CZ20032669A3 - Dna encoding l-ribose isomerae and use thereof - Google Patents

Description

DNA kódující L-ribózaizomerázu a její použití

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nové DNA,

DNA kódující L-ribózaizomerázu a její použití.

Dosavadní stav techniky

L-ribóza je typ vzácných cukrů, jejichž průmyslová produkce nebyla zavedena. V současnosti byla užitečnost tohoto sacharidu zvýrazněna v oblasti potravin a farmaceutik jako materiálů pro tvorbu protivirových činidel a protirakovinových činidel. Je tudíž silná potřeba zavést výrobu tohoto sacharidu v průmyslovém měřítku.

Ke splnění této potřeby původci předloženého vynálezu popsali nový enzym, L-ribózaizomerázu, který je užitečný pro výrobu L-ribózy v průmyslovém měřítku, způsob výroby tohoto enzymy využívající mikroorganismus schopný tvorby enzymu a jeho použití v japonském patentu Kokai č. 155 480/98, jehož přihlášku podal stejný přihlašovatel, jako tuto přihlášku.

Jak je popsáno výše, výroba L-ribózy v průmyslovém měřítku byla zavedena jako výsledek výzkumu původců tchoto vynálezu. V průběhu dalších studií L-ribózaizomerázy však původci tohoto vynálezu nalezli, že je potřeba další zlepšení tvorby a účinnosti enzymu a jeho enzymatických vlastností, přičemž k překonání takového požadavku nebyly provedeny žádné studie.

Za těchto okolností, pokud DNA kódující enzym vytvářející L-ribózu bude dobře nakloňována, aplikace techniky rekombinantní DNA, která v těchto dnech významně pokročila, na této DNA splní výše uvedený požadavek. Neexistuje však žádná pozitivní zpráva o klonování DNA kódující enzym vytvářející L-ribózu.

Podstata vynálezu

Ke splnění těchto cílů původci intenzivně studovali chromozomální DNA u mikroorganizmů vytvářejících L-ribózaizomerázu pomocí částečných sekvencí aminokyselin popsaných v japonském patentu Kokai č. 155 480/98, jehož přihlášku podal stejný přihlašovatel, jako tuto přihlášku. Výsledkem bylo úspěšné klonování DNA kódující aminokyselinovou sekvenci, která má částečnou aminokyselinovou sekvenci popsanou výše, z mikroorganizmu rodu Acinetobacter. Rovněž nalezli, že rekombinantní mikroorganizmy, které mají klonovanou DNA, účinně vytvářejí polypeptid, který má aktivitu L-ribózaizomerázy. Předložený vynález byl tedy uskutečněn na základě výzkumných výsledků původců tohoto vynálezu.

Předložený vynález řeší první předmět poskytnutím DNA kódující L-ribózaizomerázu, která katalyzuje izomerační reakci L-ribózy na L-ribulózu a naopak (zde dále pojem „L-ribózaizomerázová aktivita znamená enzymatickou aktivitu, která katalyzuje tyto izomerační reakce).

Navíc předložený vynález řeší druhý předmět poskytnutím použití DNA, obzvláště poskytnutím způsobu zahrnujícího kroky umělé exprese DNA k vytvoření pclypeptidu, který má L-ribózaizomerázovou aktivitu a zachycení vytvořeného polypeptidu.

Nej lepší způsob provedení vynálezu

Předložený vynález se týká DNA kódující „L-ribózaizomerázu a jejího použití. L-Ribózaizomeráza, jak je v předloženém vynálezu označována, znamená enzym, který má L-ribózaizomerázovou aktivitu neboli enzym, který konverguje L-ribózu na L-ribulózu a naopak. „L-Ribózaizomerázová aktivita může být detekována následujícími stanoveními. Reakční směs se připraví smísením 0,05 ml 0,5M pufru glycin-hydroxid sodný (pH 9,0), 0,05 ml 0,05M Lribózy a 0,4 ml enzymového roztoku. Výsledná směs se inkubuje při teplotě 30 °C po dobu 10 minut k izomerizaci L-ribózy na L-ribulózu. Po zastavení reakce povařením se množství L-ribulózy vytvořené v reakční směsi stanoví pomocí cystein-karbazolového způsobu. V předloženém vynálezu je jedna jednotka L-ribózaizomerázové aktivity definována jako množství enzymu, které vytvoří jeden mikromol L-ribulózy za minut za výše uvedených podmínek.

