CN1668753A - 利用来自博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶的偶联酶促反应体系 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在由有机相和水相组成的双相体系中实施的偶联酶促反应体系。所述体系用辅因子依赖性酶进行操纵，所述辅因子用来源于博伊丁假丝酵母的FDH连续地酶促再生。

Description

利用来自博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶的偶联酶促反应体系
本发明涉及由酶操纵的偶联反应体系，该偶联反应体系的与众不同之处为其在双相的溶剂混合物中起作用。具体而言，本发明涉及一种反应体系，它包括有机化合物的辅因子依赖性酶促转化以及在同一体系中利用来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)(或基于它们的突变体)的甲酸脱氢酶的酶辅因子的再生。
用生物催化方法对具有光学活性的有机化合物(例如乙醇和氨基酸)的分离变得越来越重要。偶联使用两种可进行辅因子再生的脱氢酶已经证实是大规模工业化合成这些化合物的一种方法(DE 197 53 350)。
图示1
Figure A0381732800041
在三甲基丙酮酸被还原性氨基化为L-假亮氨酸的过程中，用来源于博伊丁假丝酵母的NAD依赖性甲酸脱氢酶原位再生NADH(Bommarius et al.Tetrahedron Asymmetry1995，6，2851-2888)。
与大量的合成的含金属催化剂比较，有效应用于水性介质的生物催化剂除它们的催化特性以及有效性以外，还具有的其它优点是可以避免使用含金属的添加材料，特别是含有重金属并因此有毒的添加材料。此外，例如在不对称还原作用的过程中，也可以避免使用昂贵及可能有害的还原剂，例如硼烷。
然而，在微溶于水的底物的转化过程中出现了难题。对于微溶于水的产物也存在着同样的难题。特别是在根据上述观点制备具有光学活性的醇上便存在这一难题，因为所需的作为原料化合物的酮比图示1中所采用的α-酮酸有着显著更低的溶解度。
原则上一个可能的解决方法是用一种醇脱氢酶和一种甲酸脱氢酶在一种极性有机溶剂或其水溶液中实施生物催化还原。在这种情况中，酶和底物两者以及任选地产物都应当是可溶的。然而，直接出现有机溶剂的一个常见缺点在于，在这些条件下通常发生酶活性的相当大的减低(见，例如，Anderson et al.，Biot.echnol.Bioeng.1998，57，79-86)。特别是，来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶是至今在工业化规模生产中所采用的并且是商品化可获得的唯一一种NADH再生酶，遗憾的是它对有机溶剂有着高敏感性(EP 1 211 316)。在使用DMSO、环丁砜、MTBE、丙酮、异丙醇和乙醇等有机溶剂成分的对比例1中也显示了这一点，每种溶剂的补给量只有10％体积(见图1)。
为解决这个问题的各种已知的方法都考虑到要稳定有机溶剂中的来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶，例如通过以表面活性物质的形式附加使用表面活性剂进行反应。但这种方法的缺点是，反应的速度被降低近40倍(！)，并且会出现对甲酸脱氢酶的抑制(B.Orlich et al.，Biotechnol.Bioeng.1999，65，357-362.)。作者另外注意到，因为醇脱氢酶的低稳定性，微乳状液条件下的还原方法是不经济的。在EP 340 744中所描述的方法原则上也具有相同的缺点，其中在存在水相和/或有机相的情况下将易溶中间相(lyotropic mesophases)选为反应位点。
实现生物催化反应的另一种基本可能性包括在有机溶剂中应用固定化酶或在由水和易混于水的有机溶剂组成的均质溶液中应用酶。然而将这些有机溶剂与酶发生直接接触的技术仅在少数的酶类获得成功，特别是水解酶。例如，在DE 44 36 149中提及“只有少数属于水解酶类的酶耐受有机溶剂(易混于水的或与非易混于水的)的直接存在”。尽管在此期间已知有其它酶类的一些其它实例(包括醇腈酶和来源于酵母的FDH)，但DE 44 36 149中的陈述对大多数酶而言仍是正确的。例如，来源于博伊丁假丝酵母的FDH能否有效固定化是未知的。另外，与固定化本身相关的是固定化步骤及固定化材料所带来的额外费用。
