CN111850019A - 一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法 - Google Patents

一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，包括以下步骤：S1、质粒提取得到重组质粒Aga0917‑pMD19T和CBM13‑pUC57‑DH5α；S2、PCR扩增得到Aga0917基因片段和CBM13基因片段；S3、Aga0917基因片段和CBM13基因片段的重叠PCR得到Aga0917‑CBM13；S4、Aga0917‑CBM13的末端加A；S5、末端带A的Aga0917‑CBM13与克隆载体进行连接，得到克隆载体溶液；S6、表达载体构建得到琼胶酶融合酶工程菌株。本发明提出的构建方法，具有应用价值，且得到的琼胶酶融合酶工程菌株酶活性高、耐热性能优越、适用范围广，易应用于工业化生产中。

Description

一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法。
背景技术
琼胶寡糖(AOS)具有很多特殊的生物学活性，如抗氧化、抗肿瘤、消炎、美白、保湿等功效，在预防糖尿病、诱导细胞凋亡等方面具有显著的生理活性，因此，在医药、食品、化妆品等行业极具潜在的应用价值。传统的琼胶寡糖制备方法包括物理法和化学法，其中物理法主要是利用超声、微波和辐射降解，化学法主要是利用酸、碱降解。这些方法虽然效率较高，但是均存在降解条件不易控制、产物均一性差等缺点，而且还存在着物理降解能耗高、化学降解环境污染严重等问题，成为制约琼胶寡糖高效制备的主要瓶颈。随着琼胶酶研究的兴起和蓬勃发展，酶法制备琼胶寡糖已经成为新的研究趋势，利用琼胶酶水解琼胶生产琼胶寡糖的技术被认为是当今最理想的绿色环保生产技术。
琼胶酶是琼胶酶解过程中的重要酶类，是一类能够降解琼脂糖的糖苷水解酶。琼脂糖是由(1-3)-O-β-D-吡喃半乳糖残基与(1-4)-O-3，6-内醚-α-L-吡喃半乳糖残基交替连接组成的线性链状分子。经琼胶酶作用后可产生由琼二糖的重复单位连接而成的低聚合度(2-10)的琼胶寡糖。根据琼胶酶降解琼脂糖的作用方式不同，可将琼胶酶分为两类：α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶裂解琼脂糖的α-1，3糖苷键，生成以β-D-半乳糖为非还原性末端和以3，6-内醚-α-L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖系列；β-琼胶酶裂解琼脂糖的β-1，4糖苷键，生成以β-D-半乳糖为还原性末端和以3，6-内醚-α-L-半乳糖为非还原性末端的新琼寡糖系列。与众多的糖苷水解酶一样，已报道的部分琼胶酶除了包含一个具有催化功能的结构域(CD)，还同时含有一到两个碳水化合物结合域(CBM)。CD区和CBM区之间靠柔性较强的铰链区/连接肽连接，在三维结构上相对独立。但传统的琼胶酶热稳定性较差，应用范围严重受限，因此很难应用在工业化生产中，基于此，本发明提出一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有琼胶酶的热稳定差、使用范围窄、在工业化生产中的应用较困难的问题，而提出的一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
S1、质粒提取：
将菌株Aga0917-pMD19T-Top10和CBM13-pUC57-DH5α接种到5ml的LB液体培养基中，并向LB液体培养基中加入Amp溶液，培养12～14小时，按试剂盒说明书方法提取重组质粒Aga0917-pMD19T和CBM13-pUC57-DH5α；
S2、PCR扩增：
以步骤S1得到的重组质粒Aga0917-pMD19T为模板，F0917和Rm为引物，进行PCR扩增反应得到Aga0917基因片段，PCR扩增反应体系：Prime STAR Max(2x)为25μL、F0917为2μL、Rm为2μL、重组质粒Aga0917-pMD19T为2μL、DW为19μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、62℃退火1min、72℃延伸1min、30个循环，72℃终延伸5min；
以步骤S1得到的重组质粒CBM13-pUC57-DH5α为模板，Fm和Fusion R为引物，进行PCR扩增反应得到CBM13基因片段，PCR扩增反应体系：Prime STAR Max(2x)为25μL、FusionR为2μL、Fm为2μL、重组质粒CBM13-pUC57-DH5α为2μL、DW为19μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、65℃退火1min、72℃延伸1min、30个循环，72℃终延伸5min；
