CZ291154B6 - Kmen mikroorganismu Comamonas testosteroni CCM 4824 - Google Patents
Kmen mikroorganismu Comamonas testosteroni CCM 4824 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ291154B6 CZ291154B6 CZ20012823A CZ20012823A CZ291154B6 CZ 291154 B6 CZ291154 B6 CZ 291154B6 CZ 20012823 A CZ20012823 A CZ 20012823A CZ 20012823 A CZ20012823 A CZ 20012823A CZ 291154 B6 CZ291154 B6 CZ 291154B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- penicillin
- strain
- hydrolysis
- ccm
- ampicillin
- Prior art date
Links
- 241000589518 Comamonas testosteroni Species 0.000 title claims abstract description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 7
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 21
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 13
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 claims abstract description 6
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims abstract description 3
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 claims description 5
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 7beta-aminodeacetoxycephalosporanic acid Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@@H]12 NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 0.000 claims 1
- CSGFFYNMTALICU-ZWNOBZJWSA-N adipyl-7-aminodesacetoxycephalosporanic acid Natural products CC1=C(N2[C@H](SC1)[C@H](NC(=O)CCCCC(O)=O)C2=O)C(O)=O CSGFFYNMTALICU-ZWNOBZJWSA-N 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 22
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 7
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 abstract description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 abstract 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 27
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 27
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 19
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 16
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 10
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 7
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 6
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 5
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 description 5
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- LSBDFXRDZJMBSC-UHFFFAOYSA-N 2-phenylacetamide Chemical compound NC(=O)CC1=CC=CC=C1 LSBDFXRDZJMBSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 4
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000574352 Mus musculus Protein phosphatase 1 regulatory subunit 17 Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- -1 2-nitro-5-phenyl-acetaminobenzoic acid Chemical compound 0.000 description 2
- AOPRXJXHLWYPQR-UHFFFAOYSA-N 2-phenoxyacetamide Chemical compound NC(=O)COC1=CC=CC=C1 AOPRXJXHLWYPQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 3-phenylpropionic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 XMIIGOLPHOKFCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N Acetoin Chemical compound CC(O)C(C)=O ROWKJAVDOGWPAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 241000185992 Rhizobium viscosum Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 108010016886 ampicillin acylase Proteins 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N phenoxyacetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC=CC=C1 LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- IGKMJWPWSFSLDV-UHFFFAOYSA-N 1,4-dimethylcyclohexa-2,4-diene-1-carbaldehyde Chemical compound CC1=CCC(C)(C=O)C=C1 IGKMJWPWSFSLDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSEWAUGPAQPMDC-UHFFFAOYSA-N 2-(4-aminophenyl)acetic acid Chemical compound NC1=CC=C(CC(O)=O)C=C1 CSEWAUGPAQPMDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 2-phenylacetic acid Chemical compound O[14C](=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 0.000 description 1
- VYIBCOSBNVFEIW-UHFFFAOYSA-N 3-phenylpropanamide Chemical compound NC(=O)CCC1=CC=CC=C1 VYIBCOSBNVFEIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-nitrobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(O)=O)=C1 KZZWQCKYLNIOBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 description 1
- 241000588810 Alcaligenes sp. Species 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 108010082340 Arginine deiminase Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- CTJZBBGQPVVKBP-SSPAHAAFSA-N C1=CC=C2NC=CC2=C1.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O CTJZBBGQPVVKBP-SSPAHAAFSA-N 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N Cephalosporin C Natural products S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000588752 Kluyvera Species 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L Malonate Chemical compound [O-]C(=O)CC([O-])=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N acetic acid phenyl ester Natural products CC(=O)OC1=CC=CC=C1 IPBVNPXQWQGGJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M cephalosporin C(1-) Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000020176 deacylation Effects 0.000 description 1
- 238000005947 deacylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- NNQIJOYQWYKBOW-UHFFFAOYSA-N desacetoxycephalosphorin G Natural products S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)C(NC(=O)CCCC(N)C(O)=O)C12 NNQIJOYQWYKBOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N methyl red Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1\N=N\C1=CC=CC=C1C(O)=O CEQFOVLGLXCDCX-WUKNDPDISA-N 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229940049953 phenylacetate Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Kmen mikroorganismu Comamonas testosteroni CCM 4824 produkuj c vnitrobun nou penicilinacylasu, stabiln v rozsahu pH od 3,0 do 11,0 a teplot do 60 .degree.C, vyu iteln² zejm na pro p° pravu 6-aminopenicilanov a 7-aminodeacetoxycefalosporanov kyseliny z penicilinu a n kter²ch deriv t cefalosporinu, pro enzymovou reverzn synt zu semisyntetick²ch antibiotik, hydrol²zu a synt zu amid , hydrol²zu ester a odblokov n N-koncov aminokyseliny p°i synt ze peptid , nebo p°i d len racemick²ch sm s aminokyselin.\
Description
Oblast techniky
Vynález se tyká kmene mikroorganismu Comamonas testosteroni CCM 4824 produkujícího vnitrobuněčnou penicilinacylasu, použitelného pro biotransformace β-laktamových antibiotik, zejména pro hydrolýzu penicilinů a některých cefalosporinových derivátů a přípravu 6aminopenicilanové kyseliny (6-APK) event.7-aminodesacetoxycefalosporanové kyseliny (7ADCK), a nebo pro reverzní reakci tj. přípravu semisyntetických penicilinů a cefalosporinů z těchto kyselin a příslušného acylačního agens, popřípadě hydrolýzu různých fenylacetylovaných sloučenin.