因此，工业上已经发展了新的方法以避免因有机溶剂的存在而引起的酶失活或变性的危险。例如，DE 44 36 149描述了一种方法，其中通过产物可通透性膜将产物从反应溶液提取到有机溶剂中，特别是通过一种疏水性膜。然而，与搅拌罐反应器中的标准方法比较，本发明无疑在技术上有着更多的要求；另外，所需的有机膜也是增加额外费用的因素。另外，本方法只适合于连续运作。而且，一个缺点是用这个方法得到的时空产率相对较低。例如，在乙酰苯的还原过程中，所得到的时空产率只有88g/(L*d)(S.Rissom etal.，Tetrahedron：Asymmetry1999，10，923-928)。关于这一点，要注意到乙酰苯本身是相当好的水溶性酮，而绝大多数类似的取代乙酰苯的酮以及相关的酮具有显著更低的可溶性，因此常见的疏水性酮的时空产率应当是明显更低的。尽管存在这些相当大的缺点，但是该方法至今还被认为是用单个酶不对称生物催化还原弱可溶性酮的优选方法(也见A.Liese，K.Seelbach，C.Wandrey，IndustrialBiotransformations，Wiley-VCH Verlag，Weinheim，2000，pp.103-106)。
综上所述，因此可以注意到现在还不知道有方法可以有助于避免上面罗列的缺点，以及容许利用“直接”存在于有机溶剂中的来源于博伊丁假丝酵母(或基于它们的突变体)的甲酸脱氢酶以工业化规模酶促制备微溶于水的底物。
因此本发明的目的是说明一种可能性，具体为如何能够充分有效地使得微溶于水的有机化合物进行偶联的辅因子依赖性酶促转化，以便在有利于经济和环保的条件下实现转化的工业化规模的应用。特别的，一个目的是这种方法应当适合用于微溶于水的酮的还原并且应当容许使用“直接”存在于有机溶液中的来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶(即没有被疏水性膜隔离)。
这个目的是以权利要求书中所定义的方式而实现的。权利要求1到8涉及一种根据本发明进行操纵的反应体系。权利要求9保护一种装置。权利要求10涉及一种根据本发明进行操纵的方法，而权利要求11和12涉及根据本发明的反应体系的优选用途。
本发明能够提供这样一种偶联酶促反应体系，其包含，在一种水相与液态有机相直接接触的双相溶剂体系中，用醇脱氢酶对有机化合物进行NADH依赖性酶促转化以及用来源于博伊丁假丝酵母或其突变体的甲酸脱氢酶进行NADH的酶促再生，基于这一点，获得了对上述目的的解决方案，尤其是以令人惊讶的、决无可预计的、且根据本发明是特别有利的一种方式获得了该解决方案。与从本领域的现状所能推定出的观点不同，令人惊奇地是，尽管存在有机溶剂，但仍能够进行该偶联酶促反应体系，且不存在由该溶剂所造成的其中一种酶的活性的减低，特别是来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶的活性的减低，且该反应体系的时空产率足以满足工业化规模生产。也可以采用来源于博伊丁假丝酵母生物体本身的FDH或相同生物体的进一步发展的重组突变体的FDH(DE197 53 350)。特别有利的是使用具有C23S/C262A氨基酸取代的突变体。与之相关的特别令人惊讶的事实是，尽管已经观察到博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶具有与有机溶剂相关的高度不稳定性(见实施例部分的对比例1)，但在这些条件下它也可以被十分有效地使用。
在反应体系中所使用的有机溶剂是用来与存在的水相形成如上述所解释的两个分离相。在这个要求的范围内，本领域人员原则上可以自由地选择有机溶剂。然而，如果所选定的有机相的溶剂具有尽可能低的在水中的溶解度(logP值≥3、优选的≥3.1、更优选的≥3.2等)，已经被证实是有利的。既然有机溶剂同时也用来吸纳微溶于水的离析物，那么所述的溶剂具有对所使用的有机化合物的尽可能高的溶解度也是重要的。
在反应体系中可以优选地采用的这种类型的有机溶剂是在给定的反应条件下为液态的芳香族或脂肪族烃。特别的，正戊烷、正己烷、正庚烷、正辛烷、异辛烷、环己烷、甲基环己烷以及它们的侧链异构体也是十分特别优选的。也可以使用卤代烃(CHCl3、CH2Cl2、氯苯等)。可以考虑使用芳香烃、甲苯、二甲苯或苯。
