CN110004127A

CN110004127A - 木聚糖酶基因、重组质粒、重组菌株、木聚糖酶及其应用

Info

Publication number: CN110004127A
Application number: CN201910307665.XA
Authority: CN
Inventors: 韩正刚; 杨江科; 上官芳
Original assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Wuhan Polytechnic University
Current assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Wuhan Polytechnic University
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2019-07-12

Abstract

本发明公开一种木聚糖酶基因、重组质粒、重组菌株、木聚糖酶及其应用，涉及基因工程技术领域。所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述木聚糖酶基因mbXynSPP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒携带所述木聚糖酶基因mbXynSPP2；所述重组菌株包含所述木聚糖酶基因mbXynSPP2。本发明提供的木聚糖酶水解木聚糖的产物几乎不含有木糖单糖(水解产物为3～4个残基的木聚寡糖)，缩短了木聚寡糖制备中的纯化分离步骤，极大地提高了木聚寡糖的产率和制备效率，因此，可以将该木聚糖酶应用到益生素木聚寡糖的制备，同时本发明提供的木聚糖酶在低温下具有高活性，且耐盐性良好，可适用于高盐环境，拓展了其应用范围。

Description

木聚糖酶基因、重组质粒、重组菌株、木聚糖酶及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种木聚糖酶基因、重组质粒、重组菌株、木聚糖酶及其应用。

背景技术

半纤维素是自然界中第二大丰富的碳水化合物。其主要存在于植物细胞壁中。半纤维素多种存在形式，主要有木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡萄糖甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖等。其中木聚糖是半纤维素中的主要存在形式。在植物中占干重的15％～30％；在裸子植物中木聚糖含量占7％一12％；被子植物如硬木的木聚糖中有70％～80％。木聚糖的降解需众多酶的协同作用(内切木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、木二糖酶等)。这些酶中，内切型木聚糖酶时最为重要的一种(因此内切型木聚糖酶通常被称为木聚糖酶)。内切型木聚糖酶随机切割木聚糖主链上的beta-1,4糖苷键，将木聚糖水解为木聚寡糖。木聚糖酶在半纤维多聚糖资源的利用及工业应用方面有巨大潜力。目前，木聚糖酶在食品、饲料、纺织、造纸，医药、能源等行业中广泛使用。其中，木聚寡糖的制备具有重要的医药用途。

由于蛋白质序列的差异，来自不同微生物的木聚糖酶往往具有不同的酶学性质，例如，不同的反应温度和pH，不一样的温度、酸碱度以及盐度的耐受性，以及不同的产物类型(产物为不同长度的木聚寡糖)等。大部分木聚糖酶可以水解的最短底物为木三糖，因此木聚糖的水解产物往往以木二糖和木糖为主。由于含有较大比例的单糖，因此寻找能够将木聚糖水解为较大长度木聚寡糖的木聚糖酶具有重要的意义。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种木聚糖酶基因、重组质粒、重组菌株、木聚糖酶及其应用，旨在提供一种中温、耐高盐的木聚糖酶，该木聚糖酶可有效地将木聚寡糖及山毛榉木聚糖水解为3～4个残基的木聚寡糖。

为实现上述目的，本发明提出一种木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

本发明还提出一种木聚糖酶基因mbXynSPP2，用于编码上述木聚糖酶，所述木聚糖酶基因mbXynSPP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提出了一种重组质粒，携带权利要求2所述的木聚糖酶基因mbXynSPP2。

优选地，所述重组质粒包含表达载体pET-28a。

本发明还提出了一种重组菌株，包含上述的木聚糖酶基因mbXynSPP2。

优选地，所述重组菌株由包含上述的木聚糖酶基因mbXynSPP2的重组质粒转化大肠杆菌BL21(Rosetta)获得。

此外，本发明还提出了上述的木聚糖酶在益生素木聚寡糖的制备中的应用。

此外，本发明还提出了上述的木聚糖酶在高盐食品加工中的应用。

本发明技术方案中，提供了木聚糖酶基因mbXynSPP2、携带该基因的重组质粒以及重组菌株，该木聚糖酶基因mbXynSPP2可以编码出一种木聚糖酶，该木聚糖酶水解木聚糖的产物几乎不含有木糖单糖(水解产物为3～4个残基的木聚寡糖)，缩短了木聚寡糖制备中的纯化分离步骤，极大地提高了木聚寡糖的产率和制备效率，因此，可以将该木聚糖酶应用到益生素木聚寡糖的制备，同时本发明提出的木聚寡糖在低温下具有高活性，且耐盐性良好，可适用于高盐环境，拓展了其应用范围。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的木聚糖酶的SDS-PAGE测试结果图；

