KR100464780B1 - 산화적 안정성이 증대된 엔-카바모일라아제 변이효소 - Google Patents

산화적 안정성이 증대된 엔-카바모일라아제 변이효소 Download PDF

Info

Publication number
KR100464780B1
KR100464780B1 KR10-2002-0014243A KR20020014243A KR100464780B1 KR 100464780 B1 KR100464780 B1 KR 100464780B1 KR 20020014243 A KR20020014243 A KR 20020014243A KR 100464780 B1 KR100464780 B1 KR 100464780B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
carbamoylase
mutase
gly
leu
amino acid
Prior art date
Application number
KR10-2002-0014243A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20030075098A (ko
Inventor
김학성
오기훈
남성훈
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR10-2002-0014243A priority Critical patent/KR100464780B1/ko
Publication of KR20030075098A publication Critical patent/KR20030075098A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100464780B1 publication Critical patent/KR100464780B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01077—N-Carbamoyl-D-amino-acid hydrolase (3.5.1.77)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01087—N-Carbamoyl-L-amino-acid hydrolase (3.5.1.87)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/05—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in nitriles (3.5.5)
    • C12Y305/05001—Nitrilase (3.5.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 N-카바모일라아제 변이효소를 암호화하는 유전자, 전기 유전자로부터 발현되는 N-카바모일라아제 변이효소, 전기 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드, 전기 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물, 전기 미생물을 배양하여, N-카바모일라아제 변이효소를 생산하는 방법, 전기 N-카바모일라아제 변이효소를 이용하여 비천연 D-아미노산을 제조하는 방법 및 전기 N-카바모일라아제 변이효소의 활성여부를 분석하는 활성 착색방법에 관한 것이다. 본 발명의 N-카바모일라아제 변이효소는 야생형의 효소보다 산화적 안정성이 증대되었기 때문에, 이를 이용하여 DTT를 첨가할 필요없이 보다 효율적이고 경제적으로 비천연 D-아미노산을 제조할 수 있다.

Description

산화적 안정성이 증대된 엔-카바모일라아제 변이효소{Mutated N-carbamoylase with Improved Acid-Stability}
본 발명은 산화적 안정성이 증대된 N-카바모일라아제 변이효소에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 N-카바모일라아제 변이효소를 암호화하는 유전자, 전기 유전자로부터 발현되는 N-카바모일라아제 변이효소, 전기 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드, 전기 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물, 전기 미생물을 배양하여, N-카바모일라아제 변이효소를 생산하는 방법, 전기 N-카바모일라아제 변이효소를 이용하여 비천연 D-아미노산을 제조하는 방법 및 전기 N-카바모일라아제 변이효소의 활성여부를 분석하는 활성 착색방법(activity staining method)에관한 것이다.
D-파라-히드록시페닐글리신(D-p-hydroxyphenylglycine), D-발린(D-valine) 및 D-세린(D-serine) 등의 광학활성을 가지는 비천연 D-아미노산은 감미료, 농약 및 페니실린(penicilline)이나 세파로스포린계 항생제(cephalosporin antibiotic) 등의 의약품 합성에 광범위하게 이용된다. 일반적으로, 비천연 D-아미노산은 화학적으로 제조된 5'-단치환 히단토인(hydantoin) 유도체를 D-히단토이나아제(D-hydantoinase)와 반응시켜 N-카바모일-D-아미노산을 생성시키는 단계와 전기 N-카바모일-D-아미노산을 N-카바모일라제와 반응시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조된다. 이러한 비천연 D-아미노산의 제조방법은 사용되는 효소의 활성에 따라 공정의 효율성과 경제성이 결정되므로, 열과 산화적인 조건에서도 활성을 갖는 안정한 효소의 이용이 필수적으로 요구된다.
이에, 본 발명자들은 비천연 D-아미노산의 제조방법에서 5'-단치환 히단토인 유도체로부터 N-카바모일-D-아미노산을 생성시키는 단계에 이용되는 D-히단토이나아제를 바실러스 스테아로더모필러스(Bacillus stearothemrophilus) SD-1으로부터 분리하여 종래의 것보다 열안정성이 높은 D-히단토이나아제로 개발하고, 전기 효소와 관련하여, "내열성 D-히단토이나아제를 숙주세포 내에서 가용성인 상태로 대량 생산하는 방법 및 회수방법" 및 "내열성 D-히단토이나아제 활성을 갖는 고온성 신규 미생물을 이용한 N-카르바모일-D-아미노산의 제조방법"이라는 발명의 명칭으로 특허를 획득한 바 있다(대한민국 특허 제 148468호 및 제 119168호). 전기 내열성 D-히단토이나아제를 이용하면 고온에서 효소반응을 수행할 수 있기 때문에, 기질의용해도가 증가되어 반응속도가 증가되고, 연속공정이 용이하며, 미생물에 의한 오염을 방지할 수 있다.
다음으로, 비천연 D-아미노산의 제조방법의 N-카바모일-D-아미노산을 분해시키는 단계에 있어서, 최근들어 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 아쓰로박터(Arthrobacter) 속, 코마모나스(Comamonas) 속 및 블라스토박터(Blastobacter) 속 등의 다양한 미생물에서 발견되는 N-카바모일라아제를 이용하는 방법이 주로 이용되고 있으나, 전기 미생물에서 분리된 N-카바모일라아제는 효소활성에 중요한 역할을 하는 시스테인(cysteine)의 -SH 그룹이 산화적인 조건에서 쉽게 산화되기 때문에, N-카바모일라아제의 효소활성을 지속적으로 유지시키기 위해서는 DTT(dithiothreitol) 등의 환원제를 첨가해야 하는 어려움이 있었다.