S3、重叠PCR：
将步骤S2得到的两个扩增产物进行重叠PCR，反应体系为：Prime STAR Max(2x)为12.5μL、Aga0917基因片段为2μL、CBM13基因片段为2μL、DW为8.5μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、65℃退火1min、72℃延伸1min、10个循环，然后加入引物F0917和Fusion R各1μL，再按照95℃预变性5min、95℃变性1min、62℃退火1min、72℃延伸1min、25个循环得到Aga0917-CBM13；
S4、末端加A
向步骤S3得到的Aga0917-CBM13中加入Taq聚合酶进行PCR反应对Aga0917-CBM13末端加A，反应结束后，根据凝胶回收试剂盒的说明回收末端带A的目的片段Aga0917-CBM13；
S5、克隆载体构建：
将步骤S4得到的末端带A的目的片段Aga0917-CBM13与克隆载体pMD19T进行连接，得到Aga0917-CBM13-pMD19T克隆载体溶液，且连接体系：Aga0917-CBM13为4μL、pMD19T为1μL、SolutionI为5μL；
S6、表达载体构建：
A、将Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株接种在20ml含有Amp和Kan抗生素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床170rpm转速培养12～16h，将获得的菌液12000rpm离心2min，倒掉上清；用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒按照其说明书步骤提取Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株的质粒Aga0917-CBM13-pMD19T，得到Aga0917-Cbm13-pMD19T质粒溶液，将得到的Aga0917-CBM13-pMD19T质粒溶液与BamHI酶、XholI酶和10×Buffer K溶液按照体积比为21∶3∶3∶3：进行双酶切操作，得到Aga0917-CBM13基因片段；
B、将pET28a-TOP10菌株接种在20ml含有Amp和Kan抗生素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床170rpm转速培养12～16h，将获得的菌液12000rpm离心2min，倒掉上清；用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒按照其说明书步骤提取pET28a-TOP10菌株的质粒pET28a，得到pET28a质粒溶液，将得到的pET28a质粒溶液与BamHI酶、XholI酶和10×Buffer K溶液按照体积比为21∶3∶3∶3：进行双酶切操作，得到线性表达载体pET28a；
C、将步骤A得到的Aga0917-CBM13基因片段、步骤B得到的线性表达载体pET28a、以及Solution I溶液按照体积比为1∶4∶5在冰上向EP管内混合均匀，再置于16℃恒温水浴锅内过夜连接，得到连接体系；
D、从-80℃冰箱取出冻存的TOP10感受态细胞在冰上融化10min，在超净工作台内取出100μL TOP10感受态细胞并在超净工作台内向感受态细胞加入10μL步骤C得到的连接体系，在冰中放置30min，然后在42℃水浴锅内热激90s，立即至于冰中冷却2min，然后在超净工作台中向感受态细胞EP管内加入890μL 37℃ LB培养基，在37℃摇床内170rpm培养1h；再进行离心转化体系、去除上清液、悬菌液、涂布平板培养操作，培养12h后观察平板长菌情况，并将平板在灭菌超净台内用无菌竹签轻挑单菌落并转接到含有Kana的液体LB培养基内，再置于恒温摇床内37℃转速170rpm过夜培养，并在灭菌的超净工作台内取出1.5mL菌液，用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒，按照其说明书步骤操作，再用20μL DW洗脱获得质粒溶液；
E、向冰上解冻过的100μL菌株溶液中加入1μL步骤D得到的质粒溶液，42℃水浴锅内热激90s，并立即至于冰中冷却2min，然后在超净工作台中向感受态细胞EP管内加入890μL 37℃ LB培养基，在37℃摇床内170rpm培养1h，然后再进行离心转化体系、去除上清液、悬菌液、涂布平板培养操作，得到琼胶酶融合酶工程菌株。
