CZ300467B6

CZ300467B6 - Sekvence nukleotidu o velikosti 2646 bp, kódující penicilinacylázu, nové konstrukty rekombinantní nukleové kyseliny a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tuto sekvenci

Info

Publication number: CZ300467B6
Application number: CZ20070082A
Authority: CZ
Inventors: Kyslík@Pavel; Štepánek@Václav; Hollerová@Lenka; Becka@Stanislav; Williams Rajasekar@Vyasarayani; Datla@Anupama; Plhácková@Kamila; Maršálek@Jaroslav
Original assignee: Mikrobiologický ústav AV CR, v.v.i.; Fermenta Biotech Limited
Priority date: 2007-01-31
Filing date: 2007-01-31
Publication date: 2009-05-27
Also published as: CN101563459A; US8039604B2; EP2109672A1; US20100112673A1; KR20090114380A; CZ200782A3; WO2008093351A1

Abstract

Rešení spocívá v sekvenci nukleotidu o velikosti 2646 bp, kde je poradí nukleotidu identické s poradím nukleotidové sekvence kódující penicilinacylázu z Achromobacter sp. CCM 4824 (puvodne Comamonas testosteroni CCM 4824), prípadne v 5´-koncových fragmentech této sekvence o délce nejméne 150 nukleotidu a zacínající kterýmkoli nukleotidem s poradovým císlem 1 až 14 nebo v 3´-koncových fragmentech této sekvence o délce 150 nukleotidu a zacínající kterýmkoli nukleotidem s poradovým císlem 2606 až 2646. Sekvence muže být použita pro tvorbu konstruktu nukleové kyseliny, prípadne konstruktu opatreného nejméne jednou regulacní sekvencí rídící expresi genu a produkci polypeptidu s aktivitou penicilinacylázy. Sekvence muže být soucástí rekombinantního expresního vektoru, který se skládá z výše uvedeného konstruktu, promotoru, translacního start signálu, translacního a transkripcního stop signálu. Dále se rešení týká rekombinantní hostitelské bunky obsahující konstrukt nukleové kyseliny nesený na vektoru nebo integrovaný do genomu bunky a kmene E. coli BL21 obsahujícího recenou sekvenci nukleotidu kódujících penicilinacylázu a nesenou na plazmidu pKX1P1, pKLP3 nebo pKLP6.

Description

(57) Anotace:

Řešení spočívá v sekvenci nukleotidů o velikosti 2646 bp, kde je pořadí nukleotidů identické s pořadím nukleotidové sekvence kódující penicilinacylázu z Achromobacter sp. CCM 4824 (původně Comamonas testosteroni CCM 4824), případně v 5'-koncových fragmentech této sekvence o délce nejméně 150 nukleotidů a začínající kterýmkoli nukleotidem s poiádovým číslem 1 až 14 nebo v 3'-koncových fragmentech této sekvence o délce 150 nukleotidů a začínající kterýmkoli nukleotidem s pořadovým číslem 2606 až 2646. Sekvence může být použitapro tvorbu konstruktu nukieové kyseliny, případně konstruktu opatřeného nejméně jednou regulační sekvencí řídící expresi genu a produkci polypeptidú s aktivitou penicilinacylázy. Sekvence může být součástí rekombinantního expresního vektoru, který se skládá z výše

Sekvence nukleotidů o velikosti 2646 bp, kódující penicilinacylázu, nové konstrukty rekombinantní nukleové kyseliny a rekombinantní mikroorganismy nesoucí tuto sekvenci

Oblast techniky

Vynález se týká sekvence nukleotidů o velikosti 2646 bp, kódující polypeptid penicilinacylázu, konstruktů rekombinantní nukleové kyseliny, a rekombinantních mikroorganismů nesoucích tuto sekvenci.