따라서, 보다 효율적이고 경제적으로 비천연 D-아미노산을 제조하기 위해서는 산화적 안정성이 증대된 N-카바모일라아제를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 산화적 안정성이 높은 N-카바모일라아제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 야생형의 N-카바모일라아제의 유전자에 무작위적인 변이를 가하여 작제한 다양한 변이효소 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 작제하고, 전기 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물을 배양하여 수득한 N-카바모일라아제 변이효소에 과산화수소를 처리한 다음, 잔여 효소활성을 분석하여 선별한 N-카바모일라아제 변이효소가 실제적으로 산화적 조건에서 효소활성을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 N-카바모일라아제 변이효소를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 전기 유전자로부터 발현되는 N-카바모일라아제 변이효소를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 전기 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 전기 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다섯 번째 목적은 전기 미생물을 배양하여, N-카바모일라아제 변이효소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 여섯 번째 목적은 전기 N-카바모일라아제 변이효소를 이용하여 비천연 D-아미노산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일곱 번째 목적은 효소의 활성여부를 분석하는 활성 착색방법을 제공하는 것이다.
도 1은 다양한 농도의 과산화수소 처리 후의 야생형 N-카바모일라아제(■) 및 N-카바모일라아제 변이효소 NC23(●)의 잔여 효소활성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 재조합 플라스미드 pNC23을 나타내는 유전자 지도이다.
본 발명의 N-카바모일라아제 변이효소를 생산하는 방법은 N-카바모일라아제 변이효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물을 배양하여, 전기 유전자로부터 발현된 N-카바모일라아제 변이효소를 수득하는 공정을 포함한다: 이때, N-카바모일라아제 변이효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 4, 12, 13 또는 14의 염기서열로 나타내어지는 유전자로부터 선택될 수 있고, 이에 따라 생산되는 N-카바모일라아제 변이효소는 서열번호 5, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열로 나타내어지는 단백질일 수 있다.
또한, 본 발명의 비천연 D-아미노산을 제조하는 방법은 N-카바모일라아제 변이효소를 N-카바모일-D-아미노산과 반응시키는 공정을 포함한다: 이때, 비천연 D-아미노산은 D-파라-히드록시페닐글리신, D-발린 또는 D-세린일 수 있고, N-카바모일-D-아미노산은 N-카바모일-D-파라-히드록시페닐글리신, N-카바모일-D-발린 또는 N-카바모일-D-세린일 수 있다.
아울러, 본 발명은 N-카바모일라아제 변이효소를 위한 활성 착색방법을 제공하는데, 전기 방법은 니트릴라아제 그룹에 속하는 효소의 기질 및 pH 지시약을 포함하는 고체배지에서 전기 효소를 발현하는 미생물을 배양하고, pH 지시약에 의한 배지의 색변화로서 효소의 활성여부를 분석하는 단계를 포함한다: 이때, 니트릴라제 그룹에 속하는 효소는 카바모일라아제, 니트릴라아제 또는 아미다아제일 수 있고, 기질은 N-카바모일-D-아미노산일 수 있으며, pH 지시약은 페놀 레드일 수 있다.
이하, 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명에서는 무작위적인 돌연변이 유도방법으로서 오류유발(error-prone) PCR(참조: Leung et al., Technique, 1:11-15, 1989)을 이용하여, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) NRRL B11291 유래의 N-카바모일라아제 유전자로부터 다양한 변이효소를 암호화하는 유전자를 작제하고, 전기 유전자를 단백질 발현벡터인 pTrc99A에 삽입하여 작제한 재조합 플라스미드를 대장균 JM109에 형질전환시켜, N-카바모일라아제 변이효소의 라이브러리를 구축하였다: 오류유발 PCR 방법은 기본적으로 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) 유래 DNA 폴리머라아제의 3'→5' 엑소뉴클레아제(3'→5' exonuclease) 활성결핍을 이용하는 것으로, 본 발명에서는 변이 발생율을 보다 증가시키기 위하여, PCR에 이용되는 데옥시뉴클레오티드의 농도를 Taq 폴리머라아제가 최적으로 작용하는 조건의 농도와 다르게 하고, MnCl2를 부가적으로 첨가하였다. 라이브러리를 구축할 때 이용되는 발현벡터 또는 형질전환되는 미생물은 특별히 제한되는 것은 아니나, N-카바모일라아제 변이효소가 정상적으로 발현되고 작용할 수 있는 다른 종류의 발현벡터 또는 미생물을 사용함이 바람직하다.
전기 구축한 라이브러리로부터 산화적 안정성이 증대된 N-카바모일라아제 변이효소를 발현하는 클론을 선별하기 위하여, 라이브러리의 각 클론에 과산화수소를 처리한 후, 잔여 효소활성을 측정함으로써, 산화적 안정성이 증대된 N-카바모일라아제 변이효소를 선별하였다. 전기 선별된 산화적 안정성이 증대된 N-카바모일라아제 변이효소를 암호화하는 유전자를 주형으로 하는 오류유발 PCR을 수행하여 새로운 라이브러리를 구축하고, 전기 라이브러리로부터 산화적 안정성이 보다 증대된 변이효소 NC23을 선별한 다음, 염기서열 분석과 아미노산 서열 분석을 통하여 변이의 위치를 확인하고, 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 변이된 아미노산 중에서 산화적 안정성에 기여하는 아미노산을 결정하였다. 전기 변이효소 NC23을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 'pNC23'으로 대장균(E.coli) JM109를 형질전환시킨 미생물을 '대장균(Escherichia coli) NC23(JM109/pTrc99a/NC23)'이라 명명하고, 2002년 1월 28일자로 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재하는 국제 기탁기관인 생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 10164BP로 기탁하였다.