Dosavadní stav techniky
Je známo mnoho mikroorganismů jako zdroj enzymu penicilinacylasy (E.C. 3.5.1.11, penicilín amidohydrolasa). Podle preferenční hydrolýzy různých penicilinů byly klasifikovány jako penicilín acylasy (PGA), penicilín V acylasy (PVA) a ampicilinacyiasy. Tyto průmyslově důležité enzymy jsou produkovány několika mikroorganismy včetně bakterií, aktinomycet, hub a kvasinek. Penicilín G acylasa byla popsána u řady zejména bakteriálních kmenů např. Aeromonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Achromobacter, Bacillus, Corynebacterium, Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Kluyvera, Mikrococcus, Nocardia, Próteus, Pseudomonas, Sarcina, Xanthomonas, (Economic Microbiology vo 5 ed. A. H. Rose 1980, 475-522; Proč. Biochem. 24, 146-154, 1989; Proč. Biochem. 27, 1431-143,1992; Biotechnol. Advances 18.289-301, 2000).
Nejvíce průmyslově a komerčně je využívána PGA z Escherichia coli odvozená zejména z ATCC 9637 a ATCC 11105. Například kmeny Escherichia coli CCM 2843 a CCM 3759, které byly získány selekčními postupy se vyznačují zvýšenou aktivitou PGA nebo zvýšenou odolností proti fágové infekci (čs. patentový spis č. 244 343 a 246 957). Jsou popsány též kmeny obsahující rekombinantní plazmidy nesoucí gen z uvedených kmenů kódující PGA (čs. patentový spis č. 278 847 a 278 516). Jako producenti PGA jsou však využívány další kmeny jejichž pga heny byly sekvenovány a klonovány. Jsou to Alcaligenes sp. nebo A. faecalis (Curent Microbiology 39, 2444-2448, 1999; EP 638649; Appl. Environ. Microbiol. 63, 3412-3418, 1997), Arthrobacter viscosus (Appl. Environ. Microbiol. 54, 2603-2607, 1988 a 55, 1351-1356; Gene 143, 79-83, 1994), Bacillus megatherium (J. Bacteriol. 93, 302-306, 1967, Appl. Microbiol. Biotechnol. 25, 372-378, 1987; patent US 3 145 395; Process Biochemistry 29, 263-270, 1994), Kluyvera citrophila (Agrig. Biol. Chem. 39, 1225-1232, 1975; Gene 49, 69-80; Biotechnol. Letters 14, 285-290, 1992), Próteus event. Providentia rettgeri (Acta Biochim. Polonica 28, 275-284, 1981; J. Bacteriol. 168, 431-433, 1986; DNA seguescens 3, 195-200, 1992. Jsou popsány kmeny Pseudomonas melanogenum produkujících ampicilinacylasu, enzym a úzkou substrátovou specifitou (Agric. Biol. Chem. 47, 2503-2509,1983; Biochim. Biophys. Acta 1040, 12-18, 1990). Syntéza penicilinacylas je u uvedených kmenů je většinou indukována fenyloctovou kyselinou, která je ve vyšší koncentraci toxická. Její koncentrace zaručující maximální indukci bez výrazné inhibice růstu se obvykle pohybuje v rozmezí 0,1 % {Escherichia coli) až 0,25 % {Arthrobacter viscosus). Většina těchto enzymů je lokalizována v periplazmatickém prostoru, takže enzymová aktivita je detekovatelná přímo s intaktními buňkami, (např. Escherichia coli), nebo jsou tyto enzymy extracelulámí a jsou uvolňovány do média (např. Bacillus megatherium).