Dosavadní stav techniky

Penicilinacylázy (E.C. 3.5,1.11, penicilinamidohydrolasa) jsou produkovány bakteriemi, aktino15 mycétami, houbami i kvasinkami. Tyto významné průmyslové enzymy jsou na základě své substrátové specifity děleny do tří skupin: pěnici]in-G-acylázy (PGA), penicilin-V-acylázy (PVA) a esterhydrolázy α-aminokyselin (AEH, dříve označované jako ampicilinacylázy). Enzymy skupiny PGA mají širokou substrátovou specifitu a katalyzují hydrolýzu amidické vazby penicilinů i cefalosporinů. Mezi bakteriální producenty PGA patří zástupci rodů: Aeromonas, Achromo20 bacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Corynebacterium, Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Kluyvera, Micrococcus, Nocardia, Próteus, Providencia, Pseudomonas, Sarcina, Xanthomonas, Xylella (Process Biochem. 24:146-154, 1989, Process Biochem. 27:131-143, 1992, Biotechnoí. Adv. 18:289-301, 2000).

Kromě produkčních kmenů pro PGA získaných mutagenezí byly připraveny i rekombinantní mikroorganismy obsahují rekombinantní plazmidy se strukturním genem kódujícím PGA z Escherichia coli (Čs. patentový spis 244 343 a 246 957), Alcaligenes sp. nebo fecalis (Current Microbiology 39: 2444-2448, 1999; EP 638 649, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3412-3418, 1997), Arthrobacter viscosus (Appl. Environ. Microbiol. 54: 2603-2607, 1988 a 55: 1351—1356,

1989; Gene 143: 79-83, 1994), Bacillus megaterium (J. Bacteriol. 93: 302-306, 1967, Appl.

Microbiol. Biotechnoí. 25: 372-378, 1987; patent US 3 145 395; Process Biochemistry 29: 263270, 1994), Kluyvera citrophila (Agric. Biol. Chem. 39. 1225-1232, 1975; Gene 49: 69-80, Biotechnoí. Letters 14: 285-290, 1992), Providencia rettgeri (Acta Biochim. Polonica 28: 275284, 1981; J. Bacteriol. 168: 431-433, 1986; DNA sequences 3: 195-200, 1992).

Většina prokaryotních producentů PGA jsou gram-negativní bakterie a enzym je v buňce lokalizován v periplazmě. Enzym je sekretován z buňky do média u kultury Bacillus megaterium.

Pěnici 1 in-G-acy lázy jsou průmyslově využívány především pro hydrolýzu fenylacetylovaných derivátů cefalosporinů a penicilinu G za účelem přípravy intermediátů 6-APK a 7-ADCK. V poslední době jsou tyto enzymy využívány i pro syntetické reakce, acylace výše zmíněných intermediátů, které vedou k případě polosyntetických antibiotik (např. patenty US 5 753 458 a US 5 801 011; WO 98/04732; WO 97/04086; Enzyme Microb. Technol. 25: 336-343, 1999; Synthesis of β—lactam antibotics: Chemistry, Biocatalysis and Process Integration, Ed.: A. Brug45 gink, Kluwer Academie Publíshers, Dordrecht/Boston/London, 2001).

Za účelem opakovaného, dlouhodobého využívání PGA při katalýze enzymové reakce je enzym stabilizován imobilizaei nebo enkapsulací za vzniku enzymového katalyzátoru. V této podobě enzym vykazuje vyšší pH stabilitu, teplotní stabilitu a delší poločas životnosti za reakčních podmínek, při nichž katalyzuje průběh reakce.

-1 CZ 300467 B6

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je sekvence nukleotidů o velikosti 2646 bp, kódující penici5 linacylázu, kde je pořadí nukleotidů nejméně z 95 % identické s pořadím nukleotidů uvedeným na obr. 5.

Význakem vynálezu jsou dále 5-koncové fragmenty sekvence nukleotidů podle předloženého vynálezu o délce nejméně 150 nukleotidů a začínající kterýmkoli nukleotidem s pořadovým ío číslem 1 až 14.

Dále jsou význakem vynálezu 3-koncové fragmenty sekvence nukleotidů podle předloženého vynálezu o délce nejméně 150 nukleotidů a začínající kteiýmkoli nukleotidem s pořadovým číslem 2606 až 2646.

Význakem vynálezu je také konstrukt nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleotidů podle předloženého vynálezu nebo 5-koncové fragmenty nebo 3-koncové fragmenty sekvence nukleotidů podle předloženého vynálezu, opatřený nejméně jednou regulační sekvencí řídící expresi genu a produkci polypeptidu s aktivitou penicilinacylázy.