Konkrétní příklady L-ribózaizomerázy podle tohoto vynálezu zahrnují L-ribózaizomerázy, které mají celou sekvenci aminokyselin SEQ IN No: 1. tyto L-ribózaizomerázy, které mají tuto aminokyselinovou sekvenci, mohou být izolovány z mikroorganizmů, obzvláště mikroorganizmů rodu Acinetobacter, které jsou schopny tvorby tchoto enzymu. L-Ribózaizomerázy se obvykle izolují z takových mikroorganizmů jako oligomerní enzymy sestavené ze čtyř podjednotek polypeptidů, které mají aminokyselinouvou sekvenci SEQ ID No: 1. Aminokyselinová sekvence v SEQ ID No: 1 je příkladem aminokyselinové sekvence, která je obsažena v L-ribózaizomeráze podle tohoto vynálezu. L-Ribózaizomeráza může obsahovat aminokyselinovou sekvenci, která není zcela shodná s SEQ ID No: 1, například uveďme L-ribózaizomerázy, kde je k N-konci SEQ ID No: 1 přidán methionin nebo kde jeden nebo více aminokyselinových zbytků na N- nebo C-konci SEQ ID No: 1 chybí. L-Ribózaizomeráza podle tohoto vynálezu tedy není omezena na enzym nebo polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No: 1, přičemž zahrnuje ty L-ribózaizomerázy, které vykazují L-ribózaizomerázovou aktivitu a mají částečnou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No: 1. L-Ribózaizomeráza, která má částečnou aminokyselininovou sekvencí SEQ ID No: 1 má obvykle homologií 60 % nebo vyšší, výhodně 70 % nebo vyšší, výhodněji 80 % nebo vyšší a nej výhodněji 90 % nebo vyšší, pokud se vypočítá obvyklým způsobem založeným na maximálním shodném přiřazení dvou aminokyselinových sekvencí.

Molekuly DNA podle předloženého vynálezu kódují L-ribózaizomerázu jak je definována zde výše..Zahrnují kteroukoli z nich ve formě jedno- nebo dvoušroubovicového nukleo-tidového řetězce pokud kódují L-ribózaizomerázu (zde dále řetězec tvořený nukleotidovou sekvencí, která kóduje L-ri-bózaizomerázu může být nazýván „smyslový řetězec).

Pro konkrétní příklady DNA podle předloženého vynálezu jsou příkladmo uvedeny ty molekuly DNA, které obsahují celou nukleotidovou sekvenci SEQ ID No: 2, která kóduje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No: 1. Molekuly DNA kódující výše uvedené aminokyselinové sekvence mohou obecně být izolovány z mikroorganizmů, které tento enzym vytvářejí, obzvláště mohou tyto molekuly DNA být izolovány z chromozomálních molekul DNA mikroorganizmů rodu Acinetobacter. Obecně tyto izolované molekuly DNA obsahují • · · · nukleotidovou sekvenci SEQ ID No: 2, která má iniciační a stop kodón přidané k 5'-konci respektive ke 3'-konci. Nukleotidová sekvence SEQ ID No: 2 je příkladem DNA podle tohoto vynálezu. Molekuly DNA podle předloženého vynálezu mohou obsahovat jiné nukleotidová sekvence, které zcela neodpovídají nukleotidová sekvenci SEQ ID No: 2. Obecně molekuly DNA podle tohoto vynálezu mohou být modifikovány substitucí, inzercí a delecí nukleotidů použitím obvyklých technik rekombinace DNA, jako je mutageneze zacílená na místo na molekuly DNA se specifickými nukleotidy, taková modifikace zahrnuje přidání nukleotidových sekvencí, které kódují visačku (His) ₆, která má afinitu pro specifické materiály nebo která kóduje signální peptidy. Molekuly DNA podle předloženého vynálezu tudíž nejsou omezeny na molekuly DNA, které obsahují část nebo celou nukleotidovou sekvenci SEQ ID No: 2 a které kódují požadovanou L-ribózaizomerázu. Ve srovnání s nukleotidovou sekvencí SEQ ID No: 2 molekuly DNA podle předloženého vynálezu, které mají částečnou nukleotidovou sekvenci SEQ ID No: 2 mají obvykle hcmologii 60 % nebo vyšší, výhodně 70 % nebo vyšší, výhodněji 80 % nebo vyšší a nejvýhodněji 90 % nebo vyšší, pokud se vypočítá obvyklým způsobem založeným na maximálním shodném přiřazení dvou aminokyselinových sekvencí.

