JPH0556786A - リパーゼ産生遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 シュードモナス属細菌のリパーゼ産生遺伝子
を含む特定な塩基配列で表わされるＤＮＡ断片の取得、
提供。 【構成】 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
属細菌、例えばシュードモナス・ノブ・エスピーＮｏ．
１０９（微工研菌寄第３０２５号）、由来のリパーゼ産
生遺伝子を含むＤＮＡ断片。 【効果】 このＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組込んだ
プラスミドを製作することによって、シュードモナス属
細菌由来のリパーゼを大量に生産することが可能とな
る。更に、位置特異的変異導入法等により、熱、アルカ
リ、酸、有機溶媒等に対して安全性の増大したリパーゼ
あるいは位置特異性、基質特異性に特徴のあるリパーゼ
を生産することも可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はシュードモナス属細菌由
来のリパーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片に関する。こ
のＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組込んだプラスミドを
製作することによって、シュードモナス属細菌由来のリ
パーゼを大量に生産することが可能となる。更に、位置
特異的変異導入法等により、熱、アルカリ、酸、有機溶
媒等に対して安定性の増大したリパーゼあるいは位置特
異性、基質特異性に特徴のあるリパーゼを生産すること
も可能となる。

【０００２】

【従来の技術】近年組換えＤＮＡ技術を中心とする遺伝
子操作は急激に発展してきた。とりわけ組換えＤＮＡ技
術の基礎研究として種々のベクターの開発が盛んに行わ
れている。例えば、大腸菌の系においては種々の発現ベ
クターが開発され、これらの発現ベクターに目的の遺伝
子を含むＤＮＡ断片を組込むことにより宿主での物質生
産や形質転換が行われるのである。また、枯草菌の系に
おいては発現ベクターの他に宿主細胞の染色体上に目的
遺伝子が導入できるベクターも開発されている〔Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０
４０７４（１９８３）〕。

【０００３】これらの技術を利用すると、目的とする産
物の産生量を増大させることができるのみならず目的と
する産物を生産する生物種を変えることもでき、目的産
物をより有利な条件で生産することが可能となり、生産
性の向上が期待できる。

【０００４】リパーゼは水溶液中で脂肪酸エステルの加
水分解反応を触媒する一方、反応系の水分含量を少なく
すると脂肪酸とアルコールからエステルを合成する反応
をも触媒する〔Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ． １０，１３（１９６４）〕。リパーゼは多種の
起源より多種類のものが入手できるため、パン酵母と並
んで有機合成分野に最もよく利用されている触媒であ
り、不斉加水分解によるキラルな合成原料の調製、温和
な条件下における不安定物質の合成、非水溶媒中でのエ
ステル交換反応によるキラルなエステルやラクトンの合
成、位置選択的反応等応用範囲は広い。

【０００５】しかしながらかかるリパーゼを安価かつ大
量に供給するための満足すべき方法はまだ開発されるに
至っていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らはリパーゼ
の産生菌であるシュードモナス属細菌の染色体に制限酵
素を作用させてリパーゼの産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
を取り出し、このＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに組込ん
だプラスミドを製作することによってシュードモナス属
細菌等由来のリパーゼを大量に生産することを可能なら
しめるものである。

【０００７】従って、本発明はシュードモナス属細菌の
リパーゼ産生遺伝子を含む特定な塩基配列で表わされる
ＤＮＡ断片を取得し、提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らはシュードモ
ナス属細菌由来のリパーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片
の取得に成功した。

【０００９】本発明におけるリパーゼを産生するシュー
ドモナス属細菌の染色体ＤＮＡは次のようにして分離す
ることができる。

【００１０】シュードモナス・ノブ・エスピーＮｏ．１
０９（微工研菌寄第３０２５号）株を培養集菌後、リゾ
チーム溶液を加えて一定時間おく。次いでＳＤＳ溶液を
加えて完全に溶菌させた後、フェノール処理によってＤ
ＮＡを抽出する。ＤＮＡをイソプロパノール沈殿によっ
て回収した後、ＲＮａｓｅ処理し、染色体ＤＮＡを得
る。