优选的，步骤S1中，所述LB液体培养基和Amp溶液的体积比为1000∶1。
优选的，所述Amp溶液的浓度为100mg/ml。
优选的，步骤S4中，Aga0917-CBM13末端加A的PCR反应体系为：Taq聚合酶为0.25μL、DNTPs为4μL、10×PCR Buffer为5μL、Aga0917-cbm13为1μL、F0917为2μL、Fusion R为2μL、DW为35.75μL。
优选的，所述F0917的序列为5’-CGCGGATCCGCAGATTGGGACGCATATAG-3’，Fusion R的序列为5’-CCGCTCGAGTTATTGGAACTTCCATTGCTG-3’，Fm的序列为5’-GATTGGGTACGTGTTTACAAACCAGTTGATTCAGGTGCTTCAGCGCCTACG-3’，Rm的序列为5’-CGTAGGCGCTGAAGCACCTGAATCAACTGGTTTGTAAACACGTACCCAATC-3’。
优选的，步骤S5中，所述连接的具体操作为：从-80℃冰箱取出冻存的TOP10感受态细胞，冰上融化10min；在超净工作台内向感受态细胞加入10μL连接体系，冰中放置30min；然后在42℃水浴锅内热激90s，立即至于冰中冷却2min，然后在超净工作台中向感受态细胞EP管内加入890μL 37℃ LB培养基，在37℃摇床内培养1h；培养后离心机离心菌液：5000rpm离心3～5min；然后在超净工作台内吸去890μL上清，并将余液和沉淀用移液枪吸打重悬移液到有蓝白斑筛选功效的固体LB培养基，固体氨苄抗性LB培养基已经提前涂有40μL x-gal和8μL IPTG，然后用涂布棒涂抹均匀；将平板放到37℃恒温培养箱内过夜培养；用灭菌的竹签挑选蓝色斑点旁边的白色斑点然后转接到氨苄抗性液体LB培养基内，37℃摇床过夜培养得到Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株，将过夜培养的Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒按照其说明书步骤操作，最后用20μL DW洗脱获得Aga0917-CBM13-pMD19T克隆载体溶液。
优选的，步骤S6中，所述离心转化体系、去除上清液、悬菌液、涂布平板培养操作的具体内容为：将菌液以5000rpm转速离心3～5min，然后在灭菌过的超净工作台内用移液枪吸去890μL上清，并将余液和沉淀用移液枪吸打重悬，并将重悬菌液吸取至Kana抗性的固体LB培养基上，用无菌的涂布棒不断涂抹菌液直至菌液完全涂抹均匀，培养基表面无液体菌液，然后将平板标号放置37℃恒温恒湿培养箱内过夜培养。
优选的，步骤E中，所述菌株溶液为BL21(DE3)菌株溶液或BL21(DE3)plysS菌株溶液。
与现有技术相比本发明提出的构建方法优点在于：
1、本发明提出的构建方法，利用融合酶技术，将Aga0917与中温琼胶酶的CBM进行融合，获得一种新型的具有耐高温特性的琼胶酶，为琼胶寡糖的工业化生产提供新的有效工具，对琼胶的高值化利用具有重大的意义，有效解决了现有琼胶酶的热稳定差、使用范围窄、在工业化生产中的应用较困难的问题。
2、通过本发明提出的构建方法可以成功构建基因工程菌株Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)菌株和Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)plysS，并且得到的工程菌株相比于原酶温度稳定性显著提高，耐热稳定性好，适用范围更广，更易应用于工业化生产中，且在相同条件下本发明得到的基因工程菌株的酶活性更高。
附图说明
图1为Aga0917基因片段、CBM13基因片段以及对照组(DL2000 DNA Marker)电泳检测图；
图2为Aga0917-CBM13以及对照组(DL2000 DNA Marker)电泳检测图；
图3为50℃时相对酶活力与时间的关系曲线图；
图4为酶孵育时间为45min时相对酶活力与温度的关系曲线图。
图1中，1为DL2000 DNA Marker电泳检测结果，2～4为Aga0917基因片段电泳检测结果，5～7为CBM13基因片段电泳检测结果；
图2中，1为DL2000 DNA Marker电泳检测结果，2～4为Aga0917-CBM13电泳检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
本发明提出的一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
S1、质粒提取：