Význakem vynálezu je i rekombinovaný plazmid obsahující sekvenci nukleotidů podle předloženého vynálezu nebo 5-koncové fragmenty nebo 3-koncové fragmenty sekvence podle předloženého vynálezu.

Dále je význakem vynálezu rekombínantní expresní vektor složený z konstruktu nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu, promotoru, translačního start signálu a translačního a transkripěního stop signálu.

Význakem vynálezu je také hostitelská buňka obsahující konstrukt nukleové kyseliny podle před30 loženého vynálezu.

Dále je význakem vynálezu hostitelská buňka v níž je konstrukt nukleové kyseliny nesen na rekombinantním expresním vektoru podle předloženého vynálezu.

Význakem vynálezu je také hostitelská buňka v níž je konstrukt nukleové kyseliny integrován do genomu buňky.

Význakem vynálezu jsou dále rekombinované plazmidy pKXlPl, pKLP3 a pKLP6, charakterizované vloženou sekvencí nukleotidů podle předloženého vynálezu, izolovanou z kmene Achro40 mobacter sp., a restrikční mapou dle obr. 1 a 2.

Význakem vynálezu je také kmen Escherichia coli BL21 obsahující sekvenci podle předloženého vynálezu, nesenou plazmidy pKXlPl, pKLP3 nebo pKLP6.

Podstatou vynálezu je sekvence nukleotidů o velikosti 2646 bp, kde je pořadí nukleotidů identické s poradím nukleotidů uvedeným na obr. 5., případně 5-koncové fragmenty nebo 3-koncové fragmenty této sekvence, kódující penicilinacylázu, o délce nejméně 150 bází. Uvedená sekvence může být součástí konstruktů nukleové kyseliny, rekombinantních plazmidů a vektorů. Pomocí vhodného vektoru může být uvedená sekvence vnesena do genomu bakteriálního nebo kvasinkového hostitele, kterého lze následně využít pro produkci penicilinacylázy.

Jedním zmožných provedení je kmen Escherichia coli BL2I (pKXlPl) (CCM 7394) obsahující rekombínantní plazmid pKXlPl, připravený na bázi sekvence nukleotidů nově izolovaného strukturního genu s aktivitou penicilinacylázy. Uvedený plazmid je charakterizován vložením fragmentu DNA o velikosti 2646 bp (včetně oblasti s SD sekvencí) do plazmidového vektoru

-2CZ 300467 B6 pK19 (R. D. Pridmore, Gene 56: 309-312, 1987), a restrikční mapou znázorněnou na obr. 1. Příprava tohoto rekombinantního mikroorganismu spočívala v tom, že byla izolována chromozomální DNA z buněk kmene Achromobacter sp. CCM 4824 (původně Comamonas testosteroni CCM 4824; Plháčková a spol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 507-516, 2003) a připraven rekombinantní mikroorganismus E. coli TOP10(pKLP3) nesoucí 5,1 kb fragment chromozomální DNA. Nukleotidová sekvence strukturního genu pga byla získána pomocí PCR techniky (polymerázová řetězová reakce) za použití DNA plazmidů pKLP3. Podle stanovené NT sekvence genu byly navrženy DNA primeiy (tab. 1), které byly použity ke stanovení úplné nukleotidové sekvence genu včetně regulační oblasti sSD sekvencí pomocí téže PCR-sekvenační techniky, io Na základě této kompletní nukleotidové sekvence byly navrženy primeiy umožňující PCRamplifikaci celého strukturního genu pro pěnicilinacylázu (PCR; W. Rychlík: Methods in Molecular Biology 15, 31-39, 1993). Jako templát byla použita chromozomální DNA kmene Achromobacter sp. CCM 4824. Vzniklé PCR produkty byly izolovány a ligovány do mnohakopiového plazmidů pK19 (R. D. Pridmore, Gene: 309-312, 1987) za vzniku rekombinantních plazmidů, jimž byl následně transformován hostitelský kmen Escherichia coli TOPÍ 0 (Invitrogen, USA).