可以任意选择有机溶剂与水部分的数量比例。所使用的有机溶剂的相对于总体积的量是5-80vol％、优选的10-60vol％、特别优选的50vol％左右。
根据本领域现状所用的方法，为了增加酶促转化，需向酶反应混合物中添加表面活性剂，其中在反应过程中的相变被最小化，与此不同的是，本发明证实，使用根据本发明的反应体系，在体系中不含表面活性剂时，可相当成功地进行酶促转化。
文章中的名词“表面活性剂”被理解为指的是所有那些能够建立胶束结构或能够减低液-液相分界上的表面张力的物质。
如已说明的那样，在反应体系中所使用的底物的浓度应当是从经济的角度出发有利于完成转化的浓度。因此，反应开始前的有利的有机化合物的浓度应当是每升总体积溶剂(＝有机溶剂和水部分的总和)＞25mM、优选＞100mM、特别优选＞200mM、以及十分特别优选＞500mM。浓度的上限是由确保反应的可行性所自然地决定的；特别的，在每种情况下都应当达到反应混合物的可搅拌性。然而，反应也可以优选在超过底物或产物的饱和度限度的浓度情况下进行。
根据本发明，为了将酮基转化为醇基的目的，本领域人员可以在所有被考虑的酶反应中采用所具体提及的偶联酶促反应体系。然而，优选设定的是氧化还原酶反应。本方法适合于使用任何类型的醇脱氢酶。根据本发明所使用的醇脱氢酶优选地来源于生物体红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)(S-ADH)或高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefir)(R-ADH)(ADH derived from R.erythropolis：J.Peters，T.Zelinski，M.-R.Kula，Purification and characterization of a novel carbonyl reductasesilated from Rhodococcus erythropolis，J.Biotechnol.1994，33，283-292)(ADN derived from Lactabacillus kefir：C.W.Bradshaw，W.Hummel，C.-H.Wong，Lactobacillus kefir Alcohol Dehydrogenase：A Useful Catalyst forSynthesis，J.Org.Chem.1992，57，1532-1536.)。
在下一个进展中，本发明涉及一种转化有机化合物的装置，它包括根据本发明的反应体系。利于被采用的装置是例如可以被分批操纵或连续操纵的搅拌罐或搅拌罐级联、或膜反应器。
在本发明的范围内，名词“膜反应器”被理解为指的是任何反应容器，其中催化剂被密封于反应器中而小分子物质能被添加到反应器或能与之分离。同时，膜可以被直接地插入到反应槽中或可以被安装在外面的独立的过滤组件中，其中反应溶液连续或间断地流经过滤组件而存留物被循环回到反应器内。在WO 98/22415和在Wandrey et al.in Jahrbuch 1998，Verfahrenstechnik and Chemieingenieurwesen，VDI p 151ff.；Wandrey et al.in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds，Vol.2，VCH 1996，p 832ff.；Kragl et al.，Angew.Chem.1996，6，684 f中描述了适宜的实施方案。除操纵的分批和半连续模式外，在该装置中还可进行连续模式的操纵，这可根据需要以交叉流过滤模式(图4)或死端式过滤的形式(图3)而实现。在本领域的现状中原则上描述了这两种方法的变更方法(Engineering Processes for Bioseparations，Ed.：L.R.Weatherley，Heinemann，1994，135-165；Wandrey etal.，Tetrahedron Asymmetry 1999，10，923-928)。
发明的下一个进展是关于一种通过应用根据本发明的反应体系对有机化合物进行酶促转化的方法。方法优选的是涉及制备富含对映体的有机化合物优选是手性醇的方法。本领域人员根据已描述的反应体系以及下面的实施例能完成方法的设计。在给定的界限条件下，合理地设定酶促转化的其它已知的条件。