Molekuly DNA podle předloženého vynálezu jsou molekuly DNA definované výše a nejsou omezeny na molekuly DNA, které se získají pomocí specifických preparačních postupů. Molekuly DNA podle předloženého vynálezu lze získat například screeningem založeným buď na nukleotidové sekvenci popsané v popisu nebo na aminokyselinové sekvenci L-ribózaizomerázy, která je kódována DNA z chromozomálních molekul DNA mikroorganizmů rodu Acinetobacter, specifičtěji Acinetobacter calcoacetious LR7C (FERM BP-5335) a jeho mutantů, grampozitivních bakterií, gramnegativních bakterií, kvasinek, hub a jiných mikroorganizmů pomocí obvyklých technik genového klonování. Ke screeningu chromozomálních molekul DNA se dají použít hybridizační metoda genomové knihovny, metoda PCR s využitím chromozomálních molekul DNA jako templátů a jejich modifikované formy. K provedení výše uvedeného screeningu se výhodně použijí následující molekuly DNA: molekuly DNA podle předloženého vynálezu včetně těchto molekul DNA v jedno- nebo dvoušroubovicové formě a ve formě jednošroubovicových molekul DNA konstruovaných jako protismyslová DNA odpovídající smyslovým řetězcům molekul DNA podle předloženého vynálezu, přičemž zahrnují fragmenty těchto molekul DNA, které mají obvykle alespoň 10 v souvislé řadě ležících bází, výhodně alespoň 12 v souvislé řadě ležících bází, výhodněji alespoň 15 v souvislé řadě ležících bází a nejvýhodněji alespoň 20 v souvislé řadě ležících bází. Ke screeningu z genomové knihovny se například molekuly DNA dají získat způsobem, který zahrnuje kroky značení molekul DNA nebo fragmentů popsaných výše pomocí radioizotopů, enzymů nebo dioxigeninu, provedením hybridizace na genomové knihovně pomocí značených molekul DNA a hybridizačních sond a zachycení DNA z genomového klonu vykazujícího významnou hybridizaci se sondou. K provedení metody PCR se molekuly podle předloženého vynálezu mohou získat z molekul DNA namnožených pomocí PCR s využitím oligonukleotidů, které mají fragmenty DNA popsané výše jako PCR-primer (smyslový primer a/nebo protismyslový primer). Pokud je to nezbytné mohou tyto metody být použity v kombinaci. Molekuly DNA podle předloženého vynálezu lze také získat obvyklými chemickými syntetickými způsoby podle nukleotidové sekvence molekul DNA popsaných v předloženém vynálezu.

• · · · • · < · * ·

Molekuly DNA podle předloženého vynálezu se mohou výhodně použít k tvorbě polypeptidů, specifičtěji polypeptidů, které mají L-ribózaizomerázovou aktivitu, pomocí techniky rekombinace DNA, přičemž předložený vynález poskytuje způsob jejich tvorby. Způsob tvorby polypeptidů podle tohoto vynálezu je charakterizován tím, že zahrnuje kroky umělé exprese DNA podle předloženého vynálezu k vytvoření polypeptidů s L-ribózaizomerázovou aktivitou a izolace polypeptidů. K umělé expresi DNA je například možné použít obecný způsob exprese in vitro, který zahrnuje transkripční a translační metody in vitro. K výrobě požadovaného polypeptidů v průmyslovém měřítku je výhodné kultivovat transformované hostitelské buňky připravené transformací s DNA podle předloženého vynálezu.

Obvykle se transformanty použité v předloženém způsobu dají získat transformací příhodných hostitelů pomocí rekombinantní DNA zkonstruované inzercí molekul DNA podle předloženého vynálezu do autonomně replikovatelných vektorů. V závislosti na typech použitých hostů se mohou autonomně replikovatelné vektory příhodně zvolit z obvyklých vektorů, například plasmidových vektorů jako je pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pUBUO, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, Yep7 a pBS7 nebo fágových vektorů, jako je Ágt ÁC, Ágt · ÁB, pil, φΐ a φ105. K expresi molekul DNA podle předloženého vynálezu v E. coli se z vektorů popsaných výše výhodně použijí pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBR322, Bluescript II SK(+) Ágt · ÁC a Ágt · ÁB.

K expresi molekul DNA podle předloženého vynálezu v B. subtilis jsou užitečné vektory pUBUO, pTZ4, pC194, pil, φΐ a φ105. Vektory pHVl4, TRp7, Yep7 a pBS7 jsou užitečné k expresi požadovaných rekombinantních molekul DNA u dvou • · · ·

nebo více hostitelů. Tyto autonomně replikovatelné vektory obecně obsahují nukleotidové sekvence, jako jsou promotory, enhancery, replikační počátky, terminátory transkripce a selekční sekvence k expresi předložených molekul DNA v různých hostitelích nebo k potvrzení požadované transformace. K inzerci molekul DNA podle předloženého vynálezu do těchto vektorů lze použít obvyklé způsoby používané v oboru. Například lze použít přidání linkerů, přidání míst pro restrikční enzymy syntetizovaných pomocí metody PCR, zpracování restrikčním enzymem a zpracování 1 i gázou.

