CN117106759A - 一种r型酰胺水解酶、制备方法及其在制备普瑞巴林中间体上的应用 - Google Patents
一种r型酰胺水解酶、制备方法及其在制备普瑞巴林中间体上的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117106759A CN117106759A CN202311078857.0A CN202311078857A CN117106759A CN 117106759 A CN117106759 A CN 117106759A CN 202311078857 A CN202311078857 A CN 202311078857A CN 117106759 A CN117106759 A CN 117106759A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- type
- amidohydrolase
- preparation
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- AYXYPKUFHZROOJ-ZETCQYMHSA-N pregabalin Chemical compound CC(C)C[C@H](CN)CC(O)=O AYXYPKUFHZROOJ-ZETCQYMHSA-N 0.000 title claims abstract description 16
- 229960001233 pregabalin Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 29
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- NPDKTSLVWGFPQG-SSDOTTSWSA-N (3r)-3-(2-amino-2-oxoethyl)-5-methylhexanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](CC(N)=O)CC(O)=O NPDKTSLVWGFPQG-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims abstract description 11
- FNAQPQLVCOZGRH-UHFFFAOYSA-N 4-(2-methylpropyl)piperidine-2,6-dione Chemical compound CC(C)CC1CC(=O)NC(=O)C1 FNAQPQLVCOZGRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 claims description 17
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 claims description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 8
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 abstract description 17
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 abstract description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 12
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 229920003180 amino resin Polymers 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N (+)-Neomenthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@@H]1O NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N 0.000 description 1
- SWFXGBPZRVILCJ-QMMMGPOBSA-N (3R)-3-(2-hydroxyethyl)-5-methylhexanamide Chemical compound C(N)(=O)C[C@@H](CCO)CC(C)C SWFXGBPZRVILCJ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- XYHKNCXZYYTLRG-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole-2-carbaldehyde Chemical compound O=CC1=NC=CN1 XYHKNCXZYYTLRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGTASENVNYJZBK-UHFFFAOYSA-N 3,4,5-trimethoxyamphetamine Chemical compound COC1=CC(CC(C)N)=CC(OC)=C1OC WGTASENVNYJZBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPDKTSLVWGFPQG-UHFFFAOYSA-N 3-(2-amino-2-oxoethyl)-5-methylhexanoic acid Chemical compound CC(C)CC(CC(N)=O)CC(O)=O NPDKTSLVWGFPQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 3-Methylbutanoic acid Natural products CC(C)CC([O-])=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 101100013496 Mus musculus Aifm2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001263 acyl chlorides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N beta-methyl-butyric acid Natural products CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000012069 