Příprava kompetentních buněk a transformace hostitelských kmenů populací rekombinantních plazmidů byla provedena dle H. Hanahan, J. Mol. Biol, 166: 557-580, 1983. Z narostlých kolonií byly metodou alkalické lyže (HC. Bimboim a J. Doly: Methods in Enzymology 100, 243-254,

1983) izolovány rekombinantní plazmidy a určena velikost inzertovaného fragmentu a jeho orientace.

U vybraných rekombinantních klonů hostitele TOP 10 byla testována aktivita enzymu penicilinacylázy v jednorázových kulturách v LB médiu. Rekombinantní plazmid vyízolovaný z kmene s nejvyšší celkovou aktivitou PGA byl označen jako pKXlPl. Z tohoto plazmidového konstruktu je gen pga exprimován konstitutivně. Tímto plazmidem byl následně transformován hostitelský kmen BL21.

Výsledný rekombinantní kmen Escherichia coli nesoucí plazmid pKXlPl a produkující penici30 linacylázu byl kultivován v míchaném bioreaktoru. Optimálním postupem je kultivace kmene na minerálním médiu M9 doplněném hydrolyzátem kaseinu a glycerolem jako zdrojem uhlíku a energie. Jednorázová přítokovaná kultivace probíhá při teplotě 20 až 30 °C za regulace pH v rozmezí 5,5 až 7,5 a koncentrace rozpuštěného kyslíku v médiu 10 až 40 %.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje restrikční mapu rekombinantního plazmidů pKXlPl.

Na obr. 2 jsou znázorněné plazmidy pKAGSaw401, pKLP3 a pKLP6.

Obr. 3 znázorňuje průběh optické density kultury (OD600) a suché hmotnosti buněk (sušina) během přítokované kultivace kmene BL21 (pKXlPl) v míchaném bioreaktoru.

Na obr. 4 je znázorněn průběh celkové aktivity (TA) a specifické aktivity (SA) během přítokované kultivace kmene BL21(pKXlPl) v míchaném bioreaktoru.

Na obr. 5 je uvedena nukleotidová sekvence strukturního genu pga a přilehlých oblastí.

-3CZ 300467 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kultivace A. sp. a izolace chromozomální DNA

Půdní izolát Achromobacter sp. CCM 4824 (Škrob a spol., Enzyme Microbiol. Technol. 32:738io 744, 2003; Plháčková a spol., Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 507-516, 2003) byl kultivován v 50 ml LB media (v g/l: trypton 10, kvasnicový extrakt 5, NaCI 5; pH 7,2 až 7,5) při 37 °C na rotační třepačce (200 otáček/min) po dobu 12 až 16 h. Biomasa z 2 ml kultury byla oddělena od média centrifugám', promyta fyziologickým roztokem a uschována při -20 °C.

Chromozomální DNA byla izolována z rozmražené biomasy pomocí komerčně dostupných kolonek GENOMIC-TIP 100/G (Qiagen, Švýcarsko) a sady příslušných pufrů GENOMIC BUFFER SET(Qiagen).

Příklad 2

Technologie rekombinantní DNA

Všechny metody štěpení DNA restrikčními enzymy (Fermentas, Litva), analýza molekul DNA v 1,0% agarózovém gelu (USB, U.S.A.) v TBE pufru, ligace T4 DNA ligázou (Fermentas, Litva), byly prováděny podle standardních protokolů (J. Sambrook, 1989). Pro PCR reakce a sekvenování DNA byly primery (Tab. 1) syntetizovány komerčními firmami MWG-Biotech AG, (Německo) a Metabion (Německo). Pro PCR reakce byl použit Thermocycler PTC-200 (MJResearch, Inc. U.S.A.), přičemž všechny reakce byly prováděny pomocí Pwo SuperYield DNA