图2为本发明提供的木聚糖酶在不同pH值下的酶活测定结果图；

图3本发明提供的木聚糖酶mbXynSPP2在不同pH值下的稳定性测试结果图；

图4为本发明提供的木聚糖酶在不同温度下的酶活测定结果图；

图5为本发明提供的木聚糖酶在不同温度下的稳定性测试结果图；

图6为本发明提供的木聚糖酶在不同金属离子环境中的酶活测定结果图；

图7为本发明提供的木聚糖酶在不同NaCl浓度下的稳定性测试结果图；

图8为本发明提供的木聚糖酶水解山毛榉木聚糖的薄层层析测试结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

鉴于此，本发明提出了一种木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

该木聚糖酶含有318个氨基酸残基，理论分子量为36157.45道尔顿，等电点为4.87，其序列如SEQ ID NO：2所示。本发明所提供的木聚糖酶mbXynSPP2与现有报道中的同糖苷水解酶家族(GH10)的催化结构域的氨基酸序列(NCBI登录号为：AAD35164.1(Thermotoga maritime MSB8)、ABQ46873.1(Thermotoga_petrophila RKU-1)、ABX71815.1(Streptomyces sp.S9)、AAV98623.1(Bacillus_halodurans)、AAB70918.1(Bacillussp.NG-27)、ACM59337.1(Caldicellulosiruptor bescii DSM)、ADQ03732.1(Caldicellulosiruptor owensensis)、AEA30147.1(Cellulomonas fimi ATCC484)、ADG73293.1(Cellulomonas flavigena DSM)、ACE84815.1(Cellvibrio_japonicusUeda107)、ACE85439.1(Cellvibrio japonicasUeda107)、AAD09439.3(Cellvibriomixtus)、BAA02069.1(Clostridium stercorarium)、ABI49951.1(Geobacillusstearothermophilus)、CAA07174.1(Paenibacillus barcinonensis)、AAC45554.1(Streptomyces halstedii)、AAC26525.1(Streptomyces lividans 1326)、AAM39089.1(Xanthomonas citri))的一致性较低，约为16～35％，也就是说，这是一种全新的木聚糖酶。

发明人发现，该木聚糖酶为内切型：可以将山毛榉木聚糖水解为3～4个残基的木聚寡糖，而不是水解成为单糖(即木糖)；最适反应温度为50℃；最适反应pH为6.0～7.0；稳定性方面，在40℃温度下孵育2h后保持约90％的酶活，在pH为5～10条件下孵育2h对酶具有一定程度的激活作用(表现为125％～230％的酶活)，即，在中温下具有高活性，且对pH耐受范围广泛。此外，其生化特征还表现为：一些常见的金属离子在5mM的浓度下对木聚糖酶mbXynSPP2明显的抑制效果；EDTA(乙二胺四乙酸)对mbXynSPP2具有轻微的的激活作用(105％)；高浓度的NaCl(0.5M～2.5M)对木聚糖酶mbXynSPP2的活性具有极大促进效应，具体地，在NaCl浓度为0.5M的条件下，木聚糖酶mbXynSPP2表现出的活性是没有NaCl条件下酶活的近2.75倍；在NaCl浓度为2.5M的条件下，木聚糖酶mbXynSPP2表现出几近210％的酶活。即，耐碱性和耐盐性良好。

为此，本发明提出一种木聚糖酶基因mbXynSPP2，用于编码上述木聚糖酶，所述木聚糖酶基因mbXynSPP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

发明人发现，来源于海洋微生物(Marinifilaceae bacterium)的木聚糖酶编码基因序列可预测编码的木聚糖酶耐低温、耐高盐，基于这种原因，在经过对其表达的蛋白质结构多次分析后，对基因序列进行设计，具体表现为，去除该基因5’端编码132个氨基酸的核苷酸，只保留编码GH10家族催化结构域的3’端核苷酸序列，同时，为了适应大肠杆菌密码子偏爱性以实现琼脂糖酶的大量表达，发明人将该编码基因序列密码子优化，最终获得核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的木聚糖酶基因mbXynSPP2。对该基因重组表达可以获得如上所述的木聚糖酶，该木聚糖酶具有生物学活性，且经功能鉴定后，证实其具有在低温下高活性，且耐盐性良好，可有效地将木聚寡糖及山毛榉木聚糖水解为3～4个残基的木聚寡糖的优势。