将菌株Aga0917-pMD19T-Top10和CBM13-pUC57-DH5α接种到5ml的LB液体培养基中，并向LB液体培养基中加入Amp溶液，培养12～14小时，按试剂盒说明书方法提取重组质粒Aga0917-pMD19T和CBM13-pUC57-DH5α；所述LB液体培养基和Amp溶液的体积比为1000∶1，且Amp溶液的浓度为100mg/ml；
S2、PCR扩增：
以步骤S1得到的重组质粒Aga0917-pMD19T为模板，F0917和Rm为引物，进行PCR扩增反应得到Aga0917基因片段，PCR扩增反应体系：Prime STAR Max(2x)为25μL、F0917为2μL、Rm为2μL、重组质粒Aga0917-pMD19T为2μL、DW为19μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、62℃退火1min、72℃延伸1min、30个循环，72℃终延伸5min；
以步骤S1得到的重组质粒CBM13-pUC57-DH5α为模板，Fm和Fusion R为引物，进行PCR扩增反应得到CBM13基因片段，PCR扩增反应体系：Prime STAR Max(2x)为25μL、FusionR为2μL、Fm为2μL、重组质粒CBM13-pUC57-DH5α为2μL、DW为19μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、65℃退火1min、72℃延伸1min、30个循环，72℃终延伸5min；
S3、重叠PCR：
将步骤S2得到的两个扩增产物进行重叠PCR，反应体系为：Prime STAR Max(2x)为12.5μL、Aga0917基因片段为2μL、CBM13基因片段为2μL、DW为8.5μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、65℃退火1min、72℃延伸1min、10个循环，然后加入引物F0917和Fusion R各1μL，再按照95℃预变性5min、95℃变性1min、62℃退火1min、72℃延伸1min、25个循环得到Aga0917-CBM13；
S4、末端加A
向步骤S3得到的Aga0917-CBM13中加入Taq聚合酶进行PCR反应对Aga0917-CBM13末端加A，反应结束后，根据凝胶回收试剂盒的说明回收末端带A的目的片段Aga0917-CBM13；Aga0917-CBM13末端加A的PCR反应体系为：Taq聚合酶为0.25μL、DNTPs为4μL、10×PCR Buffer为5μL、Aga0917-cbm13为1μL、F0917为2μL、Fusion R为2μL、DW为35.75μL；
S5、克隆载体构建：
将步骤S4得到的末端带A的目的片段Aga0917-CBM13与克隆载体pMD19T进行连接，得到Aga0917-CBM13-pMD19T克隆载体溶液，且连接体系：Aga0917-CBM13为4μL、pMD19T为1μL、SolutionI为5μL；连接的具体操作为：从-80℃冰箱取出冻存的TOP10感受态细胞，冰上融化10min；在超净工作台内向感受态细胞加入10μL连接体系，冰中放置30min；然后在42℃水浴锅内热激90s，立即至于冰中冷却2min，然后在超净工作台中向感受态细胞EP管内加入890μL 37℃ LB培养基，在37℃摇床内培养1h；培养后离心机离心菌液：5000rpm离心3～5min；然后在超净工作台内吸去890μL上清，并将余液和沉淀用移液枪吸打重悬移液到有蓝白斑筛选功效的固体LB培养基，固体氨苄抗性LB培养基已经提前涂有40μL x-gal和8μLIPTG，然后用涂布棒涂抹均匀；将平板放到37℃恒温培养箱内过夜培养；用灭菌的竹签挑选蓝色斑点旁边的白色斑点然后转接到氨苄抗性液体LB培养基内，37℃摇床过夜培养得到Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株，将过夜培养的Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒按照其说明书步骤操作，最后用20μL DW洗脱获得Aga0917-CBM13-pMD19T克隆载体溶液；
S6、表达载体构建：
A、将Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株接种在20ml含有Amp和Kan抗生素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床170rpm转速培养12～16h，将获得的菌液12000rpm离心2min，倒掉上清；用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒按照其说明书步骤提取Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株的质粒Aga0917-CBM13-pMD19T，得到Aga0917-Cbm13-pMD19T质粒溶液，将得到的Aga0917-CBM13-pMD19T质粒溶液与BamHI酶、XholI酶和10×Buffer K溶液按照体积比为21∶3∶3∶3：进行双酶切操作，得到Aga0917-CBM13基因片段；
