CN116790537A - 一种苏氨酸转醛酶突变体、载体、菌株以及它们的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种苏氨酸转醛酶突变体、载体、菌株以及它们的应用。所述的苏氨酸转醛酶突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中突变了多个氨基酸位点。利用本发明的苏氨酸转醛酶突变体，以对甲砜基苯甲醛和L‑苏氨酸为原料，通过酶催化反应制备(2S,3R)‑对甲砜基苯丝氨酸，与突变之前的酶相比，具有更高的活力、转化收率和更高的产物de值，更适用于规模化工业生产应用。
Description
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，涉及一种苏氨酸转醛酶突变体、载体、菌株以及它们的应用。
背景技术
(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸是合成氟苯尼考的关键中间体。氟苯尼考是一种广谱抗菌药物,具有吸收快，半衰期长，不易产生耐药性，无残留，无交叉耐药性等优点，主要用于牛、猪、鸡鸭、鱼等动物的细菌性疾病，是替代氯霉素和甲砜霉素的新一代氯霉素类抗生素。近年来，我国氟苯尼考的生产和出口量不断增长，已被列入我国医药原料药年出口金额1亿美元以上的品种名单中，市场需求量极大。因此，针对(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸进行研究，开发出一种绿色高效、经济环保的制备方法备受关注。
目前，国内外工业生产(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的主要方法是化学拆分DL-对甲砜基苯丝氨酸乙酯，得到具有光学活性的对甲砜基苯丝氨酸乙酯，然后经碱水解制备(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸。具体是以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为原料，在硫酸铜和氨水存在的条件下，通过羟醛缩合反应生成对甲砜基苯丝氨酸，酯化得到对甲砜基苯丝氨酸乙酯，再先后经D-酒石酸拆分和碱水解得到(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸。虽然该反应路线简单，但反应条件剧烈，同时用到强酸、强碱和硫化氢气体，产生大量的废水、废气和固体废弃物，对环境危害大，同时，需要用到昂贵的手性拆分试剂D-酒石酸，且反应总收率只有32％-37％，工业化应用生产成本高。
近年来，广大的生物工作者利用生物酶法催化合成了(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸，避开化学法合成中的诸多缺点，实现了高效绿色的不对称合成反应。如授权专利CN110540977B，名称为：一种L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用，公开报道了一种采用苏氨酸转醛酶全细胞，可在常温常压下催化反应合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸。授权专利CN110951799B，名称为：“一菌多酶”全细胞不对称合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的方法，提供了一种苏氨酸转醛酶(PsLTTA)、乙醇脱氢酶(ApADH)和甲酸脱氢酶(CbFDH)共表达的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株，可实现(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的不对称高效生物合成，同时解除了副产物乙醛对PsLTTA的抑制作用。上述方法中，虽然公开了(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的酶法合成路线，但采用的都是野生型苏氨酸转醛酶，催化反应活性低，生产成本高。
为解决苏氨酸转醛酶低活性的问题，我们以假单胞菌属来源的苏氨酸转醛酶PsLTTA为出发点，通过构建突变体文库和定向筛选，获得了一系列的高活力、高转化率的突变体酶(最佳突变体的活力提高了5倍以上，非对映体过量de值提高了1％以上)，为实现酶法生产(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的工业化应用奠定了基础。
发明内容
