CN116515801A - 用于制备普瑞巴林中间体的海因酶 - Google Patents

用于制备普瑞巴林中间体的海因酶 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海因酶突变体SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5，其能够高效催化3‑异丁基戊二酰亚胺水解为(R)‑3‑(氨甲酰甲基)‑5‑甲基己酸，为普瑞巴林手性中间体的生物催化法生产提供了一种新途径。

Description

用于制备普瑞巴林中间体的海因酶
技术领域
本发明属于酶学技术领域，具体涉及一种海因酶突变体及其在制备普瑞巴林手性中间体(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸中的用途。
背景技术
普瑞巴林(Pregabalin)化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸，于2004年12月获得FDA批准上市，主要用于带状疱疹后神经痛、纤维肌痛、糖尿病性外周神经痛和4岁及以上患者癫痫部分发作等的治疗。此外，欧洲EMA于2006年3月还批准普瑞巴林用于治疗广泛性焦虑(GAD)，该产品已在全球130多个国家和地区上市，是全球最畅销的镇痛药。其中S-普瑞巴林是γ-氨基丁酸的结构类似物，作为镇痛、抗惊厥和抗焦虑药物广泛应用于临床治疗。S-普瑞巴林药物在口服后迅速被人体吸收并主动转运到大脑中，因此与其他γ-氨基丁酸类药物相比，S-普瑞巴林的疗效更佳。
据全球畅销药数据统计，辉瑞普瑞巴林销售额从2005年的2.91亿美元增长到2018年的49.70亿美元。辉瑞普瑞巴林专利于2018年12月到期后，美国FDA在2019年7月同时批准了梯瓦制药、雷迪博士实验室等9家制药企业的普瑞巴林仿制药上市，致使辉瑞普瑞巴林在美国市场上收到仿制药的冲击，导致其全球销售额出现大幅度下滑，2019年下降至33.21亿美元。随着2019年12月，石药集团普瑞巴林胶囊的简约新药申请获得美国FDA批准，标志着普瑞巴林将面对越来越多质优价廉国产仿制药的竞争，因此生产工艺和成本降低成为了各家竞争的焦点。
目前S-普瑞巴林的工业化规模生产工艺是利用2-氰基乙酰胺和异戊醛合成环亚胺，然后碱水解获得混消旋的R/S-单酰胺，进一步在氯仿溶液中使用R-(+)-1-苯乙胺进行化学拆分获得手性中间体R-单酰胺，最后经Hofmann重排反应合成S-普瑞巴林。美国专利US2014/0243412A1提供了一种普瑞巴林关键中间体(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的合成方法，其反应式如下：
化学拆分步骤需要使用大量的有机溶剂，污染重、周期长、收率低，因此开发普瑞巴林中间体的绿色合成工艺成为产业需求。
针对中间体(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸化学工艺路线中污染严重、效率较低的R-单酰胺化学拆分步骤，开发一步酶法手性合成R-单酰胺的技术工艺成为众多生物合成技术领域的热点之一。专利文献CN113755539A公开了一种荧光假单胞菌来源的两种二氢嘧啶氨基水解酶(Dihydropyrimidinase，NCBI登录号：WP_011030900.1和WP_011334810.1)能够催化3-异丁基戊二酰亚胺反应生成ee值为99.5％以上的高光学纯度(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。但我们经实验验证发现这两种酶的酶催化活力有限，限制了工业化应用。
发明内容
受专利文献CN113755539A的启发，考虑到3-异丁基戊二酰亚胺是环酰亚胺类化合物，而海因酶(乙内酰脲酶水解酶，乙内酰脲酶，hydantoinase，简称Dhase)能够水解具有类似结构化学基团的化合物，具有催化环亚胺合成R-单酰胺的活性，发明人推测特定的海因酶有可能具有水解3-异丁基戊二酰亚胺生成(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的潜力，于是尝试对已报道的多种微生物来源的海因酶通过实验进行筛选比较，发现一株皮氏罗尔斯顿氏菌(Ralstonia pickettii)来源的海因酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，NCBI登录号：AAL37185.1)能够高度立体选择性地水解3-异丁基戊二酰亚胺并得到高光学纯度的目标产物(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，而且其比活力高于CN113755539A公开的二氢嘧啶氨基水解酶(NCBI:WP_011030900.1和WP_011334810.1)。为了进一步提高该海因酶的催化活性，我们还通过突变技术筛选到酶活力明显提高的两个突变体。具体地，本发明的技术方案如下。
一种海因酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:5：