【００１１】染色体ＤＮＡを各種制限酵素で切断した
後、同一の制限酵素で切断したベクターＤＮＡにＴ４リ
ガーゼを用いて連結することにより、上記染色体ＤＮＡ
断片をベクターに組込んだプラスミドを得、得られたプ
ラスミドを大腸菌に形質転換し、目的のリパーゼ産生遺
伝子を含むＤＮＡ断片が組込まれたプラスミドを保持す
る大腸菌の選択はトリブチリンを含む寒天平板培地で培
養し、トリブチリンがリパーゼにより分解されることに
よってコロニーの周囲にクリアーゾーンを形成されるこ
とを指標として行う。

【００１２】大腸菌からのプラスミドの抽出は次のよう
な常法によって行うことができる。プラスミドを保持す
る大腸菌を培養集菌する。菌体の懸濁液にリゾチーム溶
菌を加えて一定時間氷中においた後、ＳＤＳ溶液を加え
て溶菌する。次いで酢酸ナトリウム溶液を添加し、一定
時間氷中においた後、遠心分離により上清を得、フェノ
ール処理、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収する。Ｄ
ＮＡを緩衝液に溶解し、ＲＮａｓｅを添加し、一定時間
保温した後、フェノール処理、エタノール沈殿によりＤ
ＮＡを回収する。

【００１３】このようにして得られたプラスミドＤＮＡ
は再び大腸菌に形質転換できる。

【００１４】上記のようにして得られたプラスミドＤＮ
ＡのサブクローニングをＢａｌ ３１ヌクレアーゼある
いはエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて行い挿入ＤＮＡ
断片を短縮する。

【００１５】本発明による上記リパーゼ産生遺伝子を含
むＤＮＡ断片の塩基配列を〔α−^３２Ｐ〕ｄＣＴＰを用
いたジデオキシ法により決定した結果、本ＤＮＡ断片は
配列表の配列番号１および配列番号２に示す塩基配列で
表わされるものであった。

【００１６】以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はそれら実施例に限定されるもので
はない。

【００１７】

【実施例】

（１）シュードモナス・ノブ・エスピーＮｏ．１０９
（微工研菌寄第３０２５号）株の染色体ＤＮＡの調製：
ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、肉エキス０．
１％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム
０．０５％、ｐＨ７．０からなる培地１０００ｍｌにシ
ュードモナス・ノブ・エスピーＮｏ．１０９（微工研菌
寄第３０２５号）株を接種し、２８℃で一夜振とう培養
し、遠心分離により集菌した。菌体をリゾチーム溶液
（０．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム、２０ｗ／ｖ％ショ糖、
０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ８．０）８０ｍｌに懸濁させ氷中で１０分間放置し
た。これにＳＤＳ溶液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
１ｗ／ｖ％ＳＤＳ、１．０Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ９．０）
を加え、室温で１５分間放置した後７０℃で５分間保温
し、完全に溶菌させ、遠心分離し、上部にある粘性の強
い物質を静かに取り除き、溶菌液を得た。次いで等量の
フェノール／クロロホルム（１：１ｖ／ｖ）を加え、約
１５分間穏やかに攪拌し、遠心分離により上層を回収し
た（以下、この操作を「フェノール抽出」という）。回
収した上層に等量のイソプロパノールを加え、−８０℃
に３０分間おき、ＤＮＡを沈殿させ、遠心分離によりＤ
ＮＡを回収し、冷エタノールで洗浄後、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０からなる
緩衝液（以下「ＴＥ」という）１０ｍｌに溶解した。こ
れに２０μｇ／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅ Ａを加
え、３７℃で１時間保温後、フェノール抽出を行った。
次いで２倍量の冷エタノールを加え−８０℃に３０分間
おき、ＤＮＡを沈殿させ、遠心分離によりＤＮＡを回収
し（以下この操作を「エタノール沈殿」という）、染色
体ＤＮＡを得た。

【００１８】（２）染色体ＤＮＡの制限酵素による切
断：（１）項で調製した染色体ＤＮＡ５μｇに制限酵素
５０単位を加え、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、７ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ ＫＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール、１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、ｐ
Ｈ７．５の組成の反応液２５μｌ中において３７℃で反
応させ切断後、フェノール抽出、エタノール沈殿により
ＤＮＡ断片を回収し、１０μｌの滅菌蒸溜水１０μｌに
溶解した。制限酵素としてはＰｓｔ ＩおよびＥｃｏＲ
Ｉを使用し、それぞれの制限酵素で切断した染色体Ｄ
ＮＡ断片を調整した。即ち、（１）項で調整した染色体
を制限酵素Ｐｓｔ Ｉで切断した染色体ＤＮＡ断片
（Ｐ）および（１）項で調整した染色体を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで切断した染色体ＤＮＡ断片（Ｅ）の２種のＤＮ
Ａ断片を調整した。