Uvedení producenti těchto enzymů jsou většinou používány pro hydrolýzu penicilinů nebo fenylacetylovaných derivátů cefalosporinů a přípravu 6-APK nebo 7-ADCK. Značné úsilí bylo věnováno však též zpětné reverzní reakci tj. acylaci těchto kyselin a syntézu semisyntetických penicilinů a cefalosporinů. Je vyvíjena řada postupů pro tyto enzymové syntézy za použití výše
-1 CZ 291154 B6 uvedených mikroorganismů WO 98/04732, patent US 5 753 458; WO 92/01061, WO 93/12250, WO 96/02663 a WO 97/04086; Enzym. Microb. Technol. 25, 336-343, 1999).
S cílem stabilizace enzymů pro mnohonásobně opakované použití se nejčastěji používají imobilizované formy enzymů. Vzhledem k tomu, že při hydrolýze amidické vazby dochází k uvolňování kyselin, klesá zejména uvnitř částic imobilizovaných biokatalyzátorů pH. Z tohoto důvodu jsou výhodnější enzymy, které jsou stabilnější v kyselém prostředí. Tato zvýšená pH stabilita je rovněž výhodná při využití těchto acylas pro reverzní acylační reakce při enzymové přípravě semisyntetických β-laktamových antibiotik, které probíhají většinou v kyselé oblasti pH (5 až 6). Výhodná je rovněž vyšší teplotní stabilita enzymu a možnosti jeho využití při vyšších reakčních teplotách a tím zkrácení reakční doby.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je nový kmen mikroorganismu Comamonas testosteroni CCM 4824 produkující vnitrobuněčnou penicilinacylasu, stabilní ve velkém rozsahu pH od 3,0 do 11,0 a teplotě do 60 °C, využitelný zejména pro přípravu 6-aminopenicilanové a aminodeacetoxycefalosporanové kyseliny (6-APK a 7-ADCK) z penicilinu a některých derivátů a syntézu amidů, hydrolýzu esterů a odblokování N-koncové aminokyseliny při syntéze peptidů, nebo při dělení racemických směsí aminokyselin.
Kmen byl vybrán na základě rozsáhlého screeningu sbírkových a z přírody izolovaných kmenů nejrůznějších rodů ze schopnosti hydrolyzovat ampicilin na 6-aminopenicilanovou kyselinu a fenylglycin. Byl získán izolací zornice, výběrem kmene citlivého k 6-aminopenicilanové kyselině a deacylující ampicilin, mutagenezí a výběrem monokoloniového izolátu bez aktivity βlaktamasy a schopného deacylace za vyšší teploty.
Nový kmen vykazuje též výhodné vlastnosti spočívající se zvýšené schopnosti růstu na živných médiích obsahujících fenyloctovou kyselinu jako induktor aktivity penicilanacylasy či ampicilinacylasy. Fenyloctová kyselina (FOK) je dobře utilizovatelná, nejvyšší výhodou koncentrací zajišťující dobrou indukci enzymu i buněčný růst je až 0,4 %. Některé další příbuzné kyseliny mohou mít v menší míře indukční vlastnosti. Kromě penicilinu G deacyluje kmen vyšší rychlostí ampicilin, moxycilin. Kromě β-laktamových antibiotik hydrolyzuje i amidy (feny lacetamid, fenoxyacetamid) a různé fenylacetylované deriváty aromatických sloučenin jako je 2-nitro-5fenyl-acetaminobenzoová kyselina (NIPAB). Vzhledem k pozorovaným rozdílům v relativních rychlostech hydrolýzy ampicilinu a penicilinu u různých surových preparátů enzymu nebo fází kultur kmene není vyloučena přítomnost eventuelně dvou acylas s odlišnou substrátovou specifítou.
Předmětný bakteriální kmen systematicky nepatří mezi výše uvedené známé producenty těchto enzymů. Tato nová penicilinacylasa, na rozdíl od ostatních penicilinacylas, je zřejmě z velké části lokalizována intracelulámě, neboť po dezintegraci značně stoupá tato enzymová aktivita. Výhodnou vlastností je neschopnost kmene syntetizovat enzym β-laktamasu, který katalyzuje nežádoucí degradaci β-laktamového kruhu.
Nový kmen, který je předmětem tohoto vynálezu byl podle morfologických, růstových a biochemických vlastností v souhlase s taxonomickými kritériemi zařazen jako Comamonas testosteroni a je uložen v České sbírce mikroorganismů (Czech Collection of Microorganisms) Masarykovy University v Brně, Tvrdého 14, po označením CCM 4824. Vlastnosti kmene jsou uvedeny v následujícím přehledu v tabulce 1.