本发明的首要目的是提供苏氨酸转醛酶突变体，相比较野生型PsLTTA具有更高的催化活力，并能以对甲砜基苯甲醛和L-苏氨酸为原料催化制备(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸时，具有更高的转化收率和产物de值。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种苏氨酸转醛酶突变体，所述的突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的苏氨酸转醛酶PsLTTA中突变多个氨基酸位点，突变的氨基酸位点包括F320Y、N342D和K378D中的一个或多个。
进一步地，突变方式包括以下7种中的任一种：F320Y；N342D；K378D；F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D；
优选：N342D；K378D；F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D中的任一种。
更进一步地：突变方式包括以下4种中的任一种：F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。
更进一步地：突变方式包括以下3种中的任一种：F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。
更进一步地：突变方式包括以下2种中的任一种：N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。
本发明第二个目的是提供编码上述的苏氨酸转醛酶突变体的多核苷酸，以能够使编码的苏氨酸转醛酶突变体较野生型苏氨酸转醛酶PsLTTA具有更高的催化活力，更高的转化收率和产物de值。
本发明第三个目的是提供含有上述的苏氨酸转醛酶突变体的多核苷酸的载体。
本发明第四个目的是提供含有上述的载体的菌株。
本发明的第五个目的是提供一种制备(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的方法，以能够更好的制备(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸。
为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种制备(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的方法，所述的方法是在反应体系中，用前述的苏氨酸转醛酶突变体，以对甲砜基苯甲醛和L-苏氨酸为原料制备(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸。
在一种优选的实施方案中，本发明提供一种制备对甲砜基苯丝氨酸的方法，其中所述反应的反应温度为22-28℃，底物L-苏氨酸浓度为500-600mM，对甲砜基苯甲醛浓度为250-300mM，辅酶磷酸吡哆醛为0.1-0.5mM，氯化镁浓度为10-30mM，NAD+浓度为0.1-0.5mM，甲酸铵为500-600mM；底物溶剂为0.5-0.1mol/L磷酸盐缓冲液，反应pH 6.5-7.0，反应时间7-10h，苏氨酸转醛酶活力为200-300U，甲酸脱氢酶活力为100-200U，乙醇脱氢酶活力为200-300U，反应体系50ml。
本发明的有益效果在于，利用本发明的苏氨酸转醛酶突变体制备(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸，与突变之前的酶相比，具有更高的活力、更高的转化收率和更高的产物de值(最佳突变体的活力提高了5倍以上，非对映体过量de值提高了1％以上)，更适用于工业规模化生产应用。
附图说明
图1为苏氨酸转醛酶催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的原理图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。
苏氨酸转醛酶及其突变体的酶活力检测方法如下：
称取对甲砜基苯甲醛0.55g(30mM)，L-苏氨酸3.57g(300mM)，磷酸吡哆醛5mg(0.2mM)，氯化镁0.20g(10mM)，加入90mL 0.1M pH6.5磷酸盐缓冲液中，并定容至100mL。收集发酵后的菌体，采用球磨或超声破碎后离心(10000r/min、5min)，精确量取0.5mL菌体破碎液，用生理盐水将样品稀释到合适的线性范围进行检测(1.25-5.0U)，取适量稀释后样品于50ml试管中，用生理盐水补足5ml，加入已预热至25℃的底物溶液20ml，于25℃的水浴中搅拌反应10min后，加入25％的三氯乙酸溶液3ml终止反应，摇匀后离心，精确量取上清液1.0ml于50ml容量瓶中，进液相分析。
液相法HPLC用于产物(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的检测：
缓冲液：1.7g磷酸氢二钾溶于1000ml蒸馏水中，用85％的磷酸调pH至3.5，0.45μm水系滤膜过滤后，脱气20min。