chiral reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000006193 diazotization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N hydantoin Chemical compound O=C1CNC(=O)N1 WJRBRSLFGCUECM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940091173 hydantoin Drugs 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 208000021722 neuropathic pain Diseases 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940126672 traditional medicines Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/091—Phenol resins; Amino resins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种R型酰胺水解酶、制备方法及其在制备普瑞巴林中间体上的应用，提供了来自芽孢杆菌的目的基因表达的R型酰胺水解酶及其突变酶作为普瑞巴林中间体R‑3‑(氨甲酰甲基)‑5‑甲基己酸的制备方法，以3‑异丁基戊二酰亚胺为底物进行生物催化反应，并进一步提供了制备固定化载体的优选方案，利用该方法生产，转化率不低于99％，产物ee值不低于99％，转化结束后固定化酶经抽滤可与转化液直接分离，重复用于下一批转化，固定化酶重复利用次数不低于25次。
Description
技术领域
本发明涉及生物酶催化领域，具体地说涉及一种R型酰胺水解酶、制备方法及其在制备普瑞巴林中间体上的应用。
背景技术
普瑞巴林作为治疗神经性理性疼痛和癫痫的药物与一些传统药物相比具有副作用小、服用剂量少等优点，具有很大的市场前景。普瑞巴林的销售额也逐年迅速增长，使其成为了全球药品市场上增长最快速的药品之一，因此无论在国内还是国外对普瑞巴林的研究依旧是热点之一。
普瑞巴林中间体手性决定了普瑞巴林成品手性纯度，目前普瑞巴林主要采用化学法合成，例如美国专利申请US20030225161A1(公开日2003年12月4日)公开了以异戊酸为原料，先制备成酰氯，再与手性试剂发生亲和取代制备手性中间体的合成路线，再进一步经亲和取代、羰基还原、酯化、重氮化等反应制备普瑞巴林，该方法通过不对称合成法，以手性试剂诱导产生手性中心，需要使用大量昂贵的手性试剂，且在反应过程中，为避免手性中心消旋化，操作条件比较苛刻，合成路线长。此外，US5616793A、CN105085290A、WO2008007145A2等专利文献披露了使用不同的手性拆分剂(如苯乙胺，苯甘氨醇，薄荷醇等)合成混旋体的3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。手性拆分剂的价格通常都比较昂贵，且拆分效率只有40％左右，另一半异构体没有得到很好的利用。综合来看，目前化学法合成普瑞巴林中间体涉及繁琐的合成路线和大量有机溶剂进行手性拆分，仅一半构型的化合物能用于目标产物的纯化，成本高且不环保。
生物法具有立体选择性强、反应条件温和、污染少等优点，一条有效途径是选用合适的酰胺水解酶将底物3-异丁基戊二酰亚胺水解为R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。中国专利申请CN111944856A(公开日2020年11月17日)公开海因酶制备R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的技术方案，转化底物浓度2g/L，产物ee值99％；中国专利(CN114164198A)公开了一种酰胺水解酶突变体可制备高光学纯度R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，但未提及转化底物浓度。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种高立体异构选择性的R型酰胺水解酶水解底物以获得R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；本发明还有一个目的是提供所述R型酰胺水解酶的编码基因、重组质粒和宿主细胞；本发明还有一个目的是提供利用前述R型酰胺水解酶在制备普瑞巴林中间体上的应用；本发明还有一个目的是提供转化率高、立体异构体纯度高的生物催化R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的制备方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种R型酰胺水解酶，包括与SEQ IDNO:1所示氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列。
具体地说，所述R型酰胺水解酶选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4任意一条氨基酸序列。这三条序列是基于SEQ ID NO:1定点突变获得，突变位点如表1所示。
本发明还提供一种酶组合物，包括不少于两种不同的R型酰胺水解酶，所述R型酰胺水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4任意一条氨基酸序列所示。
本发明还提供编码所述R型酰胺水解酶的基因片段，其与上述R型酰胺水解酶的关系如表1所示。
表1酰胺水解酶及突变位点
| 酶 | 对应氨基酸序列 | 突变位点 | 对应核苷酸序列 |
| AMD I | SEQ ID NO:1 | - | SEQ ID NO:5 |
| AMD II | SEQ ID NO:2 | I31L、E164G | SEQ ID NO:6 |
| AMD III | SEQ ID NO:3 | I31L、E164G、S254M | SEQ ID NO:7 |
| AMD IV | SEQ ID NO:4 | I31L、E164G、S254M、D315A | SEQ ID NO:8 |
通过基因工程手段，将上述核苷酸序列对应的基因片段与质粒载体结合获得重组质粒，转染感受态宿主细胞中获得可生产R型酰胺水解酶的发酵菌种。将发酵菌液破碎后即可直接对底物进行生物催化，或进一步与固定化载体结合以提高酶的重复使用率。
利用本发明获得的R型酰胺水解酶制备普瑞巴林中间体的技术路线如下：