-2CZ 291154 B6
Tabulka 1 - Charakteristika kmene Comamonas testosteroni CCM 4824.
| A. Morfologie (mikroskopie) | |
| Velikost, tvar buněk: | kokotyčky, tyčky, jednotlivě, v nepravidelných shlucích |
| Pohyblivost: | bičíky > 1 |
| Gram-barvení: | negativní |
| B. Morfologie kolonií na masopeptonovém: agaru | kulaté, hladké, lesklé, mírně vypouklé, okraj souvislý, 1-4 mm v průměru |
| C. Růstové podmínky: | |
| Teplota: | roste dobře při 37-42 °C |
| pH: | 6,5-8,5 |
| Vztah ke kyslíku: | striktně aerobní |
| Růst v přítomnosti 6,5 % NaCl | negativní |
| D. Fyziologické charakteristiky: | |
| Ox-ferm test: | alkalizace (glukóza) |
| Indol: | negativní |
| Acetylmetylkarbinol: | negativní |
| Metyl-red test: | negativní |
| Hydrolýza škrobu: | negativní |
| Hydrolýza tyrosinu: | pozitivní |
| Hydrolýza o-nitrofenyl-3-D-galaktosidu: | negativní |
| Hydrolýza Tween 80: | negativní |
| Hydrolýza eskulinu: | negativní |
| Hydrolýza lecithinu a DNA: | negativní |
| Želatina: | neztekucuje |
| Redukce nitrátů: | pozitivní |
| Redukce nitritů: | negativní 1 |
| Produkce sirovodíku: | negativní |
| Produkce fluoresceinu: | negativní |
| Katalasa: | pozitivní |
| Ureasa: | negativní |
| Lysin dekarboxylasa | negativní |
| Omitin dekarboxylasa | negativní |
| Arginin dihydrolasa: | negativní |
| Oxidasa: | pozitivní |
| Hemolýza: | negativní |
| Utilizace C-zdrojů: pozitivní | citrát, malonát, benzoát, fenylacetát, acetamid |
| Fermentace cukrů: | glukóza, mannitol, fruktóza, xylóza, maltóza bez kyselin a plynů |
| β-laktamasa: | negativní |
| E. Zdroj: | izolováno z omice |
| F. Vlastnosti kmene ve vztahu k penicilinacylase | |
| Lokalizace enzymu: | intracelulámí |
| Optimum pH hydrolytické aktivity: | 7,0-8,0 |
| Indukce syntézy enzymu: | kyselina fenyloctová (+++), |3-fenylpropionová (+), 4aminofenyloctová (+), fenoxyoctová (+) |
| Substrátová specifita enzymu: (relativní rychlost hydrolýzy v %, bezbuněčný extrakt)) | ampicilin (100), penicilín G (63), amoxycilin (136), deacetoxycefalosporin G (69), cefalexin (100), penicilín V (16), cefalosporin V (5), cefalosporin C (0), fenylacetamid (3150), fenoxyacetamid (3750), βfenylpropionamid (470), NIPAB (100) |
-3CZ 291154 B6
Kvantitativní stanovení acylasy bylo prováděno až po dezintegraci buněk sonikátorem nebo mechanickým štěrbinovým dezintegrátorem. Množství acylasy bylo určováno měření počáteční rychlosti hydrolýzy ampicilinu, penicilinu G nebo dalších substrátů v prostředí 0,1 M fosfátovém 5 pufru pH 7,5 a teplotě 37 °C v oblasti kinetiky nultého řádu. Produkty reakce u β-laktamových antibiotik byly stanoveny spektrofotometricky za použití p-dimetylbenzaldehydu (Balasingham a sp., Biochem. Biophys. Acta 276, 250-256, 1972). Hydrolýza chromogeního substrátu NIPAB byla sledována spektrofotometrickým měřením (při 380 nm) žlutého produktu hydrolýzy tj. 2nitro-5-aminobenzoové kyseliny. Detekce β-laktamasy byla prováděna modifikací jodometrické 10 metody dle Svkese (Lab. Methods Antimicrob. Chemother. 64-69, eds. Reeves D. S. a kol., 1978) na plotnách po 15 minutovém působení 1% roztoku Ksoli penicilinu G a poté detekcí jodovým reagens. Hydrolýza amidů byla sledována stanovením uvolněných amonných iontů Bertholetovou metodou v modifikaci dle Weathembuma (Analyt. Chem. 39,971-974, 1967).
Jedna jednotka (U) enzymové účinnosti odpovídá tvorbě jednoho mikromolu (1 pmol) 6-APK ev 7-ADCK za minutu za výše uvedených podmínek reakce. Specifická aktivita je definována jako U.g1 suché hmoty buněk U.g1 bílkovin.