본 발명의 N-카바모일라아제 변이효소 NC23은 야생형의 효소보다 산화적 안정성이 증대되었기 때문에, 효소활성의 유지를 위하여 공정과정 동안 DTT를 첨가할 필요가 없으므로, 보다 효율적이고 경제적으로 비천연 D-아미노산을 제조하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 산화적 안정성이 증대된 N-카바모일라아제 변이효소의 선별은 활성 착색방법을 이용하여 수행하였다. N-카바모일라아제는 단백질 분류상 니트릴라아제 그룹에 속하며(참조: Pace et al., Genome Biol., 2:1-9, 2001; Bork et al., Protein Sci., 3:1344-1346, 1994), 전기 그룹은 산업적으로 유용한 효소인 니트릴라아제와 아미다아제 등의 효소를 포함한다(참조: Cowan et al., Extremophiles, 2:207-216, 1998). 활성 착색방법은 니트릴라아제 그룹에 속하는효소들이 기질의 탄소-질소 결합을 가수분해할 때 생성되는 암모니아가 주변 환경의 pH를 증가시킨다는 사실에 기초한다. 따라서, 분석하고자 하는 효소의 기질과 pH 지시약을 포함하는 고체배지에서 분석하고자 하는 효소를 발현하는 미생물을 배양했을 경우, 발현된 효소가 활성을 가진다면, 기질을 분해하여 생성된 암모니아에 의하여 변화된 pH를 pH 지시약의 색변화로서 확인할 수 있다. 구체적으로, 기질로서의 N-카바모일-D-아미노산과 pH 지시약으로서의 페놀 레드를 포함하는 고체배지에서 본 발명의 대장균을 배양하였을 경우, 만약 본 발명의 대장균이 활성을 가지는 N-카바모일라아제를 발현한다면, N-카바모일라아제는 기질인 N-카바모일-D-아미노산을 가수분해시켜 D-파라-히드록시페닐글리신, 암모니아 및 이산화탄소를 생성시키고, 생성된 암모니아는 배지의 pH를 증가시켜 지시약인 페놀 레드의 색을 노란색에서 붉은색으로 변화시키는 반면, 본 발명의 대장균이 활성을 상실한 N-카바모일라아제를 발현한다면, 배지의 pH는 변화되지 않으므로, pH 지시약의 색도 변화하지 않게 된다. 야생형의 N-카바모일라아제는 과산화수소 처리에 의해 활성이 거의 상실되기 때문에, 활성 착색방법에 의하면 산화적 안정성이 증대되어 잔여 효소활성을 갖는 N-카바모일라아제 변이효소를 신속하고 간편하게 선별할 수 있다. 본 발명의 활성 착색방법은 분석하고자 하는 효소를 발현하는 미생물을 분석하고자 하는 효소의 기질과 pH 지시약을 포함하는 배지에서 배양하는 하나의 단계만으로, 간단하게 효소의 활성여부를 분석할 수 있으므로, 니트릴라아제 그룹에 속하는 효소의 활성분석에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하자고 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: N-카바모일라아제 변이효소의 작제 및 선별
아그로박테리움 튜메파시언스(Agrobacterium tumefaciens) NRRL B11291 유래의 N-카바모일라아제를 암호화하는 유전자에 무작위적인 돌연변이를 가하여 다양한 변이효소를 암호화하는 유전자의 라이브러리를 구축하고, 전기 라이브러리의 유전자를 발현시킨 다음. 산화적 안정성이 증대된 변이효소를 선별하였다: 아그로박테리움 튜메파시언스 NRRL B11291의 염색체로부터 N-카바모일라아제를 암호화하는 유전자(서열번호 1)를 PCR을 통하여 증폭하고, 제한효소 NcoI 및 BamHI으로 절단한 다음, 발현벡터 pTrc99A에 삽입하여 재조합 플라스미드 pCAB를 작제하고, 전기 재조합 플라스미드 pCAB를 주형으로 하고 하기의 CAN 및 CAC를 프라이머로 사용하는 오류유발 PCR을 수행하였다(94℃에서 5분; 94℃에서 60초, 52℃에서 60초, 72℃에서 60초, 30회; 72℃에서 5분).
CAN: 5'-CAAAGGTCCATGGCACGTCAGATG-3'(서열번호 2); 및,
CAC: 5'-AAGGGATCCTTATCGAATTCCGCGATCAG-3'(서열번호 3)
PCR이 완료되면, 수득한 PCR 절편을 0.8% 아가로스 겔을 이용한 전기영동을통하여 분리,정제하고, 제한효소 NcoI 및 BamHI으로 절단한 다음, 동일한 제한효소로 절단한 단백질 발현벡터 pTrc99A에 삽입하여 재조합 플라스미드를 작제하고 대장균 JM109(Promega, USA)에 형질전환시켜, N-카바모일라아제 변이효소를 암호화하는 유전자의 라이브러리를 구축하였다.
전기 라이브러리로부터 야생형 N-카바모일라아제보다 산화적 안정성이 증대된 N-카바모일라아제 변이효소를 발현하는 클론을 선별하기 위하여, 전기 라이브러리의 각 클론을 LB 고체배지에서 37oC로 10시간 동안 배양하였다. 배양으로 생성된 대장균 군락(colony)을 종이 필터로 옮기고, 37oC에서 30분간 3mg의 리소자임(lysozyme, Sigma Chemical Co., USA)을 처리하여 대장균의 세포벽을 용해시킨 다음, 1.5mM 과산화수소로 37oC에서 30분간 처리하고, 5g/L N-카바모일-D-파라-히드록시페닐글리신, 1mM EDTA, 0.01% 페놀레드(phenol red) 및 1% 박토-아가(Bacto-Agar)를 포함하는 pH 7.0의 LB 고체배지에서 배양한 후, 주변 배지를 붉은색으로 변화시킨 클론을 선별하였다.
전기 선별된 클론이 발현하는 산화적 안정성이 증대된 N-카바모일라아제 변이효소보다 산화적 안정성이 보다 증대된 변이효소를 작제하기 위하여, 전기와 동일한 방법으로, 산화적 안정성이 증대된 N-카바모일라아제를 암호화하는 유전자를 주형으로 오류유발 PCR을 수행하고, 유전자의 라이브러리를 구축한 다음, 산화적 안정성이 보다 증대된 변이효소를 선별하고, 전기 변이효소를 'N-카바모일라아제 변이효소 NC23'으로 명명하였다. 전기 변이효소 NC23을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pNC23(참조: 도 2)으로 대장균(E.coli) JM109를 형질전환시킨 미생물을 '대장균(Escherichia coli) NC23(JM109/pTrc99a/NC23)'이라 명명하고, 2002년 1월 28일자로 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 소재하는 국제 기탁기관인 생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 10164BP로 기탁하였다.