【００１９】（３）ベクターＤＮＡの切断および脱リン
酸化：ベクターＤＮＡ（ｐＵＣ １９）５μｇを（２）
項と同条件で制限酵素にて切断後、フェノール抽出、エ
タノール沈殿により回収し、５μｌのＴＥに溶解した。
即ち、（２）項同様ベクターＤＮＡ（ｐＵＣ １９）を
Ｐｓｔ Ｉで切断したベクターＤＮＡ（Ｐ）およびベク
ターＤＮＡ（ｐＵＣ １９）をＥｃｏＲＩで切断したベ
クターＤＮＡ（Ｅ）の２種のベクターＤＮＡを調整し
た。次にこれらのベクターＤＮＡ溶液５μｌに０．２Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．０）２０μｌを加え、
更に滅菌蒸溜水１５μｌを加えこれに１単位の大腸菌ア
ルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）を加え、５４℃で１
時間反応させた後、フェノール抽出、エタノール沈殿に
よりＤＮＡを回収し、１０μｌの滅菌蒸溜水に溶解し
た。

【００２０】（４）ベクターＤＮＡへの染色体ＤＮＡ断
片の挿入：上記（２）および（３）項の染色体ＤＮＡ断
片およびベクターＤＮＡをおよそ１：１の割合になるよ
う混合し、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）
を用いて両者を連結させることにより、組換え体プラス
ミドを得た。連結方法はライゲーションキットの使用説
明書に従った。なお、ベクターＤＮＡと染色体ＤＮＡ断
片との連結は、（２）の項染色体ＤＮＡ断片（Ｐ）と
（３）項のベクターＤＮＡ（Ｐ）（組換え体プラスミド
（Ｐ））および（２）項の染色体ＤＮＡ断片（Ｅ）と
（３）項のベクターＤＮＡ（Ｅ）（組換え体プラスミド
（Ｅ））の２通りを行った。

【００２１】（５）組換え体プラスミドの大腸菌への形
質転換：上記（４）項の２種の組換え体プラスミド
（Ｐ）および（Ｅ）をそれぞれ大腸菌ＪＭ１０５株のコ
ンピテントセルに添加し、氷中に３０分間放置した後、
４２℃で２分間処理した。これを１．５ｍｌのＮａＣｌ
０．５％、トリプトン１％、酵母エキス０．５％から
なる培地（以下「ＬＢ培地」という）接種して、３７℃
で１時間培養した。この培養液を５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン、１％トリブチリン、０．５％ノイゲンＨＣ（第
一工業製薬社製）を添加したＬＢ培地に塗抹し、クリア
ーゾーンの形成能をリパーゼ活性の指標として検索し
た。その結果、組換え体プラスミド（Ｐ）から大腸菌形
質転換体（Ｐ）を、また組換え体プラスミド（Ｅ）から
大腸菌形質転換体（Ｅ）を得た。

【００２２】（６）サブクローニング：上記（５）項で
得られたリパーゼを産生する２種の大腸菌形質転換体
（Ｐ）および（Ｅ）から、それぞれ以下の常法によって
プラスミドを抽出した。即ち、プラスミドを保持する大
腸菌を５μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地５００
ｍｌに接種し、３７℃で一夜振とう培養後、遠心分離に
て集菌した。菌体を緩衝液（５０ｍＭグルコース、２５
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０）８ｍｌに懸濁し、これに５０ｍｇ／ｍｌリゾチ
ーム溶液２ｍｌを加え、氷中に５分間おき、次いでＳＤ
Ｓ溶液（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）２０ｍｌを
加え、氷中に１０分間おき、５Ｍ酢酸ナトリウム１５ｍ
ｌを加え、氷中に３０分間おき、遠心分離により上清を
得、フェノール抽出、エタノール沈殿でＤＮＡを回収し
た。回収したＤＮＡを８ｍｌのＴＥに溶解し、２０μｇ
／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅ Ａを加え、３７℃で１
時間保温後、再度フェノール抽出、エタノール沈殿でＤ
ＮＡを回収し、これを９ｍｌのＴＥに溶解した。このよ
うにして得られたプラスミドＤＮＡのサブクローニング
をキロシークエンス用デレーションキット（宝酒造社
製）を用いた段階的欠損法により行った。なお、方法は
キットの使用説明書に従った。サブクローニングされた
プラスミドをもつ大腸菌形質転換体からリパーゼ活性を
産生している株を（５）項の方法に従って選択し、上記
の方法でプラスミドＤＮＡを抽出し、（２）項と同様の
条件で制限酵素にて切断し、１％アガロースゲル電気泳
動を行いλ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ−φ×１
７４／Ｈａｅ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡社製）を
マーカーとしてベクターＤＮＡ上の挿入ＤＮＡ断片の大
きさを測定し、最小のものを選択した。その結果、組換
え体（Ｐ）から約１．５Ｋｂｐの挿入断片をもつプラス
ミドを得（ｐＵＹ ７）と名付けた。また組換え体
（Ｅ）から約１．６Ｋｂｐの挿入断片をもつプラスミド
を得（ｐＵＹ ２１）と名付けた。