流动相：缓冲液：乙腈＝90:10
柱子：大连江申BDS C18，5u，200×4.6
流速：1.00ml/min
波长：230nm
进样量：20μl
检测温度：30℃
样品出峰时间：
苏氨酸2.1min左右
(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸2.8min左右
三氯乙酸7.2min
对甲砜基苯甲醛22min
其中，(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸固体粉末，采用市售的(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸乙酯(纯度＞99％)，在碱性条件下水解并经纯化干燥获得。
标准溶液：精确称取(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸对照品10mg于100ml容量瓶中，加水溶解并定容至100ml刻度，进行HPLC分析。
酶活力计算
W标：(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸对照品称量，mg；
p标：(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸对照品含量，％；
A样：样品HPLC检测中(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸峰面积；
A标：(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸对照品峰面积；
M：(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸分子量，259.3；
T：反应时间，10min；
V：液态酶取样量，ml。
实施例1：苏氨酸转醛酶PsLTTA易错突变文库的构建及筛选
本发明中的L-苏氨酸转醛酶来源于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，GenBank中的登录号为：CRN02517.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。对编码上述PsLTTA氨基酸序列的密码子进行人工优化，优化后的多核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，经人工合成后克隆至表达载体pET30a(+)的NdeI和XhoI多克隆位点间，获得重组表达质粒pET30-PsLTTA，转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
将大肠杆菌BL21(DE3)/pET30-PsLTTA接种于含有50μg/mL的卡那霉素LB液体培养基中，220rpm，37℃过夜培养，收集菌体，用质粒试剂盒(OMEGA)提取质粒，并以质粒pET30-PsLTTA为模板，进行易错突变文库的构建，构建具体流程如下：以上述提取的的质粒pET30-PsLTTA为模板，选择常规的通用引物(通用引物序列：T7F:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’；T7R:5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’，分别见SEQ ID NO.3-4)进行易错PCR反应，调整PCR扩增反应体系中Mg2+、Mn2+、dCTP和dTTP寡核苷酸浓度，使该突变体文库的碱基错配率仅为千分之二，即保证一个突变体仅有1到2个氨基酸发生突变。易错PCR反应体系与程序如下：
易错PCR反应体系：
易错PCR反应程序：先95℃预变性5min；然后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共30-35个循环；最后72℃延伸10min。将上述易错PCR产物取样2μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测正确后，采用DNA产物纯化试剂盒纯化回收PCR产物。在37℃条件下，用NdeI和XhoI限制性内切酶分别对PCR纯化产物和原核表达载体pET30a(+)进行双酶切，酶切产物切胶回收(其中回收PCR纯化产物片段大小约为1300bp，回收载体pET30a(+)片段大小约为5400bp)，将易错PCR产物：原核表达载体pET30a(+)为3：1的摩尔比进行混合，加入T4 DNAligase于16℃过夜反应。次日用DNA产物纯化回收试剂盒对连接产物进行纯化回收，回收产物用于大肠杆菌BL21(DE3)的电击转化。电击转化后的产物，取适量菌体涂布于含有50μg/mL的卡那霉素LB固体培平板上，于37℃培养过夜，平板上形成的单菌落即为PsLTTA的易错突变体文库。