具体地，本发明提供的木聚糖酶基因mbXynSPP2在GenBank基因数据库中通过对比搜索(BLASTp，为美国国立生物信息研究中心开发的免费序列相似性搜索程序，网址为：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)找到一种来源于海洋微生物(Marinifilaceae bacterium)的木聚糖酶编码基因。该基因全长1353个碱基。通过同源结构模拟(https://swissmodel.expasy.org/)显示该基因3’端957个碱基编码10家族木聚糖酶的催化结构域，因此，只选择然该基因3’端957个碱基构建重组质粒。通过人工合成得到该基因3’端957个核苷酸并进行密码子优化(苏州金维智公司)，优化后得到的基因序列为SEQ ID NO：1。

合成的木聚糖酶基因mbXynSPP2位于pU57载体上，合成基因的5’端和3’端带有限制性酶切位点BamH 1和Xho 1。该两个限制性酶切位点将用于把木聚糖酶基因mbXynSPP2克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a。

同时，本发明公开了一种重组质粒，该重组质粒携带了上述木聚糖酶基因mbXynSPP2。应当理解，插入了上述木聚糖酶基因mbXynSPP2的重组载体即属于本发明的保护范围内。

进一步地，在经过对表达细胞和本发明提出的木聚糖酶的氨基酸结构的多次考量后，优选为以大肠杆菌表达载体pET-28a作为重组质粒的载体，并利用上述合成基因的5’端和3’端带有的限制性酶切位点BamH 1和Xho 1把木聚糖酶基因mbXynSPP2克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a，得到上述重组质粒。其原因在于：大肠杆菌表达载体pET-28a本身具有如上所述的酶切位点，便于重组操作，且其本身具有卡那霉素抗性基因，可以用于载体筛选。需要说明的是，上述重组质粒的其具体的制备方法可以通过以下步骤实现：

通过人工合成获得木聚糖酶基因mbXynSPP2，所合成的木聚糖酶基因

mbXynSPP2位于pU57载体上，通过酶切位点BamH 1和Xho 1将木聚糖酶基因mbXynSPP2从pU57载体上切下来，酶切获得的DNA片段再连接至经同样酶切(BamH 1和Xho 1酶切)的大肠杆菌表达载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，试剂盒提取质粒，用BamH 1和Xho 1双酶切质粒进行鉴定，酶切正确的即为重组质粒pET-28a-mbXynSPP2。

此外，本发明还提出了一种重组菌株，包含上述的木聚糖酶基因mbXynSPP2。

该重组菌株可以由包含上述的木聚糖酶基因mbXynSPP2的重组质粒转化大肠杆菌BL21(Rosetta)获得。即，该重组菌株还可以包含上述重组质粒。将上述重组质粒导入表达细胞中即可获得重组菌株，目的基因即可随着宿主细胞的繁殖而复制。通常来说，所述表达细胞可以是大肠杆菌，也可以是酵母等细胞，或者是其他类型的细胞例如动物细胞等，在本实施例中，表达细胞优选为大肠杆菌BL21(Rosetta)。

基于此，上述重组菌株可以通过下述步骤制得：

步骤S1、将木聚糖酶基因mbXynSPP2通过酶切位点BamH 1和Xho 1连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，通过BamH 1和Xho 1双酶切进行鉴定，酶切正确的即为重组质粒pET-28a-mbXynSPP2；

步骤S2、将重组质粒pET-28a-mbXynSPP2采用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21(Rosetta)，得到含有重组质粒pET-28a-mbXynSPP2的重组大肠杆菌BL21(Rosetta)，即为重组菌株。

而基于上述重组菌株的制备方法，可以得出培养上述重组菌体以形成上述木聚糖酶的制备方法，该制备方法具体操作时可以通过以下步骤实现：

S10、将木聚糖酶基因mbXynSPP2通过酶切位点BamH 1和Xho 1连接到载体pET-28a上，连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，用试剂盒提取质粒，通过BamH 1和Xho 1双酶切进行鉴定，酶切正确的即为重组质粒pET-28a-mbXynSPP2；

S20、将重组质粒pET-28a-mbXynSPP2采用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21(Rosetta)，得到含有重组质粒pET-28a-mbXynSPP2的大肠杆菌BL21(Rosetta)(即为重组表达菌株)；