B、将pET28a-TOP10菌株接种在20ml含有Amp和Kan抗生素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床170rpm转速培养12～16h，将获得的菌液12000rpm离心2min，倒掉上清；用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒按照其说明书步骤提取pET28a-TOP10菌株的质粒pET28a，得到pET28a质粒溶液，将得到的pET28a质粒溶液与BamHI酶、XholI酶和10×Buffer K溶液按照体积比为21∶3∶3∶3：进行双酶切操作，得到线性表达载体pET28a；
C、将步骤A得到的Aga0917-CBM13基因片段、步骤B得到的线性表达载体pET28a、以及Solution I溶液按照体积比为1∶4∶5在冰上向EP管内混合均匀，再置于16℃恒温水浴锅内过夜连接，得到连接体系；
D、从-80℃冰箱取出冻存的TOP10感受态细胞在冰上融化10min，在超净工作台内取出100μL TOP10感受态细胞并在超净工作台内向感受态细胞加入10μL步骤C得到的连接体系，在冰中放置30min，然后在42℃水浴锅内热激90s，立即至于冰中冷却2min，然后在超净工作台中向感受态细胞EP管内加入890μL 37℃ LB培养基，在37℃摇床内170rpm培养1h；再进行离心转化体系、去除上清液、悬菌液、涂布平板培养操作，培养12h后观察平板长菌情况，并将平板在灭菌超净台内用无菌竹签轻挑单菌落并转接到含有Kana的液体LB培养基内，再置于恒温摇床内37℃转速170rpm过夜培养，并在灭菌的超净工作台内取出1.5mL菌液，用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒，按照其说明书步骤操作，再用20μL DW洗脱获得质粒溶液；
E、向冰上解冻过的100μLBL21(DE3)菌株溶液中加入1μL步骤D得到的质粒溶液，42℃水浴锅内热激90s，并立即至于冰中冷却2min，然后在超净工作台中向感受态细胞EP管内加入890μL 37℃ LB培养基，在37℃摇床内170rpm培养1h，然后再进行离心转化体系、去除上清液、悬菌液、涂布平板培养操作，得到Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)菌株。
实施例2
将实施例1步骤E中的BL21(DE3)菌株溶液等体积替换成BL21(DE3)plysS菌株溶液，其他构建条件同实施例1，得到Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)plysS菌株。
本发明中，F0917的序列为5’-CGCGGATCCGCAGATTGGGACGCATATAG-3’，Fusion R的序列为5’-CCGCTCGAGTTATTGGAACTTCCATTGCTG-3’，Fm的序列为5’-GATTGGGTACGTGTTTACAAACCAGTTGATTCAGGTGCTTCAGCGCCTACG-3’，Rm的序列为5’-CGTAGGCGCTGAAGCACCTGAATCAACTGGTTTGTAAACACGTACCCAATC-3’。
本发明中，所述离心转化体系、去除上清液、悬菌液、涂布平板培养操作的具体内容为：将菌液以5000rpm转速离心3～5min，然后在灭菌过的超净工作台内用移液枪吸去890μL上清，并将余液和沉淀用移液枪吸打重悬，并将重悬菌液吸取至Kana抗性的固体LB培养基上，用无菌的涂布棒不断涂抹菌液直至菌液完全涂抹均匀，培养基表面无液体菌液，然后将平板标号放置37℃恒温恒湿培养箱内过夜培养。参照图1，对实施例1步骤S2得到的Aga0917基因片段和CBM13基因片段以及对照组(DL2000 DNA Marker)进行电泳检测，结果显示Aga0917基因片段扩增出的条带大小约为890bp与琼胶酶基因Aga0917实际大小相符，CBM13基因片段扩增出的条带大小约为450bp与基因PV-CBM13实际大小相符。
参照图2，对实施例1步骤S3得到的重叠PCR产物Aga0917-CBM13以及对照组(DL2000 DNA Marker)进行电泳检测，结果显示重叠PCR产物Aga0917-CBM13大小约为1340bp与基因Aga0917-CBM13实际大小相符。