实施例2：PsLTTA易错突变体文库的高通量筛选
用高温灭菌后的牙签，小心挑取突变体文库的单菌落(每根牙签挑取1个单菌落)，分别接种于96孔细胞培养板的不同孔中(每孔中已加入含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基)。将96孔细胞培养板置于恒温高速摇床中37℃、700rpm培养6小时，从培养板中取50μL细胞培养液，加入无菌处理过的96孔酶标板中作为种子液保存，然后用8通道移液器向96孔培养板中加入终浓度为1％(m/v)的乳糖，25℃、700rpm诱导培养8小时。诱导培养完毕后，将96孔细胞培养板放入-80℃的超低温冰箱中冷冻2小时，取出放置于室温半小时，后4000r/min，4℃离心10分钟，每孔取上清50μL置于96孔酶标板中，用于后续高通量筛选反应。高通量筛选反应相关试剂配制：
底物溶液：5g/L的对甲砜基苯甲醛，35g/L的L-苏氨酸，0.1g/L的磷酸吡哆醛，2g/L的氯化镁，用0.1mol/L、pH6.5磷酸盐缓冲液溶解后，加入300U的乙醇脱氢酶及0.375g/L的NADH，充分搅拌溶解。
高通量筛选显色反应：
在含有50μL/孔菌体破碎上清液的96孔酶标板中，加入50μL/孔的反应底物溶液，用酶标仪测定OD320nm的吸光值，数据记录为A，25℃温育60min后，测定OD320nm的吸光值，数据记录为B。分析A至B的降低值，选择A与B差值较大的孔，用于后续摇瓶发酵、测序分析及转化验证。
经过多轮突变文库构建与筛选，挑取了大约10000个克隆子，经初筛和复筛等流程反复验证，选择吸光值差值大的菌株进行摇瓶发酵和活力分析，获得了3株表达苏氨酸转醛酶的高活力菌株，后经测序分析，产生了3种突变型的苏氨酸转醛酶，如表1所示：
表1：筛选获得的高活力PsLTTA突变体
从上表中可以看出，筛选获得的3株突变体菌株PsLTTA-1、2和3，相比野生型PsLTTA菌体发酵活力都有明显提升，相对活力提升范围在75-250％之间，因此下一步考虑在PsLTTA的基础上将上述的3个有利突变位点进行叠加突变与筛选，以进一步提升苏氨酸转醛酶的活力。
实施例3：PsLTTA定点叠加突变文库的构建与筛选
首先，以表达PsLTTA-1的菌株为出发菌株，经摇瓶培养和质粒提取，将N342D和K378D突变位点分别叠加上去，获得含F320Y/N342D和F320Y/K378D的突变体表达菌株PsLTTA-4和PsLTTA-5；同理，以PsLTTA-2突变株的质粒为模板，将K378D的突变位点叠加上去，获得含有N342D/K378D的突变株PsLTTA-6。最后以PsLTTA-4突变株的质粒为模板，将K378D的突变位点叠加上去，获得含有F320Y/N342D/K378D的突变株PsLTTA-7，将以上所有表达不同突变型PsLTTA的菌株进行摇瓶发酵、测序分析和活力测定筛选，最终获得活力提升的突变体酶如表2所
表2：叠加突变构建获得的PsLTTA突变体
从上表中的结果可知，将有利突变位点F320Y、N342D和K378D进行不同组合的叠加，产生的所有新型突变体PsLTTA的活力相较于野生型，都有大幅度的提升，最大提高比例达650％，为了进一步验证各突变体酶的催化反应性能，我们选择将PsLTTA-5、PsLTTA-6和PsLTTA-7的表达菌株进行发酵培养，收集菌体经破碎处理后，进行(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的转化反应。
实施例4：PsLTTA-5、PsLTTA-6及PsLTTA-7突变体酶的转化应用
分别将表达PsLTTA-5、PsLTTA-6及PsLTTA-7的工程菌株，接种于含有50μg/mL的卡那霉素LB液体培养基中，于37℃、220rpm过夜培养，按照2％(v/v)的接种量转接于含500mlTB液体发酵培养基的摇瓶中，于37℃、220rpm培养6h后，加入终浓度为1％(m/v)的乳糖，降温至25℃诱导培养8h后，4℃、10000r/min，离心收集全部的发酵液菌体，菌体用磷酸盐缓冲液(pH7.0、0.1mol/L)反复洗涤两次，离心后将菌体浓缩5倍重悬于100mL磷酸盐缓冲液(pH7.0、0.1mol/L)中。将上述的浓缩菌液置于冰水中进行超声破碎直至澄清，超声破碎条件为：工作3s，间隔5s，循环30次，超声功率为500W。
将上述含有PsLTTA突变体酶的超声破碎菌体液，进行以对甲砜基苯甲醛和L-苏氨酸为底物生产(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的催化反应，反应条件如下：在50ml反应体系中，用pH6.5、0.1mol/L磷酸盐缓冲液配置含有540mM L-苏氨酸，270mM对甲砜基苯甲醛，0.4mM辅酶磷酸吡哆醛，20mM氯化镁，0.3mMNAD+和540mM甲酸铵的底物溶液，然后依次加入苏氨酸转醛酶270U，甲酸脱氢酶140U，乙醇脱氢酶300U，在25℃条件下搅拌反应7-10h。