S30、将含有重组质粒pET-28a-mbXynSPP2的大肠杆菌BL21(Rosetta)按1:90～110的比例(优选为1:100)接种至ZYP-5052培养基中，于37℃、180～220rpm(优选为200rpm)条件下培养至OD₆₀₀为0.95～1.05，然后将温度降低至18～22℃(优选为20℃)，继续培养20～26h(优选为24h)后，离心收集菌体，将菌体悬浮于HisTrap A缓冲液，然后通过压力破碎后离心取上清液(上清液中即包含由重组菌株发酵形成的重组蛋白)；

S40、在8～10℃的温度环境下，将上清液通过HisTrap亲和层析柱后，使用HisTrapB缓冲液在AKTA蛋白纯化仪上梯度洗脱层析柱上的重组蛋白，然后使用截留分子量为10kDa的Millipore浓缩管将重组蛋白换液至磷酸盐缓冲液中浓缩至蛋白浓度为1mg/mL，得到纯化的木聚糖酶。

其中，所述HisTrap A缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap A缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、20mM的咪唑和20mM的Na₂HPO₄；所述HisTrap B缓冲液的pH值为7.4，所述HisTrap B缓冲液包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、500mM的咪唑和20mM的Na₂HPO₄。

ZYP-5052培养基的具体配方如下：1％蛋白胨，5％酵母提取物，50mM Na₂HPO₄，50mMKH₂PO₄，25mM(NH₄)₂SO₄，0.5％丙三醇，0.05％葡萄糖，0.2％乳糖，2mM MgSO₄，卡那霉素100μg/ml，氯霉素34μg/ml。

所述磷酸盐缓冲液含有以下摩尔浓度的组分：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄。

需要说明的是，上述涉及到基因合成、重组质粒及重组菌株制备、以及重组菌株发酵培养获得重组蛋白等实施方式中，未说明具体实验方式、实验原材料者，均按照基因工程及基于基因工程进行微生物发酵培养制备蛋白质的常规方法进行。

此外，基于上述木聚糖酶的内切型、中温、耐碱以及耐盐性的特征，本发明还提出如上所述的木聚糖酶在益生素木聚寡糖制备或高盐食品加工中的应用。

由于本发明提出的木聚糖酶为内切型，特别是，该木聚糖酶水解木聚糖的产物几乎不含有木糖单糖(水解产物为3～4个残基的木聚寡糖)，缩短了木聚寡糖制备中的纯化分离步骤，极大地提高了木聚寡糖的产率和制备效率，因此，可以将该木聚糖酶应用到益生素木聚寡糖的制备中，即以木聚寡糖或山毛榉木聚糖为原料，加入本发明提出的木聚糖酶进行水解，获得3～4个残基的木聚寡糖。而且，由于本发明提出的木聚糖酶具有耐碱以及耐盐性的特征，该木聚糖酶可以适用于高盐环境，例如，可以被应用于海产品或高盐食品加工中，其中，海产品包括海藻类(例如紫菜、海带等)、虾类(例如龙虾、基围虾等)、鱼类(例如三文鱼、沙丁鱼等)以及贝类(例如海螺、文蛤等)等，高盐食品包括腌菜、酱菜、培根、腊肉等食品。

综上所述，本发明提供的木聚糖酶基因mbXynSPP2，通过载体转入大肠杆菌后，获得重组表达菌株，然后重组表达菌株经过高密度发酵工艺、亲和纯化方法后，制得木聚糖酶，所制得的木聚糖酶在低温下具有高活性，且耐盐性良好，可有效地将木聚寡糖及山毛榉木聚糖水解为3～4个残基的木聚寡糖，可用于益生素木聚寡糖的制备以及高盐食品加工。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1木聚糖酶基因mbXynSPP2的获得

以Thermotoga maritima木聚糖酶TmxB蛋白质序列为查询序列，用Blastp程序搜索Genbank蛋白质序列资源库，找到本发明所涉及的木聚糖酶基因；然后根据结构模拟的结果，去除该基因5’端编码132个氨基酸的核苷酸，只保留编码GH10家族催化结构域的3’端核苷酸序列。根据大肠杆菌密码子的偏爱性，对木聚糖酶基因密码子进行优化设计，得到木聚糖酶基因mbXynSPP2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。木聚糖酶基因mbXynSPP2在苏州金维智公司合成，合成的木聚糖酶基因mbXynSPP2位于pU57载体上，合成基因的5’端和3’端带有限制性酶切位点BamH 1和Xho 1。