Z vlastností deacylační aktivity, zejména specifity při kyselém pH a vyšších teplotách, vyplývá 20 reálný předpoklad využití kmene CCM 4824, který je předmětem vynálezu, nejen pro hydrolýzu, ale i reverzní reakci tj. acylaci a přípravu semisyntetických antibiotik.
V následujících příkladech je detailně popsán způsob získání nového kmene, produkce a vlastnosti nové deacylační enzymové aktivity, aniž by se jimi omezoval.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Kmen Comamonas testosteroni CCM 4824 byl získán z omice tímto způsobem:
g omice bylo suspendováno ve fyziologickém roztoku, filtrát byl příslušně ředěn a vyset na 35 masopeptonový agar následujícího složení (v hmotn.): Nutrient Broth (Difco) 0,8 %, kvasničný extrakt (Oxoid) 1 %, Bacto casiton (Difco) 0,5 %, NaCl 0,8 %, agar (Oxoid) 1,5 %; pH 7,2, sterilizace při 120 °C 20 min. Po nárůstu při laboratorní teplotě byly narostlé morfologicky odlišné kolonie přeneseny na čerstvý masopeptonový agar a na stejnou půdu obsahující penicilín G (K sůl) nebo 6-APA v koncentraci 100 gg.mf1 půdy. Vyrostlé kolonie byly dále opět 40 přeneseny na masopeptonový agar a po nárůstu za laboratorní teploty byly kmeny testovány na deacylační aktivitu následujícím způsobem. Důlky mikrotitračních destiček byly naplněny 50μ1 0,5% roztokem ampicilinu v 0,1 M fosfátovém pufru (pH 7,5) a biomasa izolátů byla přenesena sterilními párátky a suspendována do roztoku ampicilinu v důlkách ve dvou paralelních destičkách. Jedna paralela destiček byla inkubována přes noc při teplotě 30 °C, druhá 4 hodiny při 45 teplotě 37 °C. Po této době bylo do důlků přidáno 200 μΐ detekční směsi obsahující pdimetylaminobenzaldehyd. Po 15 minutách bylo pozorováno žluté vybarvení. Stejným způsobem byly testovány různé sbírkové bakteriální kmeny. Vybrané suspektní izoláty byly testovány submerzní jednorázovou kultivací následujícím způsobem. 500 ml varné baňky byly naplněny 100 ml tekuté živné půdy obsahující 3% kvasničný extrakt (Oxoid, pH7,2), po sterilizaci 50 očkovány suspektními kmeny a poté inkubovány na rotačním třepacím stroji o frekvenci
240 otáček za minutu při teplotě 28 až 30 °C po dobu 24 hodin. 2 ml těchto kultur první vegetativní generace bylo použito pro očkování dvou paralelních baněk se 100 ml půdy stejného složení. Druhá vegetativní generace byla kultivována ze stejných podmínek 24 nebo 48 hodin. Poté byly kultury separovány odstředěním (14 000 G, 10 minut), supematant slit, buněčný
-4CZ 291154 B6 sediment promyt stejným objemem 0,1 M fosfátového pufru o pH 7,5 a buňky suspendovány do 4krát menšího objemu stejného pufru. Připravené suspenze byly testovány na specifickou aktivitu acylasy se substrátem ampicilinem za reakčních podmínek uvedených v popisu předmětného vynálezu. Ze série zkoumaných kmenů byl vybrán přírodní izolát, citlivý k 6-APK, který vykazoval za 24 hodin kultivace aktivitu celých buněk na ampicilin 2,5 U/mg suché hmoty buněk.
Byla připravena první a druhá vegetativní generace tohoto vybraného izolátu způsobem, jak je uvedeno výše s tím rozdílem, že kultura druhé generace byla ve druhé třetině exponenciální fáze růstu asepticky odstředěna a supematant slit. Získané separované buňky byly promyty a suspendovány do stejného objemu výše uvedeného pufru. Připravená suspenze buněk byla poté přidána k roztoku N-metyl-Ň'-nitro-N-nitrooguanidinu ve stejném pufru tak, aby výsledná směs obsahovala cca 107 až 108 buněk . ml1 a 150 μ uvedeného mutagenu . ml”1. Směs byla míchána 60 minut při laboratorní teplotě a poté byla vyseta na Petriho misky obsahující pevnou živnou půdu - masopeptonový agar. Po třídenní inkubaci při 28 °C byly vyrotlé kolonie přeneseny sametovými razidly na pevnou půdu následujícího složení (v % hmotn.): Bacto casiton (Difco) 1 %, kvasničný extrakt (Difco) 0,5 %, rozpustný škrob (Lachema) 1 %, agar (Difco) 1,5%. pH7,2. Detekce β-laktamasy monokoloniových izolátů byla prováděna metodou uvedenou v popisu předmětného vynálezu. Kolonie netvořící světlou zónu na modrém pozadí (βlaktamasa negativní) byly izolovány z původní matrice na masopeptonový agar a po nárůstu (2 až 3 dny při 28 °C) byly testovány na deacylační aktivitu k ampicilinu v mikrotitračních destičkách jak je popsáno výše v tomto příkladu s tím rozdílem, že jedna paralela destiček byla inkubována 1 hodinu při 37 °C a druhá 1 hodinu při 50 °C. Z testovaných monocykloniových izolátů byl vybrán kmen s intenzivní reakcí při 50 °C. Tento získaný kmen Comamonas testosteroni CCM 4824 byl hodnocen submerzní jednorázovou kultivací, způsobem a s použitím půdy jak je uvedeno výše. Po 24 hodinové kultivaci vykazoval aktivitu 3 U.g”1 suché hmoty buněk.