【００２３】（７）挿入断片のＤＮＡ塩基配列決定：プ
ラスミド（ｐＵＹ ７）および（ｐＵＹ ２１）上の挿
入ＤＮＡ断片の塩基配列決定のため、段階的欠損法によ
って塩基配列決定用プラスミドを作製し、塩基配列決定
は〔α−^３２Ｐ〕ｄＣＴＰを用いたジデオキシ法により
行った。段階的欠損法にはキロシークエンス用デレーシ
ョンキット（宝酒造社製）を、また、ジデオキシ法には
シーケナーゼＶｅｒ．２．０（東洋紡社製）を用いた。
なお、方法はそれぞれのキットの使用説明書に従った。
その結果、プラスミド（ｐＵＹ ７）上の挿入断片は配
列表の配列番号１に示されるとおり、全長１５６４ｂｐ
であり、１８０〜１１７８ｂｐの間に３３３個のアミノ
酸をコードするオープンリーディングフレームが存在し
ていた。また、配列番号１に示されている塩基配列より
推定されるアミノ酸配列の第８４番目から第８８番目ま
での間に配列表の配列番号３に示すＧｌｙ Ｉｌｅ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｙという配列が存在し、この配列が
リパーゼに特異的な配列といわれているＧｌｙ Ｘ Ｓ
ｅｒ Ｘ Ｇｌｙ（ただし、Ｘは任意のアミノ酸を示
す）と一致していたが、その他の領域では、従来アミノ
酸配列が報告されている他種由来のリパーゼとの相同性
は全くみられなかった。他方、プラスミド（ｐＵＹ ２
１）上の挿入断片は配列表の配列番号２に示されるとお
り、全長１６３７ｂｐであり、１３〜１３７７ｂｐの間
に４５５個のアミノ酸をコードするオープンリーディン
グフレームが存在していた。また、配列番号２に示され
ている塩基配列より推定されるアミノ酸配列中には、リ
パーゼに特異的な配列といわれているＧｌｙ Ｘ Ｓｅ
ｒ Ｘ Ｇｌｙ（ただし、Ｘは任意のアミノ酸を示す）
は存在せず、その他の領域でも従来アミノ酸配列が報告
されている他種由来のリパーゼとの相同性は全くみられ
なかった。

【００２４】

【発明の効果】以上詳細に説明したとおり、本発明によ
り、リパーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られた。
このＤＮＡ断片を用いることによりリパーゼの高生産微
生物または細胞を調製することができ、該リパーゼを効
率よく製造する道が開かれた。更に、このＤＮＡ断片
は、位置特異的変異導入法等を採用し、熱、アルカリ、
酸、有機溶媒等に対して安定性の増大したリパーゼある
いは位置特異性、基質特異性に特徴のあるリパーゼを作
るための材料にもなりうる。