在磷酸缓冲液中，以3-异丁基戊二酰亚胺为底物，加入R型酰胺水解酶在30-50℃、pH 7.0-9.0的条件下进行生物催化反应，经分离和/或纯化后获得R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；其中，所述R型酰胺水解酶具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4任意一条氨基酸序列。作为本发明的进一步优化，反应体系的催化条件为40-45℃、pH7.5-8.0。
所述R型酰胺水解酶是通过制备包含目的基因的重组质粒，转染感受态宿主细胞后，经生物发酵、超声破碎后获得的酶液。
作为本发明的进一步优化以适用于工业化生产：将所述酶液与固定化载体结合，作为R型酰胺水解酶使用，底物浓度为150-250g/L。与固定化载体的结合包括但不限于物理吸附、包埋、共价结合、化学交联任意一种或多种的结合。
优选地，所述固定化载体选自LX-1000HA、LX-1000EP、LX-1000NH、LX-1000HFA，DIAIONHP2MG、SEPABEADSEC-EP、SEPABEADSEC-HFA、SEPABEADSEC-HA、SEPABEADSEC-HFA/S的任意一种或多种的组合。
进一步地，所述固定化载体与酶液的质量比1:10-20，优选为1:10。
有益效果：本发明提供的R型酰胺水解酶可用于在制备R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，底物3-异丁基戊二酰亚胺投加浓度不低于200g/L，转化率不低于99％，产物ee值不低于99％，转化结束后固定化酶经抽滤可与转化液直接分离，重复用于下一批转化，固定化酶重复利用次数不低于25次。该方法无需引入其他助溶剂或游离酶蛋白等杂质，整个过程操作方便、产物分离简单。
附图说明
图1为DIAION HP2MG、Seplite LX-1000HA、SEPABEADSEC-HA三种树脂固定化酶稳定性比较；
图2为实施例8固定化酰胺水解酶重复操作使用次数。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1R型酰胺水解酶表达菌株的制备
利用无缝克隆技术将来源于芽孢杆菌属ISL-75(NCBI Reference Sequence:WP_215013235.1)的核苷酸序列SEQ ID No.5连接于质粒pET28a(+)载体上，获得重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌BL21 star(DE3)感受态细胞中进行转化，冰浴30min后，45℃水浴热激90s，再冰浴2min后将菌液均匀地涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基的平板上，37℃培养18h后获得菌落。挑取上述单克隆菌落接入4mL含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养12小时后，将菌液全部接种至600mL TB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600至1左右，加入终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导，25℃诱导16h。然后5000rpm离心20分钟收集含酰胺水解酶的湿菌体，其中含有R型酰胺水解酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，定义为AMD I。
参照表1将对SEQ ID NO:1进行定点突变，分别获得SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4序列，委托安徽通用生物股份有限公司合成对应的核苷酸序列SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8，分别连接质粒pET28a(+)载体上，获得重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌BL21 star(DE3)感受态细胞中进行转化，冰浴30min后，45℃水浴热激90s，再冰浴2min后将菌液均匀地涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基的平板上，37℃培养18h后获得菌落。挑取上述单克隆菌落接入4mL含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，37℃，180rpm培养12小时后，将菌液全部接种至600mL TB液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD600至1左右，加入终浓度为0.3mM的IPTG进行诱导，25℃诱导16h。然后5000rpm离心20分钟收集含酰胺水解酶的湿菌体获得突变后的酰胺水解酶的湿菌体，分别记为AMD II、AMDIII、AMD IV。
实施例2
菌体细胞酶活的检测方法：取10mL磷酸缓冲液(0.2M，pH 7.5)，加入0.1g 3-异丁基戊二酰亚胺，加入0.5g实施例1获得的湿菌体，40℃反应2h，液相检测底物转化率和产物ee值，结果如表2所示。
表2 R型酰胺水解酶酶活比较
| 酶 | 转化率％ | 产物ee％ | 产物主要构型 |
| AMD I | 71.5 | 71.8 | R |
| AMD II | 79.5 | 85.7 | R |
| AMD III | 91.6 | 94.4 | R |
| AMD IV | 97.8 | 99.2 | R |
实施例3固定化酶的制备
1.氨基树脂固定化载体活化
a.按10g氨基树脂加入40mL 0.1M PBS缓冲液(pH＝4.2-4.5)，在温度20-25℃，转速150rpm，搅拌或振荡15min，结束后用4M NaOH溶液调pH＝8.0，弃液体；
b.加入40mL 0.02M的PBS缓冲液(pH8.0)，在温度20-25℃，转速150rpm，搅拌或振荡5min，弃液体；
c.加入40mL 0.02M的PBS缓冲液(pH8.0)，再加入1.6mL 50％的戊二醛(即戊二醛的使用浓度为2％)，在温度20-25℃，转速150rpm，搅拌或振荡60min，弃液体，然后用0.02MPBS洗两遍，抽干液体即得活化后氨基酸树脂载体，备用。
一般氨基树脂使用前需要活化，其他类型树脂无需活化。
2.酶液制备
由于经定点突变后AMD IV酶活和手性值最为理想，后续实施例均选用AMD IV作为固定化用酶。
取20g实施例2制备的湿菌体AMD IV用80g磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH 7.0)重悬，超声破碎后，6000rpm离心即得R型酰胺水解酶液。