Hostitelské buňky obvykle používané ke konstrukci transformantů, například mikroorganizmů jako je E. coli, B. subtilis, kvasinka a houba, bezobratlí, jako je hmyz, rostliny a obratlovci, mohou být použity jako hostitelské buňky, do nichž se zavedou molekuly DNA podle předloženého vynálezu. K poskytnutí polypeptidu při nízkých nákladech je výhodné jako hostitelskou buňku použít mikroorganismus jako je E. coli a B. subtilis. K transformaci molekul DNA podle předloženého vynálezu do hostitelských buněk lze dle úvahy použít kalciumfosfátovou metodu, elektroporační metodu a virovou transfekční metodu, pokud je to nezbytné DEAEdextranovou metodu, lipofekční metodu a mikroinjekční metodu. Požadované klony mohou být zvoleny z transformantů s vytvářečem transformované DNA nebo tvorby polypeptidu jsou užitečné. Detaily o běžných materiálech a metodách pro rekombinantní techniky a transformanty jsou popsány v J. Sambrook a kol., Molecular Cloning, a laboratory manual 2. vydání, Cold Spring Harbor Lab. (1989).

Takto získané transformované buňky vytvářejí polypeptidy, které mají L-ribózaizomerázovou aktivitu • · · · • * ·

extra/intracelulárně při kultivaci za podmínek příhodných pro induktivní stimulaci, pokud je to nezbytné, v závislosti na povaze hostitelských buněk nebo vektorů použitých k zavedení požadovaných molekul DNA. V závislosti na druhu použitých hostitelských buněk a vektorů se výhodně použijí kultivační média používaná obecně, která jsou doplněna o zdroje uhlíku, zdroje dusíku a minerálů, dále, pokud je to nezbytné, o stopové živiny, jako jsou aminokyseliny a vitamíny. Příklady zdrojů uhlíku použitelných v předloženém vynálezu zahrnují škroby, hydrolyzáty škrobů, glukózu, fruktózu, sacharózu a trehalózu. Příklady zdrojů dusíku použitelných v předloženém vynálezu jsou anorganické nebo organické látky včetně amoniaku, amoniových solí, močoviny, dusičnanu, peptonu, kvasinkového extraktu, odtučněných sójových bobů, kukuřičného výluhu a masového extraktu. Kultury obsahující polypeptidy, které mají L-ribózaizomerázovou aktivitu, lze získat, když se transformované buňky kultivují jeden až pět dní za aerobních podmínek, jako je aerace a třepání, přičemž se udržuje teplota a pH, obvykle teplota na 20 až 60 °C a pH na 2 až 10, které se mění v závislosti na použitých hostitelských buňkách a vektorech.

Ačkoliv polypeptidy vytvořené výše uvedeným způsobem mohou být použity intaktní, pokud je to nezbytné, mohou se před použitím vyčistit. Lze použít následující čisticí postupy pro proteiny běžně v oboru používané: vysolování, dialýza, filtrace, koncentrace, precipitace,

1ontoměničová chromatografie, gelová filtrační chromatografie, adsorpční chromatografie, izoelektrofckuzační chromatografie, hydrofóbní chromatografie, chromatografie s reverzní fází, afinitní chromatografie, gelové elektroforéza a izoelektrické fokuzace. Požadované • · · · polypeptidy vyčištěné na požadovanou úroveň lze získat analýzou vlastností, jako je aminokyselinová sekvence, molekulová hmotnost a izomerázová aktivita k určení požadovaných frakcí a zachycením frakcí, které vykazují požadované vlastnosti.

Podobně jako L-ribózaizomeráza popsaná v japonském patentu Kokai č. 155 480/98 přihlášeném původci tohoto vynálezu, takto získané polypeptidy mající L-ribózaizomerázovou aktivitu mají takovou aktivitu a další aktivity, které katalyzují izomerační reakci aldóz, jako je D-xylóza, D-talóza, D-mannóza, L-allóza a L-glukóza. Polypeptidy získané způsobem podle tohoto vynálezu lze výhodně dodávat za relativně nižších nákladů, než jsou náklady na přirozené enzymy nebo na enzymy produkované mikroorganizmy schopnými tvorby L-ribózaizomerázy. Výše uvedené polypeptidy jsou velmi užitečné pro průmyslovou výrobu sacharidů, jako je L-ribóza a D-talóza, které jsou užitečné, ale vzácné.

Molekuly DNA podle předloženého vynálezu, protismyslové jednořetězcové molekuly DNA a jejich fragmenty jsou velmi užitečné pro screening dalších enzymů, které mají struktury podobné struktuře L-ribózaizomerázy.