对实施例1步骤S5得到的Aga0917-CBM13-pMD19T克隆载体溶液进行DNA序列，结果显示实施例1得到的Aga0917-CBM13-pMD19T克隆载体溶液的DNA序列正确。
将实施例1得到的Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)菌株和实施例2得到的Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)plysS菌株分别进行诱导表达，具体操作如下：分别在灭菌后的超净工作台内按照1∶100比例转接实施例1得到的Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)菌株和实施例2得到的Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)plysS菌株，置于37℃摇床，150rpm培养2.5h后，加入终浓度0.1mM的IPTG，16℃诱导培养12h，使得菌株充分表达产物蛋白，得到Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)菌液和Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)plysS菌液。
SDS-PAGE样品制备，1)全胞样品制备：分别取1mL上述菌液用离心机4000rpm转速下离心10min，弃掉上清然后用160μL PBS溶液重悬菌体沉淀，然后取40μL PBS重悬液加入10μL SDS-5×loading buffer溶液混合均匀，然后将混合液煮沸10min，获得全细胞上样品；2)制备破碎细胞上清液上样品：分别取29mL上述菌液用离心机4000rpm转速下离心10min，然后分别用5mL PBS溶液重悬，重悬后为了增加破碎效果在-80℃冰箱冻存30min，然后将菌体化冻后细胞破碎，细胞破碎仪使用200w，每工作5s间歇5s防止蛋白过热变性，持续破碎7min，破碎过程全程在冰上操作防止过热，然后取破碎的细胞液，在低温离心机内使用12000rpm在4℃下离心30min得到固液分离的菌体破碎的溶液，然后取40μL上清液，加入10μL SDS-5×loading buffer溶液混合均匀，然后将混合液煮沸10min，获得细胞破碎上清上样品；3)制备破碎细胞沉淀上样品：保存剩余的破碎细胞上清液，并用5mL PBS溶液重悬沉淀，然后取40μL PBS重悬液加入10μL SDS-5×loading buffer溶液混合均匀，然后将混合液煮沸10min，获得破碎细胞沉淀上样品。
蛋白胶上样跑胶检测，两种菌株的三类上样品分别取20μL点样至浓缩胶胶孔内，然后开始用80V电压跑胶，观察到样品跑到分离胶的时候更换电压为120V，再用SDS-PAGE染色液染色2h，然后放于SDS-PAGE脱色液中过夜脱色，再置于凝胶成像仪中观察，结果显示两菌株均检测到阳性克隆子，表明Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)菌种和Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)plysS菌种构建成功。
参照图3，在50℃，分别检测Aga0917-pET28a-BL21(DE3)和Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)的相对酶活力与时间的关系，结果显示Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)的温度稳定性相比于原酶(Aga0917-pET28a-BL21(DE3))显著提高。
参照图4，在酶孵育时间为45min时，分别检测Aga0917-pET28a-BL21(DE3)和Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)的相对酶活力与温度的关系，结果显示Aga0917-CBM13-pET28a-BL21(DE3)在45℃和50℃时酶活性明显高于原酶
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、质粒提取：
将菌株Aga0917-pMD19T-Top10和CBM13-pUC57-DH5α接种到5ml的LB液体培养基中，并向LB液体培养基中加入Amp溶液，培养12～14小时，按试剂盒说明书方法提取重组质粒Aga0917-pMD19T和CBM13-pUC57-DH5α；
S2、PCR扩增：