实施例2重组质粒的制备

(1)用限制性内切酶BamH 1和Xho 1(均购自Takara公司)将实施例1获得的木聚糖酶基因mbXynSPP2从pU57载体上切下来，割胶回收切下的mbXynSPP2DNA片段；

(2)将mbXynSPP2DNA片段通过T4DNA连接酶(购自Takara公司)连接到pET-28a载体(一种用于在大肠杆菌中重组表达外源基因的商业化载体，购自Novagen公司，该载体上带有卡那霉素抗性基因)上；

(3)将连接产物通过CaCl₂法转化到大肠杆菌DH5α(一种生物学实验室常规的克隆菌株，购自Invitrogen公司，保存于武汉轻工大学实验室)感受态细胞中。将转化的细胞涂布在含有100μg/ml卡那霉素(购自Sigma公司)的LB琼脂平板上进行阳性转化子筛选；其中涉及到的大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及CaCl₂转化方法是生物学实验室的常规操作，具体方法可参考Current Protocols in Molecular Biology一书中关于DNA转化的章节(doi.org/10.1002/0471142727.mb0108s37)；其中用到的LB琼脂平板是通过在LB培养基(每升中含有10g NaCl，5g酵母提取液和10g蛋白胨)加入2.5％的琼脂制备而成。

(4)挑取单克隆接种至含有100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，过夜培养，然后用试剂盒提取质粒，通过BamH 1和Xho 1双酶切进行鉴定，酶切结果正确的即为重组质粒pET-28a-mbXynSPP2。

实施例3重组菌株的制备

(1)将实施例2获得的重组质粒pET-28a-mbXynSPP2采用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21(Rosetta)(购自Novagen公司，为实验室常见的基因工程表达菌，该菌株自带有氯霉素抗性，保存于武汉轻工大学实验室)感受态细胞；其中感受态大肠杆菌BL21(Rosetta)的制备及转化方法与实施例2(3)中的方法相同；

(2)将转化后的大肠杆菌BL21(Rosetta)涂布在含有卡那霉素(100μg/ml)和氯霉素(34μg/ml,购自Sigma公司)的LB琼脂平板上。在此双抗性平板上生长的菌落为重组菌株。

实施例4木聚糖酶的制备

(1)将实施例2制备的重组菌株过夜培养后(培养基中加100μg/ml卡那霉素和34μg/ml的氯霉素)，按1:100的比例接种至ZYP-5052培养基中，于37℃、200rpm条件下培养至OD₆₀₀(600nm处的吸光度)为0.95～1.05，然后将温度降低至20℃，继续培养24h后，5000r/min离心收集菌体，将菌体悬浮于HisTrap A缓冲液，然后通过压力破碎后离心取上清液(含有由重组表达菌株发酵形成的重组蛋白)；其中，HisTrap A缓冲液的pH值为7.4，包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、20mM的咪唑和20mM的Na₂HPO₄；ZYP-5052培养基的具体配方如下：1％蛋白胨，5％酵母提取物，50mM Na₂HPO₄，50mM KH₂PO₄，25mM(NH₄)₂SO₄，0.5％丙三醇，0.05％葡萄糖，0.2％乳糖，2mM MgSO₄，卡那霉素100μg/ml，氯霉素34μg/ml；

(2)取步骤(1)制得的上清液通过HisTrap亲和层析柱(购自通用公司)后，使用HisTrap B缓冲液在AKTA上梯度洗脱上清液中的重组蛋白，然后使用Millipore浓缩管将重组蛋白换液至磷酸盐缓冲液中浓缩至蛋白浓度为1mg/mL，得到纯化的木聚糖酶；其中，HisTrap B缓冲液的pH值为7.4，包括以下摩尔浓度的组分：500mM的NaCl、500mM的咪唑和20mM的Na₂HPO₄；磷酸缓冲液含有以下摩尔浓度的组分：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄。

对实施例4制备的木聚糖酶mbXynSPP2的蛋白表达、酶活、最适反应条件、及耐盐性的分析测定(以下所述的木聚糖酶mbXynSPP2代表实施例4制备的木聚糖酶)，测定方法及结果如下：