mdiiikngtivtadgisradlgikdgkitqiggalgpaertidaagryvfpggidvhthvetvsfntqsadtfatatvaaacggtttivdfcqqdrghslaeavakwdgmaggksaidygyhiivldptdsvieelevlpdlgitsfkvfmayrgmnmiddvtllktldkavktgslvmvhaengdaadylrdkfvaegktapiyhalsrpprveaeataralalaeivnapiyivhvtceesleevmraksrgvralaetcthylyltkedlerpdfegakyvitpparakkdhdvlwnalrngvfetvssdhcswlfkghkdrgrndfraipngapgveerlmmvyqgvnegrisltqfvelvatrpakvfgmfpqkgtiavgsdadivlwdpeaemvieqtamhnamdyssyeghkvkgvpktvllrgkvivdegsyvgeptdgkflkrrkykq(SEQ ID NO:3)，
该突变体为野生海因酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，NCBI登录号：AAL37185.1)的F285I突变体。
mdiiikngtivtadgisradlgikdgkitqiggalgpaertidaagryvfpggidvhthietvsfntqsadtfatatvaaacggtttivdfcqqdrghslaeavakwdgmaggksaidygyhiivldptdsvieelevlpdlgitsfkvfmayrgmnmiddvtllktldkavktgslvmvhaengdaadylrdkfvaegktapiyhalsrpprveaeataralalaeivnapiyivhvtceesleevmraksrgvralaetcthylyltkedlerpdfegakyvitpparakkdhdvlwnalrngvfetvssdhcswlfkghkdrgrndfraipngapgveerlmmvyqgvnegrisltqfvelvatrpakvfgmfpqkgtiavgsdadivlwdpeaemvieqtamhnamdyssyeghkvkgvpktvllrgkvivdegsyvgeptdgkflkrrkykq(SEQ ID NO:5)；
该突变体为野生海因酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，NCBI登录号：AAL37185.1)的F285I/V60I突变体。
mdiiikngtivtadgisradlgikdgkitqiggalgpaertidaagryvfpggidvhthvetvsfntqsadtfatatvaaacggtttivdfcqqdrghslaeavakwdgmaggksaidygyhiivldptdsvieelevlpdlgitsfkvfmayrgmnmiddvtllktldkavktgslvmvhaengdaadylrdkfvaegktapiyhalsrpprveaeataralalaeivnapiyivhvtceesleevmraksrgvralaetcthylyltkedlerpdfegakyvftpparakkdhdvlwnalrngvfetvssdhcswlfkghkdrgrndfraipngapgveerlmmvyqgvnegrisltqfvelvatrpakvfgmfpqkgtiavgsdadivlwdpeaemvieqtamhnamdyssyeghkvkgvpktvllrgkvivdegsyvgeptdgkflkrrkykq(SEQ ID NO:1)。
本发明的另一方面还提供了编码上述海因酶突变体的基因。
例如，编码海因酶突变体SEQ ID NO:3的基因可以是核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的多核苷酸、或者核苷酸序列与SEQ ID NO:4有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多核苷酸。
编码海因酶突变体SEQ ID NO:5的基因可以是核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的多核苷酸、或者核苷酸序列与SEQ ID NO:6有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多核苷酸。
另一方面，编码野生海因酶(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，NCBI登录号：AAL37185.1)的基因可以是核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸、或者核苷酸序列与SEQ ID NO:2有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性的多核苷酸。