Je možné, že molekuly DNA kódující nový enzym, které mají jinou aktivitu než je aktivita L-ribózaizomerázy, lze získat screeningem chromozomálních molekul DNA připravených z různých původů podle způsobů hybridizace nebo PCR používaných k přípravě molekul DNA podle předloženého vynálezu. Výhodně mohou být použity podmínky (přísné podmínky) pro hybridizaci sond a chromozomálních molekul DNA nebo pro žíhání PCR primerů a chromozomálních molekul DNA. Přísné podmínky pro hybridizaci nebo žíhání jsou • · • · · · • · · · • « ·

obecně ovlivněny teplotou a iontovou silou. Detaily faktorů, které ovlivňují určení přísností jsou popsány v Sambrook a kol., Moiecular Cloning, a laboratory manual 2. vydání, Cold Spring Harbor Lab. (1989). S odkazem na tyto detaily lze hybridizaci nebo metodou PCR získat za různých podmínek přísnosti různé molekuly DNA kódující enzymy, které vykazují různé strukturní podobnosti s L-ribózaizomerázou. Je možné, že nové enzymy, které jsou použitelné ke tvorbě vzácných cukrů, jako variace tohoto vynálezu, lze získat expresí výše uvedených molekul DNA pomocí příhodných technik rekombinace DNA a stanovením enzymatické aktivity expresních produktů. Navíc je možné dosáhnout molekulárního uspořádání pro účely změny substrátové specificity a enzymatických vlastností kombinováním znalostí o vztahu struktury a funkce mezí L-ribčzaizomerázou a vztahu struktury a funkce u nových enzymů získaných způsobem popsaným výše. Molekuly DNA podle předloženého vynálezu, protismyslové jednořetězcové molekuly DNA a jejich fragmenty jsou tedy velmi užitečné pro screening nových enzymů, které jsou strukturně příbuzné L-ribózai zomeráze.

Následující příklady vynález vysvětlují v detailu.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

DNA kódující L-ribózaizomerázu

Příklad 1 • · · ·

Příprava chromozomální DNA z Acinetobacter calcoaceticus LR7C

Acinetobacter calcoaceticus LR7C (FERM BP-5335) se inokuluje na čerstvé médium a anorganickou solí obsahující D-xylózu jako jediný zdroj uhlíku (D-xylose inorganic salt medium) a kultivuje se při teplotě 28 °C po dobu 24 hodin podle způsobu, který popsal T. Shimonishi v Journal of Fermantation and Bioengineering, 81, 493 až 497 (1996). Očkovací kultura se získá opakováním postupu popsaného výše třikrát každých 24 hodin. Výsledná očkovací kultura se inokuluje do 100 ml média s kvasinkovým extraktem (pH 7,0) obsahujícího 0,5 %hmotnost/objem kvasinkového extraktu, 0,5 % hmotnost objem polypeptonu a 0,5 % hmotnost/objem chloridu sodného a kultivuje se přes noc aerobně za třepání a aerace při teplotě 28 °C.

Proliferované mikroorganismy se z kultury zachytí odstředěním. Po obvyklém zpracování lysozymem se buňky rozruší zmrazením na teplotu -80 °C a následnou disolucí při teplotě 60 °C. Výsledný roztok se podrobí obvyklé fenolové extrakci a výsledná vodná fáze se zachytí a podrobí se ethanolové precipitaci. Frakce se surovou chromosomální DNA se získá jako sraženina a konvenčně se zpracuje ribonukleázou a proteinázou. Výsledná chromozomální DNA se podrobí obvyklé chlroformové/izoamylalkoholové extrakci a poté ethanolové precipitaci k vysrážení chromozomální DNA. Sraženina se rozpustí k získání koncentrace DNA 1 mg/ml pomocí sterilizované destilované vody k získání čištěného přípravku chromozomální DNA jako vodného roztoku DNA.

Příklad 1 -2

Příprava hybridizační sondy

SEQ ID No: 4 ukazuje N-koncovou aminokyselinovou sekvenci L-ribózaizomerázy izolované z mikroorganizmu rodu Acinetobacter, jak je popsána v japonském patentu č. 155 480/98 přihlášeného původci tohoto vynálezu. Tato aminokyselinová sekvence nemá na svém N-konci žádný methionin odpovídající počátečnímu kodónu. Původci předloženého vynálezu tedy vyslovili hypotézu, že gen L-ribózaizomerázy mikroorganizmu rodu Acinetobacter má nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci, která má na svém N-konci methionin SEQ ID No: 4 na 5'-konci své kódující oblasti, a že L-ribózaizomeráza se konstruuje z polypeptidu, ze kterého je methionin deletován z N-konce předběžného expresního produktu. Na základě této hypotézy byly designovány smyslové a protismyslové primery pro PCR. Nukleotidové sekvence smyslových primerů jsou ukázány v SEQ ID No: 5 a 6. Nukleotidové sekvence protismyslových primerů jsou ukázány v SEQ ID No: 7 a 8. Kodón ATG na 5'-konci SEQ ID No: 5 a 6 odpovídá methioninu jak je popsáno ve výše uvedené hypotéze.