Příklad 2
500 ml varné baňky byly naplněny 50 ml živné půdy následujícího složení (v % hmotn.): kvasničný extrakt (Oxoid) 1 %, dihydrofosforečnan draselný 0,1 %, chlorid sodný 0,2 %, chlorid hořečnatý 0,02 % (sterilizace zvlášt), fenyloctová kyselina 0,2 % (před přidáním neutralizována na sodnou sůl); pH půdy 7,2, sterilizace při 120 °C. Po zaočkováním kmenem Comamonas testosteroni CCM 4824 získaným v příkladu 1 a narostlém na pevné půdě s masopeptonovým agarem (2-3 dny při 28 °C), byly baňky inkubovány 24 hodin na rotačním třepacím stroji o frekvenci 240 otáček za minutu při 28 °C. Poté byl 1 ml narostlé kultury první generace použit pro očkování 50 ml stejné půdy a baňky byly inkubovány stejným způsobem. Specifická aktivita buněk byla zjišťována stejným způsobem jako v příkladu 1. Za použití substrátu ampicilinu a nativních buněk byla zjištěna aktivita 84U.1”1 živné půdy při nárůstu 3,3 g suché hmoty buněk . Γ1 tj. specifická aktivita 25 U.g1 suché hmoty buněk. Se substrátem penicilinem G bylo dosaženo aktivity 26 U.g1 s.hm.b. Ve stejné půdě bez fenyloctové kyseliny byl zjištěn nárůst buněk 1,8 g s.hmJ”1 živné půdy a specifická aktivita 4 Ug1 s.hm.b. (substrát ampicilin).
Příklad 3
Suspenze buněk kmene CCM 4824 získaná stejným způsobem kultivace, promývání a koncentrování jako v příkladu 1 a 2 byla dvakrát ředěna stejným pufrem a poté použita pro dezintegraci buněk ultrazvukem za použití ultrasonikátoru Microson XL 2000. Vzorky byly ponořeny do ledové lázně a sonikovány (100 W, frekvence 5 kHZ) čtyřikrát po 1 minutě s přestávkami půl minuty. Dezintegrovaná směs byla použita pro stanovení aktivity acylasy. Celková aktivita se substrátem ampicilinem byla 235 U.l1 živné půdy a specifická aktivita dosahovala 70 U.g”1 suché hmoty buněk. Se substrátem penicilinem, G byla specifická aktivita 45 U.g”1 s.hm.
-5CZ 291154 B6
Příklad 4
Byla provedena kultivace kmene CCM 8424 jako v příkladu 2 s tím rozdílem, že koncentrace fenyloctové kyseliny v živné půdě byla zvýšena na 0.4 %. Narostlá kultura byla zpracována stejným způsobem jako v příkladu 3. Výtěžek suché hmoty buněk byl 4,3 g.f1 půdy, aktivita acylasy 302 U-Γ1 půdy a 70 U.g“1 s.hm. (substrát ampicilin). Se substrátem penicilinem G byla specifická aktivita 40 U.g“1 s.hm.