실시예 2: N-카바모일라아제 변이효소 NC23의 분리, 정제 및 산화적 안정성 분석
대장균으로부터 N-카바모일라아제 변이효소 NC23을 분리·정제하고, 전기 변이효소의 산화적 안정성을 분석하였다: N-카바모일라아제 변이효소 NC23을 발현하는 대장균을 300ml의 LB 배지에서 흡광도가 0.6 내지 0.7이 될 때까지 배양하고, 1mM IPTG를 첨가하여 37oC에서 3시간 동안 추가 배양하였다. 3시간 후, 배양액을 원심분리하여 분리된 균체를 초음파로 파쇄하고, 여러가지 단백질분해효소의 작용을 억제하기 위하여 1mM PMSF(phenylmethylsulfonylfluoride)를 가한 다음, 리소스 Q(Resource Q, Amersham Pharmacia Biotech, England)로 충진된 이온교환 크로마토그래피에 적용시켰다. 1M NaCl이 첨가된 20mM 인산완충용액(pH 7.0)으로 농도구배를 가하여 단백질을 용출시키고, 전기 용출된 단백질을 소수성 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech, England)에 적용시킨 후, 4% Na2SO4가 첨가된 20mM 인산완충용액(pH 7.0)으로 농도 역구배를 가하여 N-카바모일라아제 변이효소 N23을 포함하는 단백질을 용출시켰다. 일반적으로, 소수성 컬럼으로부터의 단백질 용출에는 주로 (NH4)2SO4를 사용하지만, N-카바모일라아제의 경우 암모니아에 의한 활성저해(참조: Oliveri et al., Biotechnol. Bioeng., 23:2173-2183, 1981)를 막기 위하여, (NH4)2SO4대신 Na2SO4를 사용하였다.
분리·정제된 N-카바모일라아제 변이효소 NC23의 산화적 안정성을 확인하기 위하여, 전기 수득된 N-카바모일라아제 변이효소 NC23을 포함하는 단백질 용출액에 1mM DTT를 가하여 25oC에서 1시간 동안 반응시킨 후, 잔여 DTT를 탈염(desalting) 컬럼(D-salt column, Pierce, USA)을 이용하여 제거하였다. 그런 다음, 전기 단백질 용액(0.25mg/ml)을 다양한 농도의 과산화수소로 처리하여 25oC에서 30분 동안 반응시키고, 25mM N-카바모일-D-파라-히드록시페닐글리신을 가하여 40oC에서 1시간 동안 추가 반응시킨 후, 생성된 D-파라-히드록시페닐글리신의 양을 HPLC(Shimazu, Japan)로 분석하고, 동일한 조건으로 처리한 야생형 N-카바모일라아제에 의해 생성된 D-파라-히드록시페닐글리신의 양과 비교하였다(참조: 도 1). 도 1은 다양한 농도의 과산화수소 처리 후의 야생형 N-카바모일라아제(■) 및 N-카바모일라아제 변이효소 NC23(●)의 잔여 효소활성을 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 과산화수소의 농도가 증가함에 따라 야생형 N-카바모일라아제의 잔여 효소활성은 급격하게 감소하는 반면, N-카바모일라아제 변이효소 NC23의 잔여 효소활성은 과산화수소의 농도에 크게 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있다. 따라서, N-카바모일라아제 변이효소 NC23은 야생형 N-카바모일라아제보다 산화적 안정성이 크게 증대되었다고 할 수 있다.
실시예 3: N-카바모일라아제 변이효소 NC23에서 치환된 아미노산이 산화적 안정성에 끼치는 효과분석
N-카바모일라아제 변이효소 NC23를 암호화하는 유전자의 염기서열(서열번호 4) 및 그로부터 번역된 아미노산 서열(서열번호 5)을 결정하고, 변이효소 NC23에서 치환된 아미노산이 산화적 안정성에 끼치는 효과를 분석하였다: N-카바모일라아제 변이효소 NC23을 암호화하는 유전자의 염기서열을 자동서열분석기(Automated DNA sequencer, Perkin-Elmer, USA)를 이용하여 결정하고, Vector NTI 프로그램(InforMax Inc., USA)을 이용하여, 전기 결정된 N-카바모일라아제 변이효소 NC23의 염기서열을 야생형 N-카바모일라아제를 암호화하는 유전자의 염기서열과 비교하여, 68번째 염기인 아데닌이 티민으로, 119번째 염기인 티민이 시토신으로, 223번째의 염기인 구아닌이 아데닌으로 각각 치환된 것을 확인하였다. 또한, N-카바모일라아제 변이효소 NC23을 암호화하는 유전자의 염기서열을 아미노산 서열로 번역하고, 야생형 N-카바모일라아제의 아미노산 서열과 비교하여, 23번째 아미노산인 글루타민(glutamine, Gln)이 류신(leucine, Leu)으로, 40번째 아미노산인 발린(valnine, Val)이 알라닌(alanine, Ala)으로, 75번째 아미노산인글리신(glycine, Gly)이 세린(serine, Ser)으로 각각 치환된 것을 확인하였다. 치환된 각 아미노산이 변이효소의 산화적 안정성에 끼치는 효과를 확인하기 위하여, 하기의 Q23L-f(서열번호 6)와 Q23L-r(서열번호 7), V40A-f(서열번호 8)와 V40A-r(서열번호 9) 또는 G75S-f(서열번호 10)와 G75S-r(서열번호 11)을 프라이머로 사용하고, 야생형 N-카바모일라아제를 암호화하는 유전자를 주형으로 사용하는 중복 PCR 변이유도(overlap PCR mutagenesis, 참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001)를 통해, 68번째 염기인 아데닌이 티민으로, 119번째 염기인 티민이 시토신으로, 또는, 223번째의 염기인 구아닌이 아데닌으로 치환된 N-카바모일라아제 변이효소(Gln23Leu, Val40Ala 또는 Gly75Ser)를 암호화하는 유전자(서열번호 12, 13 또는 14)를 수득하였다.