以步骤S1得到的重组质粒Aga0917-pMD19T为模板，F0917和Rm为引物，进行PCR扩增反应得到Aga0917基因片段，PCR扩增反应体系：Prime STAR Max(2x)为25μL、F0917为2μL、Rm为2μL、重组质粒Aga0917-pMD19T为2μL、DW为19μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、62℃退火1min、72℃延伸1min、30个循环，72℃终延伸5min；
以步骤S1得到的重组质粒CBM13-pUC57为模板，Fm和Fusion R为引物，进行PCR扩增反应得到CBM13基因片段，PCR扩增反应体系：Prime STAR Max(2x)为25μL、Fusion R为2μL、Fm为2μL、重组质粒CBM13-pUC57-DH5α为2μL、DW为19μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、65℃退火1min、72℃延伸1min、30个循环，72℃终延伸5min；
S3、重叠PCR：
将步骤S2得到的两个扩增产物进行重叠PCR，反应体系为：Prime STAR Max(2x)为12.5μL、Aga0917基因片段为2μL、CBM13基因片段为2μL、DW为8.5μL，PCR扩增反应条件：95℃预变性5min、95℃变性1min、65℃退火1min、72℃延伸1min、10个循环，然后加入引物F0917和Fusion R各1μL，再按照95℃预变性5min、95℃变性1min、62℃退火1min、72℃延伸1min、25个循环得到Aga0917-CBM13；
S4、末端加A
向步骤S3得到的Aga0917-CBM13中加入Taq聚合酶进行PCR反应对Aga0917-CBM13末端加A，反应结束后，根据凝胶回收试剂盒的说明回收末端带A的目的片段Aga0917-CBM13；
S5、克隆载体构建：
将步骤S4得到的末端带A的目的片段Aga0917-CBM13与克隆载体pMD19T进行连接，得到Aga0917-CBM13-pMD19T克隆载体溶液，且连接体系：Aga0917-CBM13为4μL、pMD19T为1μL、SolutionI为5μL；
S6、表达载体构建：
A、将Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株接种在20ml含有Amp和Kan抗生素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床170rpm转速培养12～16h，将获得的菌液12000rpm离心2min，倒掉上清；用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒按照其说明书步骤提取Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株的质粒Aga0917-CBM13-pMD19T，得到Aga0917-Cbm13-pMD19T质粒溶液，将得到的Aga0917-CBM13-pMD19T质粒溶液与BamHI酶、XholI酶和10×Buffer K溶液按照体积比为21∶3∶3∶3：进行双酶切操作，得到Aga0917-CBM13基因片段；
B、将pET28a-TOP10菌株接种在20ml含有Amp和Kan抗生素的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床170rpm转速培养12～16h，将获得的菌液12000rpm离心2min，倒掉上清；用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒按照其说明书步骤提取pET28a-TOP10菌株的质粒pET28a，得到pET28a质粒溶液，将得到的pET28a质粒溶液与BamHI酶、Xhol I酶和10×Buffer K溶液按照体积比为21∶3∶3∶3：进行双酶切操作，得到线性表达载体pET28a；
C、将步骤A得到的Aga0917-CBM13基因片段、步骤B得到的线性表达载体pET28a、以及SolutionI溶液按照体积比为1∶4∶5在冰上向EP管内混合均匀，再置于16℃恒温水浴锅内过夜连接，得到连接体系；