本发明的下一个方面也是关于根据本方面的反应体系在有机化合物的酶促转化或有机化合物优选是醇的鉴定或分析的方法中的用途。在进一步优选的方法中，根据本发明的反应体系被如上所述用于制备富含对映体的有机化合物(优选是醇)的方法中。
令人惊讶的是，来源于博伊丁假丝酵母的甲酸脱氢酶(FDH)具有与双相溶剂体系相关的非常好的稳定性。根据关于来源于博伊丁假丝酵母的FDH在各种溶剂体系中的长时间稳定性的试验可以说明这一点。根据本发明的对比例1以及本发明的实施例2，在这些试验中，选择相应的对应于总体积的10％和20％的有机溶剂的比例。与水溶性的有机溶剂相反(见对比例1)，它导致来源于博伊丁假丝酵母的FDH衍生物的快速失活，在双相体系中，特别是当使用前述的烃成分例如正己烷时，甚至在数天后仍能观察到来源于博伊丁假丝酵母(在这些实施例中所用的是双重突变形式)的甲酸脱氢酶的出众的稳定性特性。例如，酶活性在丙酮或DMSO中在24小时内相应地减少35％或66％，然而在20vol％的己烷中，甚至在3天后仍能看到90％的酶活性。正己烷的结果(实施例2)图解地表示于图1中并列于表3中。在图1和表1中同样记录了其它有机溶剂的对比例。
根据本发明，在已经描述的方法中也可以采用不易混于水的并因此与水形成双相的其它有机溶剂。例如，用有机溶剂的比例为20％的正庚烷的有机溶剂成分也可能获得非常高的稳定性。在这种情况下，27小时后的稳定性为出众的99.8％(见实施例3和表4)。因此它的活性以完全令人惊异的方式仍显著地高于纯水溶液中的活性，说明在使用双相体系中，来源于博伊丁假丝酵母的FDH具有意料不到的稳定性(也见实验部分，
实施例3，表4和图2)。
此外，注意到在使用具有更高的有机溶剂的体积比例的双相体系的情况时，根据本发明的反应体系可以成功地完成酶促转化。用更高溶剂比例的正庚烷所进行的试验证实了这一点(见实施例3，表4)。对于60％有机溶剂体积比例的正庚烷，同样可以保持长时间的高活性，清楚地显示27小时后的残留活性为82.8％。在图2图解地说明了与不同体积比例的有机溶剂相关的长时间稳定性的有关结果(根据实施例3，表4)。
根据醇脱氢酶/NADH/FDH/甲酸体系所提供的实施例可以说明本发明。通过该反应体系可以从相应的酮开始不对称地合成醇。
图示2：
                             实验实施例
Figure A0381732800123
(S)-1-(对氯苯基)乙醇   (S)-1-苯氧基丙烷-2-醇    (R)-2-氯-1-(间氯苯基)乙醇
(见实施例4)            (见实施例5)              (见实施例6)
69％转化率，           ＞95％转化率，           77％转化率，
＞99％对映选择性       ＞99.8％对映选择性       ＞99.2％对映选择性
反应混合物的处理通过MtBE的萃取以及通过蒸发而浓缩有机相而实现。用这个方法在装置中以非常简单的方式得到相应的醇，产率为69％以及对映选择性为99％(实施例4)。
但是用其它酮作为原材料也能获得出色的对映选择性。例如在这些反应条件下，苯氧基丙酮经还原生成了对映纯度的产物，经定量为＞99.8％ee(实施例5)。
但是，根据本发明的反应体系也适用于空间要求的酮。以α，m-二氯乙酰苯为例以示例的方式证实了这一点。该酮在甲基和在芳香环上都被氯原子取代。在双相体系中的生物催化还原生成了所需的产物2-氯-1-(间氯苯基)乙醇，也有出众的对映选择性＞99.2％(实施例6)。其转化率为77％左右。
这些高的转化率及对映选择性是令人惊奇的，原因是常常观察到因为有机溶剂的存在不仅降低了酶活性(伴有低转化率)也改变了酶的立体特异性的特性(伴有对映选择性的降低)。
然而在本文中，提高底物浓度的试验结果证实是特别地令人惊奇。这些试验采用了对氯乙酰苯作为示范底物。如果在上述的试验中，10mM的底物浓度(这个底物浓度对应于本领域现有试验中的浓度)获得69％的转化率(实施例4)，那么，与普遍的观点即由于抑制作用等原因提高底物浓度只会使得产量减低相反，提高底物浓度能增加这类反应的产量，现在从20mM浓度开始，可获得更高的转化率75％(40mM)以及74％(100mM)(实施例7、8；图示3；图5)。