本发明还提供了包含上述编码基因例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的质粒。例如，上述质粒可以是pET载体例如pET22b、pET24a、pET24b、pET28a、pET28b等，也可以是pSH质粒等其他常用载体，但并不受限于此。
本发明的另一方面还提供了表达上述海因酶突变体、或者野生海因酶(NCBI登录号：AAL37185.1)的微生物，例如其基因组中整合了上述的基因SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6，或者转化了上述质粒的微生物。
优选地，所述微生物是大肠杆菌，更优选是大肠杆菌BL21(DE3)。
上述质粒的转化可以通过常规的化学转化法或者电转化方法转入细胞感受态中。上述基因组中整合可通过基因编辑技术实施，所述基因编辑技术例如选自下组：同源双交换，TALEN系统，CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cpf1系统，CRISPR-Cas12系统，CRISPR-BEST系统，MuGENT(multiplex genome editing by natural transformation，通过自然转化进行多重基因组编辑)等。
本发明的另一方面还提供了上述海因酶突变体、野生海因酶或者上述微生物在生产(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸中的用途。
具体地，本发明提供了一种制备(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的方法，其步骤为，以3-异丁基戊二酰亚胺为反应底物，采用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的海因酶、或者海因酶突变体SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5、或者上述的微生物催化水解反应，得到(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。
可选地，上述催化反应在缓冲溶液反应体系中进行。反应体系为pH8.0-9.0、优选pH8.5左右。
反应温度可以为25-50℃、优选28-48℃、更优选30-45℃、更优选35-40℃、最优选40℃左右。
本文中在表述数值特征时，术语“约”、“大约”或者“左右”是指所表示的本数可以有±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％的误差范围或浮动范围。另外，除非另行定义，本发明所出现的数词范围包含该数词以及该范围中的任意数。
本发明筛选的海因酶及其突变体能够高效地催化底物3-异丁基戊二酰亚胺水解得到高光学纯度的(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，为普瑞巴林中间体的生产提供了一种新的生物合成途径。
附图说明
图1是构建的用于表达海因酶F285I/V60I突变体的质粒pET28b-Dhase/F285I/V60I的结构图谱。
图2是实施例7中酶催化3-异丁基戊二酰亚胺制备(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的HPLC图谱。
图3是实施例7中制备的产物3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸R-构型和S-构型的HPLC图谱。
具体实施方式
为了寻找能够立体选择性地将底物3-异丁基戊二酰亚胺水解为普瑞巴林手性中间体的海因酶，发明人通过实验对已有文献报道的多种微生物来源的海因酶进行了比较筛选，这些微生物例如还包括专利CN01105347.X报道的产DHase的皮氏伯克霍尔德氏菌Burkholderia pickettii、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens DSM84、Bacillusstearothermophilis NS1122A、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CCRC12857；专利CN200610054616.2报道的根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens NRRLB11291、假单胞菌Pseudomonas DSM84、Pseudomonas KNK003、Pseudomonas KNK005、土壤杆菌AgrobacteriumKNK712、杆菌属sp.KNK 108、杆菌属sp.KNK 245或杆菌属sp.KNK 1415；专利CN200410000842.3报道的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida YZ-II6等等。最终筛选到来源于皮氏罗尔斯顿氏菌(Ralstonia pickettii)的海因酶(NCBI登录号：AAL37185.1)具有较好的催化性能。