Smyslový a protismyslový primer se chemicky syntetizuje podle designu popsaného výše. PCR se provádí v jednom systému pomocí chemicky syntetizovaných primerů, vyčištěné chromozomální DNA připravené v příkladu 1-1 jako templátu a Taq DNA-polymerázy (Takara Corporation, Tokio, Japonsko) za standardních podmínek PCR. Jako výsledek se pozoruje amplifikace DNA, která má délku řetězce okolo 70 párů bází. Amplifikovaná DNA se klonuje do plasmidového vektoru, pUC119, a sekvenuje. Jako výsledek se zjistí, že amplifikovaná DNA má 68 párů bází a kóduje Nkonec aminokyselinové sekvence (SEQ ID No: 4), přičemž se • · · 1 • · ·

má za to, že je užitečná jako sonda ke klonování požadovaného genu. Následně se připraví hybridizační sonda značením amplifikované DNA o délce 68 párů bází pomocí dioxigeninem značeného deoxy-UTP (DIG-ll-dUTP) na jejím 3'-konci pomocí komercionalizovaného kitu pro značení (Boehringer Mannheim GmbH, Německo).

Příklad 1-3

Příprava genomové knihovny mikroorganizmu rodu Acinetobacter

Okolo jednoho mikrogramu vyčištěné chromozomální DNA připravené v příkladu 1 se částečně rozloží pomocí restrikční endonukleázy, Sac I, pomocí obvyklých metod. Výsledná částečné štěpy se rozdělí gelové elektroforézy s 0,7% agarózou (hmotnost/objem) a přenesou se na nylonovou membránu podle metody standardního Southern blottingu. Pro hybridizaci se použijí membrána a sonda připravené v příkladu 1-2. Po hybridizaci se provede imunologická detekce pomocí protilátky proti DIG. Jako výsledek se detekuje významný signál ukazující specifickou hybridizaci v poloze odpovídající délce řetězce 1,2 tisíce bází (kb) . Na základě tohoto výsledku se připraví genomová knihovna mikroorganizmu rodu Acinetobacter. Specificky se z gelu extrahuje a vyčistí frakce o velikosti 1,2 kb po částečném štěpení chromozomální DNA podle výše uvedené metody a následné elektroforéze v agarózovém gelu. Požadovaná genomová knihovna se získá inzercí fragmentů DNA do této frakce na klonovacím místě plasmidového vektoru, pUC119 (ATCC 37461) a následnou transformací E. coli DH5 (ATCC 53868).

Příklad 1-4

Screening genomové knihovny a klonování DNA kódující L-ribózaizomerázu

Okolo pěti tisíc klonů genomové knihovny Acinerobacter připravené v příkladu 1 - 3 se inokuluje na L-agarovou desku a přes noc se kultivuje při teplotě 37 °C. Kolonie, které na desce vyrostou se přenesou na nylonovou membránu a fixují se na ní. Nylonová membrána a sonda připravené v příkladu 1 - 2 se použijí k hybridizaci kolonií za standardních podmínek. Po hybridizaci kolonií se použije imunologická detekce pomocí protilátek proti DIG. Jako výsledek se potvrdí, že sonda se hybridizovala na čtyři z 5 000 screeningovaných klonů. Obvyklými metodami se izolují pozitivní klony, respektive se připraví plasmidové molekuly DNA. Vložené molekuly DNA každého plasmidu připraveného ze čtyřech pozitivních klonů se sekvenují dideoxysekvenační metodou. Jako výsledek se zjistí, že tyto nukleotidové sekvence jsou zcela shodné. Nukleotidová sekvence takto dekódovaná je ukázána v SEQ ID No: 3. Jak je ukázáno paralelně s SEQ ID No: 3, sekvence kóduje aminokyselinovou sekvenci, která má na svém N-konci methionin a skládá se z 249 aminokyselinových zbytků. Aminokyselinová sekvence sestávající z 2. až 27.

aminokyselinového zbytku z N-konce aminokyselinové sekvence kódované nukleotidovou sekvencí SEQ ID No: 3 je zcela shodná s N-koncovou aminokyselinovou sekvencí L-ribózaizomerázy izolované z mikroorganizmů rodu Acinetobacter. Na základě těchto výsledků se čtyři pozitivní klony získané v tomto příkladu identifikují jako klony, které mají DNA, která kóduje L-ribózaizomerázu, tj. klony, které mají gen mikroorganizmu pro L-ribózaizomerázu.

• · · · • · · « • · ·

Výsledek sekvenování výše uvedené DNA ukazuje, že tato DNA nemusí nutně vyžadovat celou nukleotidovou sekvenci SEQ ID No: 3 ke kódování aminokyselinové sekvence, která má L-ribózaizomerázovou aktivitu, a že nukleotidová sekvence, která je v počátečním kodónu a ve stop kodónu nukleotidové sekvence defektní, specificky, SEQ ID No: 2 složená ze 744 nukleotidů, je dostačující, zatímco gen pro L-ribózaizomerázu z mikroorganizmu rodu Acinetobacter má nukleotidovou sekvenci SEQ ID No: 3, která se skládá ze 750 nukleotidů obsahujících počáteční kodón a stop kodón jako nukleotidovou sekvenci kódující oblasti.