1、木聚糖酶mbXynSPP2的蛋白表达分析

对实施例4步骤(1)中细胞破碎制得的上清液和步骤(2)中纯化后的木聚糖酶mbXynSPP2，分别进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)测试，结果如图1所示(图1中：泳道1标准蛋白质Marker，泳道2为细胞破碎后的上清液，泳道3为细胞破碎后的离心沉淀，泳道4-8为上清液经过层析柱梯度洗脱得到的收集管样品)。

由图1可知，纯化后的木聚糖酶mbXynSPP2在大肠杆菌中得到了高效的表达并且通过亲和层析进行的有效地纯化。

2、木聚糖酶mbXynSPP2的酶活分析(还原糖法，也即DNS法)

配制标准的反应体系为2mL，包括：0.5mL约1:20稀释的木聚糖酶mbXynSPP2、1mL反应缓冲液以及0.5mL山毛榉木聚糖(购自Megazyme公司)溶液(10mg/mL)；将该反应体系在水浴中孵育15min后加入DNS试剂(3，5-二硝基水杨酸)，沸水水浴5min，然后冷却至室温；再将该反应体系定容至25mL，在520nm测定吸光度。还原糖的定量采用木糖标准品做标准曲线，1单位(U)木聚糖酶活的活性定义为每分钟能够释放1μmol还原糖所需的木聚糖酶毫克数。

经DNS法测定，纯化后的木聚糖酶mbXynSPP2的酶活约为870U/mg。

3、木聚糖酶mbXynSPP2最适反应pH温度分析

将木聚糖酶mbXynSPP2分散在pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液(pH 3～8的缓冲液由McIlvaine缓冲液制备，pH 9～11的缓冲液由甘氨酸-氢氧化钠(50mM)缓冲液制备)中，于30℃温度下，分别通过上述DNS法测定酶活。其中，pH 3～8的缓冲液由McIlvaine缓冲液制备的方法如下：用摩尔浓度为200mM的Na₂HPO₄溶液和摩尔浓度为100mM的柠檬酸溶液进行勾对配制至所需要的pH值，具体比例如下表1所示：

表1由McIlvaine缓冲液制备对应pH值缓冲液的比例

pH	Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>体积(mL)	柠檬酸体积(mL)
			3.0	04.11	15.89
4.0	07.71	12.29
			5.0	10.30	09.70
6.0	12.63	07.37
			7.0	16.47	03.53
8.0	19.45	00.55

pH 9～11的缓冲液由甘氨酸-氢氧化钠(50mM)缓冲液制备的方法如下：将甘氨酸溶解在水中，用氢氧化钠滴定到需要的pH(9.0，10.0，11.0)。

各pH反应区间的相对酶活的计算结果如图2所示。由图2可知，本实施例制备的木聚糖酶mbXynSPP2在pH值为6～7区间都具有最高的活性。

4、木聚糖酶mbXynSPP2的pH稳定性分析

将木聚糖酶mbXynSPP2分散在不同pH(pH值为3～11)的缓冲液体系中，于4℃温度下孵育2h后，在40℃、pH值为7.0的条件下，通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各pH反应区间的相对酶活，结果如图3所示。

由图3可知，本实施例制备的木聚糖酶mbXynSPP2在pH为5～10条件下，孵育2h后表现出125％～230％的酶活。

综合如上所述的3、4两项的考察结果，可知，本发明提出的木聚糖酶具有宽泛的pH耐受范围，可适应强酸碱环境或pH变化较大的应用场景。

5、木聚糖酶mbXynSPP2最适反应温度分析

将木聚糖酶mbXynSPP2分散在pH值为7.0的缓冲液体系中，分别于0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃温度下，通过上述DNS法测定酶活。结果如图4所示。

由图4可知，本实施例制备的木聚糖酶mbXynSPP2在30～50℃温度区间都具有较高的活性，其最适温度为50℃。

6、木聚糖酶mbXynSPP2的温度稳定性分析

将木聚糖酶mbXynSPP2分散在pH值为7.0的缓冲液体系中，分别置于50℃、60℃、70℃、80℃和90℃温度下孵育1h后，在40℃、pH值为7.0的条件下，通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各pH反应区间的相对酶活，结果如图5所示。