Příklad 5
Ve fermentačním tanku o objemu 75 litrů (průměr 350 mm. výška 810 mm) vybaveném dupliká15 torem, 4 zarážkami, aeračním věncem, třemi radiálními míchadly se šesti lopatkami o průměru 120 mm na jednom hřídeli (vzdálenost míchadel od sebe 250 mm, spodního ode dna 85 mm) bylo připraveno 50 litrů živné půdy následujícího složení (v % hmotn.): kvasničný extrakt (OHLY) 1 %, dihydrofosforečnan draselný 0,1 %, chlorid sodný 0.2 %, chlorid hořečnatý 0,02 % (sterilizace zvlášt), fenyloctan amonný 0,474%, protipenidlo SAG471 0,005%, vodovodní 20 voda, pH 7,2 sterilizace při 120 °C 40 minut. Varné baňky (20 kusů) o objemu 500 ml byly naplněny 50 ml půdy stejného složení (bez SAG) a po sterilizaci byly očkovány kmenem CCM 4824 a poté provedena kultivace první generace jako v příkladu 2. Po 24 hodinách byly kultury v baňkách za aseptických podmínek slity a použity pro očkování fermentoru. Kultivace probíhala za míchání 400 otáček za minutu a vzdušněni 13,5 litrů při teplotě 28 °C po dobu 25 17 hodin. Výtěžek suché hmoty buněk byl 5,2 g.f1 živné půdy, aktivita acylasy 213 U.f1 živné půdy a specifická aktivita 41 U.g-1 s.hm. (substrát ampicilin). Se substrátem penicilinem G byla specifická aktivita 31 U.g“1 s.hm. Po ukončení kultivace byly buňky separovány na odstředivce Sharples a získaná buněčná pasta byla suspendována v 0,025 M fosfátovém pufru o pH 7,5 v koncentraci 140 g vlhké hmoty buněk litr“1 suspenze. Poté byla provedena dezintegrace buněk 30 trojnásobným průchodem mechanickým štěrbinovým dezintegrátorem Manton Gualin za chlazení mezi cykly na teplotu cca 15 °C. Aktivita získané dezintegrované směsi byla 1995 U.l“1 a 120 U.g“1 suché hmoty se substrátem ampicilinem a 1330 U.l1 a 80 U.g“1 suché hmoty se substrátem penicilinem G.
Příklad 6
Dezintegrovaný homogenát získaný způsobem, jak je popsáno v příkladu 5, byl centrifugován (14 000 G, 10 minut). Získaný supematant vy kazoval aktivitu se substrátem ampicilinem 40 1966 U.l1 a 150 U.g“1 bílkovin, s penicilinem G 1310 U.l1 a 100 U.g1 bílkovin. K 300 ml tohoto bezbuněčného extraktu bylo za chlazení (cca 15 CC), míchání a udržování pH na hodnotě 7,2 postupně přidáváno 13,93 g síranu amonného. Po 15 minutách míchání byl roztok ponechán přes noc při 5 °C a vzniklá sraženina separována centrifugám' (14 000 g, 30 minut). Sediment byl poté rozpuštěn v 0,01 M fosfátovém pufru o pH 7,2 a dialvzován přes noc proti stejnému pufru. 45 Vzniklý roztok (68 ml) měl aktivitu acylasy s ampicilinem 4289 U.l1, s penicilinem G 2859 U.l1 a specifická aktivita byla 302 resp. 202 U.g’1 bílkovin.
Příklad 7
Bezbuněčný extrakt získaný v příkladu 6 byl rozdělen na díly, ve kterých bylo za míchání upraveno pH pomocí 2M kyseliny octového nebo 4% hydroxidem sodným na hodnoty 4, 7,10 a vzorky byly ponechány 1 hodinu 5, 40, 50 a 55 °C. Po této době bylo pH opět upraveno na výchozí hodnotu (7,0-7,2) a stanovena aktivita acylasy se substrátem ampicilinem a penicilinem
-6CZ 291154 B6
G. Výsledky shrnuté v následující tabulce 2 ukazují na značnou stabilitu této enzymové aktivity k extremním pH a teplotě.