【配列表】

【００２５】

【００２６】

【００２７】

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成３年１２月２４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２２】（６）サブクローニング：上記（５）項で
得られたリパーゼを産生する２種の大腸菌形質転換体
（Ｐ）および（Ｅ）から、それぞれ以下の常法によって
プラスミドを抽出した。即ち、プラスミドを保持する大
腸菌を５μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地５００
ｍｌに接種し、３７℃で一夜振とう培養後、遠心分離に
て集菌した。菌体を緩衝液（５０ｍＭグルコース、２５
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０）８ｍｌに懸濁し、これに５０ｍｇ／ｍｌリゾチ
ーム溶液２ｍｌを加え、氷中に５分間おき、次いでＳＤ
Ｓ溶液（０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）２０ｍｌを
加え、氷中に１０分問おき、５Ｍ酢酸ナトリウム１５ｍ
ｌを加え、氷中に３０分間おき、遠心分離により上清を
得、フェノール抽出、エタノール沈殿でＤＮＡを回収し
た。回収したＤＮＡを８ｍｌのＴＥに溶解し、２０μｇ
／ｍｌとなるようにＲＮａｓｅ Ａを加え、３７℃で１
時間保温後、再度フェノール抽出、エタノール沈殿でＤ
ＮＡを回収し、これを９ｍｌのＴＥに溶解した。このよ
うにして得られたプラスミドＤＮＡのサブクローニング
をキロシークエンス用デレーションキット（宝酒造社
製）を用いた段階的欠損法により行った。なお、方法は
キットの使用説明書に従った。サブクローニングされた
プラスミドをもつ大腸菌形質転換体からリパーゼ活性を
産生している株を（５）項の方法に従って選択し、上記
の方法でプラスミドＤＮＡを抽出し、（２）項と同様の
条件で制限酵素にて切断し、１％アガロースゲル電気泳
動を行いλ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ −φ×
１７４／Ｈａｅ ＩＩＩ ｄｉｇｅｓｔ（東洋紡社製）
をマーカーとしてベクターＤＮＡ上の挿入ＤＮＡ断片の
大きさを測定し、最小のものを選択した。その結果、組
換え体（Ｐ）から約１．５Ｋｂｐの挿入断片をもつプラ
スミドを得ｐＵＹ７と名付けた。また組換え体（Ｅ）か
ら約１．６Ｋｂｐの挿入断片をもつプラスミドを得ｐＵ
Ｙ２１と名付けた。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２３】（７）挿入断片のＤＮＡ塩基配列決定：プ
ラスミドｐＵＹ７およびｐＵＹ２１上の挿入ＤＮＡ断片
の塩基配列決定のため、段階的欠損法によって塩基配列
決定用プラスミドを作製し、塩基配列決定は〔α−^３２
Ｐ］ｄＣＴＰを用いたジデオキシ法により行った。段階
的欠損法にはキロシークエンス用デレーションキット
（宝酒進社製）を、また、ジデオキシ法にはシーケナー
ゼＶｅｒ．２．０（東洋紡社製）を用いた。なお、方法
はそれぞれのキットの使用説明書に従った。その結果、
プラスミドｐＵＹ７上の挿入断片は配列表の配列番号１
に示されるとおり、全長１５６４ｂｐであり、１８０〜
１１７８ｂｐの間に３３３個のアミノ酸をコードするオ
ープンリーディングフレームが存在していた。また、配
列番号１に示されている塩基配列より推定されるアミノ
酸配列の第８４番目から第８８番目までの間に配列表の
配列番号３に示すＧｌｙ Ｉｌｅ ＳｅｒＡｓｐＧｌｙ
という配列が存在し、この配列がリパーゼに特異的な配
列といわれているＧｌｙ Ｘ Ｓｅｒ Ｘ Ｇｌｙ（た
だし、Ｘは任意のアミノ酸を示す）と一致していたが、
その他の領域では、従来アミノ酸配列が報告されている
他種由来のリパーゼとの相同性は全くみられなかった。
他方、プラスミドｐＵＹ２１上の挿入断片は配列表の配
列番号２に示されるとおり、全長１６３７ｂｐであり、
１３〜１３７７ｂｐの間に４５５個のアミノ酸をコード
するオープンリーディングフレームが存在していた。ま
た、配列番号２に示されている塩基配列より推定される
アミノ酸配列中には、リパーゼに特異的な配列といわれ
ているＧｌｙ Ｘ Ｓｅｒ Ｘ Ｇｌｙ（ただし、Ｘは
任意のアミノ酸を示す）は存在せず、その他の領域でも
従来アミノ酸配列が報告されている他種由来のリパーゼ
との相同性は全くみられなかった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
   ｓ）属細菌由来のリパーゼ産生遺伝子を含む配列表の配
   列番号１または配列番号２に示した塩基配列で表わされ
   るＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 シュードモナス属細菌がシュードモナス
   ・ノブ・エスピーＮｏ．１０９（微工研菌寄第３０２５
   号）であることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断
   片。