Výsledek popsaný v tomto příkladu ukazuje, že L-ribózaizomeráza odvozená z mikroorganizmu rodu Acinetobacter má obecně aminokyselinovou sekvenci, která kóduje nukleotidovou sekvenci SEQ ID No: 2, specificky, aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No: 1. Tyto výsledky dckazují hypotézu z příkladu 1-2 zastávanou původci předloženého vynálezu.

Příklad 2

Tvorba polypeptidu, který má L-ribózaizomerázovou aktivitu pomocí techniky rekombinace DNA

Příklad 2-1

Příprava rekombinantní DNA a transformantu

Plasmid DNA se izoluje z jednoho z pozitivních klonů získaných v příkladu 1-4 pomocí obvyklých metod. Vložená DNA, která má nukleotidovou sekvenci SEQ ID No: 3 • ···· · ·· ·· ···· ♦ · * ···· · · * se uvolní z plasmidové DNA dvojitým štěpením pomocí restrikčních endonukleáz, EcoR I a Pst I. Následně se pomocí ligázy ligací s uvolněnou DNA a plasmidovým vektorem, pUC118 (ATCC 37462), který byl rozštěpen pomocí IcoR I a Pst I, získá rekombinantní DNA, nazývaná p8lR. Transformant se získá transformací E. coli JM109 (ATCC 53323) s rekombinantním plasmidem, p8IR.

Příklad 2-2

Tvorba polypeptidu, který má L-ribózaizomerázovou aktivitu, transformantem

Transformant, který má rekombinantní plasmid, p8IR, se inokuluje do 2000 ml bujónu LB obsahujícího 100 mg/ml ampicilinu a kultivuje se při třepání při teplotě 37 °C. Tato kultivace se provede za monitorování zákalu (absorbance při 600 nm, 1 mm buněk) bujónu. Ke kultuře se přidá 5-brom-4-chlor-3-indolyl-p—galaktosid k získání kcnečné koncentrace lmM, když zákal dosáhne 0,7 a v kultivaci se pokračuje dalších 5 hodin.

Buňky se zachytí z kultivačního bujónu odstřeďováním (10 000 x g) po dobu 10 minut. Po dvojitém promytí buněk pufrem glycin-hydroxid sodný (pH 9,0) se rozruší za přítomnosti oxidu hlinitého pomocí třenky s těrkou. Rozrušené buňky se suspendují v pufru glycinhydroxid sodný (pH 9,0)a buněčná drť se ze suspenze odstraní odstřeďováním (10 000 x g) po dobu 30 minut. Požadovaná aktivita se detekuje při aplikaci výsledného surového extraktu na stanovení L-ribózaizomerázové aktivity. Aktivita se vypočítá jako okolo 1,5 U/ml bujónu. Když se E. coli JM109, která má vektor plasmidový vektor

pUC118, nahradí rekombinantím plasmidem, p8IR, poté se kultivuje a rozruší podobně jako výše, nedetekuje se žádná L-ribózaizomerázová aktivita. Tento výsledek podporuje názor, že DNA, klonovaná a sekvenovaná v příkladu 1, kóduje L-ribózaizomerázu.

Příklad 3

Příprava polypeptidu, který má L-ribózaizomerázovou aktivitu

Podle způsobu popsaného v japonském patentu Kokai č. 155 480/98, přihlášeném původci tohoto vynálezu, se vyčistí polypeptid, který má L-ribózaizomerázovou aktivitu, následnou polyethylenovou frakcionací, aniontoměničovou chromatografií a gelovou filtrační chromatografií ze surového buněčného extraktu, který se získá v příkladu 2 vyčištěný polypeptid vykazuje jedinou proteinovou frekvenci v poloze odpovídající molekulové hmotnosti 28 000 daltonů pomocí obvyklé SDS-PAGE. Tento výsledek dobře souhlasí s daty, že molekulová hmotnost L-ribózaizomerázy z mikroorganizmu rodu Acinetobacter je v rozmezí od asi 25 000 do asi 35 000 daltonů, což je popsáno v japonském patentu Kokai č. 155 480/98, přihlášeném původci tohoto vynálezu.