由图5可知，本实施例制备的木聚糖酶mbXynSPP2在40℃温度下孵育2h后保持约90％的酶活。

7、金属离子及一些化学试剂对木聚糖酶mbXynSPP2的作用及木聚糖酶mbXynSPP2的耐盐性分析

按照上述酶活分析中的方法配制标准反应体系10份，向标准反应体系中分别加入终浓度为5mM的FeSO₄、MnSO₄、CaCl₂、ZnCl₂、CoCl₂、MgSO₄、DTT(二硫苏糖醇)、EDTA(乙二胺四乙酸)溶液、以及浓度分别为0.5M、1M、2M、3M和4M的NaCl溶液，以不含有上述试剂溶液的标准反应体系作为对照组，通过上述DNS法测定酶活，以测得的最高酶活值设定为100％，计算其他各pH反应区间的相对酶活，结果如图6和图7所示，图6为不同金属离子及化学试剂对木聚糖酶mbXynSPP2活性的影响，图7为不同NaCl浓度为木聚糖酶mbXynSPP2活性的影响。

由图6和图7可知，上述常见的金属离子(Fe²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Co²⁺和Mg²⁺)在5mM的浓度下对木聚糖酶mbXynSPP2明显的抑制效果，但NaCl对木聚糖酶mbXynSPP2的活性具有极大促进效应。说明本实施例制备的木聚糖酶mbXynSPP2具有良好的耐盐性，可适应高盐环境的应用场景

实施例5木聚糖酶mbXynSPP2水解山毛榉木聚糖能力测试

将山毛榉木聚糖(购自Megazyme公司)作为底物，在标准反应体系(上述酶活分析中提供的标准反应体系)和50℃、pH 7.0的反应条件下反应不同时间后，进行薄层层析分析(薄层层析硅胶板购自Merck公司)。薄层层析所用的展开剂为正丁醇：乙酸：水＝10：5：1(体积比)，条带显影剂为浓硫酸：甲醇＝5：95(体积比)，喷洒显影剂后将薄层板置于115℃、10min。

分析结果如图8所示，图8中：泳道1和2分别为灭活木聚糖酶mbXynSPP2以及未灭活木聚糖酶mbXynSPP2水解山毛榉木聚糖的产物，泳道3为木糖(X1)标准品，泳道4和5分别为灭活木聚糖酶mbXynSPP2以及未灭活木聚糖酶mbXynSPP2水解木二糖(X2)的产物，泳道6和7分别为灭活木聚糖酶mbXynSPP2以及未灭活木聚糖酶mbXynSPP2水解木三糖(X3)的产物，泳道8和9分别为灭活木聚糖酶mbXynSPP2以及未灭活木聚糖酶mbXynSPP2水解木四糖(X4)的产物，泳道10和11分别为灭活的木聚糖酶mbXynSPP2以及为灭活木聚糖酶mbXynSPP2水解木五糖(X5)的产物，泳道12和13分别为灭活的木聚糖酶mbXynSPP2以及为灭活木聚糖酶mbXynSPP2水解木六糖(X6)的产物；木聚寡糖(X1～X6)简写字符的位置和大小指示水解产物中木聚寡糖在平板中迁移的位置。

由图8可知，本发明实施例制备的木聚糖酶mbXynSPP2可有效地将木聚寡糖(X2～X6)及山毛榉木聚糖水解为3～4个残基的木聚寡糖。

综上所述，本发明提供的木聚糖酶基因mbXynSPP2，通过载体转入大肠杆菌后，获得重组表达菌株，然后重组表达菌株经过高密度发酵工艺、亲和纯化方法后，制得高纯度的木聚糖酶，所制得的木聚糖酶在低温下具有高活性，且耐盐性良好，可有效地将木聚寡糖及山毛榉木聚糖水解为3～4个残基的木聚寡糖，可用于益生素木聚寡糖的制备、以及海产品或高盐食品的加工。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉轻工大学

<120> 木聚糖酶基因、重组质粒、重组菌株、木聚糖酶及其应用

<130> 2019.1.28

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 957

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agcttgaaaa aggcggctga tacattctta gttggagtct cagttcaatc gggaaaattg 60