3.固定化酶制备
取1g树脂载体，加入10g酶液，25℃，180rpm振荡20h，抽滤水洗三次，再用0.02MPBSpH8.0的缓冲液，0.5M NaCl，150rpm，搅拌或振荡45min，然后用0.02M PBS pH8.0的缓冲液洗2次，抽滤即得固定化酶。
实施例4固定化R型酰胺水解酶的酶活比较
1.固定化R型酰胺水解酶的制备
根据表3提供的不同固定化载体，按照实施例3所述的方法制备固定化R型酰胺水解酶。
表3不同树脂型号
| 树脂名称 | 树脂官能团 | 树脂来源 |
| Seplite LX-1000HA | 氨基 | 西安蓝晓 |
| Seplite LX-1000NH | 氨基 | 西安蓝晓 |
| SEPABEADSEC-HA | 氨基 | 日本三菱 |
| Seplite LX-1000EP | 环氧 | 西安蓝晓 |
| Seplite LX-1000HFA | 环氧 | 西安蓝晓 |
| SEPABEADSEC-EP | 环氧 | 日本三菱 |
| SEPABEADSEC-HFA | 长间隔臂环氧 | 日本三菱 |
| SEPABEADSEC-HFA/S | 氨基环氧官能团 | 日本三菱 |
| DIAION HP2MG | 吸附 | 日本三菱 |
2.酰胺水解酶液酶活检测方法
取9mL磷酸缓冲液(0.2M，pH 7.5)，加入0.3g 3-异丁基戊二酰亚胺，加入1mL上述实施例2制备的酰胺水解酶液，40℃反应20min，液相检测底物生成量。酶活定义：1min产生1μmol R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸定义为一个酶活单位。
3.固定化酰胺水解酶酶活检测方法
取10mL磷酸缓冲液(0.2M，pH 7.5)，加入0.3g 3-异丁基戊二酰亚胺，加入0.2g上述实施例3制备的固定化酰胺水解酶，40℃反应20min，液相检测底物生成量。酶活定义：1min产生1μmol R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸定义为一个酶活单位。
4.试验结果
如表4可以看出，使用DIAION HP2MG作为固定化载体酶活回收率最高，固定化效果最好，LX-1000HA、SEPABEADSEC-HA效果其次。
表4不同树脂固定化亚胺还原酶结果
| 型号 | LX-1000HA | LX-1000NH | SEPABEADSEC-HA |
| 比酶活(U/g) | 102 | 92 | 112 |
| 酶活回收率％ | 43.5 | 39.8 | 47.6 |
| 型号 | LX-1000EP | LX-1000HFA | SEPABEADSEC-EP |
| 比酶活(U/g) | 52 | 40 | 60 |
| 酶活回收率％ | 21.3 | 16.4 | 25.6 |
| 型号 | SEPABEADSEC-HFA | SEPABEADSEC-HFA/S | DIAION HP2MG |
| 比酶活(U/g) | 42 | 76 | 174 |
| 酶活回收率％ | 18.0 | 32.4 | 74.2 |
实施例5固定化酶的稳定性比较
DIAION HP2MG、Seplite LX-1000HA、SEPABEADSEC-HA三种树脂固定化酶稳定性比较：取10mL磷酸缓冲液(0.2M，pH 7.5)，加入0.3g 3-异丁基戊二酰亚胺，加入0.5g上述实施例3制备的固定化酰胺水解酶，40℃反应2h，液相检测转化率，抽滤将所得的固定化酶重复操作用于下次催化反应，三种酶重复使用6次结果如图1所示，选用DIAION HP2MG树脂制备固定化酶使用第三次转化几乎难以反应，而Seplite LX-1000HA、SEPABEADSEC-HA制备固定化酶较稳定，转化率仍保持97％以上，表明DIAION HP2MG树脂尽管有着较高的酶活回收率，但由于其与酶蛋白之间是通过吸附结合，相较于后两者共价结合，稳定性较差。
实施例6固定化酰胺水解酶制备R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸
转化体系：950g磷酸缓冲液(0.2M，pH 7.5)，加入200g 3-异丁基戊二酰亚胺，加入100g固定化酰胺水解酶，45℃搅拌，反应30h，高效液相色谱HPLC检测转产物浓度201.5g/L，转化率99.5％,ee值99.1％。
实施例7固定化酰胺水解酶重复操作使用次数
分别选用Seplite LX-1000HA、SEPABEADSEC-HA制备的固定化酶按照实施例6转化方案进行连续转化，即每次转化完成后，将抽滤获得固定化酶继续用于下次催化反应，酶活稳定如图2所示，以第一次使用固定化酶酶活定为100％，使用25次后仍保留初始酶活的90％以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (12)
1.一种R型酰胺水解酶，其特征在于：包括与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种R型酰胺水解酶，其特征在于：选自SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4任意一条氨基酸序列。
3.酶组合物，包括不少于两种不同的R型酰胺水解酶，所述R型酰胺水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4任意一条氨基酸序列所示。
4.编码权利要求2所述R型酰胺水解酶的基因片段。
5.一种重组质粒，包含权利要求4所述的基因片段。
6.一种宿主细胞，包含权利要求所述的重组质粒。
7.权利要求1或2所述R型酰胺水解酶，或权利要求3所述的酶组合物在制备普瑞巴林中间体上的应用。
8.R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的制备方法，其特征在于：在磷酸缓冲液中，以3-异丁基戊二酰亚胺为底物，加入R型酰胺水解酶在30-50℃、pH 7.0-9.0的条件下进行生物催化反应，经分离和/或纯化后获得R-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸；