采用OPA/NAC衍生化检测产物(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸：衍生剂的配制：pH9.5、0.4mol/L硼酸缓冲液：称取24.73g硼酸溶解950ml去离子水中，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH至9.5，用去离子水定容至1000mL，过滤。0.01mo/L N-乙-L-半胱氨酸：称取N-乙酰-L-半胱氨酸816mg，用硼酸盐缓冲液定容至50mL。10g/L邻苯二甲醛溶液：称取0.50g邻苯二甲醛加入5ml乙醇和硼酸缓冲液超声溶解并定容至50mL。
分别移取1ml上述反应液，加入1mL 0.01mol/L N-乙酰-L-半胱氨酸，2mL 10g/L邻苯二甲醛溶液，于振荡器上振荡1min，加硼酸盐缓冲液定容至50mL，室温下避光放置10min后进行HPLC分析。HPLC分析条件如下：缓冲液：0.05mol/L乙酸钠溶液配制：称取0.41g无水乙酸钠至1000mL，用乙酸调pH至5.55。流动相：0.05mol/L乙酸钠溶液：甲醇＝70：30；色谱柱：氨基酸专用柱，大连江申(4.6mmx250mm，5μm)；检测波长：338nm。v)；流速：1mL/min；上样：20μL；检测温度：30℃。
产物(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸和(2S,3S)-对甲砜基苯丝氨酸的出峰时间分别为5.8min和6.3min；计算非对映体过量de值，计算方式如下：
反应过程中采用HPLC监控反应，待反应完成后，检测分析各反应液中(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的产量、转化收率((2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸与对甲砜基苯甲醛的摩尔比)及产物de值，最终的转化结果如表3所示：
表3：PsLTTA突变体反应完成后的产量分析
从表3可以看出，在相同反应条件和同等投酶量的情况下，野生型PsLTTA和突变体PsLTTA-5、-6及-7的转化完成时间相当，但突变体的转化收率(93-95％)明显高于野生型PsLTTA(90％)，且(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的非对映体过量de值相较野生型PsLTTA有所提高，可极大地降低(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的生产成本，适用于规模化工业生产。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。
SEQ ID NO.1假单胞菌属来源的野生型PsLTTA氨基酸序列
MSNVKQQTAQIVDWLSSTLGKDHQYREDSLSLTANENYPSALVRLTSGSTAGAFYH
CSFPFEVPAGEWHFPEPGHMNAIADQVRDLGKTLIGAQAFDWRPNGGSTAEQALML
AACKPGEGFVHFAHRDGGHFALESLAQKMGIEIFHLPVNPISLLIDVAKLDEMVRRN
PHIRIVILDQSFKLRWQPLAEIRSVLPDSCTLTYDMSHDGGLIMGGVFDSPLSCGADIV
HGNTHKTIPGPQKGYIGFKSAQHPLLVDTSLWVCPHLQSNCHAEQLPPMWVAFKEM
ELFGRDYAAQIVSNAKTLARHLHELGLDVTGESFGFTQTHQVHFAVGDLQKALDLC
VNSLHAGGIRSTNIEIPGKPGVHGIRLGVQAMTRRGMKEKDFEVVARFIADLYFKKT
EPAKVAQQIKEFLQAFPLAPLAYSFDNYLDDELLAAVYQGAQR
SEQ ID NO.2野生型PsLTTA核苷酸人工序列
ATGAGCAACGTTAAACAGCAGACCGCGCAGATCGTGGATTGGCTGAGCAGCACC
CTGGGTAAAGATCACCAGTATCGTGAAGATAGCCTGAGCCTGACCGCAAACGAA
AACTATCCGAGCGCACTGGTTCGCCTGACCTCAGGTAGCACCGCGGGTGCGTTTT
ATCATTGCTCTTTTCCGTTTGAAGTTCCGGCAGGTGAATGGCATTTTCCGGAACC
GGGTCACATGAATGCCATTGCAGATCAGGTTCGTGATCTGGGTAAAACCCTGATT
GGTGCCCAGGCATTTGATTGGCGTCCGAATGGTGGTAGTACAGCAGAACAGGCT
CTGATGCTGGCAGCATGTAAACCGGGAGAAGGATTTGTTCATTTTGCACATCGCG
ATGGTGGTCATTTTGCACTGGAGAGCCTGGCACAGAAAATGGGTATTGAAATTTT
TCATCTGCCTGTTAACCCGATTAGTCTGCTGATTGATGTTGCCAAACTGGATGAA
ATGGTTCGTCGTAATCCGCACATTCGTATTGTTATCCTGGATCAGAGCTTTAAACT
GCGTTGGCAGCCGCTGGCAGAAATTCGTTCCGTTCTGCCGGATAGTTGTACCCTG
ACCTATGATATGTCACATGATGGTGGTCTGATTATGGGTGGTGTTTTTGATTCACC
GCTGAGCTGTGGTGCAGATATTGTACATGGTAATACCCATAAAACCATTCCGGGT
CCGCAGAAAGGTTATATTGGTTTTAAAAGTGCACAGCACCCGCTGCTGGTTGATA
CCTCCCTGTGGGTTTGTCCGCATCTGCAGAGTAACTGTCACGCAGAACAGCTGCC
GCCTATGTGGGTTGCATTTAAAGAGATGGAACTGTTTGGTCGTGATTATGCCGCC
CAGATTGTTTCTAACGCGAAAACCCTGGCCCGTCACCTGCACGAACTGGGTCTGG
ATGTTACCGGTGAGAGCTTTGGTTTCACCCAGACGCATCAGGTTCATTTTGCCGT
TGGTGATCTGCAGAAAGCCCTGGATCTGTGCGTCAATTCACTGCATGCAGGTGGT
ATTCGTAGCACCAATATTGAAATTCCGGGTAAACCAGGAGTTCATGGTATTCGTC
TGGGTGTTCAGGCAATGACCCGTCGTGGTATGAAAGAAAAAGATTTTGAAGTGG
TTGCACGTTTTATTGCAGATTTATATTTCAAAAAGACCGAGCCGGCAAAAGTTGC
ACAGCAGATTAAAGAGTTTCTGCAGGCCTTTCCTCTGGCCCCGCTGGCATATAGC
TTTGATAATTATCTGGATGATGAGCTGCTGGCCGCAGTGTATCAGGGTGCACAGC
GT。
Claims (10)
1.一种苏氨酸转醛酶突变体，其特征在于：在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中进行突变，突变的氨基酸位点包括F320Y、N342D、K378D中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：突变方式包括以下7种中的任一种：F320Y；N342D；K378D；F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D；
优选：N342D；K378D；F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D中的任一种。
3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于：突变方式包括以下4种中的任一种：F320Y/N342D；F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。
4.根据权利要求3所述的突变体，其特征在于：突变方式包括以下3种中的任一种：F320Y/K378D；N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。
5.根据权利要求4所述的突变体，其特征在于：突变方式包括以下2种中的任一种：N342D/K378D；F320Y/N342D/K378D。
6.一种编码权利要求1-5任一项所述的苏氨酸转醛酶突变体的多核苷酸。
7.含有权利要求6所述的苏氨酸转醛酶突变体的多核苷酸的载体。
8.含有权利要求7所述的载体的菌株。
9.一种苏氨酸转醛酶制备(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的方法，其特征在于：以对甲砜基苯甲醛和L-苏氨酸为原料，在权利要求1-5任一项苏氨酸转醛酶突变体的作用下，催化制备(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述反应参数为：反应温度为22-28℃，底物L-苏氨酸浓度为500-600mM，对甲砜基苯甲醛浓度为250-300mM，辅酶磷酸吡哆醛为0.1-0.5mM，氯化镁浓度为10-30mM，NAD+浓度为0.1-0.5mM，甲酸铵为500-600mM；底物溶剂为0.5-0.1mol/L磷酸盐缓冲液，反应pH6.5-7.0，反应时间7-10h，苏氨酸转醛酶活力为200-300U，甲酸脱氢酶活力为100-200U，乙醇脱氢酶活力为200-300U，反应体系50ml。
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