D、从-80℃冰箱取出冻存的TOP10感受态细胞在冰上融化10min，在超净工作台内取出100μL TOP10感受态细胞并在超净工作台内向感受态细胞加入10μL步骤C得到的连接体系，在冰中放置30min，然后在42℃水浴锅内热激90s，立即至于冰中冷却2min，然后在超净工作台中向感受态细胞EP管内加入890μL 37℃ LB培养基，在37℃摇床内170rpm培养1h；再进行离心转化体系、去除上清液、悬菌液、涂布平板培养操作，培养12h后观察平板长菌情况，并将平板在灭菌超净台内用无菌竹签轻挑单菌落并转接到含有Kana的液体LB培养基内，再置于恒温摇床内37℃转速170rpm过夜培养，并在灭菌的超净工作台内取出1.5mL菌液，用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒，按照其说明书步骤操作，再用20μL DW洗脱获得质粒溶液；
E、向冰上解冻过的100μL菌株溶液中加入1μL步骤D得到的质粒溶液，42℃水浴锅内热激90s，并立即至于冰中冷却2min，然后在超净工作台中向感受态细胞EP管内加入890μL 37℃ LB培养基，在37℃摇床内170rpm培养1h，然后再进行离心转化体系、去除上清液、悬菌液、涂布平板培养操作，得到琼胶酶融合酶工程菌株。
2.根据权利要求1所述的一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述LB液体培养基和Amp溶液的体积比为1000∶1。
3.根据权利要求1或2所述的一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，其特征在于，所述Amp溶液的浓度为100mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤S4中，Aga0917-CBM13末端加A的PCR反应体系为：Taq聚合酶为0.25μL、DNTPs为4μL、10×PCRBuffer为5μL、Aga0917-cbm13为1μL、F0917为2μL、Fusion R为2μL、DW为35.75μL。
5.根据权利要求1或4所述的一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，其特征在于，所述F0917的序列为5’-CGCGGATCCGCAGATTGGGACGCATATAG-3’，Fusion R的序列为5’-CCGCTCGAGTTATTGGAACTTCCATTGCTG-3’，Fm的序列为5’-GATTGGGTACGTGTTTACAAACCAGTTGATTCAGGTGCTTCAGCGCCTACG-3’，Rm的序列为5’-CGTAGGCGCTGAAGCACCTGAATCAACTGGTTTGTAAACACGTACCCAATC-3’。
6.根据权利要求1所述的一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤S5中，所述连接的具体操作为：从-80℃冰箱取出冻存的TOP10感受态细胞，冰上融化10min；在超净工作台内向感受态细胞加入10μL连接体系，冰中放置30min；然后在42℃水浴锅内热激90s，立即至于冰中冷却2min，然后在超净工作台中向感受态细胞EP管内加入890μL 37℃LB培养基，在37℃摇床内培养1h；培养后离心机离心菌液：5000rpm离心3～5min；然后在超净工作台内吸去890μL上清，并将余液和沉淀用移液枪吸打重悬移液到有蓝白斑筛选功效的固体LB培养基，固体氨苄抗性LB培养基已经提前涂有40μL x-gal和8μL IPTG，然后用涂布棒涂抹均匀；将平板放到37℃恒温培养箱内过夜培养；用灭菌的竹签挑选蓝色斑点旁边的白色斑点然后转接到氨苄抗性液体LB培养基内，37℃摇床过夜培养得到Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株，将过夜培养的Aga0917-CBM13-pMD19T-TOP10菌株用TaKaRa质粒DNA小量纯化试剂盒按照其说明书步骤操作，最后用20μL DW洗脱获得Aga0917-CBM13-pMD19T克隆载体溶液。
7.根据权利要求1所述的一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤S6中，所述离心转化体系、去除上清液、悬菌液、涂布平板培养操作的具体内容为：将菌液以5000rpm转速离心3～5min，然后在灭菌过的超净工作台内用移液枪吸去890μL上清，并将余液和沉淀用移液枪吸打重悬，并将重悬菌液吸取至Kana抗性的固体LB培养基上，用无菌的涂布棒不断涂抹菌液直至菌液完全涂抹均匀，培养基表面无液体菌液，然后将平板标号放置37℃恒温恒湿培养箱内过夜培养。
8.根据权利要求1所述的一种琼胶酶融合酶工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤E中，所述菌株溶液为BL21(DE3)菌株溶液或BL21(DE3)plysS菌株溶液。
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