Polymerase v přítomnosti GC-RICH Solution (ROCHE, Švýcarsko). Velikost produktů techniky PCR byla zjišťována v 1% agarózovém gelu v TBE pufru, přičemž jako standard molekulových vah byla použita DNA fága λ štěpená restrikění endonukleázou Pst\. Specifické produkty PCR určené k dalšímu subklonování nebo sekvenování byly izolovány z agarózového gelu pomocí QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen, Německo) dle firemního protokolu. Unikátní DNA frag35 menty byly purifikovány pomocí High Pure PCR Product Purification Kit (ROCHE, Švýcarsko) dle firemního protokolu. Příprava kompetentních buněk a transformace hostitelských kmenů byla provedena dle J. Hanahan, Mol. Biol. 166: 557-580, 1983, přičemž kompetentní buňky transformované plazmidy nesoucími požadované PCR fragmenty byly kultivovány po dobu 16 h při 37 °C na pevné kultivační půdě Luria-Bertani (LB, v g/l: trypton 10, kvasnicový extrakt 5, NaCI

5, agar 15; pH 7,2-7,5) doplněném antibiotikem kanamycinem (Km, 50pg/ml), popřípadě v 50 ml tekutého LB média doplněného Km na orbitální třepačce Gallenkamp (200 otáček/min). Rekombinantní plazmidy byly pro následné analýzy izolovány pomocí Qiagen Plasmid Midi Kit (Qiagen, Německo) a High Pure Plasmid Isolation Kit (ROCHE, Švýcarsko) podle firemního protokolu. Stanovení všech NT sekvencí DNA byla prováděna v Mikrobiologickém ústavu

AVČR automaticky na sekvenátoru 3100 DNA Sequencer (Perkin-Elmer, IJ.S.A.). Získané sekvence byly vyhodnoceny pomocí programu Lasergene (DNASTAR Inc., U.S.A.). Homologie NT sekvencí byla ověřena pomocí programu BLAST (National Center for Biotechnology Information, U.S.A.; S. F. Altschul a spol: Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997).

-4CZ 300467 B6

Tab. 1 DNA primery a jejich lokalizace vzhledem k pga genu

Lokalizace

s CM O cn CM

cn O Ό CM CM VO

1495 ... 1475 |

I 1936... 1917 |

2758 ... 2738 |

157...136 |

s o un OO O

27...46 1

Γ 543...562 |

1574...1596 |

1 cn cn 1

-31...-4 1

2632...2605 |

Nukleotidová sekvence

! CGG CAC GCC CAG GAA GTT

CGC CAT GCC GGT CCT TCA AC

TGT GCG CGT AGC C AA TGT TGC

GTT GGC GCT CGC TGG TCA TC

CAC CGG ACC ACG CTG GTG ATC

CAT CGC GCC GGA TCG TGA CCT T

CAG TTC GGC TGG TGG AAT CC

CCT GTT GGC GGC CAG TTC GT

| CAT GGC CAA CCG CTT TTC GG Π

GCC TGC TGC CGT TCT CTA CCA AT

| GGC GCG GAC CCA TTC GAT AC |

CGC GGA CCC ΑΤΓ CTA GAC GGA GAC AGA T

GTG TAC TGC AGC CTT GCC AGC CAC CAG G

Velikost (NTs)

OO

o CM

CM

o CM

CM

CM CM

o CM

O CM

o CM

m CM

8

00 CM

OO CM

Specifický primer

£ > a.

3 >< o §

cn U > < i

3 o < > a

3 >- §

OO >< Q < B

3 >- o < 0-. O

IUPACYL2

m CJ < 0-1 ÍD

υη £ s

CJ §

Tj > Oh ÍD

š < B

-5CZ 300467 B6

Příklad 3

Stanovení nukleotidové sekvence pga genu a příprava expresního systému

Chromozomální DNA kmene Achromobacter sp. CCM 4824 byla parciálně štěpena enzymem Sflw3AI. Tyto DNA-fragmenty byly ligovány s /fawHI-linearizovanou plazmidovou DNA vektoru pK19 (RD. Pridmore: Gene 56, 309-312, 1987). Vzniklými konstrukty byl následně transformován hostitelský kmen E, coli TOP 10. Plazmid pKAG5a«401 (obr. 2) izolovaný z rekombiio nantního kmene E. coli vykazujícího penici 1 inacyfázový fenotyp (PGA⁺) byl podroben restrikci pomocí Pstl. Největší, cca 5,1 kb Pstl-fragment, byl následně subklonován do Ps/I-linearizováného vektoru pK19 za vzniku 2 typů konstruktů pKLP3 a pKLP6 (obr. 2) s opačně orientovaným

Psfi-inzertem, Rekombinantní kmeny E. coli TOP10(pKLP3) i E. coli TOPlO(pKLPó) byly fenotypu PGA⁺.