其中，所述R型酰胺水解酶具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4任意一条氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述R型酰胺水解酶是通过制备包含目的基因的重组质粒，转染感受态宿主细胞后，经生物发酵、超声破碎后获得的酶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：进一步将所述酶液与固定化载体结合，作为R型酰胺水解酶使用，底物浓度为150-250g/L。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述固定化载体选自LX-1000HA、LX-1000EP、LX-1000NH、LX-1000HFA，DIAIONHP2MG、SEPABEADSEC-EP、SEPABEADSEC-HFA、SEPABEADSEC-HA、SEPABEADSEC-HFA/S的任意一种或多种的组合。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述固定化载体与酶液的质量比1:10-20。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311078857.0A CN117106759A (zh) | 2023-08-24 | 2023-08-24 | 一种r型酰胺水解酶、制备方法及其在制备普瑞巴林中间体上的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311078857.0A CN117106759A (zh) | 2023-08-24 | 2023-08-24 | 一种r型酰胺水解酶、制备方法及其在制备普瑞巴林中间体上的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117106759A true CN117106759A (zh) | 2023-11-24 |
Family
ID=88810572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311078857.0A Pending CN117106759A (zh) | 2023-08-24 | 2023-08-24 | 一种r型酰胺水解酶、制备方法及其在制备普瑞巴林中间体上的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117106759A (zh) |
-
2023
- 2023-08-24 CN CN202311078857.0A patent/CN117106759A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11987826B2 (en) | Nitrilase mutant and application thereof in the synthesis of an anti-epileptic drug intermediate | |
| CN104212784B (zh) | 重组腈水解酶、编码基因、突变体、工程菌及应用 | |
| US11085059B2 (en) | Methylopila sp. and use thereof in selective resolution preparation of (S)-α-ethyl-2-oxo-1-pyrrolidineacetate | |
| US20060240532A1 (en) | DNA encoding hydantoinase, DNA encoding N-carbamyl-L-amino acid hydrolase, recombinant DNA, transformed cell, method of producing protein and method of producing optically active amino acid | |
| JP7401116B2 (ja) | 新規なｌ－アミノ酸オキシダーゼ及びｄ－アミノ酸又はその誘導体の製造方法 | |
| KR100244066B1 (ko) | D-N-카르바모일-α-아미노산의 제조법 | |
| CN104212850A (zh) | 利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法 | |
| CN117106759A (zh) | 一种r型酰胺水解酶、制备方法及其在制备普瑞巴林中间体上的应用 | |
| US6686181B1 (en) | Method for the production of L-amino acids from their racemic N-aceytyl-D, L-derivatives by enzymatic racemate cleavage by means of isolated recombinant enzymes | |
| US7629154B2 (en) | Deinococcus N-acylamino acid racemase and use of preparing L-amino acid | |
| CN110791536B (zh) | 一种左旋多巴的生物合成方法 | |
| CN113755539B (zh) | 一种二氢嘧啶氨基水解酶及其应用 | |
| CN108359695A (zh) | 产d-色氨酸的工程菌及构建方法及生产d-色氨酸的用途 | |
| CN114196659B (zh) | 酰胺酶突变体、编码基因、工程菌及其应用 | |
| CN112941045B (zh) | 一种重组转氨酶及合成l-苯甘氨醇的方法 | |
| CN114958894B (zh) | 一种基于CcmK2纤维状蛋白的亚精胺合成多酶复合体的构建方法及其应用 | |
| KR20010075649A (ko) | 아미노아실라제 및 이를 사용한 디-아미노산의 제조방법 | |
| CN116515800A (zh) | PaDP蛋白和其突变体在普瑞巴林手性中间体酶法合成中的应用 | |
| EP2130925A1 (en) | Method for production of optically active amino acid | |
| KR100244055B1 (ko) | 디-엔-카르바모일-알파-아미노산의 제조법 | |
| CN116515801A (zh) | 用于制备普瑞巴林中间体的海因酶 | |
| CN116121310A (zh) | 一种利用酰胺酶合成右旋酮洛芬的方法 | |
| CN117660389A (zh) | 转氨酶突变体及其在制备手性胺类化合物中的应用 | |
| CN114107270A (zh) | 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体 | |
| CN116790537A (zh) | 一种苏氨酸转醛酶突变体、载体、菌株以及它们的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |