR을 수행했을 때 레인 4, 7 및 8에서 2.4-kb 단일 밴드 형성으로 확인되었다 (도 5b).
마지막으로 CRISPR-Cas9를 이용하여 사카로마이세스 보울라디 게놈에 BpGH16A 및 SED1을 포함하는 SB_16A_D 균주를 구축하고, 2.5 g/L 아가로스가 포함된 YSC 배지에서 72시간 동안 플라스크 발효를 진행하였다. 네오아가로테트라오스 생산은 TLC 분석에 의해 확인되었으며(도 6a), 이는 BpGH16A가 균주 SB_16A_D에서 분비되었음을 시사한다. 보다 정확한 발효 산물 분석을 위해 HPLC 분석 및 성장 측정도 각 시점에서 수행되었다 (도 6b). 글루코오스는 배양 12시간이 되기 전에 고갈되었고, 균주는 72시간에 OD600=15.51까지 성장했다. 발효 후 0.80 g/L의 네오아가로테트라오스가 생성되었고, 3.03 g/L의 에탄올과 3.65 g/L의 아세트산이 축적되었다.
영양 요구성 마커가 있는 플라스미드 벡터 시스템을 사용할 때에 비해 CRISPR-Cas9 시스템으로 구축된 균주의 72시간 발효 후 최종 OD600은 2.3배 높았지만 네오아가로테트라오스 생산은 낮게 나타났다. 이러한 차이의 원인은 비교적 강력한 프로모터와 pRS426GPD 플라스미드의 높은 카피 수 때문인 것으로 추정된다 (Mumberg D., et al. (1995) Gene. 156, 119-122). 그럼에도 불구하고 게놈 통합으로 구축된 사카로마이세스 보울라디 성공적인 단백질 분비는 사카로마이세스 보울라디가 인간의 장에서 유용한 단백질 및 물질을 생산하는 미생물 세포 공장으로 사용될 수 있다는 가능성을 보여주었다.
<110> Korea University Research and Business Foundation
<120> Recombinant yeast Saccharomyces boulardii for producing
neoagarooligosaccharides and use thereof
<130> P21U13C0245
<160> 31
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 894
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BpGH16A coding sequence
<400> 1
gcagaaaatt taaataataa atcatacgag tgggacatct atcctgtacc agctaatgct 60
ggtgacggta tggtgtggaa acttcatcca cagtcggacg actttaatta tattgctgac 120
gaaaaggata aaggaaaaga gttctatgcc aaatggactg atttctatca taatcattgg 180
acagggcctg ctcctacaat atggcagaga gaccatgttt ccgtttcaga cggattcctt 240
aaaatcagag ccagccgtcc tgaagatgtc cctctaaaga aagttgtaag cggacctaac 300
acaaaggaac tcccgggaac ctatacagga tgtattacat cgaagactcg tgtaaaatat 360
ccggtttatg tagaagcata cgccaaactt tcaaattcaa ccatggcatc cgatgtatgg 420
atgcttagcc ctgatgatac tcaggaaatc gatattatag aggcatacgg tggtgataga 480
gacggtggag gttatggtgc cgacagactt cacttaagcc atcacatatt catccgtcag 540
ccattcaagg attatcagcc aaaggattca ggttcatggt ataaggatga caagggaaca 600
ttgtggcgcg atgattttca tcgtgttgga gtattctgga aagatccttt cacacttgaa 660
tattatgtag atggagaact cgtcagaact ataagcggta aggatattat tgatcccaac 720
aactacactg gtggcacggg gttggttaag gatatggaca tcataataaa tatggaagac 780
caaagctgga gggccgttaa aggtttaagc cctacggatg aggaactgaa aaatgtggaa 840
gatcacactt tccttgtcga ctggataagg gtttatacac tggtcccaga agaa 894
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CL signal paptide coding sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> alpha-MF signal paptide coding sequence
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ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaagct 267
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STA1 signal paptide coding sequence
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ttggtccttt cgcttctatt taactcagct ttgggttttc caactgcact agttcctaga 120
ggatcctcct ctagcaacat cacttcctcc ggtccatctt caactccatt cagctctgct 180
actgaaagct tttctactgg cactactgtc actccatcat catccaaata ccctggcagt 240
aaaacagaaa cttctgtttc ttctacaacc gaaactacca ttgttccaac tacaactacg 300