Izolované plazmidy pKLP3 a pKLP6 byly použity jako templát pro získání celkové nukleotidové sekvence pga genu pomocí jak univerzálních M13/pUC sekvenačních primerů, tak následně odvozených /?gúf-striktně specifických primerů (výčet viz tab. 1). Nukleotidová sekvence strukturního genu pga čítající 2592 nukleotidů (včetně terminačního tripletu TA A) vykazuje v oblasti vymezené nukleotidy 63 až 2592 92% identitu s pga genem příbuzného mikroorganismu Achromobacter xylosoxidans ssp. xylosoxidans (GenBank AF490005).

Na základě takto získané celkové nukleotidové sekvence pga genu i s jeho přilehlými oblastmi byly navrženy primery umožňující PCR amplifikací strukturního genu pga s chromozomální

DNA kmene Achromobacter sp. CCM 4824 jako templátem. Navržená dvojice primerů UPACYLY&al + REVACYLAs/1 z oblastí přiléhajících ke strukturnímu genu pga s vloženými restrikčními místy Xbal, resp. Pstl (tab. 1) byla použita v PCR reakci obsahující následující kroky: 1)5 min při 94 °C; 2) 30 cyklů s denaturací při 94 °C po dobu 45 s, vazbou primerů při 60 °C po dobu 45 s a polymerací při 72 °C po dobu 3 min; 3) dokončení polymeraee při 72 °C po dobu

10 min. Za těchto podmínek byl připraven specifický PCR produkt o velikosti 2663 bp nesoucí celý strukturní gen pga včetně jemu předcházející části regulační oblasti se Shine-Dalgamo sekvencí. Tento /řga-specifický PCR produkt byl podroben štěpení restrikční endonukleázou Xbal (cílová sekvence v příměru UPACYLATwl) a následně ligován do vektoru pK19 štěpeného dvěma polylinkerovými enzymy ΛΜ a Smál. Získaný rekombinantní konstrukt byl označen jako plazmid pKXlPl (obr. 1). Analýzou sekvence DNA tohoto plazmidu bylo prokázáno, že při inzerci PCR-produktu nedošlo k žádným inserčně delečním mutacím, avšak byla zaznamenána záměnová mutace C —> T u 99. nukleotidu strukturního genu pga oproti dříve postulované nukleotidové sekvenci. Tato mutace je však tichá, neboť nemění typ aminokyseliny kódované tripletem. Izolovanými rekombinantními plazmidy pKLP6 a pKXlPl byl transformován proto40 trofní hostitelský kmen E. coli BL21 (Invitrogen, USA) a připraven prokaryotní expresní systém BL21(pKXlPl) pro PGA.

Příklad 4

Exprese pga v Escherichia coli

Příprava inokula pro kultivace kmenů Escherichia coli BL21 (pKXlPl)

Z glycerolové konzervy (narostlá kultura smíchaná s glycerolem podle J. Sambrook, 1989) uchovávané v -70 °C bylo zaočkováno 50 ml média LB doplněného kanamycinem (Km, 50gg/ml). Inokulum bylo kultivováno 16 h při 28 °C v orbitálním inkubátoru Gallenkamp (200 otáček/min).

-6CZ 300467 B6

Kultivace v bioreaktoru

Kmen BL21 (pKXlPl) byl kultivován za přesně definovaných podmínek v médiu M9 (tab. 2) 5 doplněném glyeerolem (5-25 g/1) a kasein hydrolyzátem (5-25 g/1) jako zdroji uhlíku a energie v míchaném bioreaktoru Biostat MD (B. Braun Blotech Intl., Melsungen, Německo): pracovní objem 8,2 1, vzdušnění 8 až 9 1 vzduchu/min, počáteční frekvence míchání 200 až 300 otáček/min při teplotě v rozmezí 20 až 28 °C. pH média bylo udržováno v rozmezí 7,5 až 5,5 a koncentrace rozpuštěného kyslíku (pO₂) byla automaticky udržována změnou frekvence míchání od 200 do io 840 otáček/min v rozmezí 5 až 30 % hodnoty maximálního nasycení média kyslíkem. Kultivace probíhala po dobu 20 až 25 hodin jako přítokovaná kultivace (obr. 3 a 4). V závěru kultivací byly stanoveny následující parametry: koncentrace biomasy (suchá hmotnost buněk, edw), celková aktivita (TA) a specifická aktivita (SA) penicilinacylázy.