图示3
Figure A0381732800131
因此这个方法也特别适合用于对高底物浓度的酮的酶促还原。
本方法的一个主要优点是它的简便性。例如，不包括复杂的工艺步骤，可以在分批反应器中和连续地实施本方法。同样，与较早的方法不同，不需要分离水性介质与有机介质的特殊膜。在这个方法中也不需要在一些以往方法中所需添加的表面活性剂。另一个主要的优点在于，首次使得在技术上意义重大的＞25mM的底物浓度条件下进行具有光学活性的醇的酶促制备成为可能。从本领域现有的方法中不能得到这些优点。
名词“富含对映体”指定的是在混合物中一种光学对映体对另一种光学对映体的比例要大于50％。
对于存在有一个立体中心的情况，所描绘的结构涉及两种可能的对映体，对于分子中多于一个立体中心的情况，所描绘的结构涉及所有的可能的非对映立体异构体，对于一种非对映立体异构体，包括所讨论的化合物的可能的两种对映体。
生物体博伊丁假丝酵母保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC 32195，并且是公众可获得的。
根据本发明，“偶联酶促体系”这一表述被理解为指的是有机化合物的酶促转化的发生伴有辅因子的消耗，并且辅因子被第二种酶体系(这里是来源于博伊丁假丝酵母或它们的突变体的FDH)原位再生。因此，这减少了昂贵的辅因子的使用。
本申请所公开的内容一并包括在本文中已经被提及的本领域现有技术的文献。
附图说明
图3显示了具有死端式过滤的膜反应器。通过泵2将底物1转移到含有膜5的反应器槽3中。除溶剂外，位于搅拌器驱动的反应器槽中的还有催化剂4、产物6和未转化的底物1。低分子产物6主要通过膜5滤出。
图4显示了具有交叉流过滤的膜反应器。这里通过泵8将底物7转移到被搅拌的也包含溶剂、催化剂9和产物14的反应器槽中。通过泵16驱动溶剂流经任选地存在的热交换器12到达交叉流过滤比色皿15。这里低分子产物被膜13分开。随后高分子催化剂9随溶剂流动一起被转运回到反应器10内，任选地再次经过热交换器12，任选地经过阀11。
实验部分
实施例1(应用来源于博伊丁假丝酵母(双重突变体：C23S/C262A)的FDH的FDH活性的对比例)
称量2.72g(0.8mol/L)甲酸钠和1.14g(0.1mol/L)磷酸氢二钾三水化物，并溶解于40mL去离子H2O中。用氨水(25％)和甲酸(100％)或相应的稀释液将溶液的pH值调至8.2。然后将溶液转移到50mL量瓶内并用去离子H2O将其完全注满。与这些分开进行的是，称量71.7mg(4mmol/L)NAD+三水化物并溶解于约20mL去离子H2O中。用氨水(25％)和甲酸(100％)或相应的稀释液将溶液的pH值调至8.2。然后将溶液转移到25mL量瓶内并用去离子H2O将其完全注满。随后，在每种情况中，将500μl底物溶液以及NADH溶液混合于被用于测定的1cm比色皿中。在加入10μl酶溶液后，其中使用的溶剂是含有10％有机溶剂的水溶液(见表)，进行短时间的摇晃，将比色皿置于光度计中，并开始记录数据。在开始测定之前首先直接加入酶溶液。通过光度测定NAD+形成NADH的反应，确定特定时间段后的来源于博伊丁假丝酵母(双重突变体：C23S/C262A)的FDH的活性。在温度为30℃、340nm波长下进行光度测定，测定时间为15分钟。在下面的表1和表2中显示了结果。
表1.来源于博伊丁假丝酵母(双重突变体：C23S/C262A)的FDH的酶活性：单位U/mL，表示为溶剂和时间的函数。
  时间   丁醇   MEK   DMSO   THF   环丁砜   乙腈
  [d]   活性[U/mL]   活性[U/mL]   活性[U/mL]   活性[U/mL]   活性[U/mL]   活性[U/mL]
  0.000   0.5262   0.0058   0.7965   0.8492   0.0028   0.7961
  0.042   0.0006   0.0011   0.7880   0.4357   0.0003   0.4494
  0.125   0.7794   0.0414   0.0840
  1.097   0.2669   0.0008
  2.035   0.2331
  2.896   0.2201
  5.927   0.1763
  7.885   0.1404