为了进一步提高野生型海因酶的酶活力，发明人进一步通过易错PCR技术进行突变，并从随机突变库中筛选到酶活力显著提升的F285I突变体以及进一步突变得到的F285I/V60I突变体。
本发明中述及的野生海因酶及其F285I突变体和F285I/V60I突变体都是具有高度立体选择性的酶，能够用于制备高光学纯度的普瑞巴林中间体(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。
有时为了表述方便起见，可以将(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸简称为普瑞巴林手性中间体、普瑞巴林中间体、手性中间体、中间体。实施例中为描述方便，可将其简写为IBM。相应地，将其前体即酶催化底物3-异丁基戊二酰亚胺简写为IBI。
在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”表示相同的意义，都是指皮氏罗尔斯顿氏菌(Ralstonia pickettii)来源的海因酶(NCBI登录号：AAL37185.1)。类似地，野生型海因酶也可以称为“海因酶突变体”、“突变海因酶”、“突变酶”或“突变体”。有时为了表述方便起见，在本文中可以将野生酶与其F285I突变体和F285I/V60I突变体等统称为“海因酶(Dhase)”。
本发明的海因酶含有457个氨基酸，序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。比如用于在宿主大肠杆菌中表达F285I/V60I突变体的质粒可以是图1中所示的重组质粒pET28b-Dhase/F285I/V60I，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7，转化大肠杆菌后得到的转化子可以高效表达该突变酶。
为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达海因酶突变体，可以对这些酶的表达基因进行了密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
例如，为了在大肠杆菌中表达海因酶及其突变体，经密码子优化的野生海因酶SEQID NO:1的编码基因可以是SEQ ID NO:2；其F285I突变体SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4；F285I/V60I突变体SEQ ID NO:5的编码基因可以是SEQ ID NO:6。
上述转化体宿主可以是任何适合表达海因酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
当作为生物催化剂用于生产普瑞巴林中间体时，本发明的海因酶可以呈现酶的形式或者微生物菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体、死亡菌体、固定化菌体等。
当微生物比如大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
普瑞巴林中间体含量HPLC检测方法：
高效液相色谱仪(安捷伦1200)
色谱柱：SB-C18(250-4.6-5)
流动相A：乙腈/水＝20/80，用磷酸调pH＝2.5
流动相B：乙腈
流速：1.0ml/min
波长：210nm
流动相梯度：
时间(min) 0 12 20 21 26
A％ 100 100 0 100 100
保留时间：
IBM(3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸)：9.1min
IBI(3-异丁基戊二酰亚胺)：19.8min。
普瑞巴林中间体光学纯度检测方法：
衍生剂溶液配置：20g 2-溴苯乙酮溶液1L乙腈溶液中。
取反应液1mL，12000rpm离心1分钟，取上清液200ul于1mL离心管中，加入300mg无水碳酸钾和800μl纯化水，混合均匀。加入衍生剂溶液5mL，放置于25℃摇床中，150rpm衍生30分钟，静置分层，取上层液体进行薄层层析，展开剂为：正己烷：丙酮＝6：2。刮取Rf 0.08左右条带，用乙酸乙酯萃取。真空干燥乙酸乙酯后，用乙腈/水＝50/50溶解析出的固体，进样通过HPLC分析手性。
IBM构型检测HPLC方法：
高效液相色谱仪(安捷伦1200)
色谱柱：大赛路AD-RH手性柱
流动相：乙腈/水＝50/50，用磷酸调pH＝2.5
流速：0.5ml/min
波长：245nm
柱温：30℃。
需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。
实施例1：表达野生海因酶的大肠杆菌工程菌的构建
根据野生海因酶(NCBI登录号：AAL37185.1)的氨基酸序列即SEQ ID NO:1，进行大肠杆菌偏好性的密码子优化，全基因合成其编码基因序列SEQ ID NO:2，并在基因两端设计限制性内切酶位点NdeI和BamHI，亚克隆到载体pET28b(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET28b-Dhase。将重组质粒pET28b-Dhase转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，得到表达野生海因酶的重组大肠杆菌，简称Dhase。