Stanovené parametry:

koncentrace biomasy 28 g cdw/1 kultivačního média celková aktivita 18 000 U/l kultivačního média specifická aktivita 670 U/g cdw.

Enzymové stanovení

Pro stanovení aktivity enzymu PGA byly z produkční kultivace odebírány vzorky kultury o objemu 1 až 2 ml. Biomasa byla oddělena centrifugací a po promytí 1 až 2 ml destilované vody a opě25 tovné centrifugací byla uchovávána v -20 °C. Rozmražená biomasa byla resuspendována v 0,005 M fosfátovém pufru (pH 8,0).

Aktivita PGA byla stanovena titračně při 37 °C s penicilinem G jako substrátem.

Tab. 2 Komponenty kultivačního média M9

Substance	vzorec	koncentrace (g/L)
Síran amonný	(NH₄)₂SO4	4,0
Dihydrofosforečnan draselný	KH₂PO₄	13,6
Chlorid sodný	NaCI	10,0
Hydroxid sodný	NaOH	3,0
Síran hořečnatý	MgSO₄.7 H₂O	2,0
Chlorid vápenatý	CaCI₂.6 H₂O	0,05
Síran železnatý	FeSO₄.7 H₂O	0,01

Průmyslová využitelnost

Rekombinantní kmeny mikroorganismů obsahující sekvenci nukleotidů podle vynálezu lze využít k produkci penicilinacylázy pro různé aplikace v chemickém a farmaceutickém průmyslu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Sekvence nukleotidů o velikosti 2646 bp, kódující pěnici linacylázu, kde je pořadí nukleotidů nejméně z 95 % identické s pořadím nukleotidů uvedeným na obr. 5.
2. 5'-koncové fragmenty sekvence nukleotidů podle nároku 1 o délce nejméně 150 nukleotidů a začínající kteiýmkoli nukleotidem s pořadovým číslem 1 až 14.
3. 3'-koncové fragmenty sekvence nukleotidů podle nároku 1 o délce nejméně 150 nukleotidů a začínající kterýmkoli nukleotidem s pořadovým číslem 2606 až 2646.
4. Konstrukt nukleové kyseliny obsahující sekvenci nukleotidů podle nároku 1 nebo fragment 15 sekvence nukleotidů podle nároku 2 nebo 3, opatřený nejméně jednou regulační sekvencí řídící expresi genu a produkci polypeptidu s aktivitou penicilinacylázy.
5. Rekombinovaný plazmid obsahující sekvenci nukleotidů podle nároku 1 nebo fragment sekvence podle nároku 2 nebo 3.
6. Rekombinovaný expresní vektor složený z konstruktu nukleové kyseliny podle nároku 4, promotoru, translačního start signálu a translačního a transkripčního stop signálu.
7. Hostitelská buňka obsahující konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 4.
8. Hostitelská buňka podle nároku 7, v níž je konstrukt nukleové kyseliny nesen na rekombinantním expresním vektoru podle nároku 6.
9. Hostitelská buňka podle nároku 7, v níž je konstrukt nukleové kyseliny integrován do geno30 mu buňky.
10. Rekombinované plazmidy pKXlPl, pKLP3 a pKLP6, charakterizované vloženou sekvencí nukleotidů podle nároku 1, izolovanou z kmene Achromobacter sp., a restrikční mapou dle obr. 1 a 2.
11. Kmen Escherichia coli BL21 obsahující sekvenci podle nároku 1 nesenou plazmidy pKXlPl, pKLP3 nebo pKLP6 podle nároku 10.