  9.948   0.1205
  13.073   0.0915
  14.892   0.0717
  16.875   0.0540
  19.938   0.0355
表2.来源于博伊丁假丝酵母(双重突变体：C23S/C262A)的FDH的酶活性：单位U/mL，表示为溶剂和时间的函数。
    时间     丙酮     乙醇
    [d]     活性[U/mL]     活性[U/mL]
    0.000     0.8355     0.8491
    0.042     0.7402     0.7689
    0.750     0.5893     0.6367
    1.000     0.5426     0.5933
    1.875     0.3484     0.4687
    2.760     0.2691     0.3510
    3.781     0.2004     0.2814
    4.646     0.1614     0.2240
    5.875     0.1325     0.1736
    6.778     0.0987     0.1486
    7.792     0.0794     0.1277
    8.729     0.0610     0.0998
    11.750     0.0333     0.0536
    13.726     0.0421
实施例2(来源于博伊丁假丝酵母(双重突变体：C23S/C262A)的FDH活性的测定)
根据实施例1的说明进行活性的测定，将己烷用作有机溶剂成分。
结果列于下面的表3中。
表3.来源于博伊丁假丝酵母(双重突变体：C23S/C262A)的FDH的酶活性：单位U/mL，表示为己烷和时间的函数。
    时间     己烷(10％)     己烷(20％)
    [d]     活性[U/mL]     活性[U/mL]
    0.000     0.8364     1.0280
    0.042     0.9572     0.9952
    0.177     0.8223     1.1408
    0.899     0.7892     0.9311
    2.000     0.6242     0.9467
    2.878     0.7654     0.9280
实施例3(来源于博伊丁假丝酵母(双重突变体：C23S/C262A)的FDH活性的测定)
根据实施例1的说明进行活性的测定，将正庚烷用作有机溶剂成分。结果列于下面的表4中。以百分比的形式给出评估，且在每种情况中每个底物浓度的结果都是相对于被定义为100％的初始活性的结果。
表4.来源于博伊丁假丝酵母(双重突变体C23S/C262A)的FDH的酶活性：单位U/mL，表示为庚烷和时间的函数。
    时间     正庚烷(10％)     正庚烷(20％)     正庚烷(60％)
    [h]     活性[％]     活性[％]     活性[％]
    0     100.0     100.0     100.0
    3     102.3     99.5     88.1
    21     92.2     96.7     82.3
    27     89.3     99.8     82.8
实施例4(对氯乙酰苯的转化)
将10.1U醇脱氢酶(来源于红串红球菌)和10U甲酸脱氢酶(来源于博伊丁假丝酵母的FDH，表达于E.coli，双重突变体C23S/C262A)添加到组成为对氯乙酰苯(78.4mg；10mM)、甲酸钠(50mM)和NADH(2mM)的10mL正庚烷及40mL磷酸缓冲液的溶液中。将形成的反应混合物在30℃下搅拌21小时。随后用3×25mL MTBE进行萃取操作，用硫酸钠干燥所收集的有机相。测定在真空管中去除溶剂后所得到的粗产物的转化率(用1H-NMR光谱测定)和对映选择性(用手性GC)。
转化率：69％
对映选择性：＞99％ee
实施例5(苯氧基丙酮的转化)