实施例2：易错PCR和随机突变库的构建
以野生酶的编码基因SEQ ID NO:2为模板，应用易错PCR和大引物PCR技术构建随机突变体库。设计引物如下：
正向引物Dhase errF：5’GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC；
反向引物Dhase errR：5’CTTGTCGACGGAGCTCGAAT3’。
100μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板，各0.2μM一对引物Dhase errF和Dhase errR，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0.2mM,0.3mM,0.4mM)MnCl2，1U Taq。
PCR反应条件为：95℃，5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，40个循环；72℃7min。胶回收1.3kb随机突变片段作为大引物，用KOD FX neo DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃，2min，68℃10min；98℃10s，55℃30s，68℃3min，25个循环；68℃10min。
在PCR产物中加入DpnI于37℃消化去除质粒模板，纯化回收后电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态，加入1mL LB培养基于37℃复苏1h，涂布Kan平板37℃培养过夜，得到超过包括104个克隆的随机突变体库。
实施例3：突变体库的高通量筛选方法
按下述方法筛选具有催化合成普瑞巴林中间体能力的菌株。
反应液的配制：反应液如下：1M MnCl2 0.5μL，0.5M Na2SO3 2.5μL，5g/l底物IBI(3-异丁基戊二酰亚胺)197μl，pH8.5。
显色剂的配制：0.1g苯酚红加入60％乙醇溶解。
挑取突变体库中的菌株至含有kan抗性的200μl LB的96孔板中，37℃培养6h后加含有0.4mM IPTG、0.4g/l氯化钴和kan抗性的LB 200μl降温至28℃培养过夜。次日早上取50μL培养物转到96孔深孔培养板中，3500rpm离心3min，弃上清，加入50μL双蒸水重悬，置于-70℃冷冻2h，37℃融化30min，重复三次。加入200μL反应液，40℃反应1h，加入15μL显色剂，观察颜色由红变黄快的为酶活高的突变体。
实施例4：突变体催化能力比较
按下述方法比较筛选出的突变体的酶活力。
菌株摇瓶发酵：将液体培养基TB分装于1000mL三角摇瓶，装液量200mL，然后在高压灭菌锅中于121℃加热灭菌20min。在海因酶表达菌种的平板上用接种环挑数环菌体接种于TB摇瓶中，接种前在TB培养基中加入100μg/mL卡那霉素，于37℃、220rpm摇床培养至OD600＝5-6，加入0.2mM IPTG和0.2g/l氯化钴，于28℃诱导24h左右。
粗酶液的制备：取发酵液50mL置于离心管中；离心得菌体，按200g/L加纯化水重悬，然后超声波破碎：悬浮菌体用冰浴冷却，进行超声破碎(电压400W，超声时间3s，间隔时间5s，工作次数80次)。
酶活测定：称取底物IBI 2.5g，0.1M Tris-HCl pH8.5 5ml，0.1M MnSO4 50μl，加45ml水升温至40℃，调节pH 8.5后，加入(1g菌加4ml水超声破胞)破胞液后，用1ml水洗至反应中，用5％氨水控制pH 8.5，40℃反应，2h后取样离心，取上清液100μl加900μl10％ H3PO4测液相测IBM(3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸)含量，评估酶催化能力；同时测定产物光学纯度。
通过以上两种筛选方法，从以Dhase编码基因为模板的突变体库中筛选出了一株酶活提高一倍以上的突变株。提取质粒，并委托苏州金唯智公司进行核酸测序，将基因组中海因酶相关片段与SEQ ID NO:2进行比对，对比结果发现海因酶发生了F285I突变，编码基因为SEQ ID NO:4。
实施例5：第二轮突变
按照实施例2的方法，以突变体F285I的编码基因SEQ ID NO:4为模板，应用易错PCR和大引物PCR技术构建随机突变体库。
按照实施例3和实施例4的方法，对随机突变体库进行筛选，得到酶活力进一步提高的突变菌株，其表达的海因酶相对于突变体F285I而言发生了V60I突变，即相对野生酶而言的F285I/V60I突变体，编码基因为SEQ ID NO:6。
野生酶及其突变体的酶活比较结果参见表1。
表1、海因酶酶活比较
酶 酶活(U/g)
Dhase 18.8
F285I 52.4
F285I/V60I 72.3
实验对比显示，突变体F285I的酶活力相比野生酶Dhase提高了至少2倍多，突变体F285I/V60I的酶活力相对于突变体F285I又有明显提高。
实施例6：海因酶与二氢嘧啶氨基水解酶的酶活力比较