acttctgtca taacaccatc aacaaccact attaccacta cggtttgctc tacaggaaca 360
aactctgccg gtgaaactac ttctggatgc tctccaaaga ccattacaac tactgttcca 420
tgttcaacca gtccaagcga aaccgcatcg gaatcaacaa ccacttcacc taccacacct 480
gtaactacag ttgtctcaac caccgtcgtt actactgagt attctactag tacaaaacaa 540
ggtggtgaaa ttacaactac atttgtcacc aaaaacattc caaccactta cctaactaca 600
attgctccaa cttcatcagt cactacggtt accaatttca ccccaaccac tattactact 660
acggtttgct ctacaggaac aaactctgcc ggtgaaacta cctctggatg ctctccaaag 720
actgtcacaa caactgttcc ttgttcaact ggtactggcg aatacactac tgaagctacc 780
gcccctgtta caacagctgt cacaaccacc gttgttacca ctgaatcctc tacgggtact 840
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SED1 signal paptide coding sequence
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60
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dDNA-CS5-F
<400> 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dDNA-CS5-R
<400> 25
tgctggttgc cttattaatt tatatggaag acgagataat tcattaatta gtaatacgac 60
tcactatagg gc 72
<210> 26
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dDNA-CS5+60_F
<400> 26
atggtacacg ctcttggcaa cattgaaatt acagctctca tatataaaaa atggaaagaa 60
aaaagagaag aaaaaagaga agaaatgaat 90
<210> 27
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> dDNA-CS5+60_R
<400> 27
ggcataacaa tagcgcacag atccgcaggt ttcgtaatac gcttaacaat aggcgtctcc 60
tgctggttgc cttattaatt tatatggaag 90
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gCS5_F
<400> 28
ctggtagttg cacagaaaga gttttagagc tagaaatagc aag 43
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gCS5_R
<400> 29
tctttctgtg caactaccag cgatcattta tctttcactg cg 42
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Conf-CS5-F
<400> 30
aatgaattct attatgatag cgaatgc 27
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Conf-CS5-R
<400> 31
cacaggattt acgaagacc 19
Claims (11)
- 베타-아가레이즈를 코딩하는 서열번호 1로 표시되는 유전자, 및 치킨 리소자임 시그널 펩타이드 (CL)를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 유전자 또는 SED1 시그널 펩타이드(SED1)를 코딩하는 서열번호 5로 표시되는 유전자로 형질전환된 재조합 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii); 및
기질인 아가로스;를 포함하는 신바이오틱스 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 치킨 리소자임 시그널 펩타이드 (CL) 또는 SED1 시그널 펩타이드는 베타-아가레이즈 효소를 균주 밖으로 분비하는 것인 신바이오틱스 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 형질 전환은 CRISPR-Cas9 또는 재조합 벡터에 의해 이루어지는 것인 신바이오틱스 조성물.
- 제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 재조합 사카로마이세스 보울라디는 베타-아가레이즈를 분비하여 아가로스를 기질로 프리바이오틱스를 생산하는 것인 신바이오틱스 조성물.
- 제 7항에 있어서, 상기 프리바이오틱스는 네오아가로올리고당인 신바이오틱스 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 프로바이오틱스를 더 포함하는 신바이오틱스 조성물.
- 삭제
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
| KR1020210079055A KR102642881B1 (ko) | 2021-06-18 | 2021-06-18 | 네오아가로올리고당 제조를 위한 재조합 효모 사카로마이세스 보울라디 및 이의 용도 |
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| Applied and Environmental Microbiology, 2016, Vol. 82, No. 8, pp. 2280-2287.* |
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