Q23L-f: 5'-ACACGCGAACTGGTGGTTGGC-3'(서열번호 6);
Q23L-r: 5'-GCCAACCACCAGTTCGCGTGT-3'(서열번호 7);
V40A-f: 5'-CCGGGGCGCGAACTTCATC-3'(서열번호 8);
V40A-r: 5'-GATGAAGTTCGCGCCCCGG-3'(서열번호 9);
G75S-f: 5'-GAAATGCCCAGCCCGGTG-3'(서열번호 10); 및,
G75S-r: 5'-CACCGGGCTGGGCATTTC-3'(서열번호 11)
전기 수득한 유전자를 발현벡터 pTrc99A에 삽입하여 재조합 플라스미드 'pC-Q23L', 'pC-V40A' 및 'pC-G75S'를 작제하고, 전기 재조합 플라스미드로 대장균(E. coli) JM109를 형질전환시킨 후, 전기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 대장균을배양하고, 변이효소를 분리, 정제하여 과산화수소에 대한 각 변이효소의 산화적 안정성을 분석하였다(참조: 표 1).
표 1: 야생형 N-카바모일라아제, N-카바모일라아제 변이효소 Gln23Leu, Val40Ala, Gly75Ser 및 NC23의 효소활성과 산화적 안정성
효 소 효소활성(unit/mg protein) 산화적 안정성(%)
야생형 N-카바모일라아제 5.8±0.2 5.0±1.2
Gln23Leu 4.4±0.2 65.9±2.3
Val40Ala 3.9±0.2 20.6±1.2
Gly75Ser 3.2±0.2 42.5±0.8
NC23 6.0±0.2 79.3±1.2
상기의 표 1은 야생형 N-카바모일라아제, N-카바모일라아제 변이효소 Gln23Leu, Val40Ala, Gly75Ser 및 NC23의 효소활성과 산화적 안정성을 나타낸다. 표 1에서 Gln23Leu(서열번호 15)은 23번 글루타민이 류신으로, Val40Ala(서열번호 16)는 40번 발린이 알라닌으로, Gly75Ser(서열번호 17)은 75번 글리신이 세린으로 치환된 변이효소를 나타내며, 산화적 안정성은 과산화수소 처리후의 잔여 효소활성을 효소활성에 대한 백분율로 나타낸 것이다. 표 1에서 보듯이, 야생형 효소와 변이효소간의 효소활성은 큰 차이가 나타나지 않는 반면, 야생형 효소와 변이효소들의 산화적 안정성은 큰 차이를 나타내고, 특히, Gln23Leu와 NC23은 야생형 효소와 비교할 때 10배 이상의 산화적 안정성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 각 아미노산의 치환은 모두 N-카바모일라아제 변이효소의 산화적 안정성에 영향을 끼치고, 특히, 23번 글루타민의 류신으로의 치환이 산화적 안정성에 가장 큰 영향을 끼친다고 할 수 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증한 바와 같이, 본 발명은 N-카바모일라아제 변이효소를 암호화하는 유전자, 전기 유전자로부터 발현되는 N-카바모일라아제 변이효소, 전기 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드, 전기 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물, 전기 미생물을 배양하여, N-카바모일라아제 변이효소를 생산하는 방법, 전기 N-카바모일라아제 변이효소를 이용하여 비천연 D-아미노산을 제조하는 방법 및 전기 N-카바모일라아제 변이효소의 활성여부를 분석하는 활성 착색방법을 제공한다. 본 발명의 N-카바모일라아제 변이효소는 야생형의 효소보다 산화적 안정성이 증대되었기 때문에, 이를 이용하여 DTT를 첨가할 필요없이 보다 효율적이고 경제적으로 비천연 D-아미노산을 제조할 수 있다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Mutated N-carbamoylase with Improved Acid-Stability <160> 17 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 915 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 <400> 1 atgacacgtc agatgatact tgctgtcgga cagcaaggcc ccatcgcgcg agcggagaca 60 cgcgaacagg tggttggccg cctcctcgac atgttgacga acgcagccag ccggggcgtg 120 aacttcatcg tctttcccga gcttgcgctc acgaccttct tcccgcgctg gcatttcacc 180 gacgaggccg agctcgatag cttctatgag accgaaatgc ccggcccggt ggtccgtcca 240 ctctttgaga cggccgccga actcgggatc ggcttcaatc tgggctacgc cgaactcgtc 300 gtcgaaggcg gcgtcaagcg tcgcttcaac acgtccattc tggtggataa gtcaggcaag 360 atcgtcggca agtatcgtaa gatccatttg ccgggtcaca aggagtacga ggcctaccgg 420 ccgttccagc atcttgaaaa gcgttatttc gagccgggcg atctcggctt cccggtctat 480 gacgtcgacg ccgcgaaaat ggggatgttc atctgcaacg atcgccgctg gcctgaaacg 540 tggcgggtga tgggacttaa gggcgccgag atcatctgcg gcggctacaa cacgccgacc 600 cacaatcccc ccgttcccca gcacgaccat ctgacgtcct tccaccacct tctgtcgatg 660 caggccgggt cgtaccaaaa cggcgcctgg tccgcggcgg ccggcaaggt cggcatggag 720 gaggggtgca tgctgctcgg ccattcgtgc atcgtggcgc cgaccggcga aatcgttgcc 780 ctgaccacga cgttggaaga cgaggtgatc accgccgccg tcgatctcga ccgctgccgg 840 gaactgcgcg aacacatctt caatttcaaa gcccatcgtc agccacagca ctacggtctg 900 atcgcggaat tctga 915 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CAN <400> 2 caaaggtcca tggcacgtca gatg 24 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CAC <400> 3 aagggatcct tatcgaattc cgcgatcag 29 <210> 4 <211> 915 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 <400> 4 atgacacgtc agatgatact tgctgtcgga cagcaaggcc ccatcgcgcg agcggagaca 60 cgcgaactgg tggttggccg cctcctcgac atgttgacga acgcagccag ccggggcgcg 120 aacttcatcg tctttcccga gcttgcgctc acgaccttct tcccgcgctg gcatttcacc 180 gacgaggccg agctcgatag cttctatgag accgaaatgc cccgcccggt ggtccgtcca 240 ctctttgaga cggccgccga actcgggatc ggcttcaatc tgggctacgc cgaactcgtc 300 gtcgaaggcg gcgtcaagcg tcgcttcaac acgtccattc tggtggataa gtcaggcaag 360 atcgtcggca agtatcgtaa gatccatttg ccgggtcaca aggagtacga ggcctaccgg 420 ccgttccagc atcttgaaaa gcgttatttc gagccgggcg atctcggctt cccggtctat 480 gacgtcgacg ccgcgaaaat ggggatgttc atctgcaacg atcgccgctg gcctgaaacg 540 tggcgggtga tgggacttaa gggcgccgag atcatctgcg gcggctacaa cacgccgacc 600 cacaatcccc ccgttcccca gcacgaccat ctgacgtcct tccaccacct tctgtcgatg 660 caggccgggt cgtaccaaaa cggcgcctgg tccgcggcgg ccggcaaggt cggcatggag 720 gaggggtgca tgctgctcgg ccattcgtgc atcgtggcgc cgaccggcga aatcgttgcc 780 ctgaccacga cgttggaaga cgaggtgatc accgccgccg tcgatctcga ccgctgccgg 840 gaactgcgcg aacacatctt caatttcaaa gcccatcgtc agccacagca ctacggtctg 900 atcgcggaat tctga 915 <210> 5 <211> 304 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 <400> 5 Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala 1 5 10 15 Arg Ala Glu Thr Arg Glu Leu Val Val Gly Arg Leu Leu Asp Met Leu 20 25 30 Thr Asn Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu 50 55 60 Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Ser Pro Val Val Arg Pro 65 70 75 80 Leu Phe Glu Thr Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr 85 90 