aatggacagt acgatgaaat ttaccgaaga gaatttagca gtattacagc cgaatgggaa 120

atgaagatga atgtgatgca tccatctgct ggtacttatg attttggacc tgccgatgcg 180

attgttaaat atggtgagga taatggaatt aatgttcatg gtcattctct gatttggcac 240

aattcaactc ctgattgggt gaagaatttt gcaggaacag atcaggagtt cgaagacatg 300

attgaagatt atatcacgac agtggttacc cgatataaag gaaaagttac ttcgtgggat 360

gtggtgaatg aagggctgga agatggttca ggaaatttaa ggaacacaat ttaccgccaa 420

aaaatgggcg acgattacat tgctaaatgt taccagtttg ttcgtgctgc cgacgctgat 480

gtattgattt tttataacga ttataacatg ataaccgacc aaacaaaaca ggatgctgtt 540

tttactatgg ttgatgattt tattgcacgg ggaattccaa ttgatggagt aggatttcaa 600

atgcacattt ctcacgatta tcctgccaaa gcagatattc agaaagctac cgaccgaatt 660

gttgaaagag atctattggt acatttctct gaattggatg taagagcaaa tccgaataag 720

gatttaacaa gtttatcacc agaacgatcg ttgtcgcaga aagcaaaagt gaaagaggtt 780

gtacaggtat tcaacggaat tccgaacgga aataagtatg ctttaaccgt ttggggattg 840

aaagattcag aaacctggtt gttggatttt tatggacatg ttgattggcc attgcttttt 900

gatggaaatt acaataaaaa ggatgcttac tacggatttt tagaaggctt gcagtaa 957

<210> 2

<211> 318

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Ser Leu Lys Lys Ala Ala Asp Thr Phe Leu Val Gly Val Ser Val Gln

1 5 10 15

Ser Gly Lys Leu Asn Gly Gln Tyr Asp Glu Ile Tyr Arg Arg Glu Phe

20 25 30

Ser Ser Ile Thr Ala Glu Trp Glu Met Lys Met Asn Val Met His Pro

35 40 45

Ser Ala Gly Thr Tyr Asp Phe Gly Pro Ala Asp Ala Ile Val Lys Tyr

50 55 60

Gly Glu Asp Asn Gly Ile Asn Val His Gly His Ser Leu Ile Trp His

65 70 75 80

Asn Ser Thr Pro Asp Trp Val Lys Asn Phe Ala Gly Thr Asp Gln Glu

85 90 95

Phe Glu Asp Met Ile Glu Asp Tyr Ile Thr Thr Val Val Thr Arg Tyr

100 105 110

Lys Gly Lys Val Thr Ser Trp Asp Val Val Asn Glu Gly Leu Glu Asp

115 120 125

Gly Ser Gly Asn Leu Arg Asn Thr Ile Tyr Arg Gln Lys Met Gly Asp

130 135 140

Asp Tyr Ile Ala Lys Cys Tyr Gln Phe Val Arg Ala Ala Asp Ala Asp

145 150 155 160

Val Leu Ile Phe Tyr Asn Asp Tyr Asn Met Ile Thr Asp Gln Thr Lys

165 170 175

Gln Asp Ala Val Phe Thr Met Val Asp Asp Phe Ile Ala Arg Gly Ile

180 185 190

Pro Ile Asp Gly Val Gly Phe Gln Met His Ile Ser His Asp Tyr Pro

195 200 205

Ala Lys Ala Asp Ile Gln Lys Ala Thr Asp Arg Ile Val Glu Arg Asp

210 215 220

Leu Leu Val His Phe Ser Glu Leu Asp Val Arg Ala Asn Pro Asn Lys

225 230 235 240

Asp Leu Thr Ser Leu Ser Pro Glu Arg Ser Leu Ser Gln Lys Ala Lys

245 250 255

Val Lys Glu Val Val Gln Val Phe Asn Gly Ile Pro Asn Gly Asn Lys

260 265 270

Tyr Ala Leu Thr Val Trp Gly Leu Lys Asp Ser Glu Thr Trp Leu Leu

275 280 285

Asp Phe Tyr Gly His Val Asp Trp Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn Tyr

290 295 300

Asn Lys Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Phe Leu Glu Gly Leu Gln

305 310 315

Claims

1.一种木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种木聚糖酶基因mbXynSPP2，用于编码权利要求1所述的木聚糖酶，其特征在于，所述木聚糖酶基因mbXynSPP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.一种重组质粒，其特征在于，携带权利要求2所述的木聚糖酶基因mbXynSPP2。

4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，包含表达载体pET-28a。

5.一种重组菌株，其特征在于，包含如权利要求2所述的木聚糖酶基因mbXynSPP2。

6.如权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，由包含如权利要求2所述的木聚糖酶基因mbXynSPP2的重组质粒转化大肠杆菌BL21(Rosetta)获得。

7.一种如权利要求1所述的木聚糖酶在益生素木聚寡糖的制备中的应用。

8.一种如权利要求1所述的木聚糖酶在高盐食品加工中的应用。