Enzymatické vlastnosti vyčištěného polypeptidu popsaného výše se vyšetří pomocí L-ribózaizomerázové aktivity podle stanovení. Optimální teplota je okolo 30 °C za reakčních podmínek pH 9,0 po dobu 10 minut. Teplotní stability je okolo teploty 30 °C nebo nižší po 10 minutové • · · · • · · · · • · · · · • · · · · · · inkubaci při pH 9. Optimální hodnota pH je v rozmezí od asi do asi 9. pH stabilita je v rozmezí od asi 7 do asi 9 po hodinách inkubace při teplotě 4 °C. D-Xylóza a D-mannóza se převedou působením vyčištěného polypeptidů na D-xylulózu respektive D-řruktózu, když se D-xylóza a D-mannóza použijí jako substráty pro polypeptid. Tento výsledek ukazuje, že polypeptid v tomto příkladu katalyzuje izomerační reakci

D-ribózy, stejně jako D-xylózy a D-mannózy. Tyto výsledky se také dobře shodují s enzymatickými vlastnostmi Lribózaizomerázy z mikroorganizmů rodu Acinetobacter, jak je popsáno v japonském patentu Kokai č. 155 480/98, přihlášeném původci tohoto vynálezu.

Tyto výsledky dokazují, že polypeptid získaný použitím DNA podle předloženého vynálezu mohou být výhodně užitečné pro průmyslovou výrobu různých vzácných cukrů podobně jako v případě L-ribózaizomerázy, kterou původně vytvářejí přirozeně se vyskytující mikroorganizmy.

jak je z výše uvedeného zjevné, předložený vynález byl uskutečněn na základě klonování nové DNA kódující L-ribózaizomerázu, které provedli původci tohoto vynálezu. DNA podle předloženého vynálezu umožňuje dodávání užitečných enzymů pro průmyslovou výrobu vzácných cukrů, jako je L-ribóza a D-talóza, technikami rekombinace DNA při nižších nákladech a v konstantnější kvalitě než u obvyklých způsobů. Je možné, že nové enzymy lze získat screeningem chromozomů z buněk zahrnujících četné mikroorganizmy pomocí DNA podle předloženého vynálezu nebo jejích fragmentů jako hybridizačnch sond nebo PCR primerů. DNA podle předloženého vynálezu a její fragmenty tedy jsou specificky užitečné pro screening nových enzymů souvisejících se sacharidy.

· 9 9 9 « • · 9

Předložený vynález je významným vynálezem, který přispívá vývoji různých oblastí, jako jsou potraviny a farmaceutika.

Zatímco bylo popsáno, co je v současnosti považováno za výhodná ztělesnění tohoto vynálezu, rozumí se, že lze provést jeho různé modifikace, přičemž se připojenými patentovými nároky zamýšlí pokrýt veškeré takové modifikace, jak spadají do ducha a rozsahu tohoto vynálezu.

Claims (13)

1. DNA kódující L-ribózaizomerázu, která izomeruje L-ribózu na L-ribulózu a naopak.

2. DNA podle nároku 1, kde uvedená L-ribózaizomeráza zahrnuje část nebo celou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID No: 1.

3. DNA podle nároku 1 nebo 2, která zahrnuje část nebo celou nukleotidovovou sekvenci SEQ ID No: 2.

4. DNA podle nároku 1, 2 nebo 3, kterou lze získat z mikroorganizmu rodu Acinetobacter.

5. DNA, která je členem zvoleným ze skupiny sestávající z molekul DNA jako fragmentů DNA z kteréhokoli z nároků 1 až 4, jednošroubovicové molekuly DNA jako protismyslové DNA, která odpovídá smyslovému řetězci DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 a fragmenty jednošroubovicových molekul DNA.

6. Hybridizační sonda nebo PCR primer, který zahrnuje DNA podle nároku 5.

7. Rekombinantní DNA, která zahrnuje DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 4.

8. Transformant, který je zkonstruován transformací hostitelské buňky buď za použití DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 nebo rekombinantní DNA obsahující DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 4.

9. Transformant podle nároku 8, kde uvedenou hostitelskou ·· 99 · 9 · • · · · · · * » · · · · · · • · * · · • 9 9 99

9 9 999· buňkou je mikroorganizmus.

10. Způsob výroby polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky umělé exprese DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až 4 k vytvoření polypeptidu, který má aktivitu k izomeraci L-ribózy na L-ribulózu a naopak, a zachycení vytvořeného polypeptidu.

11. Způsob podle nároku 10,vyznačující se tím, že zahrnuje kroky kultivace transformatu zkonstruovaného transformací DNA podle kteréhokoli z nároků 1 až

4 a umělé umožnění exprese podle kteréhokoli z nároků 1 až 4.

12. Způsob podle nároku 10 nebo 11, vyznačuj ící se t í m, že vytvořený polypeptid se zachytí jednou nebo více technikami zvolenými ze skupiny sestávající z dialýzy, vysolování, filtrace, koncentrace, separační precipitace, gelové filtrační chromatografie, iontoměničové chromatografie, hydrofóbní chromatografie, chromatografie s reverzní fází, afinitní chromatografie, gelové elektroforézy a izoelektrické fokuzace.

13. Polypeptid, který lze získat způsobem podle kteréhokoli z nároků 10 až 12.