95 Ala Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser 100 105 110 Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile 115 120 125 His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His 130 135 140 Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr 145 150 155 160 Asp Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg 165 170 175 Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile 180 185 190 Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His 195 200 205 Asp His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser 210 215 220 Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu 225 230 235 240 Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly 245 250 255 Glu Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala 260 265 270 Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn 275 280 285 Phe Lys Ala His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Phe 290 295 300 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Q23L-f <400> 6 acacgcgaac tggtggttgg c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Q23L-r <400> 7 gccaaccacc agttcgcgtg t 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer V40A-f <400> 8 ccggggcgcg aacttcatc 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer V40A-r <400> 9 gatgaagttc gcgccccgg 19 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer G75S-f <400> 10 gaaatgccca gcccggtg 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer G75S-r <400> 11 caccgggctg ggcatttc 18 <210> 12 <211> 915 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 <400> 12 atgacacgtc agatgatact tgctgtcgga cagcaaggcc ccatcgcgcg agcggagaca 60 cgcgaactgg tggttggccg cctcctcgac atgttgacga acgcagccag ccggggcgtg 120 aacttcatcg tctttcccga gcttgcgctc acgaccttct tcccgcgctg gcatttcacc 180 gacgaggccg agctcgatag cttctatgag accgaaatgc ccggcccggt ggtccgtcca 240 ctctttgaga cggccgccga actcgggatc ggcttcaatc tgggctacgc cgaactcgtc 300 gtcgaaggcg gcgtcaagcg tcgcttcaac acgtccattc tggtggataa gtcaggcaag 360 atcgtcggca agtatcgtaa gatccatttg ccgggtcaca aggagtacga ggcctaccgg 420 ccgttccagc atcttgaaaa gcgttatttc gagccgggcg atctcggctt cccggtctat 480 gacgtcgacg ccgcgaaaat ggggatgttc atctgcaacg atcgccgctg gcctgaaacg 540 tggcgggtga tgggacttaa gggcgccgag atcatctgcg gcggctacaa cacgccgacc 600 cacaatcccc ccgttcccca gcacgaccat ctgacgtcct tccaccacct tctgtcgatg 660 caggccgggt cgtaccaaaa cggcgcctgg tccgcggcgg ccggcaaggt cggcatggag 720 gaggggtgca tgctgctcgg ccattcgtgc atcgtggcgc cgaccggcga aatcgttgcc 780 ctgaccacga cgttggaaga cgaggtgatc accgccgccg tcgatctcga ccgctgccgg 840 gaactgcgcg aacacatctt caatttcaaa gcccatcgtc agccacagca ctacggtctg 900 atcgcggaat tctga 915 <210> 13 <211> 915 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 <400> 13 atgacacgtc agatgatact tgctgtcgga cagcaaggcc ccatcgcgcg agcggagaca 60 cgcgaacagg tggttggccg cctcctcgac atgttgacga acgcagccag ccggggcgcg 120 aacttcatcg tctttcccga gcttgcgctc acgaccttct tcccgcgctg gcatttcacc 180 gacgaggccg agctcgatag cttctatgag accgaaatgc ccggcccggt ggtccgtcca 240 ctctttgaga cggccgccga actcgggatc ggcttcaatc tgggctacgc cgaactcgtc 300 gtcgaaggcg gcgtcaagcg tcgcttcaac acgtccattc tggtggataa gtcaggcaag 360 atcgtcggca agtatcgtaa gatccatttg ccgggtcaca aggagtacga ggcctaccgg 420 ccgttccagc atcttgaaaa gcgttatttc gagccgggcg atctcggctt cccggtctat 480 gacgtcgacg ccgcgaaaat ggggatgttc atctgcaacg atcgccgctg gcctgaaacg 540 tggcgggtga tgggacttaa gggcgccgag atcatctgcg gcggctacaa cacgccgacc 600 cacaatcccc ccgttcccca gcacgaccat ctgacgtcct tccaccacct tctgtcgatg 660 caggccgggt cgtaccaaaa cggcgcctgg tccgcggcgg ccggcaaggt cggcatggag 720 gaggggtgca tgctgctcgg ccattcgtgc atcgtggcgc cgaccggcga aatcgttgcc 780 ctgaccacga cgttggaaga cgaggtgatc accgccgccg tcgatctcga ccgctgccgg 840 gaactgcgcg aacacatctt caatttcaaa gcccatcgtc agccacagca ctacggtctg 900 atcgcggaat tctga 915 <210> 14 <211> 915 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 <400> 14 atgacacgtc agatgatact tgctgtcgga cagcaaggcc ccatcgcgcg agcggagaca 60 cgcgaacagg tggttggccg cctcctcgac atgttgacga acgcagccag ccggggcgtg 120 aacttcatcg tctttcccga gcttgcgctc acgaccttct tcccgcgctg gcatttcacc 180 gacgaggccg agctcgatag cttctatgag accgaaatgc ccagcccggt ggtccgtcca 240 ctctttgaga cggccgccga actcgggatc ggcttcaatc tgggctacgc cgaactcgtc 300 gtcgaaggcg gcgtcaagcg tcgcttcaac acgtccattc tggtggataa gtcaggcaag 360 atcgtcggca agtatcgtaa gatccatttg ccgggtcaca aggagtacga ggcctaccgg 420 ccgttccagc atcttgaaaa gcgttatttc gagccgggcg atctcggctt cccggtctat 480 gacgtcgacg ccgcgaaaat ggggatgttc atctgcaacg atcgccgctg gcctgaaacg 540 tggcgggtga tgggacttaa gggcgccgag atcatctgcg gcggctacaa cacgccgacc 600 cacaatcccc ccgttcccca gcacgaccat ctgacgtcct tccaccacct tctgtcgatg 660 caggccgggt cgtaccaaaa cggcgcctgg tccgcggcgg ccggcaaggt cggcatggag 720 gaggggtgca tgctgctcgg ccattcgtgc atcgtggcgc cgaccggcga aatcgttgcc 780 ctgaccacga cgttggaaga cgaggtgatc accgccgccg tcgatctcga ccgctgccgg 840 gaactgcgcg aacacatctt caatttcaaa gcccatcgtc agccacagca