Tabulka 2 - Vliv pH a teploty na stabilitu penicilinacylasy v bezbuněčném extraktu
| teplota (1 h, °C) | PH | substrát | aktivita (U.l 1 extraktu) |
| 5 | 4,0 | ampicilin | 1990 |
| penicilín G | 1400 | ||
| 5 | 7,0 | ampicilin | 2000 |
| penicilín G | 1335 | ||
| 5 | 10,0 | ampicilin | 1926 |
| - | penicilín G | 1350 | |
| 40 | 4,0 | ampicilin | 2200 |
| penicilín G | 1375 | ||
| 40 | 7,0 | ampicilin | 2098 |
| penicilín G | 1458 | ||
| 55 | 7,0 | ampicilin | 2050 |
| penicilín G | 1206 | ||
| 60 | 7,0 | ampicilin | 1722 |
| penicilín G | 1188 |
Průmyslová využitelnost
Kmen Comamonas testosteroni CCM 4824 podle vynálezu lze využít ve farmaceutickém průmyslu.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (1)
1. Kmen mikroorganismu Comamonas testosteroni CCM 4824 produkující vnitrobuněčnou penicilinacylasu, stabilní v rozsahu pH od 3,0 do 11,0 a teplotě do 60 °C, využitelný zejména pro přípravu 6-aminopenicilanové a 7-aminodeacetoxycefalosporanové kyseliny z penicilinu a některých derivátů cefalosporinu, pro enzymovou reverzní syntézu semisyntetických antibiotik, hydrolýzu a syntézu amidů, hydrolýzu esterů a odblokování N-koncové aminoky seliny při syntéze peptidů, nebo při dělení racemických směsí aminokyselin.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20012823A CZ291154B6 (cs) | 2001-08-03 | 2001-08-03 | Kmen mikroorganismu Comamonas testosteroni CCM 4824 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20012823A CZ291154B6 (cs) | 2001-08-03 | 2001-08-03 | Kmen mikroorganismu Comamonas testosteroni CCM 4824 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ291154B6 true CZ291154B6 (cs) | 2002-12-11 |
Family
ID=5473507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20012823A CZ291154B6 (cs) | 2001-08-03 | 2001-08-03 | Kmen mikroorganismu Comamonas testosteroni CCM 4824 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ291154B6 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008093351A1 (en) * | 2007-01-31 | 2008-08-07 | Fermenta Biotech Limited | Dna sequence encoding penicillin acylase, novel recombinant dna constructs and recombinant microorganisms carrying this sequence |
-
2001
- 2001-08-03 CZ CZ20012823A patent/CZ291154B6/cs not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008093351A1 (en) * | 2007-01-31 | 2008-08-07 | Fermenta Biotech Limited | Dna sequence encoding penicillin acylase, novel recombinant dna constructs and recombinant microorganisms carrying this sequence |
| US8039604B2 (en) | 2007-01-31 | 2011-10-18 | Fermenta Biotech Limited | DNA sequence encoding penicillin acylase, novel recombinant recombinant DNA constructs and recombinant microorganisms |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shibuya et al. | Isolation and properties of 7 β-(4-carboxybutanamido) cephalosporanic acid acylase-producing bacteria | |
| Cole | Hydrolysis of penicillins and related compounds by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli | |
| Hamilton-Miller | Penicillinacylase | |
| CA2051090C (en) | Cephalosporin c acylase | |
| US4774179A (en) | Process for preparing a 7-aminocephalosporanic acid compound | |
| Forsberg et al. | Characterization of Bacillus licheniformis 6346 mutants which have altered lytic enzyme activities | |
| US5120652A (en) | Substantially purified n-acyl-l-proline acylase from comamonas testosteroni dsm 5416 and alcaligenes denitrificans dsm 5417 | |
| Okachi et al. | Penicillin acylase of Pseudomonas melanogenum KY 3987 | |
| Rhee et al. | Enzymatic biosynthesis of cephalexin | |
| Vanderhaeghe et al. | Specificity of penicillin acylase of Fusarium and of Penicillium chrysogenum | |
| US4141790A (en) | Process for the preparation of 7-amino-cephem compounds using mold fungi | |
| US6235516B1 (en) | Biocatalysts with amine acylase activity | |
| CZ291154B6 (cs) | Kmen mikroorganismu Comamonas testosteroni CCM 4824 | |
| HU181488B (en) | Process for the hydrolysis of racemic hydantoins into optically active n-carbamoyl-aminoacid derivatives and for preparing the hydrolyzing enzymatic complex | |
| Kim et al. | Isolation of novel Pseudomonas diminuta KAC-1 strain producing glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylase | |
| Pal et al. | β-Lactamase-free penicillin amidase from Alcaligenes sp.: isolation strategy, strain characteristics, and enzyme immobilization | |
| Zhang et al. | Morphological, physiological and enzymatic characteristics of cephalosporin acylase-producing Arthrobacter strain 45-8A | |
| KR100232638B1 (ko) | 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산 아실레이즈를 생산하는 슈도모나스속 세균 kac-1 | |
| Quratulain et al. | Development and characterization of a potent producer of penicillin G amidase by mutagenization | |
| Kumar et al. | Mathematically optimized production, purification and characterization of penicillin G acylase from soil bacterial isolates AA17A and AA17B | |
| WO2002081659A1 (en) | Bacterial strain alcaligenes denitrificans producing nitrilase | |
| JP2615443B2 (ja) | Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼの製造方法 | |
| JPH0370472B2 (cs) | ||
| Nam et al. | Biochemical properties of penicillin amidohydrolase from Micrococcus luteus | |
| Sato et al. | Cultural conditions for the induction of chondroitinase ABC in Proteus vulgaris cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20190803 |