按照实施例1的方法，分别构建表达二氢嘧啶氨基水解酶(NCBI登录号：WP_011030900.1)和(NCBI登录号：WP_011334810.1)的重组大肠杆菌WP_011030900.1和重组大肠杆菌WP_011334810.1。
按照实施例4和实施例5的方法，比较野生海因酶Dhase和二氢嘧啶氨基水解酶的酶活力。结果列于表2中。
表2、不同酶的酶活比较
酶 酶活(U/g)
Dhase 18.8
WP_011030900.1 10.4
WP_011334810.1 9.3
表2的对比结果表明，野生海因酶Dhase的酶活力比二氢嘧啶氨基水解酶(NCBI登录号：WP_011030900.1和WP_011334810.1)要高。据此可以推测突变体F285I和突变体F285I/V60I催化3-异丁基戊二酰亚胺合成普瑞巴林中间体更具优势。
实施例7：海因酶突变体F285I/V60I催化合成普瑞巴林中间体实验
按照实施例1的方法，全基因合成突变体F285I/V60I的编码基因序列SEQ ID NO:6，并在基因两端设计限制性内切酶位点NdeI和BamHI，亚克隆到载体pET28b(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET28b-Dhase/F285I/V60I，其结构如图1所示，核苷酸序列为SEQ IDNO:7。将重组质粒pET28b-Dhase/F285I/V60I转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，得到表达突变体F285I/V60I的重组大肠杆菌F285I/V60I。
按照实施例4的方法进行摇瓶发酵并制备粗酶液，然后按下述方法催化3-异丁基戊二酰亚胺合成(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。
在3L发酵罐中依次加入900mL 10mM Tris-HCl(pH 8.5)，100g底物3-异丁基戊二酰亚胺，终浓度0.1mM MnSO4，搅拌400转/分钟，升温到40℃，加入100mL粗酶液，反应过程中用5％氨水控制pH 8.5，定时取样，通过高效液相色谱法测定离心上清液中3-异丁基戊二酰亚胺和产物3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的含量。底物转化数据见表3。反应16小时的3-异丁基戊二酰亚胺和3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸浓度的HPLC图谱参见图2，而R-构型、S-构型产物的HPLC图谱参见图3。
表3、酶催化底物转化数据
经检测，反应16小时的转化液中，产物(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的ee值为99.6％。
上述实验结果表明，海因酶及其F285I突变体和F285I/V60I突变体能有效催化3-异丁基戊二酰亚胺合成高光学纯度的普瑞巴林中间体，具有工业化开发和应用潜力。

Claims (10)

1.一种海因酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3或者SEQ ID NO:5。
2.编码如权利要求1所述海因酶突变体的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，编码海因酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4，编码海因酶突变体SEQ ID NO:5的基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:6。
4.包含如权利要求4所述基因的质粒。
5.如权利要求4所述的质粒，其特征在于，质粒载体选自PET系列。
6.表达如权利要求1所述海因酶突变体的微生物，其特征在于，基因组中整合了如权利要求3所述的基因，或者转化了如权利要求4所述质粒的微生物。
7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌。
8.如权利要求1所述海因酶突变体或者如权利要求6所述微生物在生产(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸中的用途。
9.一种制备(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的方法，其特征在于，以3-异丁基戊二酰亚胺为反应底物，采用氨基酸序列为SEQ ID NO:1的海因酶、或者如权利要求1所述的海因酶突变体SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5、或者如权利要求6所述的微生物催化水解反应，得到(R)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，反应体系pH8.0-9.0。
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