ctacggtctg 900 atcgcggaat tctga 915 <210> 15 <211> 304 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 <400> 15 Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala 1 5 10 15 Arg Ala Glu Thr Arg Glu Leu Val Val Gly Arg Leu Leu Asp Met Leu 20 25 30 Thr Asn Ala Ala Ser Arg Gly Val Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu 50 55 60 Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro 65 70 75 80 Leu Phe Glu Thr Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr 85 90 95 Ala Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser 100 105 110 Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile 115 120 125 His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His 130 135 140 Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr 145 150 155 160 Asp Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg 165 170 175 Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile 180 185 190 Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His 195 200 205 Asp His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser 210 215 220 Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu 225 230 235 240 Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly 245 250 255 Glu Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala 260 265 270 Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn 275 280 285 Phe Lys Ala His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Phe 290 295 300 <210> 16 <211> 304 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 <400> 16 Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala 1 5 10 15 Arg Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Gly Arg Leu Leu Asp Met Leu 20 25 30 Thr Asn Ala Ala Ser Arg Gly Ala Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu 50 55 60 Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Gly Pro Val Val Arg Pro 65 70 75 80 Leu Phe Glu Thr Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr 85 90 95 Ala Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser 100 105 110 Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile 115 120 125 His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His 130 135 140 Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr 145 150 155 160 Asp Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg 165 170 175 Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile 180 185 190 Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His 195 200 205 Asp His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser 210 215 220 Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu 225 230 235 240 Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly 245 250 255 Glu Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala 260 265 270 Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn 275 280 285 Phe Lys Ala His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Phe 290 295 300 <210> 17 <211> 304 <212> PRT <213> Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291 <400> 17 Met Thr Arg Gln Met Ile Leu Ala Val Gly Gln Gln Gly Pro Ile Ala 1 5 10 15 Arg Ala Glu Thr Arg Glu Gln Val Val Gly Arg Leu Leu Asp Met Leu 20 25 30 Thr Asn Ala Ala Ser Arg Gly Val Asn Phe Ile Val Phe Pro Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Thr Thr Phe Phe Pro Arg Trp His Phe Thr Asp Glu Ala Glu 50 55 60 Leu Asp Ser Phe Tyr Glu Thr Glu Met Pro Ser Pro Val Val Arg Pro 65 70 75 80 Leu Phe Glu Thr Ala Ala Glu Leu Gly Ile Gly Phe Asn Leu Gly Tyr 85 90 95 Ala Glu Leu Val Val Glu Gly Gly Val Lys Arg Arg Phe Asn Thr Ser 100 105 110 Ile Leu Val Asp Lys Ser Gly Lys Ile Val Gly Lys Tyr Arg Lys Ile 115 120 125 His Leu Pro Gly His Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Arg Pro Phe Gln His 130 135 140 Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Glu Pro Gly Asp Leu Gly Phe Pro Val Tyr 145 150 155 160 Asp Val Asp Ala Ala Lys Met Gly Met Phe Ile Cys Asn Asp Arg Arg 165 170 175 Trp Pro Glu Thr Trp Arg Val Met Gly Leu Lys Gly Ala Glu Ile Ile 180 185 190 Cys Gly Gly Tyr Asn Thr Pro Thr His Asn Pro Pro Val Pro Gln His 195 200 205 Asp His Leu Thr Ser Phe His His Leu Leu Ser Met Gln Ala Gly Ser 210 215 220 Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Ala Ala Ala Gly Lys Val Gly Met Glu 225 230 235 240 Glu Gly Cys Met Leu Leu Gly His Ser Cys Ile Val Ala Pro Thr Gly 245 250 255 Glu Ile Val Ala Leu Thr Thr Thr Leu Glu Asp Glu Val Ile Thr Ala 260 265 270 Ala Val Asp Leu Asp Arg Cys Arg Glu Leu Arg Glu His Ile Phe Asn 275 280 285 Phe Lys Ala His Arg Gln Pro Gln His Tyr Gly Leu Ile Ala Glu Phe 290 295 300

Claims (20)

  1. 서열번호 4의 염기서열로 나타내어지는 N-카바모일라아제 변이효소를 암호화하는 유전자.
  2. 서열번호 12의 염기서열로 나타내어지는 N-카바모일라아제 변이효소를 암호화하는 유전자.
  3. 삭제
  4. 서열번호 14의 염기서열로 나타내어지는 N-카바모일라아제 변이효소를 암호화하는 유전자.
  5. 제 1항의 유전자로부터 발현되어, 서열번호 5의 아미노산 서열로 나타내어지는 N-카마모일라아제 변이효소 NC23.
  6. 제 2항의 유전자로부터 발현되어, 서열번호 15의 아미노산 서열로 나타내어지는 N-카마모일라아제 변이효소 Gln23Leu.
  7. 삭제
  8. 제 4항의 유전자로부터 발현되어, 서열번호 17의 아미노산 서열로 나타내어지는 N-카마모일라아제 변이효소 Gly75Ser.