将10.1U醇脱氢酶(来源于红串红球菌)和10U甲酸脱氢酶(来源于博伊丁假丝酵母的FDH，表达于E.coli，双重突变体C23S/C262A)添加到组成为苯氧基丙酮(76.0mg；10mM)、甲酸钠(50mM)和NADH(2mM)的10mL正庚烷及40mL磷酸缓冲液的溶液中。将形成的反应混合物在30℃下搅拌21小时。随后用3×25mL MTBE进行萃取操作，用硫酸钠干燥所收集的有机相。测定在真空管中去除溶剂后所得到的粗产物的转化率(用1H-NMR光谱测定)和对映选择性(用手性GC)。
转化率：95％
对映选择性：＞99.8％ee
实施例6(2，3’-二氯乙酰苯的转化)
将10.1U醇脱氢酶(来源于红串红球菌)和10U甲酸脱氢酶(来源于博伊丁假丝酵母的FDH，表达于E.coli，双重突变体C23S/C262A)添加到组成为2，3’-二氯乙酰苯(102.7mg；10mM)、甲酸钠(50mM)和NADH(2mM)的10mL正庚烷及40mL磷酸缓冲液的溶液中。将形成的反应混合物在30℃下搅拌21小时。随后用3×25mL MTBE进行萃取操作，用硫酸钠干燥所收集的有机相。测定在真空管中去除溶剂后所得到的粗产物的转化率(用1H-NMR光谱测定)和对映选择性(用手性GC)。
转化率：77％
对映选择性：＞99.2％ee
实施例7(40mM的对氯乙酰苯的转化)
将10.1U醇脱氢酶(来源于红串红球菌)和10U甲酸脱氢酶(来源于博伊丁假丝酵母的FDH，表达于E.coli，双重突变体C23S/C262A)添加到组成为对氯乙酰苯(78.4mg；10mM)、甲酸钠(50mM)和NADH(2mM)的2.5mL正庚烷及10mL磷酸缓冲液的溶液中。将形成的反应混合物在30℃下搅拌21小时。随后用3×25mL MTBE进行萃取操作，用硫酸钠干燥所收集的有机相。测定在真空管中去除溶剂后所得到的粗产物的转化率(用1H-NMR光谱测定)和对映选择性(用手性GC)。
转化率：75％
实施例8(100mM的对氯乙酰苯的转化)
将10.1U醇脱氢酶(来源于红串红球菌)和10U甲酸脱氢酶(来源于博伊丁假丝酵母的FDH，表达于E.coli，双重突变体C23S/C262A)添加到含有对氯乙酰苯(78.4mg；10mM)、甲酸钠(50mM)和NADH(2mM)的1mL正庚烷及4mL磷酸缓冲液的溶液中。将形成的反应混合物在30℃下搅拌21小时。随后用3×25mL MTBE进行萃取操作，用硫酸钠干燥所收集的有机相。测定在真空管中去除溶剂后所得到的粗产物的转化率(用1H-NMR光谱测定)和对映选择性(用手性GC)。
转化率：74％

Claims (12)

1.一种偶联酶促反应体系，包括在水相与液态有机相相接触的一种双相溶剂体系中，用醇脱氢酶对有机化合物进行NADH依赖性酶促转化，并用来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)或其突变体的甲酸脱氢酶对NADH进行酶促再生。
2.权利要求1的反应体系，其特征在于，所使用的有机溶剂具有尽可能低的在水中的溶解度，而对于所使用的有机化合物来说，所述有机溶剂具有尽可能高的溶解度。
3.权利要求1或2的反应体系，其特征在于，将在反应条件下为液态的芳香族或脂族烃，特别是那些logP值＞3的烃，用作有机溶剂。
4.权利要求1至3中任一项的反应体系，其特征在于所述有机溶剂的量为总体积的10-60vol％。
5.前述权利要求中任一项的反应体系，其特征在于，在反应开始前所述有机化合物的浓度为＞25mM每升溶剂混合物，特别是＞100mM每升溶剂混合物。
6.前述权利要求中任一项的反应体系，其特征在于，该体系不含表面活性剂。
7.前述权利要求中任一项的反应体系，其特征在于，将来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)的醇脱氢酶用作转化所述有机化合物的酶。
8.权利要求1到6中任一项的反应体系，其特征在于，将来源于红串红球菌(Phodococcus erythropolis)的醇脱氢酶用作转化所述有机化合物的酶。
9.一种用于转化有机化合物的装置，包括权利要求1的反应体系。
10.一种通过应用权利要求1的反应体系对有机化合物进行酶促转化的方法。
11.权利要求1的反应体系用于有机化合物的酶促转化或优选地用于醇的鉴定或分析的用途。
12.权利要求11的用途，用于制备富含对映体的有机化合物的方法中，优选为用于制备富含对映体的醇的方法中。
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