  9. 제 1항의 유전자를 포함하며, 도 2의 유전자 지도로 나타내어지는 재조합 플라스미드 pNC23.
  10. 제 9항의 재조합 플라스미드 pNC23으로 형질전환된 대장균(Escherichia coli) NC23(JM109/pTrc99a/NC23)(KCTC 10164BP).
  11. 제 1항, 제 2항 및 제 4항 중 어느 한 항에 개시된 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 미생물을 배양하여, 전기 유전자로부터 발현된 N-카바모일라아제 변이효소를 수득하는 공정을 포함하는 N-카바모일라아제 변이효소를 생산하는 방법.
  12. 제 5항, 제 6항 및 제 8항 중 어느 한 항에 개시된 N-카바모일라아제 변이효소를 N-카바모일-D-아미노산과 반응시키는 공정을 포함하는 비천연 D-아미노산을 제조하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    N-카바모일-D-아미노산은 N-카바모일-D-파라-히드록시페닐글리신, N- 카바모일-D-발린 또는 N-카바모일-D-세린인 것을 특징으로 하는
    비천연 D-아미노산을 제조하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    비천연 D-아미노산은 D-파라-히드록시페닐글리신, D-발린 또는 D-세린 인 것을 특징으로 하는
    비천연 D-아미노산을 제조하는 방법.
  15. 제 9항의 재조합 플라스미드 pNC23으로 형질전환된 제 10항의 대장균(Escherichia coli) NC23(JM109/pTrc99a/NC23)(KCTC 10164BP)을 배양하여 수득한 N-카바모일라아제 변이효소 NC23을 N-카바모일-D-파라-히드록시페닐글리신과 반응시키는 공정을 포함하는 D-파라-히드록시페닐글리신을 제조하는 방법.
  16. 니트릴라아제(nitrilase) 그룹에 속하는 효소의 기질 및 pH 지시약을 포함하는 고체배지에서 전기 효소를 발현하는 미생물을 배양하고, pH 지시약에 의한 배지의 색변화로서 효소의 활성여부를 분석하는 단계를 포함하는 활성 착색방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    니트릴라아제 그룹에 속하는 효소는 카바모일라아제, 니트릴라아제 또 는 아미다아제인 것을 특징으로 하는
    활성 착색방법.
  18. 제 16항에 있어서,
    기질은 N-카바모일-D-아미노산인 것을 특징으로 하는
    활성 착색방법.
  19. 제 16항에 있어서,
    미생물은 대장균(Escherichia coli) NC23(JM109/pTrc99a/NC23)(KCTC 10164BP)인 것을 특징으로 하는
    활성 착색방법.
  20. 제 16항에 있어서,
    pH 지시약은 페놀 레드(phenol red)인 것을 특징으로 하는
    활성 착색방법.
KR10-2002-0014243A 2002-03-16 2002-03-16 산화적 안정성이 증대된 엔-카바모일라아제 변이효소 KR100464780B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0014243A KR100464780B1 (ko) 2002-03-16 2002-03-16 산화적 안정성이 증대된 엔-카바모일라아제 변이효소

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0014243A KR100464780B1 (ko) 2002-03-16 2002-03-16 산화적 안정성이 증대된 엔-카바모일라아제 변이효소

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030075098A KR20030075098A (ko) 2003-09-22
KR100464780B1 true KR100464780B1 (ko) 2005-01-06

Family

ID=32225027

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2002-0014243A KR100464780B1 (ko) 2002-03-16 2002-03-16 산화적 안정성이 증대된 엔-카바모일라아제 변이효소

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100464780B1 (ko)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI 서열 Accession # 2211348A (1996.11.26) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20030075098A (ko) 2003-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9896705B2 (en) L-arabinose isomerase variants with improved conversion activity and method for production of D-tagatose using them
US7399624B2 (en) Cephalosporin C acylases
Verseck et al. Screening, overexpression and characterization of an N-acylamino acid racemase from Amycolatopsis orientalis subsp. lurida
KR100464780B1 (ko) 산화적 안정성이 증대된 엔-카바모일라아제 변이효소
KR100777230B1 (ko) 써모코커스 유래 돌연변이 ｄｎａ 중합효소들 및 그의유전자들
CN115960873A (zh) 一种蛋白质谷氨酰胺酶及其应用
KR102589135B1 (ko) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
US8669078B2 (en) Ammonia-specific 5′-XMP aminase mutant
Martínez-Rodríguez et al. Molecular cloning and biochemical characterization of L-N-carbamoylase from Sinorhizobium meliloti CECT4114
KR102434925B1 (ko) 3-메틸-2-옥소뷰타노에이트 하이드록시 메틸트랜스퍼라아제의 활성이 강화된 미생물, 및 이의 용도
WO2023143123A1 (zh) 可控合成单链dna的末端转移酶变体及应用
KR0184755B1 (ko) 재조합 내열성 티로신 페놀리아제 및 이를 이용한 엘-도파의 제조방법
JP2002510484A (ja) アースロバクターアウレッセンスからの組み換えｌ−ｎ−カルバモイラーゼ、それによるｌ−アミノ酸の製造方法
AU1568900A (en) Method for isolating and selecting genes coding for enzymes, and suitable culture medium
CN116848252A (zh) 用于组成型表达的新型启动子变体及其用途
KR100266754B1 (ko) Udp－xylosepyrophosphorylase의유전자염기서열,그발현벡터와재조합uxpase의생산방법
CN117210429A (zh) 一种组氨酸三甲基化酶EgtD突变体及其应用
KR100941304B1 (ko) 신규 뉴클레오시드 하이드롤라제ⅰ
KR20230100925A (ko) 항시발현용 신규 프로모터 변이체 및 이의 용도
CN114395543A (zh) 一种海藻糖合酶突变体及其应用
KR100942133B1 (ko) 신규 뉴클레오시드 하이드롤라제 ⅱ
JPH0556779A (ja) 遺伝子組換えによる耐熱性β−チロシナーゼの製造方法
JPH09107961A (ja) 新規な耐熱性ピルビン酸キナーゼ及びその製造法
CA2126001A1 (en) Human deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20071130

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee